Summary
يمثل استهداف تدهور البروتين آلية تنظيمية كبرى لوظيفة الخلية. يحدث عبر اليوبيكويتين proteasome ومسار الحفظ، والتي تعلق سلاسل polyubiquitin للبروتين الهدف الذي ثم خدمة "العلامات" الجزيئية بالنسبة للproteasome و26S. هنا، نحن تصف مقايسة خالية من الخلايا بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal البروتينات.
Abstract
برز مسار اليوبيكويتين-proteasome وعن تدهور البروتين باعتباره واحدا من أهم الآليات لتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة تقريبا. على وجه التحديد، في النباتات، ونظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس) ينظم تدهور البروتين ويساهم بشكل كبير في تطوير مجموعة واسعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية والتنمية وموت الخلية المبرمج. علاوة على ذلك، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، مثل الأجرعية، استغلال UPS المضيفة للعدوى كفاءة، مع التشديد على أهمية يو بي إس في التفاعلات النبات الممرض.
ويتحقق خصوصية ركيزة من يو بي إس من قبل اليوبيكويتين يغاز E3 الذي يعمل بالتنسيق مع E1 و E2 ligases الاعتراف وعلامة جزيئات البروتين محددة متجهة إلى التدهور عن طريق ربط لهم سلاسل من جزيئات اليوبيكويتين. فئة واحدة من ligases E3 هو SCF (Skp1 / Cالبروتين ullin / F-مربع) المعقدة، التي تعترف تحديدا ركائز يو بي اس ويستهدف لهم لubiquitination عبر عنصر البروتين F-علبته. للتحقيق في الدور المحتمل لليو بي إس في عملية بيولوجية من الفائدة، فمن المهم وضع مقايسة بسيطة وموثوق بها لUPS بوساطة تدهور البروتين. هنا، نحن تصف إحدى هذه مقايسة باستخدام نظام خالية من الخلايا النباتية. هذا الاختبار يمكن تكييفها للدراسات أدوار تدهور البروتين في تنظيم العمليات الخلوية المتنوعة، مع التركيز بشكل خاص على F-مربع البروتين الركيزة التفاعلات.
Introduction
وproteasome ومسار ubiquitin/26S والناشئة باعتبارها آلية على نطاق واسع من أجل السيطرة على التفاعلات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم النسخي، خلية دورة التقدم ونقل الإشارة، مستقبلات أسفل تنظيم أو الإلتقام، من بين أمور أخرى بمعالجة 1-4. في هذا المسار، والموسومة البروتين الهدف عن طريق اليوبيكويتين المخلفات التي تعلق الأول عن طريق السندات thiolester لانزيم تفعيل اليوبيكويتين E1 ثم translocated إلى بقايا حمض السيستين الأميني الانزيم اليوبيكويتين-E2 الاقتران، وأخيرا، يتفاعل مع اليوبيكويتين E2 E3 يغاز ، مما أدى إلى polyubiquitination الركيزة البروتين. في نهاية المطاف، يتم التعرف على البروتينات polyubiquitinated والمتدهورة التي proteasome و26S. في هذه الآلية، يحدد الإنزيم E3 الركيزة وتقوم بدور العنصر التنظيمية الرئيسية لنظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس). يمكن ligases E3 التصرف بشكل مستقل، مثل ligases مجال RING، أو كجزء من SCF multisubunit (Skp1/Cullin/F-box البروتين) المعقدة، مثل ligases مجال F-مربع. وتشارك SCF بوساطة مسارات التحلل proteasomal في تنظيم النسخ، ودورة الخلية، نقل الإشارة 5-10 والعديد من الوظائف الخلوية الرئيسية الأخرى.
إلى جانب هذه الأدوار الحاسمة في تنظيم العمليات الخلوية، يو بي إس يأخذ مرحلة مركزية في كثير من التفاعلات النبات الممرض. على سبيل المثال، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، بما في ذلك الأجرعية المورمة، والاعتماد على UPS المضيفة لتسهيل عملية العدوى 11. الأجرعية يتسبب نمو الأورام على النباتات، والتي تمثل المضيفين الطبيعية، ويمكن أيضا تحويل مجموعة واسعة من حقيقيات النوى الأخرى، من الفطريات 1،2 إلى الخلايا البشرية 12،13. أثناء الإصابة به، الأجرعية تصدر عنصر الحمض النووي (T-DNA) والعديد من الفوعة (فير) البروتينات في الخلية المضيفة 12-13. واحدة من هذه البروتينات هو VirF، أول بروتين F-مربع جدتأن المشفرة بواسطة الجينوم بدائية النواة 14. كجزء من مجمع SCF اليوبيكويتين يغاز، VirF، وجانه الفنية homolog المضيف VBF 15، وتسهيل عدوى الأجرعية عبر شركة يو بي إس تدهور البروتين بوساطة، مما يسهل يفترض uncoating من البكتيريا T-DNA الغازية من المرافق البروتينات في البكتيريا والمضيف، VirE2 وVIP1، على التوالي 16،17. ومن المثير للاهتمام، وكثير من البروتينات F-مربع، بما في ذلك VirF، هي في جوهرها غير مستقرة بسبب التحلل البروتيني الخاصة بهم، والتي يتم بوساطة النشاط autoubiquitination 18،19 أو ligases E3 الأخرى التي البروتينات F-مربع قد تكون بمثابة ركائز 20-23.
عند دراسة الأنشطة البيوكيميائية للبروتينات F-مربع، ligases اليوبيكويتين أخرى، و / أو ركائز، وسيكون من المفيد جدا لتوظيف مقايسة بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal. نحن هنا وصف بروتوكول واحد مثل لتحليل استقرار البروتين في الخليةخالية النظام. في هذا الاختبار، ويتم تحليل استقرار الركيزة يو بي إس في وجود أو عدم وجود واحدة من المكونات الأساسية للتدهور مسار proteasomal، مثل البروتين F-مربع، في نظام خالية من الخلايا. عموما، فإننا نعرب عن البروتين اختبار (ق) في أنسجة النبات، وإعداد مقتطفات خالية من الخلايا من هذه الأنسجة ورصد كميات من البروتين (ق) من الفائدة عن طريق النشاف الغربية. ويتجلى آلية تعتمد على UPS تدهور البروتين عن طريق إدراج مثبطات proteasomal محددة و / أو استخدام coexpression من الشكل السائد السلبية من عنصر SCF، Cullin. بينما نحن لتوضيح هذا الاختبار باستخدام تدهور proteasomal من البروتين نبات الأرابيدوبسيس VIP1 17 من البروتين F-مربع VBF 15، قد تكون استخدمت لتحقيق استقرار أي ركائز proteasomal الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التعبير البروتين
- اختيار نظام التعبير
حدد نظام، أي النواقل وطريقة التسليم ناقلات، وأفضل ملاءمة للتعبير عن البروتين من الفائدة في النموذج الحي / خلية معينة. نلاحظ أن لدينا فحص يتطلب التعبير من البروتينات اختبار بكميات اكتشافها بسهولة، والذي يتحقق على أفضل وجه عن طريق التحول عابرة أعداد كبيرة من الخلايا. في النباتات، على سبيل المثال، وهذا هو أفضل إنجاز باستخدام البلازميدات ثنائية كما ناقلات التعبير والأجرعية كنظام التسليم. - بناء ناقلات التعبير الثنائية
استنساخ تسلسل الترميز (ق) من البروتين (ق) من الفائدة الى ناقلات التعبير إما وحده أو في الانصهار متعدية إلى علامة حاتمة. استخدام نواقل ملائمة لنظام التعبير المختار وإجراءات البيولوجيا الجزيئية القياسية لاستنساخ الجينات. لبوساطة الأجرعية توصيل الجينات، وتوظيف نواقل ثنائية وتعريفهم، أيضا باستخدام standaبروتوكولات الثالثة، إلى سلالة الأجرعية، مثل EHA105، على التلقيح لاحقة من الأنسجة النباتية. - اختيار الأنواع النباتية
تحديد الأنواع النباتية التي سيتم التعبير البروتين (ق) من الفائدة. نلاحظ أنه، في حين أن أي نوع من النباتات عرضة للتحول الجيني بوساطة الأجرعية يمكن استخدامها، والأنواع النباتية لدينا من خيار غير نيكوتيانا benthamiana الذي يزرع بسهولة، عرضة للالأجرعية، ولها أوراق كبيرة والتي يتم تلقيح بسهولة. - نمو النبات
تنمو مصنع واحد لمدة 4 إلى 6 أسابيع في وعاء مع الموالية للميكس BX في وعاء (20 سم × 20 سم × 20 سم) تحت ظروف خاضعة للرقابة للبيئة (على سبيل المثال، وغرفة النمو) من يوم طويل (أي 16 ساعة من 130 -150 م μE-2-1 ق النور في 23 درجة مئوية و 8 ساعات الظلام في 20 ° C) والرطوبة النسبية 40-65٪.
1.5.2 تسميد أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا في تعليمات الشركة الصانعة. مرة واحدة ويزرع النبات، حدديترك مع حجم 50 ملم × 70 ملم أو أكبر (هذه القياسات لا تشمل طول سويقات) لالأجرعية التلقيح. - التلقيح مع الأجرعية
تنمو سلالة الأجرعية إيواء بناء الثنائية معربا عن البروتين اختبار (ق) من الخطوة 1.3 بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في المتوسط YEP (1٪ ببتون، 1٪ خلاصة الخميرة، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم) تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، 100 ملغ / L الستربتوميسين و 10 ملغم / لتر الريفامبيسين لناقلات المستندة pPZP-RSC2-24-25).
1.6.2 الطرد المركزي الخلايا، معلق لOD 600 = 0.5 في المخزن تسلل [10 ملي MgCl 2، 10 ملي مس (الرقم الهيدروجيني 5.6)، و 100 ميكرومتر acetosyringone]، واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اختراق الثقافة في الجانب مجافي المحور من ورقة، وذلك باستخدام needleless حقنة 1 مل، علما أن الأوراق يتم تلقيح في الموقع، في حين تعلق على النبات.
1.6.3 بعد تسلل، وتنمو النباتات لمدة 72 ساعة تحت ضوء نظام 16 ساعة 130-150 و# 181؛ م E-2-1 ق النور في 23 ° C / 8 ساعات الظلام في 20 ° C قبل الحصاد. - تطبيق مثبطات proteasomal
لدعم فكرة أن البروتين اختبار (ق) هو المتدهورة عبر مسار proteasomal، استخدام مثبطات proteasomal MG132 محددة وlactacystin 28-29، والتي ينبغي أن يقلل أو حتى منع تدهورها. أربع ساعات قبل الحصاد (انظر الخطوة 2.1)، التسلل إلى مناطق أوراق تلقيح الأجرعية مع 10 ميكرومتر MG132 (EMD ميليبور) أو 10 ميكرومتر lactacystin (سيغما الدريخ) أو وهمية علاج ورقة مع المذيبات منها، أي 0.1٪ DMSO أو الماء المقطر.
2. إعداد مقتطفات خالية من الخلايا
- حصاد نبات
حصاد المناطق تلقيح من ورقة، وعادة كاليفورنيا. 200-400 ملغ من الوزن الطازج، وطحن لهم في مسحوق ناعم في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، حبة تغلب على الأنسجة، وذلك باستخدام أي حبة الخافق (على سبيل المثال، Biospec) أو ملغام الأسنان (على سبيل المثال، TPC المتقدم تقنيات) مباشرة في المخزن المؤقت تدهور (انظر الخطوة 2.2). - استخراج البروتين
تحضير مجموع استخراج البروتين من خلال وضع الأنسجة الأرض في 500 ميكرولتر من العازلة تدهور [50MM تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 5 ملي DTT، 5 ملي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات 5'-، و 1X مثبط البروتياز كوكتيل (سيغما الدريخ)]. علما بأن كوكتيل مثبط البروتياز يؤثر أساسا سيرين، السيستين، الأسبارتيك، وmetalloproteases ولا تتداخل مع البروتيني 26S. توضيح استخراج من قبل اثنين من centrifugations متتابعة في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق. - رد فعل تدهور البروتين
نقل كميات متساوية من مقتطفات، وعادة 20 ميكرولتر، لmicrofuge أنابيب واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لزيادة فترات من الزمن. عادة، والوقت عينة صفر و 5، 10، 15، 20، و 30 نقاط زمنية دقيقة. وقف ردود الفعل من الغليان في هلام SDS عينة العازلة، وتحليلها بواسطة النشاف الغربية.
- هلام الكهربائي
3.1.1 حل عينات البروتين بواسطة SDS-بولكرلميد هلام الكهربائي وelectrotransfer البروتينات العزم على غشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول قياسي 30.
3.1.2 تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد (بيو راد)، وتحميل 50-80 ميكروغرام من البروتين الكلي في الممر. تأكد من أن جميع العينات يتم تحميلها على قدم المساواة. لضوابط التحميل، قارن شدة من نوع البروتين في كل مكان، مثل المفترضة RuBisCo السلاسل الكبيرة التي تهاجر والفرقة الكبرى مع التنقل الكهربي النسبي لحوالي 50 كيلو دالتون، بل يمكن أن يتم الكشف عن المواد الهلامية على Coomassie الملطخة الأزرق أو على الشقائقية S-أو الفلورسنت SYPRO روبي الملون والأغشية النيتروسليلوز. - حجب
منع الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم 5٪ في TBST (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة الأولية
تمييع الابتدائي الأضداد المضادة للحاتمة في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBST إلى التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة واحتضان مع غشاء حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. - الشطف
شطف يتم شطف الغشاء في 20 مل TBST لمدة 15 دقيقة مرة واحدة، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. - الأجسام المضادة الثانوية
تمييع الضد الثانوية (على سبيل المثال، مفتش المضادة للأرنب) مترافق مع الفجل البيروكسيداز (HRP) في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBST على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة واحتضان مع غشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. - كشف
شطف الغشاء مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.4. بعد شطف النهائي في TBST، تصور البروتينات من الفائدة مع chemiluminescent الركيزة HRP، والأكثر شيوعا باستخدام طقم ECL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 1، وتكييفها من Zaltsman آخرون 17، يوضح التجارب ممثل للكشف عن تدهور proteasomal في نظام خالية من الخلايا. على وجه التحديد، ونحن لشرح زعزعة استقرار لالمتعلقة بالدفاع البروتين VIP1 النبات من البروتين F-مربع VBF عبر مسار SCF VBF في N. benthamiana. VBF نبات الأرابيدوبسيس وHA الموسومة VIP1 (HA-VIP1) البروتينات وcoexpressed عابر، وجرى تحليل HA-VIP1 محتوى البروتين داخل مقتطفات من الأوراق التي كتبها معربا عن النشاف الغربية. أظهر هذا التحليل أن كميات VIP1 تم تخفيضها إلى درجة كبيرة عندما coexpressed مع VBF، ولكن ظلت مستقرة نسبيا في غياب VBF coexpression (الشكل 1A). نلاحظ أن انخفاض طفيف في محتوى VIP1 دون VBF قد يكون راجعا إلى انخفاض مستوى النشاط الذاتية VBF التبغ. ويستدل آلية تدهور proteasomal من VIP1 زعزعة الاستقرار من قبل VBF من ط لnhibition بواسطة MG132 (الشكل 1A). أظهرت الكمي للنتائج في الشكل 1A كاملة تقريبا (≥ 90 ± 5٪) VIP1 بواسطة VBF، الذي تم حظره من قبل MG132 (الشكل 1B). لاحظ أن مستويات أعلى قليلا من VIP1 بحضور MG132 الأرجح يتم تفسيرها من خلال تثبيط نشاط VBF الذاتية 17.
الشكل 1. VBF يعزز تدهور proteasomal من VIP1. وأعرب HA-VIP1 وحدها أو مع coexpressed VBF في N. benthamiana يترك. حضنت مقتطفات البروتين الناتج عن الفترات الزمنية المشار إليها وتحليلها بواسطة النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة HA. تم استخدام RuBisCo سلسلة كبيرة المفترضة عن السيطرة التحميل (A). Quantifieوأعرب د الغربية إشارة لطخة كنسبة مئوية من الإشارة التي تم الحصول عليها في غياب VBF في بداية فترة الحضانة. تمثل البيانات متوسط القيم من ثلاث تجارب مستقلة مع الانحرافات المعيارية وأشارت (B). وقد تم تكييف هذا الرقم من Zaltsman وآخرون 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد هذا الاختبار على التعبير عن البروتينات اختبار في الأنسجة النباتية، وبالتالي، فإن عملية تدهور proteasomal المحتملة الواضح يحدث بالفعل داخل الأنسجة الحية. نحن فحص البروتين زعزعة الاستقرار، ولكن فقط في مقتطفات، مع الوقت عينة الصفر العامل بوصفه نقطة مرجعية أولية. ومن هنا، نحدد بأنها مقايسة خالية من الخلايا.
أحد الجوانب الهامة لنجاح هذا الاختبار هو الخيار الصحيح للناقلات التعبير من خلالها سيتم إنتاج البروتين اختبار (ق). ما لم تكن محددة الأجسام المضادة ضد بروتين اختبار المتاحة، ينبغي أن يكون للكشف من قبل النشاف الغربية الموسومة حاتمة. وينبغي التعبير عن بروتين الموسومة من ناقلات ثنائي الأجرعية. في حين أن العديد من هذه النواقل متوفرة 26، نقترح استخدام ناقلات المستمدة من وجهة نظرنا وحدات النظام البلازميد بسة 24، والذي يسمح من خطوة واحدة من أشرطة الإدراج التعبير في البلازميدات ثنائي pPZP-RCS224-25. ميزة أخرى للنظام بسة هو أنه يتيح التعبير عن الجينات متعددة من نفس ناقلات 25، وهو أمر مفيد خاصة للتجارب لفحص عدة ركائز proteasomal أو لدراسة آثار interactors الركيزة اختبار، على سبيل المثال coexpression من الأجرعية VirD5 البروتين الذي يتفاعل مع نتائج proteasomal الركيزة VirF في حماية VirF من تدهور proteasomal 22. الأهم من ذلك أن سلسلة بسة توسيع ناقلات يتضمن بالفعل ناقلات لحاتمة علامات 27. بغض النظر عن استراتيجية الاستنساخ المختار، ينبغي إدخال تسلسل ترميز البروتين الموسومة حاتمة الاهتمام متجه ثنائي للتعبير اللاحقة في أنسجة النبات. لأن هذا الاختبار يستخدم التعبير عابرة، لا تملك ناقلات ثنائي لاحتواء علامات الاختيار للتحول مستقرة، على الرغم من وجودها لا يضر كفاءة الفحص.
على الرغم من العديد من البروتينات coexpression من الفائدة هو أفضل تحقيق ذلك باستخدام ناقلات التعبير متعددة الجينات، ويمكن أيضا أن يتم ذلك من خلال الجمع بين وحدات التخزين يعادل الثقافات السائل من اثنين أو ثلاث سلالات الأجرعية، كل منها يحمل بناء ثنائية منفصلة.
نقطة حرجة أخرى هي أنه في كثير من الحالات، وفحص تدهور proteasomal ينطوي التعبير ليس فقط من الركيزة proteasomal، ولكن أيضا من العناصر المكونة لمسار SCF. على سبيل المثال، قد يكون الهدف تجريبية لاختبار ما إذا كان البروتين F-مربع تعترف والأهداف لتدهور ركيزة محددة. في هذه الحالة، ينبغي coexpressed هذه الركيزة الموسومة حاتمة مع معلم البروتين F-مربع.
لتحليل أكثر تفصيلا من البيانات، ومدى تدهور البروتين يمكن أن يكون كميا بسهولة عن طريق قياس كثافة النسبية للإشارات غربي uالغناء أحدث البرامج يماغيج (NIH) 31. عند تنفيذ مثل هذه الكمي، فمن المهم عدم الإفراط في تطوير البقع الغربية لتجنب إشارة التشبع. يتطلب تقدير البيانات أيضا أن جميع العينات يتم تحميلها على هلام SDS-بولكرلميد على قدم المساواة فيما يتعلق محتوى البروتين على النحو تدهور البروتين في هذا الاختبار تم الكشف عنها بواسطة انخفاض في كثافة الفرقة البروتين المناسب. ويتحقق ذلك عن طريق تحديد محتوى البروتين من كل مستخلص الخلية وتحقق لاحقا من التحميل متساوية من كل حارة (انظر الخطوة 3.1). علاوة على ذلك، في أي وقت التجربة مسار معين، ينبغي أن تستمد جميع العينات من نفس دفعة من استخراج يساعد على ضمان المساواة في التحميل.
مقايسة خالية من الخلايا لتدهور proteasomal الموصوفة هنا يستخدم النباتات كنظام تجريبي. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم نفس التصميم التجريبي لأي كائن حي آخر. الفحص أيضا يمكن تمديدها من قبل فورثإيه التركيز على المسار SCF. على سبيل المثال، فإن الآلية التي تعتمد على SCF تدهور البروتين يمكن البرهنة باستخدام الشكل السائد السلبية للعنصر CULLIN1 SCF (CUL1 DN). على وجه التحديد، وقد تبين متحولة من نبات الأرابيدوبسيس CUL1 مع حذف مخلفات الأحماض الأمينية بين المواقف 1 و 420 على التفاعل مع المكون Skp1/ASK1 من مجمع SCF، ولكن ليس مع RBX1، التي تمثل جوهر الحفاز SCF 22. تثبيط أو الحد من تدهور الركيزة التالية coexpression من CUL1 DN يشير إلى تورط مسار SCF.
لدينا فحص يستخدم البروتينات من الفائدة التي أعرب عنها في الأنسجة النباتية، في بيئتهم الطبيعية. واحد بديل لهذا النهج هو لتنقية البروتينات المؤتلف، وإضافتها إلى المستخلصات النباتية، واتبع تدهورها عن طريق التحليل الغربي 32. نحن لا ننصح هذا التكتيك كما منهجية الاختيار لأن البروتينات المؤتلف لا الوايق تعكس بأمانة الخصائص البيولوجية الأصلي، ولكن إذا التعبير في بلانتا ليس ممكنا، واستخدام البروتينات المؤتلف يمثل بالتأكيد بديلا قيما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تلقت عمل يؤدي إلى هذا المنشور بتمويل من برنامج ماري كوري COFUND "U-التنقل"، تمويله من قبل جامعة ملقة والبرنامج الإطاري الاتحاد الأوروبي ال 7 (FP7/2007-2013) تحت رقم 246550 GA. ويدعم عمل في مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وزارة الزراعة / NIFA، جبهة الخلاص الوطني، BARD، والبنك السعودي الفرنسي لVC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
