Summary
Målrettet protein nedbrydning udgør en stor reguleringsmekanisme for celle funktion. Det sker via en konserveret ubiquitinproteasomvejen, som lægger multiubiquitinkæder til målproteinet som derefter tjene som molekylære "tags" for 26S proteasom. Her beskriver vi en enkel og pålidelig cellefrit assay for proteasomalaktivitet nedbrydning af proteiner.
Abstract
Den ubiquitinproteasomvejen for proteinnedbrydning dukket op som en af de vigtigste mekanismer til regulering af et bredt spektrum af cellefunktioner i praktisk taget alle eukaryote organismer. Specifikt i planter, det ubiquitin/26S proteasom systemet (UPS) regulerer proteinnedbrydning og bidrager væsentligt til udviklingen af en lang række processer, herunder immunrespons, udvikling og programmeret celledød. Desuden øger tyder på, at mange plante-patogener, såsom Agrobacterium, udnytte værten UPS til effektiv infektion, understreger betydningen af UPS i plante-patogen interaktioner.
Underlaget specificitet UPS opnås ved E3 ubiquitinligase der handler i forståelse med E1 og E2 ligase til at genkende og markere bestemte proteinmolekyler bestemt til nedbrydning ved at knytte til dem kæder af ubiquitin-molekyler. En klasse af E3 ligaser er SCF (SKP1 / CUllin / F-box protein) kompleks, som specifikt genkender UPS substrater og målretter dem til ubiquitinering via sin F-box protein komponent. At undersøge en mulig rolle UPS i en biologisk proces af interesse, er det vigtigt at udvikle en enkel og pålidelig analyse for UPS-medieret proteinnedbrydning. Her beskriver vi en sådan assay under anvendelse af en plante cellefrit system. Denne analyse kan tilpasses til undersøgelser af roller reguleret protein nedbrydning i forskellige cellulære processer, med særlig fokus på F-box protein-substrat interaktioner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasom vej fremstår som en udbredt mekanisme til styring af forskellige biologiske reaktioner, herunder transkriptionel regulering, cellecyklusfremadskriden og signaltransduktion, receptor nedregulering eller endocytose, blandt andre processer 1-4. I denne vej, er målproteinet tagget af ubiquitinenheder som først fastgjort via en thiolesterbinding til ubiquitin-aktiverende enzym E1 og derefter translokeres til en cystein aminosyrerest i ubiquitin-konjugation enzym E2, og endelig E2 interagerer med ubiquitin-ligase E3 , hvilket resulterer i polyubiquitination af proteinsubstratet. I sidste ende er de polyubiquitinated proteiner anerkendt og nedbrydes af 26S proteasomet. I denne mekanisme, E3 enzym angiver underlaget og fungerer som den centrale regulerende element i ubiquitin/26S proteasom systemet (UPS). E3 ligaser kan handle uafhængigt, såsom RING domæne ligaser, eller som del af en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein)-kompleks, såsom F-box domæne ligaser. SCF-medierede proteasomalaktivitet nedbrydningsveje er involveret i reguleringen af transskription, cellecyklus, signaltransduktion 5-10 og mange andre store cellulære funktioner.
Udover disse kritiske roller i reguleringen af cellulære processer, UPS tager den centrale scene i mange plante-patogen interaktioner. For eksempel flere beviser tyder på, at flere plante patogener, herunder Agrobacterium tumefaciens, stole på værten UPS for at lette infektionen processen 11.. Agrobacterium fremkalder neoplastiske vækster på planter, som repræsenterer dets naturlige værter, og det kan også omdanne en lang række andre eukaryoter, fra svampe 1,2 til humane celler 12,13. , Agrobacterium eksporterer løbet af sin infektion et DNA-element (T-DNA) og flere virulens (Vir) proteiner i værtscellen 12-13. Et af disse proteiner er VirF den første F-box-protein fundetat være kodet af en prokaryotisk genom 14. Som en del af SCF ubiquitinligase kompleks, VirF og dets funktionelle vært homolog VBF 15, lette Agrobacterium infektion via UPS-medieret proteinnedbrydning, hvilket formentlig letter virionkappe af invaderende bakterie T-DNA fra de ledsagende bakteriel og værtsproteiner, VirE2 og VIP1 henholdsvis 16,17. Interessant mange F-box proteiner, herunder VirF er uløseligt ustabile på grund af deres egen proteolyse, som medieres af autoubiquitination aktivitet 18,19 eller andre E3-ligaser, som F-box-proteiner kan tjene som substrater 20-23.
Når man studerer biokemiske aktiviteter F-box-proteiner, andre ubiquitin ligaser, og / eller deres substrater, ville det være meget nyttigt at anvende en enkel og pålidelig analyse for proteasomalaktivitet nedbrydning. Her beskriver vi en sådan protokol for analyse af protein stabilitet i en celle-Free system. I dette assay er stabiliteten af UPS substrat analyseret i nærvær eller fravær af en af de væsentlige dele af proteasomalaktivitet nedbrydningsvej, såsom en F-box-protein i et cellefrit system. Generelt udtrykker vi den testede protein (r) i plantevæv, forberede celle-fri ekstrakter fra disse væv og overvåge mængder af proteinet (r) af interesse ved western blotting. UPS-afhængige mekanisme af protein nedbrydning påvises ved inddragelse af specifikke proteasomalaktivitet hæmmere og / eller ved hjælp coexpression af dominant negativ form af en SCF-komponent, Cullin. Mens vi illustrere dette assay under anvendelse af proteasomalaktivitet nedbrydning af Arabidopsis VIP1 17 protein ved F-box-protein VBF 15, kan den anvendes til at undersøge stabiliteten af andre proteasomalaktivitet substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Proteinekspression
- Valg af ekspressionssystem
Vælg system, dvs, vektorer og vektor-levering metode bedst egnet til ekspression af proteinet af interesse i den specifikke model organisme / celle. Bemærk, at vores analyse kræver udtryk af de testede proteiner i let detekterbare mængder, hvilket bedst opnås ved forbigående transformation af et stort antal celler. I planter, for eksempel, er dette bedst opnås ved hjælp af binære plasmider ekspressionsvektorer og Agrobacterium leverings-system. - Konstruktion af binære ekspressionsvektorer
Klone den kodende sekvens (er) af proteinet (erne) af interesse i en ekspressionsvektor, enten alene eller i translationel fusion til et epitopmærke. Brug vektorer egnet til det valgte ekspressionssystem og standard molekylærbiologiske procedurer til genkloning. For Agrobacterium-medieret gen levering, beskæftiger binære vektorer og introducere dem, også ved hjælp af standard protokoller, i en Agrobacterium-stamme, såsom EHA105 til efterfølgende inokulering af plantevæv. - Valg af plantearter
Vælg de plantearter hvor proteinet (r) af interesse vil blive udtrykt. Bemærk, at mens der kan bruges enhver planteart, der er modtagelige for Agrobacterium-medieret genetisk transformation, vores plantearter af valg er Nicotiana benthamiana, som er let dyrket, meget modtagelige for Agrobacterium, og har store blade, som er let podet. - Plantevækst
Grow et anlæg til 4 til 6 uger i en gryde med Pro-Mix BX i en gryde (20 cm x 20 cm x 20 cm) under miljømæssigt kontrollerede forhold (f.eks vækst kammer) af lang dag (dvs. 16 H 130 -150 uE m-2 s-1 lys ved 23 ° C og 8 timer mørke ved 20 ° C) og 40-65% relativ fugtighed.
1.5.2 Gød lejlighedsvis med kommercielt tilgængelige produkter pr fabrikantens anvisninger. Når planten dyrkes vælgeblade med den størrelse på 50 mm x 70 mm eller større (disse målinger længde inkluderer ikke stilk) for Agrobacterium inokulering. - Podning med Agrobacterium
Grow Agrobacterium-stamme, der huser binær konstruktion udtrykker testede protein (er) fra trin 1.3 natten over ved 28 ° C i YEP medium (1% pepton, 1% gærekstrakt og 0,5% NaCI) suppleret med passende antibiotika (fx 100 mg / L streptomycin og 10 mg / l rifampicin for pPZP-RSC2-baserede vektorer 24-25).
1.6.2 Centrifuger cellerne, resuspenderet til OD600 = 0,5 i infiltration buffer [10 mM MgCl2, 10 mM Mes (pH 5,6), 100 uM acetosyringon], og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Infiltrere af kultur i abaxial side af et blad ved hjælp af en 1 ml injektionssprøjte uden nål, bemærk at bladene inokuleres in situ, samtidig er fastgjort til anlægget.
1.6.3 Efter infiltration, dyrke planten i 72 timer under lyset regime af 16 timer 130-150 &# 181; E m-2 s-1 lys ved 23 ° C / 8 h mørke ved 20 ° C før høst. - Anvendelse af proteasomalaktivitet inhibitorer
For at understøtte den opfattelse, at den testede protein (r) nedbrydes via en proteasomalaktivitet vej, anvende bestemte proteasomalaktivitet hæmmere MG132 og lactacystin 28-29, hvilket skulle reducere eller endda blokere nedbrydning. Fire timer før høst (se trin 2.1), infiltrere Agrobacterium inokulerede blad områder med 10 uM MG132 (EMD Millipore) eller 10 pM lactacystin (Sigma-Aldrich) eller mock-behandling af blade med de respektive opløsningsmidler, dvs 0,1% DMSO eller destilleret vand.
2. Fremstilling af cellefrie ekstrakter
- Leaf høst
Høste de inokulerede områder af bladet, som regel ca. 200-400 mg frisk vægt og male dem til fint pulver i flydende nitrogen. Alternativt perle-slå væv, ved hjælp af enhver perle-beater (f.eks Biospec) eller en tand amalgamator (f.eks TPC Advanced Technologies) direkte i nedbrydningen buffer (se trin 2.2). - Proteinekstraktion
Forbered samlede proteinekstrakt ved at placere råvæv i 500 pi nedbrydning buffer [50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenosin-5'-triphosphat, og 1x proteaseinhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)]. Bemærk, at proteaseinhibitoren cocktail påvirker især serin, cystein, asparaginsyre, og metalloproteaser og ikke interfererer med 26S protease. Ekstraktet klares ved to sekventielle centrifugeringer ved 12.000 xg i 5 min. - Proteinnedbrydning reaktion
Overfør lige volumener af ekstrakter, sædvanligvis 20 pi til mikrocentrifugerør og inkubere dem ved stuetemperatur i stigende tidsrum. Typisk prøve tiden nul, og 5, 10, 15, 20, og 30 min tidspunkterne. Stop reaktionerne ved kogning i SDS-gel-sample buffer, og analysere dem ved western blotting.
- Gelelektroforese
3.1.1 løse protein prøver ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og elektrotransfer de adskilte proteiner til en nitrocellulose membran ifølge standard protokol 30.
3.1.2 Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-metoden (Bio-Rad), og indlæse 50-80 ug totalt protein pr bane. Sørg for, at alle prøver er indlæst ligeligt. For læssekontrol, sammenligne intensiteterne af en allestedsnærværende protein arter, såsom formodede RUBISCO store kæder, der migrerer som et større bånd med en relativ elektroforetisk mobilitet på omkring 50 kDa, og de kan blive opdaget på Coomassie blåfarvede geler eller Ponceau S-eller fluorescerende SYPRO Ruby-farvede nitrocellulosemembranerne. - Blokering
Blokere membranen med 5% skummetmælk i TBST (10 mM Tris-HCI, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i 1 time ved stuetemperatur. Primært antistof
Fortyndet primære anti-epitop-antistof i 1% skummetmælk i TBST koncentrationen anbefalet af fabrikanten og inkuberes med det blokerede membran i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C med forsigtig omrøring. - Skylning
Skyl skylles membranen i 20 ml TBST i 15 minutter én gang og to gange i 5 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrøring. - Sekundært antistof
Fortyndet sekundært antistof (fx anti-kanin IgG) konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) i 1% skummetmælk i TBST som anbefalet af fabrikanten og inkuberes med membranen i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig omrøring. - Detection
Skyl membranen igen som beskrevet i trin 3.4. Efter den sidste skylning i TBST, visualisere proteinerne af interesse med et HRP kemiluminescerende substrat, mest almindeligt ved hjælp af et ECL-kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1, tilpasset fra Zaltsman et al. 17 illustrerer repræsentative forsøg til påvisning af proteasomalaktivitet nedbrydning i et cellefrit system. Konkret har vi demonstrere destabilisering af en plante forsvar-relateret protein VIP1 af VBF F-box protein via SCF VBF vej i N. benthamiana. Arabidopsis VBF og HA-mærkede VIP1 (HA-VIP1) proteiner blev transient coudtrykt, og HA-VIP1 proteinindhold inden uddrag af udtrykkende blade blev analyseret ved western blotting. Denne analyse viste, at VIP1 beløb blev reduceret til en betydelig grad, når coudtrykt med VBF, men forblev forholdsvis stabil i fravær af VBF coexpression (figur 1A). Bemærk, at et lille fald i VIP1 indhold uden VBF kan skyldes det lave niveau af det endogene tobak VBF aktivitet. Den proteasomalaktivitet nedbrydning mekanisme VIP1 destabilisering af VBF blev udledt sin inhibition af MG132 (figur 1A). Kvantificering af resultaterne i figur 1A viste næsten komplet (≥ 90 ± 5%) VIP1 af VBF, der blev blokeret af MG132 (figur 1B). Bemærk, at en smule højere niveauer af VIP1 i nærvær af MG132 sandsynligvis forklares ved hæmning af den endogene VBF aktivitet 17.
Figur 1.. VBF fremmer proteasomalaktivitet nedbrydning af VIP1. HA-VIP1 blev udtrykt alene eller co-udtrykt med VBF i N. benthamiana blade. De resulterende proteinekstrakter blev inkuberet i de angivne tidsperioder og analyseret ved western blotting under anvendelse af anti-HA antistoffer. Det formodede RUBISCO stor kæde blev anvendt som indlæsning kontrol (A). Quantified western blot-signal blev udtrykt som procent af det signal, der opnås i fravær af VBF ved begyndelsen af inkubationstiden. Dataene repræsenterer middelværdier af tre uafhængige eksperimenter med angivne standardafvigelser (B). Dette tal blev tilpasset fra Zaltsman et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne analyse bygger på ekspressionen af de testede proteiner i plantevæv, og dermed den potentielle proteasomalaktivitet nedbrydningsprocessen naturligvis sker allerede inden for de levende væv. Vi assay protein destabilisering, dog kun i ekstrakterne med tiden nul prøve tjener som det første referencepunkt. Derfor har vi definere det som et cellefrit assay.
Et vigtigt aspekt for succes i dette assay er det korrekte valg af ekspressionsvektoren, hvorfra det testede protein (er) vil blive produceret. Medmindre specifikke antistoffer mod det testede protein er til rådighed, skal det være epitopmærket til detektering ved Western blotting. Det mærkede protein bør udtrykkes fra en Agrobacterium binære vektor. Mens mange sådanne vektorer er til rådighed 26, foreslår vi at bruge vektorer afledt fra vores modulære PSAT plasmidsystem 24, som giver mulighed for et-trins indsættelse af ekspressionskassetter ind i pPZP-RCS2 binære plasmider24-25. En anden fordel ved PSAT er, at det tillader ekspression af flere gener fra den samme vektor 25, som er specielt nyttigt for eksperimenter for at analysere flere proteasomalaktivitet substrater eller at undersøge virkningerne af interaktionskandidater af det testede substrat, for eksempel coekspression af Agrobacterium VirD5 protein, der interagerer med proteasomalaktivitet substrat VirF resultater i VirF beskyttelse fra proteasomalaktivitet nedbrydning 22. Vigtigere er det, ekspanderende PSAT serie af vektor indeholder allerede vektorer for epitop tagging 27. Uanset den valgte kloningsstrategi bør sekvensen kodende for epitopmærkede protein af interesse skal indføres i en binær vektor til efterfølgende ekspression i plantevæv. Fordi denne analyse bruger transient ekspression, er den binære vektor ikke at indeholde udvælgelse markører for stabil transformation, selv om deres tilstedeværelse er ikke til skade for analysen effektivitet.
Selv coekspression af adskillige proteiner af interesse opnås bedst ved multigene ekspressionsvektorer, kan det også ske ved at kombinere ækvivalente rumfang af flydende kulturer af to eller tre Agrobacterium-stammer, som hver bærer et særskilt binær konstruktion.
Et andet kritisk punkt er, at i mange tilfælde proteasomalaktivitet nedbrydning assayet involverer ekspression ikke kun af proteasomalaktivitet substratet, men også af en komponent i SCF-vejen. For eksempel kan den eksperimentelle mål være at teste, om en F-box-protein genkender og mål for nedbrydning et specifikt substrat. I dette tilfælde skal denne epitop-mærket substrat coudtrykt med umærket F-box-protein.
For mere detaljeret analyse af de data, kan omfanget af protein nedbrydning let kvantificeres ved at måle den relative intensitet af de vestlige signaler usynge nyeste ImageJ software (NIH) 31. Ved udførelse af en sådan kvantificering, er det vigtigt ikke at over-udvikle western blots for at undgå signal mætning. Data kvantificering kræver også, at alle prøver er indlæst på SDS-polyacrylamidgel også med hensyn til deres proteinindhold proteinnedbrydning i dette assay detekteres ved reduktion i intensiteten af det relevante protein band. Dette opnås ved bestemmelse af proteinindholdet i hver celleekstrakt og ved efterfølgende kontrol af samme belastning af hver bane (se trin 3.1). Endvidere, i en given tid under forsøget, alle prøver skal være afledt fra den samme batch af ekstrakt hjælper med at sikre lige belastning.
Den cellefri assay for proteasomalaktivitet nedbrydning beskrevet her anvender planter som et eksperimentelt system. Imidlertid kunne den samme eksperimentelle design anvendes til nogen anden organisme. Analysen kan også forlænges ved Furthis fokus på SCF vej. For eksempel kan SCF-afhængig mekanisme af proteinnedbrydning demonstreres ved anvendelse af en dominant negativ form af SCF komponent CULLIN1 (CUL1 DN). Specifikt er en mutant af Arabidopsis CUL1 slettede aminosyrerester mellem position 1 og 420 blevet vist at interagere med Skp1/ASK1 bestanddel af SCF-komplekset, men ikke med RBX1, som udgør den katalytiske kerne af SCF 22. Hæmning eller reduktion af substrat nedbrydning efter coexpression af CUL1 DN indikerer inddragelse af SCF-vejen.
Vores analysen anvender proteiner af interesse udtrykt i plantevæv, i deres naturlige miljø. Et alternativ til denne fremgangsmåde er at rense rekombinante proteiner, tilføje dem til planteekstrakter, og følg deres nedbrydning ved western-analyse 32. Vi anbefaler ikke denne taktik som metode valg, fordi rekombinante proteiner ikke altid ats trofast afspejler de indfødte biologiske egenskaber, men hvis udtryk i planta ikke er muligt, brug af rekombinante proteiner udgør helt bestemt et værdifuldt alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Det arbejde, der fører til denne publikation har modtaget støtte fra Marie Curie COFUND program "U-mobilitet", medfinansieret af University of Malaga og Den Europæiske Union 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) under GA nr. 246.550. Arbejdet i vores laboratorium er støttet af tilskud fra NIH, USDA / NIFA, NSF, Bard, og BSF til VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
