Summary
Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.
Abstract
La voie ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines a émergé comme l'un des mécanismes les plus importants pour la régulation d'un large éventail de fonctions cellulaires dans pratiquement tous les organismes eucaryotes. Plus précisément, dans les plantes, le système de protéasome ubiquitin/26S (UPS) régule la dégradation des protéines et contribue de manière significative au développement d'une large gamme de procédés, y compris la réponse immune, de développement et de la mort cellulaire programmée. En outre, en plus de preuves suggère que de nombreux agents pathogènes des plantes, comme Agrobacterium, exploitent les UPS d'accueil pour une infection efficace, soulignant l'importance de l'UPS dans les interactions plante-pathogène.
La spécificité de substrat de l'onduleur est obtenue par l'ubiquitine-ligase E3 qui agit de concert avec le E1 et E2 ligases de reconnaître et de marquer les molécules de protéines spécifiques destinés à la dégradation par la fixation sur les chaînes de molécules d'ubiquitine. Une classe des ligases E3 est l'EFC (Skp1 / Cprotéine Ullin / F-box) complexe, qui reconnaît spécifiquement les substrats UPS et les objectifs pour l'ubiquitination via son composant de la protéine F-box. Pour étudier le rôle potentiel de l'UPS dans un processus biologique d'intérêt, il est important de mettre au point un test simple et fiable pour la dégradation des protéines UPS médiation. Ici, nous décrivons un tel dosage en utilisant un système sans cellule végétale. Ce test peut être adapté pour des études sur les rôles des réglementée dégradation des protéines dans divers processus cellulaires, avec un accent particulier sur les F-box interactions protéine-substrat.
Introduction
Le protéasome ubiquitin/26S est en train de devenir un mécanisme généralisé pour le contrôle de diverses réactions biologiques, y compris la régulation transcriptionnelle, la progression du cycle cellulaire et la transduction du signal, le récepteur régulation à la baisse ou l'endocytose, entre autres procédés 1-4. Dans cette voie, la protéine cible est marquée par ubiquitine résidus qui sont d'abord fixés par l'intermédiaire d'une liaison thiolester d'enzyme ubiquitine-activation E1 et ensuite transporté vers un résidu d'acide aminé cystéine de l'ubiquitine-enzyme de conjugaison E2, enfin, E2 interagit avec l'ubiquitine ligase E3 , entraînant une polyubiquitination du substrat protéique. En fin de compte, les protéines polyubiquitinées sont reconnues et dégradées par le protéasome 26S. Dans ce mécanisme, l'enzyme E3 spécifie le substrat et agit en tant que composant clé de régulation du système de protéasome ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 peuvent agir indépendamment, comme ligases de domaine RING, ou dans le cadre d'un SCF unités multiples (S) complexe protéique kp1/Cullin/F-box, tels que F-box ligases de domaine. SCF-médiation voies de dégradation par le protéasome sont impliquées dans la régulation de la transcription, le cycle cellulaire, la transduction du signal 5-10 et bien d'autres fonctions cellulaires majeurs.
Outre ces rôles essentiels dans la régulation des processus cellulaires, UPS prend l'étape centrale dans de nombreuses interactions plante-pathogène. Par exemple, en plus de preuves suggère que plusieurs agents pathogènes des plantes, y compris Agrobacterium tumefaciens, s'appuient sur les UPS d'accueil pour faciliter le processus d'infection 11. Agrobacterium provoque des tumeurs néoplasiques sur les plantes, qui représentent ses hôtes naturels, et il peut également transformer une large gamme d'autres eucaryotes, les champignons de 1,2 à 12,13 cellules humaines. Au cours de son infection, Agrobacterium exporte un élément d'ADN (ADN-T) et de plusieurs protéines de virulence (vir) dans la cellule hôte de 12 à 13. Une de ces protéines est VirF, la première protéine F-box trouvéêtre codée par un génome de procaryote 14. Dans le cadre du complexe SCF ubiquitine ligase, VirF, et son homologue de l'hôte fonctionnel VBF 15, faciliter l'infection par Agrobacterium via la dégradation des protéines UPS médiée, ce qui facilite probablement la décapsidation de l'ADN-T des bactéries envahissent de ses protéines bactériennes et d'accueil d'accompagnement, VirE2 et VIP1, respectivement 16,17. Fait intéressant, de nombreuses protéines F-box, y compris VirF, sont intrinsèquement instables en raison de leur propre protéolyse, qui est médiée par l'activité de autoubiquitination 18,19 ou par d'autres ligases E3 pour lesquels les protéines F-box peuvent servir de substrats de 20 à 23.
Lorsque l'on étudie l'activité biochimique des protéines F-box, d'autres ligases ubiquitine, et / ou leurs substrats, il serait très utile d'utiliser un test simple et fiable pour la dégradation par le protéasome. Nous décrivons ici un tel protocole pour l'analyse de la stabilité de la protéine dans une celluleSans système. Dans cet essai, la stabilité du substrat UPS est analysée en présence ou en l'absence de l'un des composants essentiels de la voie de dégradation par le protéasome, comme une protéine F-box, dans un système acellulaire. En règle générale, on exprime la protéine (s) testé dans les tissus végétaux, de préparer des extraits acellulaires à partir de ces tissus et de contrôler les quantités de la protéine (s) d'intérêt par western blot. Le mécanisme de l'onduleur dépendant de la dégradation des protéines est mise en évidence par l'inclusion d'inhibiteurs de protéasome spécifiques et / ou en utilisant la co-expression de la forme négative dominante d'un composant d'SCF, Cullin. Alors que nous illustrons ce dosage en utilisant la dégradation par le protéasome de la protéine Arabidopsis VIP1 17 par la protéine F-box VBF 15, elle peut être utilisée pour étudier la stabilité de tous les autres substrats du protéasome.
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Protocol
Une. L'expression des protéines
- Choix du système d'expression
Sélectionnez le système, c'est à dire, des vecteurs et la méthode de délivrance de vecteur, le mieux adapté pour l'expression de la protéine d'intérêt dans l'organisme modèle / cellule spécifique. A noter que notre dosage nécessite l'expression des protéines testées dans des quantités facilement détectables, ce qui est mieux réalisée par transformation transitoire de grands nombres de cellules. Chez les plantes, par exemple, cela est le mieux réalisée en utilisant des plasmides binaires en tant que vecteurs d'expression et Agrobacterium comme système de délivrance. - Construction de vecteurs d'expression binaires,
Cloner la séquence (s) codante de la protéine (s) d'intérêt dans un vecteur d'expression, seul ou en fusion traductionnelle d'une étiquette d'épitope. Utilisation des vecteurs appropriés pour le système d'expression choisi et les procédures standard de biologie moléculaire pour le clonage de gène. Pour la livraison de gène au moyen d'Agrobacterium, employer des vecteurs binaires et leur présenter, en utilisant également standard protocoles, dans une souche d'Agrobacterium, tels que EHA105, pour l'inoculation ultérieure de tissus végétaux. - Choix des espèces végétales
Sélectionner les espèces de plantes dans lesquelles la protéine (s) d'intérêt est exprimé. Notez que, bien que toutes les espèces de plantes sensibles à la transformation génétique par Agrobacterium peuvent être utilisées, les espèces de plantes de choix est Nicotiana benthamiana, qui est facile à cultiver, très sensibles à Agrobacterium, et a de grandes feuilles qui sont facilement inoculées. - La croissance des plantes
Cultiver une plante pour 4 à 6 semaines dans une casserole avec le Pro-Mix BX dans un pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) dans des conditions respectueuses de l'environnement contrôlé (par exemple, la chambre de croissance) de journée (soit 16 h de 130 -150 uE m-2 s-1 lumière à 23 ° C et 8 h d'obscurité à 20 ° C) et 40-65% d'humidité relative.
1.5.2 Fertiliser parfois avec des produits disponibles dans le commerce par les instructions du fabricant. Une fois que la plante est cultivée, sélectionnezfeuilles avec la taille de 50 mm x 70 mm ou plus (ces mesures de longueur ne comprennent pas le pétiole) pour inoculation d'Agrobacterium. - Inoculation avec Agrobacterium
Cultiver la souche d'Agrobacterium hébergeant la construction binaire exprimant la protéine (s) testé à l'étape 1.3 pendant une nuit à 28 ° C dans du milieu YEP (1% de peptone, 1% d'extrait de levure et 0,5% de NaCl) supplémenté avec des antibiotiques appropriés (par exemple, 100 mg / L de streptomycine et 10 mg / L de rifampicine pour les vecteurs à base de pPZP-RSC2 24-25).
1.6.2 centrifuger les cellules, remises en suspension à DO 600 = 0,5 dans un tampon d'infiltration [10 mM de MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 uM acétosyringone], et incuber pendant 2 h à température ambiante. Infiltrer la culture dans la face abaxiale des feuilles, en utilisant une seringue sans aiguille 1 mL; noter que les feuilles sont inoculés in situ, tout en est fixée à la plante.
1.6.3 Après infiltration, cultiver la plante pendant 72 h sous le régime de lumière de 16 h 130-150 et# 181; E m-2 s-1 lumière à 23 ° C / 8 heures d'obscurité à 20 ° C avant la récolte. - Application des inhibiteurs de protéasome
Pour soutenir l'idée que la protéine (s) testé est dégradée par une voie du protéasome, utiliser des inhibiteurs de protéasome spécifiques MG132 et lactacystine 28-29, ce qui devrait réduire ou même bloquer la dégradation. Quatre heures avant la récolte (voir l'étape 2.1), infiltrer les surfaces foliaires Agrobacterium inoculés avec 10 uM MG132 (Merck Millipore) ou 10 uM lactacystine (Sigma-Aldrich) ou une maquette de traiter la feuille avec les solvants respectifs, soit 0,1% de DMSO ou de l'eau distillée.
2. Préparation d'extraits acellulaires
- Récolte des feuilles
Récolter les zones de la feuille inoculée, habituellement ca. 200-400 mg de poids frais, et les moudre en poudre fine dans de l'azote liquide. Sinon, perles battre les tissus, en utilisant n'importe quel cordon-batteur (par exemple, Biospec) ou un amalgamateur dentaire (par exemple, PTC avancée Technologies) directement dans la mémoire tampon de dégradation (voir l'étape 2.2). - L'extraction des protéines
Préparer un extrait de protéines totales en plaçant le tissu broyé dans 500 ul de tampon de dégradation [50 mM de Tris-HCL (pH 7,5), NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, mM adénosine 5-5'-triphosphate, et un inhibiteur de protéase 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. A noter que le cocktail d'inhibiteurs de protease affecte principalement la sérine, la cystéine, aspartique, et de métalloprotéases et n'interfère pas avec la protéase 26S. Clarifier l'extrait par deux centrifugations successives à 12000 g pendant 5 min. - réaction de dégradation de la protéine
Transférer des volumes égaux d'extraits, généralement de 20 ul, à des tubes de microcentrifugation et incuber à température ambiante pendant des périodes de temps de plus en plus. Typiquement, le temps de l'échantillon zéro, et 5, 10, 15, 20, et 30 points dans le temps min. Arrêtez réactions faisant bouillir dans un tampon de gel échantillon SDS, et de les analyser par western blot.
- L'électrophorèse sur gel
3.1.1 résoudre les échantillons de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et électrotransfert des protéines résolues à une membrane de nitrocellulose selon le protocole standard de 30.
3.1.2 Déterminer la concentration en protéine en utilisant la méthode de Bradford (Bio-Rad), et la charge de 50 à 80 ug de protéine totale par voie de circulation. Assurez-vous que tous les échantillons sont chargés aussi. Pour les commandes de chargement, comparer les intensités d'une espèce de protéine ubiquitaire, comme putatif Rubisco grandes chaînes qui migrent comme un groupe majeur avec une mobilité électrophorétique relative de l'ordre de 50 kDa, ils peuvent être détectés sur Coomassie gels colorées en bleu ou sur Ponceau S-ou fluorescent SYPRO Ruby teinté membranes de nitrocellulose. - Blocage
Bloquer la membrane avec 5% de lait écrémé dans du TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) pendant 1 h à température ambiante. L'anticorps primaire
Diluer l'anticorps anti-épitope primaire dans 1% de lait écrémé dans du TBST à la concentration recommandée par le fabricant et incuber avec la membrane bloquée pendant 1 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. - Rinçage
Rincer la membrane est rincée dans 20 ml de TBST pendant 15 min une fois, et deux fois pendant 5 min à température ambiante avec agitation douce. - Anticorps secondaire
Diluer l'anticorps secondaire (par exemple, anti-IgG de lapin) conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP) dans 1% de lait écrémé dans du TBST tel que recommandé par le fabricant et incuber avec la membrane pendant 1 h à température ambiante avec agitation douce. - Détection
Rincer à nouveau la membrane, comme décrit à l'étape 3.4. Après le dernier rinçage dans du TBST, de visualiser les protéines d'intérêt avec un substrat chimioluminescent HRP, le plus souvent en utilisant un kit ECL.
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Representative Results
Figure 1, adapté de Zaltsman et al. 17, illustre expériences représentatives pour la détection de la dégradation par le protéasome dans un système acellulaire. Plus précisément, nous démontrons la déstabilisation d'une usine liées à la défense protéine VIP1 par VBF protéine F-box par la voie SCF VBF en N. benthamiana. Arabidopsis VBF et protéines HA-marqués VIP1 (HA-VIP1) ont été transitoirement co-exprimées, et HA-VIP1 la teneur en protéines dans les extraits de feuilles exprimant ont été analysés par western blot. Cette analyse a démontré que les montants de VIP1 ont été réduits de façon significative quand coexprimé avec VBF, mais est resté relativement stable en l'absence de co-expression VBF (figure 1A). Notez qu'une légère diminution de la teneur en VIP1 sans VBF peut être dû au faible niveau de l'activité de VBF tabac endogène. Le mécanisme de dégradation par le protéasome de VIP1 déstabilisation par VBF a été déduit de son inhibition par MG132 (figure 1A). La quantification des résultats de la figure 1A montre presque complète (≥ 90% ± 5) par VBF VIP1, qui a été bloqué par MG132 (figure 1B). Notez que légèrement plus élevés niveaux de VIP1 en présence de MG132 probablement sont expliqués par l'inhibition de l'activité de VBF endogène 17.
Figure 1. VBF favorise la dégradation par le protéasome de VIP1. HA-VIP1 a été exprimée seule ou avec coexprimé VBF en N. benthamiana laisse. Les extraits protéiques obtenus ont été incubées pendant des périodes de temps indiqués et analysés par Western blot en utilisant des anticorps anti-HA. Le putatif grande chaîne RuBisCo a été utilisé comme contrôle de chargement (A). Quantified signal de transfert de Western a été exprimée en pour cent du signal obtenu en l'absence de VBF au début de la période d'incubation. Les données représentent des valeurs moyennes de trois expériences indépendantes avec des écarts types indiqués (B). Ce chiffre a été adapté à partir Zaltsman et al. 17
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Discussion
Ce test repose sur l'expression des protéines testées dans les tissus végétaux, ainsi, le processus potentiel de dégradation par le protéasome se produit évidemment déjà à l'intérieur des tissus vivants. Nous dosage protéine déstabilisation, cependant, que dans les extraits, avec le temps zéro échantillon servant de point de référence initial. Par conséquent, nous définissons comme un essai acellulaire.
Un aspect important pour la réussite de cet essai est le choix correct du vecteur d'expression à partir duquel la protéine (s) testé sera produit. Sauf anticorps spécifiques dirigés contre la protéine testée sont disponibles, il devrait être épitope marqués pour la détection par Western blot. La protéine marquée doit être exprimée à partir d'un vecteur binaire Agrobacterium. Alors que beaucoup de ces vecteurs sont disponibles 26, nous vous conseillons d'utiliser des vecteurs dérivés de notre système modulaire de plasmide SPAT 24, qui permet l'insertion d'une étape de cassettes d'expression dans les plasmides binaires pPZP-RCS224-25. Un autre avantage du système SPAT est qu'elle permet l'expression de plusieurs gènes à partir du même vecteur 25, ce qui est particulièrement utile pour des expériences de dosage de plusieurs substrats de protéasome ou pour étudier les effets des interacteurs du substrat testé, par exemple la co-expression de l'Agrobacterium VirD5 protéine qui interagit avec les résultats du protéasome substrat dans la protection VirF de dégradation par le protéasome 22. Surtout, la série de la SPAT expansion de vecteur comprend déjà des vecteurs pour épitope marquage 27. Indépendamment de la stratégie de clonage choisi, la séquence codant pour la protéine à marquage épitopique d'intérêt doit être introduit dans un vecteur binaire pour l'expression ultérieure dans les tissus végétaux. Étant donné que ce dosage utilise une expression transitoire, le vecteur binaire n'a pas à contenir des marqueurs de sélection pour la transformation stable, bien que leur présence ne nuise pas à l'efficacité du test.
Bien que la co-expression de plusieurs protéines d'intérêt est mieux réalisée en utilisant des vecteurs d'expression de multigènes, il peut également être effectuée en combinant des volumes équivalents de cultures liquides de deux ou trois souches d'Agrobacterium, dont chacun porte une construction binaire séparée.
Un autre point essentiel est que, dans de nombreux cas, le dosage de dégradation par le protéasome implique non seulement l'expression du substrat par le protéasome, mais également d'un composant de la voie SCF. Par exemple, l'objectif expérimental pourrait être de vérifier si une protéine F-box reconnaît et cibles pour la dégradation d'un substrat spécifique. Dans ce cas, ce substrat à marquage épitopique doit être co-exprimé avec la protéine F-box non marqué.
Pour une analyse plus détaillée des données, la mesure de la dégradation des protéines peut être facilement quantifiée par la mesure de l'intensité relative des signaux occidentaux uchanter la dernière version du logiciel ImageJ (NIH) 31. Lors de cette quantification, il est important de ne pas trop développer les transferts de western pour éviter la saturation du signal. quantification des données exige également que tous les échantillons sont chargés sur le gel de SDS-polyacrylamide également en ce qui concerne leur teneur en protéines comme la dégradation des protéines dans cet essai est détecté par réduction de l'intensité de la bande de protéine appropriée. Ce résultat est obtenu par la détermination de la teneur en protéines de chaque extrait cellulaire et par la vérification ultérieure de l'égalité de chargement de chaque voie (voir étape 3.1). En outre, dans une expérience du temps bien sûr donné, tous les échantillons doivent être obtenus à partir du même lot d'extrait contribue à assurer l'égalité de chargement.
L'analyse acellulaire pour la dégradation par le protéasome décrit ici utilise des plantes en tant que système expérimental. Cependant, le même protocole expérimental peut être utilisé pour tout autre organisme. Le test peut également être étendu par Further en se concentrant sur la voie SCF. Par exemple, le mécanisme de SCF-dépendante de la dégradation des protéines peut être démontrée à l'aide d'une forme dominante négative de la composante CULLIN1 SCF (CUL1 DN). Plus précisément, un mutant d'Arabidopsis CUL1 avec des résidus d'acides aminés supprimés entre les positions 1 et 420 a été montré pour interagir avec le composant Skp1/ASK1 du complexe SCF, mais pas avec RBX1, qui représente le noyau catalytique de CSAH 22. Inhibition ou la réduction de la dégradation de substrat suivant la co-expression de CUL1 DN indique implication de la voie SCF.
Notre analyse utilise des protéines d'intérêt exprimés dans les tissus végétaux, dans leur environnement naturel. Une alternative à cette approche est de purifier les protéines recombinantes, les ajouter à planter des extraits, et de suivre leur dégradation par l'analyse de l'Ouest 32. Nous ne recommandons pas cette tactique comme méthode de choix parce que les protéines recombinantes ne pas ALWAYs reflète fidèlement les propriétés biologiques indigènes, mais si l'expression in planta n'est pas possible, l'utilisation de protéines recombinantes représente certainement une alternative intéressante.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les travaux menant à cette publication a bénéficié d'un financement du programme Marie Curie COFUND "U-Mobilité», cofinancé par l'Université de Malaga et le programme de l'Union européenne 7 e programme-cadre (FP7/2007-2013) sous AG n ° 246550. Le travail dans notre laboratoire est financé par des subventions des NIH, l'USDA / NIFA, NSF, BARD, et BSF à VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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