Summary
Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.
Abstract
Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen.
Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.
Introduction
Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet 1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich werden die polyubiquitiniert Proteine durch das 26S-Proteasom erkannt und abgebaut. Bei diesem Mechanismus, der E3-Enzym spezifiziert das Substrat und fungiert als regulatorische Schlüsselkomponente des Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS). E3-Ligasen können unabhängig wie RING-Domäne-Ligasen, oder als Teil eines Multiunter SCF (S handeln,kp1/Cullin/F-box Protein)-Komplex, wie F-Box-Domäne-Ligasen. SCF-vermittelten proteasomalen Abbauwege sind in die Regulation der Transkription, Zellzyklus, Signaltransduktion 5-10 und vielen anderen wichtigen Zellfunktionen beteiligt.
Neben diesen kritischen Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen, UPS nimmt die zentrale Bühne in vielen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Zum Beispiel zunehmende Hinweise darauf, dass verschiedene Pflanzenkrankheitserreger, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, verlassen sich auf die Host-USV für die Infektionsprozess 11 zu erleichtern. Agrobacterium entlockt neoplastischen Wucherungen an Pflanzen, die ihren natürlichen Wirten repräsentieren, und es kann auch verwandeln eine breite Palette von anderen Eukaryoten aus Pilzen 1,2 auf menschliche Zellen 12,13. Während der Infektion, Agrobacterium exportiert eine DNA-Element (T-DNA) und mehrere Virulenz (Vir)-Proteine in die Wirtszelle 12-13. Eines dieser Proteine ist VirF die erste F-Box-Protein gefundenvon einem prokaryotischen Genom 14 codiert werden. Im Rahmen der SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplex, VirF, und seine funktionellen Homolog Host VBF 15, erleichtern Agrobacterium-Infektion über die USV-vermittelten Proteinabbau, die vermutlich erleichtert Uncoating der bakteriellen Invasion T-DNA aus Bakterien-und der dazugehörigen Wirtsproteine, VirE2 VIP1 und jeweils 16,17. Interessanterweise sind viele F-Box-Proteine, einschließlich VirF, intrinsisch instabil aufgrund ihrer eigenen Proteolyse, die durch autoubiquitination Aktivität 18,19 oder durch andere E3-Ligasen, für das F-Box-Proteine können als Substrate dienen 20-23 vermittelt wird.
Bei der Untersuchung von biochemischen Aktivitäten von F-Box-Proteine, andere Ubiquitin-Ligasen, und / oder ihre Substrate, wäre es sehr nützlich, um einen einfachen und zuverlässigen Test für den proteasomalen Abbau zu verwenden. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll für die Analyse der Proteinstabilität in einer ZelleFreies System. In diesem Assay wird die Stabilität des UPS Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit eines der wesentlichen Bestandteile des proteasomalen Abbau-Weges, wie ein F-Box-Protein, in einem zellfreien System untersucht. Generell sprechen wir die getestet Protein (e) in Pflanzengeweben, bereiten zellfreien Extrakten aus diesen Geweben und überwachen die Mengen des Proteins (e) von Interesse durch Western-Blot. Die USV-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus wird durch die Aufnahme von spezifischen Proteasom-Inhibitoren und / oder mit Koexpression von dominant-negative Form eines SCF-Komponente Cullin demonstriert. Während wir veranschaulichen diesen Test unter Verwendung proteasomalen Abbau des Arabidopsis VIP1 17 Protein durch die F-Box-Protein VBF 15, kann es verwendet werden, um die Stabilität der anderen proteasomalen Substraten zu untersuchen.
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Protocol
1. Die Proteinexpression
- Wahl des Expressionssystems
System auswählen, das heißt, Vektoren und Vektorfreisetzungsverfahren am besten geeignet für die Expression des Proteins von Interesse in der spezifischen Modellorganismus / Zelle. Beachten Sie, dass unser Assay erfordert die Expression der untersuchten Proteine in leicht nachweisbaren Mengen, die am besten durch eine transiente Transformation einer großen Anzahl von Zellen erreicht wird. In Pflanzen, zum Beispiel, ist diese mit binären Plasmide als Expressionsvektoren und Agrobacterium als Abgabesystem am besten erreicht. - Bau von binären Expressionsvektoren
Klonierung der kodierenden Sequenz (en) des Proteins (e) von Interesse in einen Expressionsvektor entweder allein oder in translationale Fusion an ein Epitop-Tag. Verwenden Vektoren passend zum gewählten Expressionssystem und molekularbiologischen Standardverfahren für die Gen-Klonen. Für Agrobacterium-vermittelten Gentransfer beschäftigen binäre Vektoren und führen sie, auch mit Standard Protokolle in einen Agrobacterium-Stamm EHA 105, wie für die nachfolgende Inokulation von Pflanzengeweben. - Auswahl der Pflanzenarten
Aus den Pflanzen in dem das Protein (e) von Interesse exprimiert wird. Beachten Sie, dass, während alle Pflanzenarten anfällig für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation verwendet werden kann, unser Pflanzenarten der Wahl ist Nicotiana benthamiana, die leicht gewachsen ist, sehr anfällig für Agrobacterium und hat große Blätter, die leicht eingeimpft werden. - Das Pflanzenwachstum
Wachsen einer Pflanze für 4 bis 6 Wochen in einem Topf mit Pro-Mix BX in einem Topf (20 cm x 20 cm x 20 cm) unter umweltkontrollierten Bedingungen (z. B. Wachstumskammer) des langen Tag (dh 16 h von 130 uE -150 m-2 s-1 Licht bei 23 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C) und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit.
1.5.2 Düngung gelegentlich mit handelsüblichen Produkten pro Herstellers. Sobald die Pflanze angebaut wird, wählen SieBlätter mit der Größe von 50 mm x 70 mm oder größer (diese Längenmessungen beinhalten nicht die Blattstiel), Agrobacterium Impfung. - Inokulation mit Agrobacterium
Wachsen Agrobacterium-Stamm, der das binäre Konstrukt getestet Protein (e) von Schritt 1.3 über Nacht bei 28 º C in YEP-Medium (1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl) mit geeigneten Antibiotika (z. B. 100 mg ergänzt exprimieren / l Streptomycin und 10 mg / l Rifampicin pPZP-RSC2-basierte Vektoren 24-25).
1.6.2 Zentrifugation der Zellen, resuspendiert in Puffer Infiltration OD 600 = 0,5 [10 mM MgCl 2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 &mgr; M Acetosyringon] und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Infiltrieren die Kultur in der unterseits von einem Blatt, mit einer 1 ml-Spritze ohne Nadel, beachten Sie, dass die Blätter in situ angeimpft, während der Pflanze verbunden ist.
1.6.3 Nach der Infiltration, wachsen die Anlage für 72 h unter dem Lichtregime von 16 h 130-150 &Nr. 181, E m-2 s-1 Licht bei 23 ° C / 8 h Dunkelheit bei 20 ° C vor der Ernte. - Die Anwendung der proteasomalen Inhibitoren
Um die Vorstellung, dass die getesteten Protein (e) über einen Proteasom-Weg abgebaut unterstützt, verwenden spezifische Proteasom-Inhibitoren MG132 und Lactacystin 28-29, die reduzieren oder sogar blockieren Abbau sollte. Vier Stunden vor der Ernte (siehe Schritt 2.1), infiltrieren die Agrobacterium geimpften Blattflächen mit 10 uM MG132 (EMD Millipore) oder 10 uM Lactacystin (Sigma-Aldrich) oder Modelle behandeln das Blatt mit den jeweiligen Lösemittel, dh 0,1% DMSO oder destilliertes Wasser.
2. Herstellung von zellfreien Extrakten
- Blatternte
Ernte der inokulierten Bereichen des Blattes, üblicherweise ca. 200-400 mg Frischgewicht, und schleifen sie in ein feines Pulver in flüssigem Stickstoff. Alternativ schlagen die Wulst-Gewebe, mit jeder Wulst-Schläger (zB Biospec) oder eine Zahn amalgamator (zB TPC Erweiterte Technologies) direkt in der Abbaupuffer (siehe Schritt 2.2). - Proteinextraktion
Vorbereitung Gesamtproteinextrakt durch Anordnen des Grundgewebes in 500 ul Puffer Abbau [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 5 mM Adenosin-5'-Triphosphat, und 1x Protease-Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Beachten Sie, dass der Protease-Inhibitor-Cocktail betrifft hauptsächlich Serin, Cystein, Asparaginsäure, und Metalloproteasen und nicht mit dem 26S-Protease beeinträchtigen. Der Extrakt wird durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 12.000 × g für 5 min. - Protein-Abbaureaktion
Übertragen gleichen Volumina Extrakte, normalerweise 20 &mgr; l, um Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur zur Erhöhung Zeiträume. Typischerweise Probe zum Zeitpunkt Null und 5, 10, 15, 20 und 30 min Zeitpunkten. Stopp-Reaktionen durch Kochen in SDS-Gel-Probenpuffer, und analysieren sie durch Western-Blot.
- Gel-Elektrophorese
3.1.1 Auflösen von Proteinproben durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Elektrotransfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran nach dem Standardprotokoll 30.
3.1.2 Bestimmen der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode (Bio-Rad), und laden 50-80 ug Gesamtprotein pro Spur. Stellen Sie sicher, dass alle Proben gleich geladen. Zum Laden steuert, zu vergleichen, Intensitäten einer ubiquitäres Protein-Arten, wie putative RuBisCo großen Ketten, die als eine Hauptbande mit einer relativen elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 50 kDa wandern, sie können auf Coomassie-Blau-gefärbten Gelen oder Ponceau S-oder erfasst werden Fluoreszenz SYPRO Rubin-gefärbten Nitrozellulosemembranen. - Blockierung
Blockieren der Membran mit 5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. Primärer Antikörper
Verdünnte primäre anti-Epitop-Antikörpers in 1% Magermilch in TBST auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration und Inkubation mit dem blockierten Membran für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 º C unter leichtem Schütteln. - Spülung
Spülen der Membran in 20 ml TBST für 15 Minuten wieder abgespült und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. - Sekundäre Antikörper
Verdünnte sekundäre Antikörper (zB Anti-Kaninchen-IgG) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 1% Magermilch in TBST konjugiert, wie vom Hersteller empfohlen, und Inkubation mit der Membran für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. - Entdeckung
Spülen der Membran wieder wie in Schritt 3.4 beschrieben. Nach dem letzten Spülvorgang in TBST, Visualisierung der Proteine von Interesse mit einem HRP chemilumineszierendes Substrat, meist unter Verwendung eines ECL-Kits.
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Representative Results
Fig. 1, von Zaltsman et al. 17 angepasst, veranschaulicht repräsentative Experimente zum Nachweis von proteasomalen Abbau in einem zellfreien System. Insbesondere zeigen wir, Destabilisierung einer Anlage Verteidigungs Protein VIP1 von der VBF F-Box-Protein über den SCF VBF Weg in N. benthamiana. Arabidopsis VBF-und HA-markierten VIP1 (HA-VIP1)-Proteine wurden transient koexprimiert und HA-Protein innerhalb VIP1 Inhalt Extrakte der Blätter zum Ausdruck wurde durch Western Blotting analysiert. Diese Analyse zeigte, dass VIP1 Mengen wurden in einem signifikanten Ausmaß reduziert, wenn koexprimiert mit VBF, blieb aber in Abwesenheit von VBF Coexpression (1A) relativ stabil. Beachten Sie, dass ein leichter Rückgang in der VIP1 Inhalte ohne VBF kann aufgrund der niedrigen Niveau der endogenen Tabak VBF Tätigkeit sein. Die proteasomalen Abbaumechanismus von VIP1 Destabilisierung durch VBF wurde von seinem i abgeleitetnhibition von MG132 (Fig. 1A). Quantifizierung der Ergebnisse in Fig. 1A gezeigt, fast vollständig (≥ 90 ± 5%) von VBF VIP1, die von MG132 (1B) blockiert wurde. Beachten Sie, dass etwas höhere VIP1 in Gegenwart von MG132 wahrscheinlich durch Hemmung der endogenen Aktivität VBF 17 erläutert.
Abbildung 1. VBF fördert proteasomalen Abbau von VIP1. HA-VIP1 allein ausgedrückt oder mit VBF coexprimierten in N. benthamiana Blätter. Die resultierenden Proteinextrakte wurden für die angegebenen Zeiträume inkubiert, und durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-HA-Antikörper analysiert. Die mutmaßliche RuBisCo große Kette wurde als Ladekontrolle (A) verwendet. Quantified Western-Blot-Signal wurde als Prozentsatz der in Abwesenheit von VBF zu Beginn der Inkubationszeit erhaltene Signal ausgedrückt. Die Daten stellen Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten mit Standardabweichungen angegeben (B). Diese Zahl wurde von Zaltsman et al. 17 angepasst
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Discussion
Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays.
Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es sei denn, spezifische Antikörper gegen das Protein getestet sind, sollte es epitopmarkierter zum Nachweis durch Western-Blot werden. Das markierte Protein sollte von einem Agrobacterium binären Vektor ausgedrückt werden. Während viele solcher Vektoren sind 26, empfehlen wir die Verwendung von Vektoren aus unserem modularen pSAT Plasmid-System 24, die Ein-Schritt-Insertion von Expressionskassetten in den pPZP-RCS2 binären Plasmide können abgeleitet24-25. Ein weiterer Vorteil der pSAT System ist, dass es die Expression von mehreren Genen aus dem gleichen Vektor 25, der besonders nützlich für Versuche, mehrere proteasomalen Substraten zu untersuchen oder um die Wirkungen von Interaktoren des getesteten Substrats zu untersuchen ist, beispielsweise Co-Expression des Agrobacterium VirD5 Protein, das mit der proteasomalen Substrat VirF Ergebnisse in VirF Schutz vor Abbau im Proteasom 22 interagiert. Wichtig ist, dass das expandierende pSAT Reihe von Vektor enthält bereits Vektoren für Epitop-Tagging-27. Unabhängig von der gewählten Klonierungsstrategie, sollte die Sequenz, die das Epitop-markierte Protein von Interesse kodiert, in einen binären Vektor für die anschließende Expression in Pflanzengewebe eingeführt werden. Da dieser Assay verwendet transiente Expression, wird der binäre Vektor nicht Selektionsmarker zur stabilen Transformation enthalten, obwohl ihre Anwesenheit ist nicht schädlich für den Assay Effizienz.
Obwohl Coexpression von mehreren Proteine von Interesse wird am besten mit Multigen-Expressionsvektoren erreicht, kann es auch durch die Kombination von äquivalenten Mengen von Flüssigkulturen von zwei oder drei Agrobacterium-Stämmen, von denen jeder eine separate binäre Konstrukt durchgeführt werden.
Ein weiterer kritischer Punkt ist, dass in vielen Fällen die proteasomalen Abbau Assay beinhaltet nicht nur die Expression des Proteasoms Substrat, sondern auch eine Komponente der SCF-Weg. Zum Beispiel könnte das experimentelle Ziel sein, um zu testen, ob eine F-Box-Protein erkennt und die Ziele für den Abbau ein spezifisches Substrat. In diesem Fall sollte das Epitop-markierte Substrat mit dem unbezeichnet F-Box-Protein co-exprimiert werden.
Für eine detailliertere Analyse der Daten, kann das Ausmaß der Proteinabbau leicht durch Messung der relativen Intensität der westlichen Signale quantifiziert werden usingen die neueste Software ImageJ (NIH) 31. Bei solchen Quantifizierung, ist es wichtig, nicht zu über entwickeln die Western Blots zur Signalsättigung zu vermeiden. Daten Quantifizierung erfordert auch, dass alle Proben auf dem SDS-Polyacrylamid-Gel ebenso in Bezug auf ihren Proteingehalt Proteinabbau in diesem Assay beladen wird durch Reduzierung der Intensität des entsprechenden Proteinbande detektiert. Dies wird durch Bestimmung des Proteingehalts der einzelnen Zellextrakt und anschließender Überprüfung der gleiche Beladung jeder Fahrspur (siehe Schritt 3.1) gelöst. Darüber hinaus in einem bestimmten Zeitverlauf Experiment, alle Proben aus der gleichen Charge Extrakt abgeleitet werden, hilft, gleiche Beladung zu gewährleisten.
Die zellfreien Assay für die hier beschriebenen proteasomalen Abbau verwendet Pflanzen als Versuchssystem. Jedoch könnte die gleiche Versuchsanordnung aus einem anderen Organismus verwendet werden. Der Test kann auch von Furth verlängert werdener die sich auf die SCF-Weg. Zum Beispiel kann die SCF-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus unter Verwendung eines dominant-negativen Form des SCF Komponente Cullin1 (CUL1 DN) nachgewiesen werden. Insbesondere ist eine Mutante von Arabidopsis CUL1 mit gelöschten Aminosäureresten zwischen Positionen 1 und 420 wurde gezeigt, dass mit der Skp1/ASK1 Komponente des SCF-Komplex interagieren, aber nicht mit RBX1, die den katalytischen Kern des SCF 22 darstellt. Hemmung oder Reduktion der Substratabbau folgenden Koexpression CUL1 DN zeigt Einbeziehung der SCF-Weg.
Unser Test verwendet Proteine von Interesse in pflanzlichen Geweben exprimiert wird, in ihrer natürlichen Umgebung. Eine Alternative zu dieser Vorgehensweise ist, um rekombinante Proteine zu reinigen, fügen Sie diese Extrakte zu pflanzen, und folgen ihren Abbau durch Western-Analyse 32. Wir wissen nicht, wie diese Taktik empfehlen Methodik der Wahl, weil rekombinanten Proteine nicht alle Tages getreu die einheimischen biologischen Eigenschaften widerspiegeln, aber wenn Expression in planta nicht möglich ist, die Verwendung von rekombinanten Proteinen sicherlich eine wertvolle Alternative.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit, die zu dieser Veröffentlichung hat die Finanzierung aus dem Marie-Curie-Programm COFUND "U-Mobility", die von der Universität von Malaga und der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter GA Nr. 246550 kofinanziert erhalten. Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, und BSF VC unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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