Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Zusammenfassung

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Zusammenfassung

Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen.

Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.

Einleitung

Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet ^1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich....

Protokoll

1. Die Proteinexpression

1. Wahl des Expressionssystems
   System auswählen, das heißt, Vektoren und Vektorfreisetzungsverfahren am besten geeignet für die Expression des Proteins von Interesse in der spezifischen Modellorganismus / Zelle. Beachten Sie, dass unser Assay erfordert die Expression der untersuchten Proteine ​​in leicht nachweisbaren Mengen, die am besten durch eine transiente Transformation einer großen Anzahl von Zellen erreicht wird. In Pflanzen, zum Beispiel, ist diese mit binären Plasmide als Expressionsvektoren und Agrobacterium als Abgabesystem am besten erreicht.
2. Bau von binären Expressionsvektoren

Ergebnisse

Fig. 1, von Zaltsman et al. ¹⁷ angepasst, veranschaulicht repräsentative Experimente zum Nachweis von proteasomalen Abbau in einem zellfreien System. Insbesondere zeigen wir, Destabilisierung einer Anlage Verteidigungs Protein VIP1 von der VBF F-Box-Protein über den SCF ^VBF Weg in N. benthamiana. Arabidopsis VBF-und HA-markierten VIP1 (HA-VIP1)-Proteine ​​wurden transient koexprimiert und HA-Protein innerhalb VIP1 Inhalt Extrakte der Blätter zum Ausdruck .......

Diskussion

Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine ​​in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays.

Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es sei .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protein-Assay-Kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase-Inhibitor-Cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean-System	Bio-Rad	165-8000
Halbtrockenes Western-Blotting-SD-Elektrotransfersystem	Bio-Rad	170-3940
Affinitätsgereinigtes Kaninchen Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT Nitrozellulose-Transfermembran	Pall Corporation	27377-000
Immobilon westliches chemilumineszierendes HRP-Substrat	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrat	Pierce	35055