Summary
लक्षित प्रोटीन गिरावट सेल समारोह के लिए एक प्रमुख नियामक तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है. यह तो 26S एंटीबॉडी के लिए के रूप में आणविक "टैग" की सेवा है कि लक्ष्य प्रोटीन को polyubiquitin चेन देता है जो एक संरक्षित ubiquitin-एंटीबॉडी मार्ग, के माध्यम से होता है. यहाँ, हम प्रोटीन की proteasomal गिरावट के लिए एक सरल और विश्वसनीय सेल मुक्त परख का वर्णन.
Abstract
प्रोटीन गिरावट के लिए ubiquitin-एंटीबॉडी मार्ग लगभग सभी यूकेरियोटिक जीवों में सेलुलर कार्यों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के नियमन के लिए सबसे महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में उभरा है. विशेष रूप से, पौधों में, ubiquitin/26S एंटीबॉडी प्रणाली (यूपीएस) प्रोटीन गिरावट को नियंत्रित करता है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, विकास और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु सहित प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास में महत्वपूर्ण योगदान देता है. इसके अलावा, बढ़ती सबूत ऐसे Agrobacterium के रूप में कई संयंत्र रोगजनकों, संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में यूपीएस के महत्व पर बल देते हुए कुशल संक्रमण के लिए मेजबान यूपीएस का फायदा उठाने कि पता चलता है.
यूपीएस के सब्सट्रेट विशिष्टता E1 के साथ मिलकर काम करता है और E2 उन्हें ubiquitin अणुओं की चेन संलग्न द्वारा गिरावट के लिए किस्मत में विशिष्ट प्रोटीन अणुओं की पहचान और चिह्नित करने के लिए ligases कि E3 ubiquitin ligase द्वारा हासिल की है. E3 ligases के एक वर्ग एससीएफ है (Skp1 / सीविशेष रूप से यूपीएस substrates पहचानता है और अपने एफ बॉक्स प्रोटीन घटक के माध्यम ubiquitination के लिए उन्हें जो लक्ष्य Ullin / एफ बॉक्स प्रोटीन) जटिल,. ब्याज की एक जैविक प्रक्रिया में यूपीएस की एक संभावित भूमिका की जांच करने के लिए, यह यूपीएस की मध्यस्थता प्रोटीन गिरावट के लिए एक सरल और विश्वसनीय परख वसीयत करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक संयंत्र सेल मुक्त प्रणाली का उपयोग कर एक ऐसी परख का वर्णन. यह परख एफ बॉक्स प्रोटीन सब्सट्रेट बातचीत पर विशेष ध्यान देने के साथ, विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में विनियमित प्रोटीन गिरावट की भूमिकाओं की पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
ubiquitin/26S एंटीबॉडी मार्ग दूसरों के बीच में transcriptional विनियमन, सेल चक्र प्रगति और संकेत पारगमन, रिसेप्टर नीचे विनियमन या endocytosis, 1-4 प्रक्रियाओं सहित विविध जैविक प्रतिक्रियाओं के नियंत्रण के लिए एक व्यापक तंत्र के रूप में उभर रहा है. इस मार्ग में, लक्ष्य प्रोटीन पहली ubiquitin सक्रिय एंजाइम E1 के लिए एक thiolester बांड के माध्यम से जुड़ा हुआ है और फिर ubiquitin-संयुग्मन एंजाइम E2 की एक सिस्टीन अमीनो एसिड अवशेषों में स्थानांतरित कर रहे हैं जो अवशेष ubiquitin द्वारा चिह्नित है, और अंत में, E2 ubiquitin ligase E3 के साथ सूचना का आदान प्रदान , प्रोटीन सब्सट्रेट के polyubiquitination हो जाती है. अंत में, polyubiquitinated प्रोटीन 26S एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त है और अपमानित कर रहे हैं. इस तंत्र में, E3 एंजाइम सब्सट्रेट निर्दिष्ट करता है और ubiquitin/26S एंटीबॉडी प्रणाली (यूपीएस) के प्रमुख नियामक घटक के रूप में कार्य करता है. E3 ligases ऐसी अंगूठी डोमेन ligases के रूप में, या एक multisubunit एससीएफ (एस के भाग के रूप में, स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकते हैंऐसे एफ बॉक्स डोमेन ligases रूप kp1/Cullin/F-box प्रोटीन) जटिल,. एससीएफ की मध्यस्थता proteasomal गिरावट रास्ते प्रतिलेखन, सेल चक्र, संकेत पारगमन 5-10 और कई अन्य प्रमुख सेलुलर कार्यों के विनियमन में शामिल कर रहे हैं.
सेलुलर प्रक्रियाओं के नियमन में इन महत्वपूर्ण भूमिकाओं के अलावा, यूपीएस कई संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में केंद्रीय स्तर लेता है. उदाहरण के लिए, बढ़ती सबूत Agrobacterium tumefaciens सहित कई संयंत्र रोगजनकों, संक्रमण की प्रक्रिया 11 को सुविधाजनक बनाने के लिए मेजबान यूपीएस पर भरोसा करते हैं कि पता चलता है. Agrobacterium अपनी प्राकृतिक मेजबान का प्रतिनिधित्व करते हैं जो पौधों, पर neoplastic वृद्धि elicits, और यह भी मानव कोशिकाओं 12,13 के लिए कवक 1,2 से, अन्य eukaryotes के एक विस्तृत रेंज में बदल सकते हैं. इसके संक्रमण के दौरान, Agrobacterium मेजबान सेल 12-13 में एक डीएनए तत्व (टी डीएनए) और कई डाह (वीर) प्रोटीन का निर्यात करता है. इन प्रोटीनों की एक VirF, पाया पहला एफ बॉक्स प्रोटीन हैएक प्रोकार्योटिक जीनोम 14 द्वारा इनकोडिंग जा करने के लिए. एससीएफ ubiquitin ligase जटिल, VirF, और अपने कार्य मेजबान Homolog VBF 15 के भाग के रूप में, शायद VirE2, उसके साथ बैक्टीरियल और मेजबान प्रोटीन से हमलावर बैक्टीरियल टी डीएनए के uncoating जो सुविधा यूपीएस की मध्यस्थता प्रोटीन गिरावट, के माध्यम से Agrobacterium संक्रमण की सुविधा और VIP1, क्रमशः 16,17. दिलचस्प है, VirF सहित कई एफ बॉक्स प्रोटीन,, कारण autoubiquitination गतिविधि 18,19 से या एफ बॉक्स प्रोटीन substrates 20-23 के रूप में सेवा कर सकता है जिसके लिए अन्य E3 ligases द्वारा मध्यस्थता है जो अपने खुद के proteolysis, के लिए आंतरिक रूप से अस्थिर कर रहे हैं.
एफ बॉक्स प्रोटीन, अन्य ubiquitin ligases, और / या उनके substrates के जैव रासायनिक गतिविधियों का अध्ययन करते हैं, तो यह proteasomal गिरावट के लिए एक सरल और विश्वसनीय परख रोजगार के लिए बहुत उपयोगी होगा. यहाँ हम एक सेल में प्रोटीन स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए एक तरह के प्रोटोकॉल का वर्णनमुक्त प्रणाली. इस परख में, यूपीएस सब्सट्रेट की स्थिरता एक सेल मुक्त प्रणाली में इस तरह के एक एफ बॉक्स प्रोटीन के रूप में proteasomal गिरावट मार्ग,, आवश्यक घटकों में से एक की उपस्थिति या अनुपस्थिति में विश्लेषण किया है. आम तौर पर, हम इन ऊतकों से सेल मुक्त अर्क तैयार करने और पश्चिमी सोख्ता द्वारा ब्याज की प्रोटीन (ओं) की मात्रा की निगरानी, संयंत्र के ऊतकों में परीक्षण प्रोटीन (ओं) व्यक्त करते हैं. प्रोटीन गिरावट के यूपीएस निर्भर तंत्र विशिष्ट proteasomal inhibitors और / या एक एससीएफ घटक, Cullin के प्रमुख नकारात्मक फॉर्म के Coexpression का उपयोग करने का समावेश द्वारा प्रदर्शन किया है. हम VBF 15 एफ बॉक्स प्रोटीन द्वारा Arabidopsis VIP1 17 प्रोटीन की proteasomal गिरावट का उपयोग इस परख उदाहरण देकर स्पष्ट करना है, जबकि यह किसी भी अन्य proteasomal substrates की स्थिरता की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है.
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Protocol
1. प्रोटीन अभिव्यक्ति
- अभिव्यक्ति प्रणाली का विकल्प
प्रणाली, यानी, वैक्टर और विशिष्ट मॉडल जीव / सेल में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सबसे उपयुक्त वेक्टर वितरण पद्धति का चयन करें. हमारे परख सबसे अच्छा कोशिकाओं की बड़ी संख्या के क्षणिक परिवर्तन द्वारा हासिल की है, जो आसानी से detectible मात्रा में परीक्षण प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है कि ध्यान दें. पौधों में, उदाहरण के लिए, यह सबसे अच्छा वितरण प्रणाली के रूप में अभिव्यक्ति वैक्टर और Agrobacterium के रूप में द्विआधारी plasmids का उपयोग कर पूरा किया है. - बाइनरी अभिव्यक्ति वैक्टर निर्माण
एक मिलान टैग करने के लिए अकेले या translational संलयन में या तो एक अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की प्रोटीन (ओं) की कोडिंग अनुक्रम (ओं) क्लोन. इस्तेमाल की चुनी अभिव्यक्ति प्रणाली और जीन क्लोनिंग के लिए मानक आणविक जीवविज्ञान प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त वैक्टर. Agrobacterium की मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए, standa का उपयोग भी, द्विआधारी वैक्टर रोजगार और उन्हें परिचयसंयंत्र के ऊतकों के बाद टीका के लिए इस तरह के EHA105 के रूप में एक Agrobacterium तनाव,, में रोड प्रोटोकॉल,. - पौधों की प्रजातियों के विकल्प
ब्याज की प्रोटीन (ओं) व्यक्त किया जाएगा जिसमें पौधों की प्रजातियों का चयन करें. Agrobacterium की मध्यस्थता आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील किसी भी पौधों की प्रजातियों का इस्तेमाल किया जा सकता है, ध्यान दें कि, चुनाव के बारे में हमारी प्रजातियों के पौधे आसानी से Agrobacterium को अत्यधिक अतिसंवेदनशील, उगाया जाता है जो निकोटियाना benthamiana, है, और आसानी से टीका कर रहे हैं जो बड़े पत्ते है. - पौधों की वृद्धि
दिन भर के पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित परिस्थितियों (जैसे, विकास कक्ष) 130 (यानी, 16 घंटे के तहत एक बर्तन (20 सेमी x 20 सेमी x 20 सेमी) में समर्थक मिक्स BX साथ एक बर्तन में 4 से 6 सप्ताह के लिए एक संयंत्र विकसित 23 डिग्री सेल्सियस पर -150 μE एम -2 एस -1 प्रकाश और 20 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरे) और 40-65% सापेक्ष आर्द्रता.
कभी - कभी निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के साथ 1.5.2 खाद. संयंत्र उगाया जाता है एक बार, चयनAgrobacterium टीका के लिए 50 X 70 मिमी मिमी या बड़ा के आकार (इन लंबाई माप डंठल शामिल नहीं हैं) के साथ छोड़ देता है. - Agrobacterium के साथ टीका
/ उचित एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, 100 मिलीग्राम के साथ पूरक वाई मध्यम में 28 डिग्री सेल्सियस (1% peptone, 1% खमीर निकालने, और 0.5% NaCl) में रातोंरात कदम 1.3 से परीक्षण किया प्रोटीन (ओं) को व्यक्त द्विआधारी निर्माण शरण Agrobacterium तनाव हो जाना एल स्ट्रेप्टोमाइसिन और pPZP-RSC2 आधारित वैक्टर 24-25) के लिए 10 मिलीग्राम / एल रिफैम्पिसिन.
[10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी एमईएस (पीएच 5.6), 100 माइक्रोन acetosyringone] घुसपैठ बफर में 0.5 = 600 आयुध डिपो, और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते resuspended 1.6.2 अपकेंद्रित्र कोशिकाओं,. एक 1 एमएल needleless सिरिंज का उपयोग कर, एक पत्ती के शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला पक्ष में संस्कृति घुसपैठ; संयंत्र से जुड़ा हुआ है, जबकि पत्तियों, बगल में टीका संभव है.
1.6.3 घुसपैठ के बाद, 16 घंटे 130-150 और प्रकाश व्यवस्था के तहत 72 घंटे के लिए संयंत्र विकसित# 181; में ई एम -2 एस -1 प्रकाश 23 ° कटाई से पहले 20 डिग्री सेल्सियस पर सी / 8 घंटे अंधेरा. - Proteasomal inhibitors के आवेदन
परीक्षण किया प्रोटीन (एस) एक proteasomal मार्ग के माध्यम से अपमानित किया जाता है कि इस धारणा का समर्थन करने के लिए, कम करने या भी गिरावट ब्लॉक करना चाहिए, जो विशिष्ट proteasomal inhibitors MG132 उपयोग और 28-29 lactacystin. चार घंटे (2.1 कदम देखें) कटाई से पहले, 10 माइक्रोन MG132 (ईएमडी Millipore) या 10 माइक्रोन lactacystin (सिग्मा Aldrich) या साथ Agrobacterium-टीका पत्ती क्षेत्रों में घुसपैठ संबंधित विलायकों, यानी 0.1% DMSO के साथ पत्ती नकली इलाज या पानी आसुत.
2. सेल मुक्त अर्क की तैयारी
- पत्ता कटाई
पत्ती का टीका क्षेत्रों, आमतौर पर सीए हार्वेस्ट. 200-400 ताजा वजन के मिलीग्राम, और तरल नाइट्रोजन में ठीक पाउडर में उन्हें पीस. वैकल्पिक रूप से, किसी भी मनका डिब्बा (जैसे, Biospec) या एक दंत मिश्रण करने वाला (जैसे, टीपीसी उन्नत का उपयोग, ऊतकों मनका हराया सीधे गिरावट बफर में टेक्नोलॉजीज) () 2.2 कदम देखें. - प्रोटीन निष्कर्षण
गिरावट बफर के 500 μL में जमीन ऊतक रखकर कुल प्रोटीन निकालने की तैयारी [50mm Tris-एचसीएल (7.5 पीएच), 100 मिमी NaCl, 10 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी डीटीटी, 5 मिमी एडेनोसाइन 5'-triphosphate, और 1x protease अवरोध कॉकटेल (सिग्मा Aldrich)]. Protease अवरोध कॉकटेल मुख्य रूप से सेरीन, सिस्टीन, एसपारटिक, और metalloproteases को प्रभावित करता है और 26S प्रोटीज के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ध्यान दें. 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर दो अनुक्रमिक centrifugations से निकालने स्पष्ट करें. - प्रोटीन गिरावट प्रतिक्रिया
ट्यूब microfuge और समय की अवधि बढ़ाने के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें सेते हैं, अर्क, आमतौर पर 20 μL के बराबर मात्रा में स्थानांतरण. आमतौर पर, नमूना समय शून्य, और 5, 10, 15, 20, और 30 मिनट का समय अंक. एसडीएस जेल नमूना बफर में उबलते द्वारा प्रतिक्रियाओं बंद करो, और पश्चिमी सोख्ता द्वारा उन्हें विश्लेषण.
- जेल वैद्युतकणसंचलन
3.1.1 एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन के नमूने को हल करने और मानक प्रोटोकॉल 30 के अनुसार एक nitrocellulose झिल्ली का संकल्प लिया प्रोटीन electrotransfer.
3.1.2 ब्रैडफोर्ड विधि (जैव रेड) का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, और लेन प्रति कुल प्रोटीन की 50-80 ग्राम भार. सभी नमूनों समान रूप से लोड कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. लोड हो रहा है नियंत्रण के लिए, इस तरह के लगभग 50 केडीए के एक रिश्तेदार electrophoretic गतिशीलता के साथ एक प्रमुख बैंड के रूप में विस्थापित जो ख्यात RuBisCo बड़ी श्रृंखला के रूप में एक सर्वव्यापी प्रोटीन प्रजातियों की तीव्रता तुलना, वे Coomassie नीले दाग जैल पर या काकरेज़ी रंग एस या पर पाया जा सकता है फ्लोरोसेंट SYPRO nitrocellulose झिल्ली रूबी से सना हुआ. - ब्लॉकिंग
कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए TBST में 5% स्किम दूध (10 मिमी Tris-एचसीएल, 140 मिमी NaCl, 0.05% बीच 20, 7.4 पीएच) के साथ झिल्ली ब्लॉक. प्राथमिक एंटीबॉडी
निर्माता से सिफारिश की एकाग्रता के लिए TBST में 1% स्किम दूध में प्राथमिक विरोधी मिलान एंटीबॉडी पतला और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या रात भर के लिए अवरुद्ध झिल्ली के साथ सेते हैं. - Rinsing
झिल्ली एक बार 15 मिनट के लिए 20 मिलीलीटर TBST में rinsed है कुल्ला, और दो बार कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए. - माध्यमिक एंटीबॉडी
निर्माता से सिफारिश के रूप में TBST में 1% दूध स्किम में घोड़ा मूली peroxidase (एचआरपी) के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, विरोधी खरगोश आईजीजी) पतला और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली के साथ सेते हैं. - खोज
3.4 कदम में वर्णित के रूप में फिर से झिल्ली कुल्ला. TBST में अंतिम कुल्ला के बाद, सबसे अधिक एक ईसीएल किट का उपयोग कर, एक एचआरपी chemiluminescent सब्सट्रेट के साथ ब्याज की प्रोटीन कल्पना.
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Representative Results
Zaltsman एट अल. 17 से अनुकूलित चित्रा 1, एक सेल मुक्त प्रणाली में proteasomal गिरावट का पता लगाने के लिए प्रतिनिधि प्रयोगों को दिखाता है. विशेष रूप से, हम एन में एससीएफ VBF मार्ग के माध्यम से VBF एफ बॉक्स प्रोटीन से एक संयंत्र रक्षा से संबंधित प्रोटीन VIP1 की अस्थिरता का प्रदर्शन benthamiana. Arabidopsis VBF और हा टैग VIP1 (हा VIP1) प्रोटीन क्षणिक coexpressed थे, और व्यक्त पत्तियों का अर्क भीतर हा VIP1 सामग्री प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था. इस विश्लेषण VBF साथ coexpressed जब VIP1 मात्रा में एक महत्वपूर्ण डिग्री तक कम हो गई थी कि प्रदर्शन किया, लेकिन VBF Coexpression (चित्रा 1 ए) के अभाव में अपेक्षाकृत स्थिर बने रहे. VBF बिना VIP1 सामग्री में मामूली कमी अंतर्जात तंबाकू VBF गतिविधि के निम्न स्तर के कारण हो सकता है ध्यान दें. VBF द्वारा VIP1 अस्थिरता के proteasomal गिरावट तंत्र अपने मैं से inferred किया गया थाMG132 (चित्रा 1 ए) द्वारा nhibition. चित्रा 1 ए में परिणाम की मात्रा MG132 (चित्रा 1 बी) द्वारा अवरुद्ध किया गया था जो VBF, द्वारा लगभग पूरा (≥ 90 ± 5%) VIP1 प्रदर्शन किया. MG132 की उपस्थिति में VIP1 की है कि थोड़ा उच्च स्तर नोट सबसे अधिक संभावना अंतर्जात VBF गतिविधि 17 के निषेध के द्वारा समझाया जाता है.
चित्रा 1. VBF VIP1 के proteasomal गिरावट को बढ़ावा देता है. हा VIP1 अकेले व्यक्त या एन में VBF साथ coexpressed गया था benthamiana छोड़ देता है. परिणामस्वरूप प्रोटीन अर्क संकेत समय अवधि के लिए incubated और विरोधी हा एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया. ख्यात RuBisCo बड़ी श्रृंखला लोडिंग नियंत्रण (ए) के रूप में इस्तेमाल किया गया था. Quantifieडी वेस्टर्न ब्लॉट संकेत ऊष्मायन अवधि के शुरू में VBF के अभाव में प्राप्त संकेत के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था. डेटा संकेत मानक विचलन (बी) के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों की औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व. यह आंकड़ा Zaltsman एट अल. 17 से लिया गया था
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Discussion
यह परख संयंत्र के ऊतकों में परीक्षण प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, इस प्रकार, संभावित proteasomal गिरावट प्रक्रिया स्पष्ट रूप से रहने वाले ऊतकों के भीतर पहले से ही होता है. हम शून्य नमूना प्रारंभिक संदर्भ बिंदु के रूप में सेवा करने से समय के साथ, केवल निष्कर्षों में, हालांकि, प्रोटीन अस्थिरता परख. इसलिए, हम एक सेल मुक्त परख के रूप में परिभाषित करते हैं.
इस परख की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का परीक्षण प्रोटीन (ओं) का उत्पादन किया जाएगा, जहां से अभिव्यक्ति वेक्टर का सही विकल्प है. परीक्षण किया प्रोटीन के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, जब तक यह मिलान टैग पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाने के लिए किया जाना चाहिए. टैग प्रोटीन एक Agrobacterium द्विआधारी वेक्टर से व्यक्त किया जाना चाहिए. कई ऐसे वैक्टर 26 में उपलब्ध हैं, जबकि हम pPZP-RCS2 बाइनरी plasmids में अभिव्यक्ति कैसेट के एक कदम प्रविष्टि की अनुमति देता है जो हमारे मॉड्यूलर PSAT प्लाज्मिड प्रणाली 24, से व्युत्पन्न वैक्टर उपयोग करने का सुझाव24-25. PSAT प्रणाली का एक और लाभ यह है कि अनुमति देता है कई proteasomal substrates परख या परीक्षण किया सब्सट्रेट के interactors के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो एक ही वेक्टर 25, से कई जीनों की अभिव्यक्ति; Agrobacterium VirD5 का उदाहरण Coexpression के लिए proteasomal गिरावट 22 से VirF संरक्षण में proteasomal सब्सट्रेट VirF परिणामों के साथ सूचना का आदान प्रदान प्रोटीन. महत्वपूर्ण बात है, वेक्टर के विस्तार के PSAT श्रृंखला पहले ही मिलान 27 टैगिंग के लिए वैक्टर शामिल हैं. भले ही चुना क्लोनिंग रणनीति की, ब्याज की मिलान टैग प्रोटीन एन्कोडिंग अनुक्रम संयंत्र के ऊतकों में बाद में अभिव्यक्ति के लिए एक द्विआधारी वेक्टर में पेश किया जाना चाहिए. इस परख क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करता है क्योंकि उनकी उपस्थिति परख दक्षता के लिए हानिकारक नहीं है, हालांकि द्विआधारी वेक्टर, स्थिर परिवर्तन के लिए चयन मार्करों शामिल करने के लिए नहीं है.
ब्याज की कई प्रोटीन की Coexpression सबसे अच्छा बहुजीनीय अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग कर हासिल की है, यद्यपि यह एक अलग द्विआधारी का निर्माण किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक दो या तीन Agrobacterium उपभेदों के तरल संस्कृतियों के बराबर मात्रा में संयोजन के द्वारा भी किया जा सकता है.
एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु है कि कई मामलों में, proteasomal गिरावट परख न केवल proteasomal सब्सट्रेट की, लेकिन यह भी एससीएफ मार्ग के एक घटक के अभिव्यक्ति शामिल है, कि है. उदाहरण के लिए, प्रयोगात्मक लक्ष्य एक एफ बॉक्स प्रोटीन को पहचानता है और गिरावट के लिए लक्ष्य एक विशिष्ट सब्सट्रेट परीक्षण है कि क्या हो सकता है. इस मामले में, यह मिलान टैग सब्सट्रेट untagged एफ बॉक्स प्रोटीन के साथ coexpressed किया जाना चाहिए.
डेटा के अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, प्रोटीन गिरावट की हद तक आसानी से पश्चिमी संकेतों के रिश्तेदार तीव्रता को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है Uनवीनतम ImageJ सॉफ्टवेयर (एनआईएच) 31 गाते हैं. ऐसी मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करते हैं, यह संकेत संतृप्ति से बचने के लिए पश्चिमी blots से अधिक विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. डाटा मात्रा का ठहराव भी सभी नमूने उपयुक्त प्रोटीन बैंड की तीव्रता में कमी से पता चला है कि इस परख में प्रोटीन गिरावट के रूप में उनके प्रोटीन सामग्री के संबंध में समान रूप से एसडीएस polyacrylamide जेल पर लोड कर रहे हैं कि आवश्यकता है. यह प्रत्येक सेल निकालने के प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करके और प्रत्येक गली के बराबर लोड हो रहा है (3.1 कदम देखें) के बाद सत्यापन करके हासिल की है. इसके अलावा, किसी भी समय पाठ्यक्रम प्रयोग में, सभी के नमूने निकालने का एक ही बैच से प्राप्त किया जाना चाहिए बराबर लोड हो रहा है यह सुनिश्चित करने में मदद करता है.
यहाँ वर्णित proteasomal गिरावट के लिए सेल मुक्त परख एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में पौधों का उपयोग करता है. हालांकि, एक ही प्रयोगात्मक डिजाइन किसी अन्य जीव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परख भी Furth द्वारा बढ़ाया जा सकता हैएर एससीएफ मार्ग पर केंद्रित थी. उदाहरण के लिए, प्रोटीन गिरावट के एससीएफ निर्भर तंत्र एससीएफ घटक CULLIN1 (CUL1 डी.एन.) के एक प्रमुख नकारात्मक फार्म का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया जा सकता है. विशेष रूप से, पदों 1 और 420 के बीच हटाए गए अमीनो एसिड के अवशेष के साथ Arabidopsis CUL1 की एक उत्परिवर्ती लेकिन नहीं एससीएफ 22 के उत्प्रेरक कोर का प्रतिनिधित्व करता है जो RBX1, साथ, एससीएफ परिसर के Skp1/ASK1 घटक के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है. CUL1 डी.एन. की Coexpression निम्नलिखित अवरोध या सब्सट्रेट गिरावट की कमी एससीएफ मार्ग की भागीदारी को इंगित करता है.
हमारे परख उनके प्राकृतिक वातावरण में, संयंत्र के ऊतकों में व्यक्त ब्याज की प्रोटीन का इस्तेमाल करता. इस दृष्टिकोण के लिए एक वैकल्पिक, पुनः संयोजक प्रोटीन को शुद्ध निष्कर्षों संयंत्र के लिए उन्हें जोड़ने, और पश्चिमी विश्लेषण 32 से उनकी गिरावट का पालन करने के लिए है. पुनः संयोजक प्रोटीन alway नहीं है क्योंकि हम चुनाव की पद्धति के रूप में इस रणनीति की सिफारिश नहीं हैईमानदारी से देशी जैविक गुणों को प्रतिबिंबित है, Planta में अभिव्यक्ति संभव नहीं है, हालांकि, अगर पुनः संयोजक प्रोटीन के उपयोग निश्चित रूप से एक मूल्यवान विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस प्रकाशन के लिए अग्रणी काम जीए संख्या 246,550 के तहत मैलेगा विश्वविद्यालय और यूरोपीय संघ 7 वें कार्यक्रम की रूपरेखा (FP7/2007-2013) द्वारा cofinanced मैरी क्यूरी COFUND कार्यक्रम 'यू गतिशीलता ", से धन प्राप्त हुआ है. हमारी प्रयोगशाला में काम कुलपति को एनआईएच, यूएसडीए / NIFA, NSF, चारण, और बीएसएफ से अनुदान द्वारा समर्थित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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