Summary
Degradazione delle proteine mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire "tag" molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.
Abstract
Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l'UPS di accoglienza per l'infezione efficiente, sottolineando l'importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno.
La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l'ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.
Introduction
Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi 1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l'enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del substrato proteico. In definitiva, le proteine polyubiquitinated sono riconosciuti e degradati dal proteasoma 26S. In questo meccanismo, l'enzima E3 specifica il substrato e funge da elemento regolatore chiave del sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasi E3 possono agire in modo indipendente, come ligases dominio RING, o come parte di un SCF multisubunit (S) complesso proteico kp1/Cullin/F-box, come ad esempio F-box ligases dominio. SCF-mediate vie di degradazione del proteasoma sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, ciclo cellulare, la trasduzione del segnale 5-10 e molte altre importanti funzioni cellulari.
Oltre a questi ruoli critici nella regolazione dei processi cellulari, UPS prende il palco centrale in molte interazioni pianta-patogeno. Ad esempio, una crescente evidenza suggerisce che diversi agenti patogeni delle piante, tra cui Agrobacterium tumefaciens, si basano su l'UPS host per per facilitare il processo di infezione 11. Agrobacterium provoca escrescenze neoplastiche sulle piante, che rappresentano i suoi ospiti naturali, e può anche trasformare una vasta gamma di altri eucarioti, da funghi 1,2 a cellule umane 12,13. Durante la sua infezione, Agrobacterium esporta un elemento DNA (T-DNA) e vari virulenza (vir) proteine nella cellula ospite 12-13. Una di queste proteine è VirF, la prima proteina F-box trovatiessere codificati da un genoma procariotico 14. Come parte del complesso SCF ubiquitina ligasi, VirF, e il suo omologo ospitante funzionale VBF 15, facilitare infezione Agrobacterium tramite la degradazione delle proteine UPS-mediata, che facilita presumibilmente uncoating del invadere batterica T-DNA dalle proteine batteriche e ospitanti accompagnamento, VirE2 e VIP1 rispettivamente 16,17. È interessante notare che molte proteine F-box, tra cui VirF, sono intrinsecamente instabili a causa della loro proteolisi, che è mediata da attività autoubiquitination 18,19 o da altri ligasi E3 per i quali le proteine F-box possono fungere da substrati 20-23.
Quando si studia attività biochimiche delle proteine F-box, altri ligasi ubiquitina, e / o le loro substrati, sarebbe molto utile un test semplice e affidabile per la degradazione del proteasoma. Qui si descrive un tale protocollo per analizzare la stabilità della proteina in una cellula-Libero Sistema. In questo saggio, la stabilità del substrato UPS viene analizzato in presenza o assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasoma, come una proteina F-box, in un sistema acellulare. In generale, esprimiamo la proteina (s) testato in tessuti vegetali, preparare estratti privi di cellule di questi tessuti e monitorare la quantità di proteina (s) di interesse mediante western blotting. Il meccanismo UPS-dipendente di degradazione proteica è dimostrata dalla inclusione di inibitori del proteasoma specifici e / o tramite coespressione di forma dominante negativa di un componente SCF, Cullin. Considerando che illustriamo questo dosaggio utilizzando proteasoma degradazione della proteina Arabidopsis VIP1 17 dalla proteina F-box VBF 15, può essere impiegato per studiare la stabilità di eventuali altri substrati del proteasoma.
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Protocol
1. Espressione della proteina
- Scelta del sistema di espressione
Selezionare il sistema, cioè, vettori e vettore metodo di consegna, più adatto per l'espressione della proteina di interesse nella organismo modello / cella specifica. Si noti che il nostro test richiede l'espressione delle proteine testate in quantità facilmente rintracciabile, che è meglio ottenere con la trasformazione temporanea di un gran numero di cellule. Nelle piante, per esempio, questo è migliore, utilizzare plasmidi binari come vettori di espressione e Agrobacterium come sistema di consegna. - Costruzione di vettori di espressione binari
Clonare la sequenza codificante (s) della proteina (s) di interesse in un vettore di espressione da soli o in fusione traslazionale di un epitopo. Uso vettori adatti per il sistema di espressione scelto e procedure di biologia molecolare standard per la clonazione del gene. Per la consegna del gene mediata da Agrobacterium, impiegare vettori binari e far loro conoscere, utilizzando anche Standaprotocolli rd, in un ceppo Agrobacterium, come EHA105, per la successiva inoculazione di tessuti vegetali. - La scelta delle specie vegetali
Selezionare le specie vegetali in cui verrà espressa la proteina (s) di interesse. Si noti che, mentre è possibile usare qualsiasi specie di piante sensibili alla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, la nostra specie vegetali di scelta è Nicotiana benthamiana, che è facilmente coltivata, altamente suscettibile Agrobacterium, e ha foglie grandi che sono facilmente inoculati. - La crescita delle piante
Crescere un impianto da 4 a 6 settimane in una pentola con Pro-Mix BX in una pentola (20 centimetri x 20 centimetri x 20 cm) in condizioni eco-controllati (es. camera di crescita) di giorno lungo (cioè 16 h 130 -150 μE m-2 s-1 luce a 23 ° C e 8 h al buio a 20 ° C) e 40-65% di umidità relativa.
1.5.2 Concimazione tanto in tanto con i prodotti disponibili in commercio per le istruzioni del produttore. Una volta che la pianta viene coltivata, selezionarefoglie con le dimensioni di 50 mm x 70 mm o più grandi (queste misure di lunghezza non includono il picciolo) per Agrobacterium inoculazione. - Inoculazione con Agrobacterium
Crescere ceppo Agrobacterium ospitare il costrutto binario esprimente la proteina (s) testato dal punto 1.3 notte a 28 ° C in mezzo YEP (1% peptone, estratto di lievito 1%, e 0,5% NaCl) supplementato con antibiotici appropriati (per esempio, 100 mg / L streptomicina e 10 mg / L rifampicina per vettori basati pPZP-RSC2 24-25).
1.6.2 Centrifugare le cellule, risospese a OD 600 = 0.5 in tampone infiltrazione [10 mM MgCl 2, 10 Mes mM (pH 5,6), 100 mM acetosyringone], e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Infiltrarsi nella cultura nel lato abaxial di una foglia, utilizzando una siringa senz'ago 1-mL; notare che le foglie vengono inoculati in situ, mentre è attaccato alla pianta.
1.6.3 Dopo l'infiltrazione, coltivare la pianta per 72 ore sotto il regime luce di 16 h 130-150 &# 181, E m-2 s-1 luce a 23 ° C / 8 h al buio a 20 ° C prima della raccolta. - Applicazione di inibitori del proteasoma
Per sostenere l'idea che la proteina (s) testato è degradato attraverso una via del proteasoma, utilizzare specifici inibitori del proteasoma MG132 e lactacistina 28-29, che dovrebbe ridurre o addirittura bloccare il degrado. Quattro ore prima della raccolta (cfr. punto 2.1), infiltrarsi nelle zone foglia Agrobacterium-inoculati con 10 pM MG132 (EMD Millipore) o 10 micron lactacistina (Sigma-Aldrich) o mock-trattare la foglia con le rispettive solventi, cioè lo 0,1% DMSO o acqua distillata.
2. Preparazione di estratti cell-free
- Leaf raccolta
Raccogliere le zone inoculati della foglia, di solito ca. 200-400 mg di peso fresco, e li macinare in polvere fine in azoto liquido. In alternativa, bead-battere i tessuti, utilizzando qualsiasi bead-beater (ad esempio, Biospec) o amalgamator dentale (ad esempio, TPC avanzata Technologies) direttamente nel buffer di degradazione (cfr. punto 2.2). - Estrazione delle proteine
Preparare l'estratto proteico totale posizionando il tessuto macinato in 500 ml di tampone degradazione [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, adenosina 5 mM 5'-trifosfato, e inibitore della proteasi 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. Si noti che il cocktail di inibitori delle proteasi colpisce principalmente serina, cisteina, aspartico, e metalloproteasi e non interferisce con la proteasi 26S. Chiarire l'estratto da due centrifugazioni sequenziali a 12.000 xg per 5 min. - Reazione di degradazione delle proteine
Trasferire volumi uguali di estratti, di solito 20 microlitri, per microcentrifuga tubi e incubare a temperatura ambiente per periodi di tempo crescente. Tipicamente, il tempo di campionamento pari a zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 min punti temporali. Smettere di reazioni facendo bollire in SDS tampone di gel-sample, e analizzarli mediante western blotting.
- Elettroforesi su gel
3.1.1 risolvere i campioni di proteine mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e electrotransfer le proteine deliberato di una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard 30.
3.1.2 Determinare concentrazione proteica utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad), e caricare 50-80 mg di proteine totali per corsia. Assicurarsi che tutti i campioni sono stati caricati allo stesso modo. Per i controlli di carico, confrontare le intensità di una specie di proteine ubiquitarie, come putativo Rubisco grandi catene che migrano come una band importante con una mobilità elettroforetica relativa di circa 50 kDa, possono essere rilevati Coomassie gel-blu macchiato o Ponceau S-o fluorescente SYPRO Ruby-tinto membrane di nitrocellulosa. - Blocco
Bloccare la membrana con 5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. Anticorpo primario
Diluire anticorpo anti-epitopo primario in 1% di latte scremato in TBST alla concentrazione raccomandato dal produttore e incubare con la membrana bloccata per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con agitazione. - Risciacquo
Sciacquare la membrana viene sciacquato con 20 ml TBST per 15 minuti una volta e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. - Anticorpo secondario
Diluire anticorpo secondario (ad esempio IgG anti-coniglio) coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in 1% di latte scremato in TBST come raccomandato dal fabbricante e incubare con la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. - Rivelazione
Sciacquare nuovamente la membrana come descritto al punto 3.4. Dopo il risciacquo finale in TBST, visualizzare le proteine di interesse, con un substrato chemiluminescente HRP, più comunemente utilizzando un kit ECL.
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Representative Results
Figura 1, adattato da Zaltsman et al. 17, illustra esperimenti rappresentativi per il rilevamento di degradazione del proteasoma in un sistema acellulare. In particolare, dimostriamo destabilizzazione di un impianto destinato alla difesa proteina VIP1 dalla proteina F-box VBF attraverso la via SCF VBF in N. benthamiana. Arabidopsis VBF e VIP1 (HA-VIP1) proteine HA-tagged stati transitoriamente coespressi, e HA-VIP1 proteina contenuto all'interno estratti delle foglie che esprimono stati analizzati mediante western blotting. Questa analisi ha dimostrato che gli importi VIP1 sono stati ridotti in misura significativa quando coexpressed con VBF, ma è rimasto relativamente stabile in assenza di VBF coexpression (Figura 1A). Si noti che una lieve riduzione del tenore di VIP1 senza VBF può essere dovuto al basso livello del tabacco endogena attività VBF. Il meccanismo di degradazione del proteasoma di VIP1 destabilizzazione da parte VBF è stata dedotta dalla sua inhibition da MG132 (Figura 1A). La quantificazione dei risultati in Figura 1A dimostrato quasi completa (≥ 90 ± 5%) VIP1 da VBF, che è stato bloccato da MG132 (Figura 1B). Si noti che i livelli leggermente superiori di VIP1 in presenza di MG132 probabilmente sono spiegate mediante inibizione dell'attività VBF endogena 17.
Figura 1. VBF promuove proteasoma degradazione della VIP1. HA-VIP1 è stata espressa da solo o coespressi con VBF in N. benthamiana lascia. Gli estratti proteici risultanti sono state incubate per i periodi di tempo indicati e analizzati mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-HA. Il putativo grande catena RuBisCo è stato usato come controllo di caricamento (A). Quantified segnale Western Blot è stata espressa come percentuale del segnale ottenuto in assenza di VBF all'inizio del periodo di incubazione. I dati rappresentano i valori medi di tre esperimenti indipendenti con deviazioni standard (B) indicati. Questo dato è stato adattato da Zaltsman et al 17.
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Discussion
Questo test si basa sulla espressione delle proteine testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all'interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule.
Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vettore di espressione da cui verrà prodotta la proteina (s) testato. Salvo anticorpi specifici contro la proteina controllato sono disponibili, dovrebbe essere epitopo-tag per il rilevamento mediante western blotting. La proteina targhetta deve essere espresso da un Agrobacterium vettore binario. Considerando che molti di questi vettori sono disponibili 26, si consiglia di utilizzare vettori derivati dal nostro sistema plasmide PSAT modulare 24, che consente l'inserimento di uno stadio di cassette di espressione nei plasmidi binari pPZP-RCS224-25. Un altro vantaggio del sistema PSAT è che permette l'espressione di geni multipli dello stesso vettore 25, che è particolarmente utile per gli esperimenti di saggio vari substrati del proteasoma o per studiare gli effetti di interattori del substrato testato, ad esempio coexpression del Agrobacterium VirD5 proteina che interagisce con i risultati del substrato del proteasoma VirF nella protezione VirF dal proteasoma degradazione 22. È importante sottolineare che la serie PSAT espansione del vettore comprende già vettori per epitopi codifica 27. Indipendentemente dalla strategia di clonaggio scelto, la sequenza codificante la proteina epitopo-tag di interesse deve essere introdotto in un vettore binario per successiva espressione in tessuti vegetali. Poiché questo saggio impiega espressione transiente, il vettore binario non deve contenere marcatori di selezione per la trasformazione stabile, anche se la loro presenza non è dannoso per l'efficienza dosaggio.
Sebbene coexpression di diverse proteine di interesse è meglio realizzato utilizzando vettori di espressione multigeniche, può essere fatto anche combinando volumi equivalenti di colture liquide di due o tre ceppi di Agrobacterium, ciascuno dei quali porta un costrutto binario separato.
Un altro punto critico è che, in molti casi, il saggio degradazione proteasoma coinvolge espressione non solo del substrato proteasoma, ma anche di una componente della via SCF. Ad esempio, l'obiettivo sperimentale potrebbe essere quello di verificare se una proteina F-box riconosce e obiettivi per la degradazione di un substrato specifico. In questo caso, questo substrato epitopo-tag deve essere coespressi con il etichettato proteina F-box.
Per un'analisi più dettagliata dei dati, il grado di degradazione della proteina può essere facilmente quantificato misurando l'intensità relativa dei segnali occidentali ucantare l'ultima versione del software ImageJ (NIH) 31. Durante l'esecuzione di tale quantificazione, è importante non a un eccesso di sviluppare le macchie occidentali per evitare la saturazione del segnale. Quantificazione dei dati richiede anche che tutti i campioni sono stati caricati su gel di SDS-poliacrilammide parimenti al loro contenuto proteico come degradazione della proteina in questo saggio viene rilevato dalla riduzione dell'intensità della banda di proteina appropriata. Ciò si ottiene mediante determinazione del contenuto proteico di ciascun estratto cellulare e per successiva verifica della parità di carico di ciascuna corsia (vedi passo 3.1). Inoltre, in qualsiasi esperimento time-course, tutti i campioni devono essere derivati dallo stesso lotto di estratto contribuisce a garantire la parità di carico.
Il saggio privo di cellule per la degradazione proteasoma qui descritto utilizza piante come sistema sperimentale. Tuttavia, lo stesso disegno sperimentale potrebbe essere utilizzato per qualsiasi altro organismo. Il test può anche essere prorogato di Further concentrandosi sul percorso di SCF. Ad esempio, il meccanismo SCF-dipendente di degradazione delle proteine può essere dimostrata utilizzando una forma dominante-negativo della CULLIN1 componente SCF (CUL1 DN). In particolare, un mutante di Arabidopsis CUL1 con residui amminoacidici cancellati tra le posizioni 1 e 420 ha mostrato di interagire con la componente Skp1/ASK1 del complesso SCF, ma non con RBX1, che rappresenta il nucleo catalitico di SCF 22. L'inibizione o la riduzione del degrado del substrato a seguito coexpression di CUL1 DN indica il coinvolgimento della via di SCF.
La nostra analisi utilizza proteine di interesse espresse nei tessuti vegetali, nel loro ambiente naturale. Un'alternativa a questo approccio è quello di purificare proteine ricombinanti, aggiungerli a piantare estratti, e seguire la loro degradazione mediante analisi occidentale 32. Noi non consigliamo questa tattica come metodologia di scelta, perché le proteine ricombinanti non sempre puntuales riflettono fedelmente le proprietà biologiche native, tuttavia, se l'espressione in planta non è possibile, l'impiego di proteine ricombinanti rappresenta certamente una valida alternativa.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro portato a questa pubblicazione ha ricevuto finanziamenti dal programma Marie Curie COFUND "U-Mobility", cofinanziato dall'Università di Malaga e il programma dell'Unione europea 7 ° programma quadro (FP7/2007-2013) sotto GA No. 246550. Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto da sovvenzioni dal NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF a VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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