Summary
Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.
Abstract
Protein bozulması için ubikuitin-proteazom yolunun hemen hemen tüm ökaryotik organizmalarda hücresel fonksiyonların geniş bir yelpazede düzenlenmesi için en önemli mekanizmalardan biri olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle bitkilerde, ubiquitin/26S proteazom sistemi (UPS) protein bozulmasını düzenleyen ve bağışıklık tepkisi, geliştirme ve programlanmış hücre ölümü gibi işlemler geniş bir yelpazede, geliştirilmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, artan kanıtlar Agrobacterium gibi çok sayıda bitki patojenleri, bitki-patojen etkileşimleri UPS önemini vurgulayarak, etkin enfeksiyon konak UPS istismar olduğunu göstermektedir.
UPS alt-tabaka özgüllüğü, E1 ile uyum içinde hareket eder ve E2 bunlara ubiquitin moleküllerin zincirleri takılarak bozulması için hedeflenen spesifik protein moleküllerini tanıyan ve işaretlemek için ligaz E3 ligaz ubikitin ile elde edilir. E3 ligazlar bir sınıfı olan SCF (SKP1 / CÖzellikle UPS substratları tanır ve kendi F-box protein bileşeni aracılığıyla ubikuitinasyomınun için onları hedef Ullin / F-box protein) kompleksi. Ilgi konusu bir biyolojik süreç içinde UPS bir potansiyel rolünü araştırmak için, UPS aracılığında protein indirgenmesi için basit ve güvenilir bir tahlil hazırlamak için önemlidir. Burada, bir bitki hücresi serbest sistemi kullanılarak böyle bir tahlili tarif eder. Bu deney, F-box protein-substrat etkileşimleri ile ilgili özel bir odaklanarak, çeşitli hücresel süreçlerde düzenlenmiş protein degradasyon rolleri çalışmalar için uyarlanabilir.
Introduction
Ubiquitin/26S proteazomu yolu diğerleri arasında transkripsiyonel regülasyonu, hücre döngüsü ilerlemesi ve sinyal iletimi, reseptör down-regülasyonu veya endositoz, 1-4 işler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik reaksiyonlar, kontrolü için yaygın bir mekanizma olarak ortaya çıkmaktadır. Bu yol, hedef protein ilk ubikitin aktive edici enzim E1 için bir tiolester bağ üzerinden birleştirilmiş ve daha sonra ubikuitin konjugasyon enzim E2'nin bir sistein amino asit kalıntısına transloke tortuları ubikuitin ile etiketlenir, son olarak, E2, E3 ligaz ubiquitin ile etkileşime , protein alt-tabakanın polyubiquitination ile sonuçlanır. Sonuç olarak, proteinler polyubiquitinated 26S proteazomu tarafından tanınan ve parçalanırlar. Bu mekanizmada, E3 enzim substratı belirtir ve ubiquitin/26S proteazom sistemi (UPS) en önemli düzenleyici bir bileşeni olarak işlev görür. E3 ligaz gibi halka alanı ligazlar olarak, ya da bir multisubunit SCF (S parçası olarak, bağımsız bir şekilde hareket edebilirBöyle F-box etki ligazlara olarak kp1/Cullin/F-box protein) kompleksi. SCF aracılı proteozomal degradasyon yollarının transkripsiyon, hücre döngüsü, sinyal transdüksiyonu 5-10 ve birçok diğer önemli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynamaktadır.
Hücresel süreçlerin düzenlenmesinde bu kritik rolleri yanı sıra, UPS birçok bitki-patojen etkileşimleri merkezi sahne alıyor. Örneğin, artan kanıtlar Agrobacterium tumefaciens dahil olmak üzere birçok bitki patojenleri, enfeksiyon süreci 11 kolaylaştırmak için konakçı UPS güvenmek olduğunu göstermektedir. Agrobacterium doğal ana temsil eden bitkiler, neoplastik büyümeler ortaya çıkarır, ve aynı zamanda insan hücreleri 12,13 için mantar 1,2 dan, ökaryotlarda geniş bir yelpazede dönüştürebilir. Bu enfeksiyon esnasında, Agrobacterium konakçı hücre 12-13 bir DNA elemanı (T-DNA) ve çeşitli virülans (vir) proteinleri ihraç etmektedir. Bu proteinlerin biri VirF, bulunan ilk F-box proteindirBir prokaryotik genom 14 ile kodlanmış olması. SCF ubikuitin ligaz kompleksi, VirF ve onun fonksiyonel bir ev sahibi homolog VBF 15 bir parçası olarak, muhtemelen VirE2, ona eşlik eden bir bakteriyel ve konak proteinler istilacı bakteri T-DNA'nın integraz kolaylaştırır UPS-aracılı protein yıkımı, Agrobacterium ile enfeksiyon kolaylaştırmak VIP1 ve sırasıyla 16,17. İlginçtir, VirF dahil olmak üzere birçok F-box proteinler, nedeniyle autoubiquitination aktivite 18,19 veya F-box proteinler yüzeylerde 20-23 olarak hizmet olabilecek diğer E3 ligazlara aracılık kendi proteoliz, özünde kararsız.
F-box proteinler, diğer ligazlar ubikitin ve / veya alt-tabakalar arasında biyokimyasal aktivitelerini incelemek, bu proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir deney kullanılması çok yararlı olacaktır. Burada, bir hücrede protein stabilitesini analiz etmek için böyle bir protokol açıklar-Free sistemi. Bu deneyde, UPS substratın kararlılık, hücre içermeyen bir sistem içinde, böyle bir F-box proteini olarak proteozomal bozunum yolu, temel bileşenlerinden biri varlığında veya yokluğunda analiz edilir. Genel olarak, bu dokulardan hücresiz özleri hazırlamak ve western blotting ile ilgilenilen protein (ler) in miktarları, monitör bitki dokularında test edilen protein (ler) ifade eder. Protein degradasyon UPS-bağımlı mekanizma özel proteozomal inhibitörleri ve / veya bir bileşen SCF, cullin dominant-negatif bir form of yakımının birlikte kullanılarak dahil ile gösterilmiştir. Biz VBF 15 F-box proteini ile, Arabidopsis VIP1 17 protein proteozomal bozundurması kullanılarak, bu tahlili göz önüne alarak, bu da başka alt-tabakalar proteozomal stabilitesini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Protein ekspresyonu
- Ekspresyon sistemi seçimi
Sistemin, örneğin, vektörler ve spesifik bir model organizma / hücrede ilgi konusu proteinin ekspresyonu için en uygun vektör dağıtım yöntemi seçin. Bizim deney iyi hücre sayıda geçici transformasyonu ile elde edilir kolayca algılanabilir miktarlarda, test edilen proteinlerin ifadesini gerektirdiğini not edin. Bitkilerde, örneğin, bu dağıtım sistemi en iyi ekspresyon vektörleri Agrobacterium ikili plazmidler kullanılarak gerçekleştirilir. - Ikili sentezleme vektörlerinin yapılandırılması
Bir epitop etiketine tek başına ya da translasyonel füzyon ya da bir ekspresyon vektörü içine ilgilenilen protein (ler) in kodlama sekans (lar) Clone. Kullanım olarak seçilen sentezleme sisteminde ve gen klonlama için kullanılan standart moleküler biyoloji işlemleri için uygun olan vektörleri. Agrobacterium-aracılı gen aktarımı için, Standa kullanılması da, ikili vektörler kullanmak ve bunları tanıtmakBitki dokularının aşılanması için daha sonra bu gibi bir EHA105 Agrobacterium suşu, içine rd protokolleri. - Bitki türlerinin seçimi
Ilgilenilen protein (ler) olarak ifade edilecek olan bitki türleri seçin. Agrobacterium aracılı genetik transformasyona duyarlı herhangi bir bitki türü kullanılabilir iken, unutmayın, seçim bizim bitki türlerinin kolayca Agrobacterium'a son derece duyarlı, yetiştirilen Nicotiana benthamiana, ve kolayca aşılanır büyük yaprakları vardır. - Bitki büyüme
Uzun bir günün çevre kontrollü koşullarda (örneğin, büyüme odası) 130 (yani, 16 saat altında bir tencerede (20 cm x 20 cm x 20 cm) Pro-Mix BX ile bir tencerede 4 ila 6 hafta boyunca bir bitki büyütün 23 ° C'de -150 μE m-2 s-1, ışık ve 20 ° C'de 8 saat karanlık) ve% 40-65 bağıl nem.
Zaman, üretici talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen ürünler ile 1.5.2 Gübre. Bitki yetişir kez seçmekAgrobacterium aşılama için 50 mm x 70 mm ya da daha büyük bir boyutu (uzunluk, bu ölçümler sapı kapsamamaktadır) ile terk eder. - Agrobacterium ile aşılama
/ Uygun antibiyotikler (örneğin, 100 mg desteklenmiş YEP ortam içinde 28 ° C'de (% 1 pepton,% 1 maya özütü ve% 0.5 NaCl), gece boyunca adım 1.3 arasındaki test edilen protein (ler) ifade eden ikili yapıyı taşıyan Agrobacterium suşu büyümek L streptomisin ve pPZP RSC2-bazlı vektörler, 24-25) için 10 mg / L rifampisin.
[10 mM MgCI2, 10 mM Mes (pH 5.6), 100 uM asetosiringon] sızma tamponu = 0.5 OD 600 ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe yeniden süspansiyon haline 1.6.2 Santrifüj hücreler. 1 ml iğnesiz şırınga kullanılarak, bir yaprağın eksen dışı tarafına kültür sızın, bitkiye takılı durumdayken yapraklar, in situ aşılanır unutmayın.
1.6.3 infiltrasyonu sonra 16 saat 130-150 ve ışık rejimi altında 72 saat boyunca bitki büyümesi# 181; E, m-2 s-1 ışık 23 ° hasat öncesi 20 ° C ° C / 8 saat karanlık. - Proteozomal inhibitörlerinin uygulanması
Test protein (ler) bir proteozomal yolu aracılığıyla bozulmuş olduğu görüşünü desteklemek için, azaltmak ve hatta bozulmasını engellemek gerekir, hangi spesifik proteozomal inhibitörleri MG132 kullanımı ve 28-29 Laktasistin. Dört saat (adım 2.1) hasat önce, 10 uM MG132 (Merck) ya da 10 uM laktasistin (Sigma-Aldrich) ya da Agrobacterium ile aşılanmış yaprak alanları sızmak ilgili çözücülerin, yani,% 0.1 DMSO ile mock-yaprak tedavisinde ya da damıtılmış su.
2. Hücresiz ekstrelerinin hazırlanması
- Yaprak hasat
Yaprağın aşılanmış alanları, genellikle ca hasat. 200-400 taze ağırlığının, herbir mg, ve sıvı azot içinde ince bir toz haline öğütmek bunları. Alternatif olarak, herhangi boncuk-çırpıcı (örneğin, BioSpec) veya diş amalgamator (örneğin, TCK Advanced kullanarak, dokuları boncuk yendi Doğrudan bozulma tamponunda Technologies) () Adım 2.2. - Protein ekstre etme
Bozunma tampon 500 uL içine zemin dokusu yerleştirerek total protein ekstresi hazırlamak [50 mM Tris-HCL (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenozin 5'-trifosfat ve 1x proteaz inhibitör kokteyli (Sigma-Aldrich)]. Proteaz inhibitörü kokteyl esas olarak serin, sistein, aspartik ve metaloproteazları etkiler ve 26S proteaz ile karışmaz unutmayın. 5 dakika boyunca 12,000 x g'de iki ardışık santrifüj işlemi ile özü açıklığa kavuşturulacaktır. - Protein bozunma reaksiyon
Mikrofüj tüpler ve zaman süreleri arttırmak için oda sıcaklığında inkübe etmek, özler, genellikle 20 uL'lik eşit hacimlerde aktarın. Tipik haliyle, numune süresi sıfır, ve 5, 10, 15, 20 ve 30 dakika zaman noktalarında. SDS jel örnek tampon maddesi içinde kaynatma ile reaksiyonlar durdurun ve western blotting ile analiz.
- Jel elektroforezi
3.1.1 SDS-poliakrilamit jel elektroforezi ile protein örnekleri gidermek ve standart protokole 30'a göre bir nitroselüloz zara giderilmiş proteinleri elektrotransfer.
3.1.2 Bradford yöntemi (Bio-Rad) kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin ve hat başına toplam proteinin 50-80 ug yükleyin. Tüm örnekler eşit yüklü olduğundan emin olun. Yükleme kontrol için, bu yaklaşık 50 kDa bir görece elektroforetik hareketlilik ile önemli bir bant olarak göç varsayımsal RUBISCO büyük zincirler olarak her yerde bulunan bir protein türleri, yoğunluklarını karşılaştırmak; bunlar Coomassie blue-lekeli jeller üzerinde veya Ponceau S-ya da tespit edilebilir Floresan SYPRO Ruby nitroselüloz membranlar-boyandı. - Bloke etme
Oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST içinde% 5 yağsız süt (10 mM Tris-HCI, 140 mM NaCI,% 0.05 Tween 20, pH 7.4) ile bloke membran. Primer antikor
Üretici tarafından tavsiye edilen konsantrasyona TBST içinde% 1 yağsız süt birincil anti-antikor epitop seyreltin ve yumuşak çalkalama ile 4 ° C'de, oda sıcaklığında 1 saat süre ile ya da gece boyunca bloke edilmiş membran ile inkübe edin. - Durulama
Membran, 15 dakika boyunca bir kez 20 ml TBST içinde çalkalanır durulayın ve iki kez nazik çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı. - İkincil antikor
Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi TBST içinde% 1 yağsız süt olarak at turpu peroksidaz (HRP) ile konjüge edilmiş sekonder antikor (örneğin, bir anti-tavşan IgG) seyreltin ve yumuşak çalkalama ile oda sıcaklığında 1 st için membran ile inkübe edin. - Bulma
Aşama 3.4 'de tarif edildiği gibi yeniden membran durulayın. TBST içinde son bir kez çalkalandıktan sonra, en yaygın olarak, bir ECL kiti kullanılarak, bir HRP alt-tabaka ile kimyasal olarak ışık veren, ilgi konusu proteinleri görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zaltsman et al. 17 uyarlanmıştır Şekil 1, bir hücre barındırmayan sistemde proteozomal bozulmasının saptanması için örnek deneyleri gösterir. Özellikle, N. SCF VBF yolu aracılığıyla VBF F-box proteini tarafından bir bitki savunma-ilişkili protein VIP1 istikrarsızlaştırma göstermek benthamina. Arabidopsis VBF ve HA-etiketli VIP1 (HA-VIP1) geçici proteinler eksprese edildi ve ifade yaprak ekstreleri içinde HA-VIP1 içerik protein western blotting ile analiz edilmiştir. Bu analiz, VBF ile birlikte eksprese zaman VIP1 miktarları önemli bir dereceye kadar azaltılmış olduğunu göstermiştir, ancak VBF birlikte sentezlenmesiyle (Şekil 1A) yokluğunda nispeten kararlı kaldı. Vbf olmadan VIP1 içeriğinde hafif bir azalma endojen tütün VBF aktivite düşük seviyesine bağlı olabileceğini unutmayın. Vbf tarafından VIP1 istikrarsızlaştırma proteozomal bozunma mekanizması kendi i olayla edildiMG132 (Şekil 1A) tarafından nhibition. Şekil 1A'da sonuçların miktarının MG132 (Şekil 1 B) ile bloke edilmiştir VBF ile hemen hemen tam bir (≥ 90 ±% 5) VIP1 gösterdi. MG132 mevcudiyetinde VIP1 bu biraz daha yüksek seviyelerde Not büyük olasılıkla, endojen VBF aktivitesi 17 inhibisyonu ile açıklanmıştır.
Şekil 1.. VBF VIP1 proteozomal bozulmasını teşvik eder. HA-VIP1 tek başına ifade veya N Vbf ile coexpressed edildi benthamiana bırakır. Elde edilen protein ekstreleri belirtilen süreler için inkübe edildi ve anti-HA antikoru kullanılarak Batı beneklemesi ile analiz edilmiştir. Varsayılan Rubisco büyük zincir yükleme kontrolü (A) olarak kullanılmıştır. Quantified western blot sinyali İnkübasyon süresinin başlangıcında VBF yokluğunda elde edilen sinyalin yüzdesi olarak ifade edildi. Veriler, standart sapmaları belirtilmiştir (B) ile, üç bağımsız deneyin ortalama değerleri temsil eder. Bu rakam Zaltsman et al. 17 uyarlanmıştır
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deney, bitki dokularında test edilen proteinlerin ekspresyonu dayanır, böylece, potansiyel proteozomal bozulması işlemi belli canlı dokular içinde daha önce ortaya çıkar. Sıfır örnek başlangıç referans noktası olarak hizmet eden zaman, sadece ekstrelerinde ise, protein kararsız hale gelmelerine tahlil. Bu yüzden, bir hücre içermeyen tahlil olarak tanımlar.
Bu deneyde başarısı için önemli bir yönü, test edilen protein (ler) üretilecek olan ifade vektörünün uygun bir seçimdir. Test edilen proteine karşı özel antikorlar mevcut olmadığı sürece, bu epitop etiketli western blotting ile tespiti için olmalıdır. Etiketli protein, bir Agrobacterium ikili vektöründen ifade edilmelidir. Gibi pek çok vektör mevcuttur 26 Oysa biz pPZP-RCS2 ikili plasmidler içine ekspresyon kasetlerinin tek-aşamalı sokulmasına izin veren modüler pSAT plasmid sistemi 24, türetilmiş vektörler kullanılarak önermek24-25. PSAT sisteminin bir diğer avantajı sağlar: ki çeşitli alt tabakaların proteozomal tahlil ya da test edilen alt-tabakanın interactors etkilerini incelemek için deneyler için özellikle yararlıdır aynı vektör 25, birden fazla gen ekspresyonu; Agrobacterium VirD5 örneğin ekspresyonuna için proteozomal bozulması 22 VirF koruma proteozomal substrat VirF sonuçlar protein ile etkileşime girer. Önemli bir şekilde, vektörün genişleyen pSAT serisi zaten epitop 27 etiketleme için vektörler içerir. Bağımsız olarak seçilmiş klonlama stratejisi, ilgi konusu epitop etiketli proteini kodlayan sekansı bitki dokularında daha sonra ekspresyon için bir ikili vektörü içinde ele alınmalıdır. Bu deney, geçici ifadeyi kullandığı için bunların varlığı, tahlil verimi için zararlı olmasa da, ikili vektör, stabil transformasyon için seçim işaretçileri içeren zorunda değildir.
Ilgi çeşitli proteinlerin ortak tanımlaması, en iyi çoklu gen sentezleme vektörleri kullanılarak elde edilir, ancak, ayrı bir ikili bir yapı taşıyan, her biri iki ya da üç Agrobacterium suşunun, sıvı kültürlerin eş hacimlerinin birleştirilmesiyle de yapılabilir.
Diğer bir önemli nokta, birçok durumda, proteozomal bozunma deney sadece proteozomal alt-tabaka, aynı zamanda SCF yolunun bir bileşeni ekspresyonunu içerir olmasıdır. Örneğin, deney hedef bir F-box protein tanır ve indirgenmesi için hedefler, belirli bir alt-tabaka olup olmadığını test etmek için olabilir. Bu durumda, bu epitop etiketli substrat etiketsiz F-box proteini ile birlikte tanımlanması gerekir.
Verilerin daha ayrıntılı bir analizi için, protein degradasyon ölçüde kolayca batı sinyallerinin nispi yoğunluğu ölçülerek tayin edilebilir uson ImageJ yazılımı (NIH) 31 şarkı. Böyle ölçümü yaparken, bu sinyal doymasını önlemek için batı lekelerinden fazla geliştirmek için önemli değildir. Veri miktar aynı zamanda tüm numune uygun protein bandının yoğunluğundaki azalma ile tespit edilir, bu deneyde protein yıkımı olarak protein içeriği ile ilgili olarak aynı şekilde, SDS-poliakrilamid jeli üzerine yüklenmiş gerektirir. Bu, her bir hücre ekstresi protein içeriğinin belirlenmesi ve her bir şerit içinde eşit yükleme (adım 3.1) daha sonra doğrulama ile elde edilir. Ayrıca, belirli bir zaman-akışı deneyinin in, tüm numuneler özü aynı partiden elde edilmelidir eşit yükleme sağlamak için yardımcı olur.
Burada tarif proteozomal indirgenmesi için hücre içermeyen tahlil, bir deney sistemi gibi bitkiler kullanır. Bununla birlikte, aynı deney tasarımı herhangi bir başka organizma için kullanılabilir. Tahlil, aynı zamanda Furth uzatılabilirer SCF yolu üzerinde duruluyor. Örneğin, protein degradasyon SCF bağımlı mekanizma SCF bileşen CULLIN1 (CUL1 DN) bir dominant-negatif bir form kullanılarak kanıtlanabilir. Özel olarak, pozisyon 1 ve 420 arasında silinen amino asit kalıntıları ile Arabidopsis CUL1 bir mutant değil, SCF 22 katalitik çekirdeğini temsil RBX1 ile, SCF kompleksin Skp1/ASK1 bileşeni ile etkileşim olduğu gösterilmiştir. CUL1 DN ekspresyonuna aşağıdaki engellenmesi ya da alt-tabaka bozulmasının azaltılması SCF kanalın yer aldığım belirtir.
Bizim deney doğal ortamda, bitki dokularında ifade edilen proteinleri ilgi kullanır. Bu yaklaşımın bir alternatif, yeniden birleştirici proteinlerin arıtılması, bitki ekstrelerinin bunları eklemek ve batı analizi 32 kendi bozunmasını takip etmektir. Rekombinant proteinleri Alway yok çünkü biz seçim metodolojisi olarak bu taktiği tavsiye etmiyoruzsadakatle doğal biyolojik özelliklerini yansıtmaktadır s, in planta ifadesi mümkün değildir, ancak, yeniden birleştirici proteinlerin kullanımı kesinlikle değerli bir alternatif teşkil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu yayının önde gelen iş GA No 246550 altında Malaga Üniversitesi ve Avrupa Birliği 7. Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) mali katkısıyla Marie Curie COFUND programı "U-Mobility", fon aldı. Laboratuvarımızda çalışma VC NIH, USDA / Nifa, NSF, ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
