Summary
Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.
Abstract
La vía de la ubiquitina-proteasoma para la degradación de proteínas se ha convertido en uno de los mecanismos más importantes para la regulación de una amplia gama de funciones celulares en prácticamente todos los organismos eucariotas. Específicamente, en las plantas, el sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regula la degradación de proteínas y contribuye significativamente al desarrollo de una amplia gama de procesos, incluyendo la respuesta inmune, desarrollo y muerte celular programada. Por otra parte, cada vez más evidencia sugiere que numerosos patógenos de las plantas, tales como Agrobacterium, explotan la acogida de UPS para la infección eficiente, haciendo hincapié en la importancia de la UPS en las interacciones planta-patógeno.
La especificidad de sustrato de la UPS se consigue mediante la ubiquitina ligasa E3 que actúa en concierto con la E1 y E2 ligasas para reconocer y marcar moléculas de proteínas específicas destinadas a la degradación por unir a ellos cadenas de moléculas de ubiquitina. Una clase de las ligasas E3 es el SCF (Skp1 / Cproteína ullin / F-box) compleja, que reconoce específicamente los sustratos de UPS y los dirige a través de su componente de ubiquitinación de proteínas F-box. Para investigar un posible papel de la UPS en un proceso biológico de interés, es importante para idear un ensayo simple y fiable para la degradación de proteínas mediada por UPS. Aquí, se describe uno de tales ensayo utilizando un sistema libre de células de la planta. Este ensayo se puede adaptar para el estudio de las funciones de la degradación de proteínas regulado en diversos procesos celulares, con un enfoque especial en los F-box interacciones proteína-sustrato.
Introduction
La vía del proteasoma ubiquitin/26S está emergiendo como un mecanismo generalizado para el control de diversas reacciones biológicas, incluyendo la regulación transcripcional, la progresión del ciclo celular y la transducción de la señal, el receptor de baja regulación o endocitosis, entre otros procesos de 1-4. En esta vía, la proteína diana se marca por ubiquitina residuos que se unen primero a través de un enlace tioléster de enzima ubiquitina-activación de E1 y luego trasladadas a un residuo de aminoácido cisteína de la enzima ubiquitina-conjugación E2; finalmente, E2 interactúa con ubiquitina ligasa E3 , lo que resulta en polyubiquitination del sustrato proteína. En última instancia, las proteínas polyubiquitinated son reconocidos y degradados por el proteasoma 26S. En este mecanismo, la enzima E3 especifica el sustrato y actúa como el componente regulador clave del sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasas E3 pueden actuar independientemente, tales como ligasas de dominio ANILLO, o como parte de un SCF de múltiples subunidades (Skp1/Cullin/F-box proteína) compleja, como ligasas de dominio F-box. Vías de degradación proteasomal mediadas por SCF están involucrados en la regulación de la transcripción, el ciclo celular, la transducción de señal de 5-10 y muchas otras funciones celulares importantes.
Además de estos papeles críticos en la regulación de procesos celulares, UPS toma el escenario central en muchas de las interacciones planta-patógeno. Por ejemplo, el aumento de la evidencia sugiere que varios patógenos de plantas, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, se basan en la acogida de UPS para facilitar el proceso de infección 11. Agrobacterium provoca crecimientos neoplásicos en las plantas, que representan sus huéspedes naturales, y también puede transformar una amplia gama de otros eucariotas, a partir de hongos 1,2 a las células humanas 12,13. Durante su infección, de Agrobacterium exporta un elemento de ADN (ADN-T) y varios virulencia (Vir) las proteínas en la célula huésped 12-13. Una de estas proteínas es VirF, la primera proteína F-box encontradopara ser codificada por un genoma procariota 14. Como parte del complejo SCF ubiquitina ligasa, VirF, y su homólogo anfitrión funcional VBF 15, facilitar la infección de Agrobacterium a través de la degradación de proteínas mediada por la UPS, que presumiblemente facilita uncoating de la T-ADN bacteriano invasor de sus acompañan proteínas bacterianas y de acogida, VirE2 y VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muchas proteínas F-box, incluyendo VirF, son intrínsecamente inestables debido a su propia proteólisis, que está mediada por la actividad autoubiquitination 18,19 o por otras ligasas E3 para el que F-box proteínas pueden servir como sustratos 20-23.
Al estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas F-box, otras ligasas de ubiquitina, y / o sus sustratos, sería muy útil emplear un ensayo sencillo y fiable para la degradación proteasomal. Aquí se describe un protocolo de este tipo para el análisis de estabilidad de la proteína en una célulaSin sistema. En este ensayo, la estabilidad del sustrato de UPS se analiza en la presencia o ausencia de uno de los componentes esenciales de la vía de degradación proteasomal, tales como una proteína de la caja F, en un sistema libre de células. En general, expresamos la proteína (s) ensayados en los tejidos vegetales, preparar los extractos libres de células de estos tejidos y controlar las cantidades de la proteína (s) de interés por el Western Blot. El mecanismo de la UPS dependientes de la degradación de proteínas se demostró mediante la inclusión de inhibidores de proteasomal específicos y / o el uso de co-expresión de la forma dominante negativa de un componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustramos este ensayo usando la degradación proteasomal de la proteína de Arabidopsis VIP1 17 por la proteína F-box VBF 15, que se puede emplear para investigar la estabilidad de los otros sustratos proteasomal.
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Protocol
1. La expresión de proteínas
- Elección del sistema de expresión
Seleccione el sistema, es decir, los vectores y el método de entrega de vectores, el más adecuado para la expresión de la proteína de interés en el modelo de organismo / celda específica. Tenga en cuenta que nuestro ensayo requiere la expresión de las proteínas de la prueba en cantidades fácilmente detectables, lo que se consigue mejor mediante la transformación transitoria de un gran número de células. En las plantas, por ejemplo, esto se realiza mejor usando plásmidos binarios como vectores de expresión y de Agrobacterium como sistema de entrega. - Construcción de vectores de expresión binarios
Clonar la secuencia codificante (s) de la proteína (s) de interés en un vector de expresión, ya sea solo o en fusión traduccional a una etiqueta de epítopo. Uso vectores adecuados para el sistema de expresión elegido y procedimientos estándar de biología molecular para la clonación de genes. Para la entrega de genes mediada por Agrobacterium, emplear vectores binarios y introducirlos, también utilizando Standaprotocolos Rd, en una cepa de Agrobacterium, tales como EHA105, para la posterior inoculación de tejidos de plantas. - Elección de las especies de plantas
Seleccionar las especies de plantas en el que se expresa la proteína (s) de interés. Tenga en cuenta que, mientras que cualquiera de las especies de plantas susceptibles a la transformación genética mediada por Agrobacterium se pueden utilizar, nuestros especies de plantas de elección es Nicotiana benthamiana, que se cultiva fácilmente, altamente susceptibles a Agrobacterium, y tiene grandes hojas que se inoculan fácilmente. - Crecimiento de las plantas
Haga crecer una planta de 4 a 6 semanas en una olla con Pro-Mix BX en una olla (20 cm x 20 cm x 20 cm) en condiciones de ambiente controlado-(por ejemplo, la cámara de crecimiento) de día largo (es decir, 16 h de 130 -150 E · m-2 s-1 la luz a 23 º C y 8 h oscuridad a 20 ° C) y una humedad relativa del 40-65%.
1.5.2 Abono de vez en cuando con los productos disponibles en el mercado según las instrucciones del fabricante. Una vez que la planta se cultiva, seleccionehojas con el tamaño de 50 mm x 70 mm o mayor (estas mediciones de longitud no incluyen el pecíolo) para la inoculación de Agrobacterium. - La inoculación con Agrobacterium
Crecer la cepa de Agrobacterium que alberga la construcción binaria que expresa la proteína (s) de prueba de la etapa 1.3 durante la noche a 28 ° C en medio YEP (1% de peptona, extracto de levadura 1%, y 0,5% de NaCl) suplementado con los antibióticos apropiados (por ejemplo, 100 mg / l de estreptomicina y 10 mg / L de rifampicina para los vectores basados en pPZP-RSC2 24-25).
1.6.2 Centrifugar las células, se resuspendieron a OD 600 = 0,5 en tampón de infiltración [10 mM de MgCl 2, Mes 10 mM (pH 5,6), acetosiringona 100 mM], y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. Infíltrate en la cultura en la cara abaxial de una hoja, utilizando una jeringa sin aguja 1-ml; en cuenta que las hojas se inoculan in situ, mientras que está unido a la planta.
1.6.3 Después de la infiltración, cultivar la planta durante 72 h bajo el régimen de luz de 16 h 130-150 y# 181; E m-2 s-1 la luz a 23 ° C / 8 h oscuridad a 20 ° C antes de la cosecha. - La aplicación de inhibidores de proteasomal
Para apoyar la idea de que la proteína (s) prueba es degradada por una vía proteasoma, usar inhibidores de proteasomal MG132 específicos y lactacistina 28-29, lo que debería reducir o incluso bloquear la degradación. Cuatro horas antes de la cosecha (ver Paso 2.1), infiltrarse en las áreas de la hoja inoculado con Agrobacterium con 10 M de MG132 (EMD Millipore) o 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) o maqueta tratar la hoja con los respectivos disolventes, es decir, 0,1% de DMSO o agua destilada.
2. Preparación de extractos libres de células
- La cosecha de la hoja
Recoger las áreas inoculadas de la hoja, por lo general aprox. 200-400 mg de peso fresco, y se muelen en un polvo fino en nitrógeno líquido. Alternativamente, bead-vencer a los tejidos, el uso de cualquier grano-batidor (por ejemplo, Biospec) o un amalgamador dental (por ejemplo, TPC Advanced Technologies) directamente en el búfer de degradación (véase el paso 2.2). - La extracción de proteínas
Preparar el extracto de proteína total mediante la colocación del tejido molido en 500 l de tampón de degradación de [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl 2, DTT 5 mM, adenosina 5 mM 5'-trifosfato, y el inhibidor de la proteasa 1x cóctel (Sigma-Aldrich)]. Tenga en cuenta que el cóctel inhibidor de la proteasa afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, y metaloproteasas y no interfiere con la proteasa 26S. Aclarar el extracto mediante dos centrifugaciones secuenciales a 12.000 xg durante 5 min. - Reacción de degradación de proteínas
Transferencia de volúmenes iguales de extractos de, por lo general 20 l, para microcentrífuga tubos e incubar a temperatura ambiente para aumentar los períodos de tiempo. Típicamente, tiempo de la muestra cero, y 5, 10, 15, 20, y 30 puntos de tiempo min. Deje de reacciones por ebullición en SDS-gel tampón de la muestra, y analizarlos por el Western Blot.
- La electroforesis en gel
3.1.1 resolver el muestras de proteína mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y electrotransferencia las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el protocolo estándar 30.
3.1.2 Determinar la concentración de proteína por el método de Bradford (Bio-Rad), y la carga de 50 a 80 g de proteína total por carril. Asegúrese de que todas las muestras se cargan por igual. Para los controles de carga, comparar las intensidades de una especie de proteína ubicua, tales como putativo Rubisco grandes cadenas que migran como una banda principal con una movilidad electroforética relativa de alrededor de 50 kDa, ya que pueden ser detectados en geles teñidos de azul de Coomassie o en Ponceau S-o fluorescente SYPRO Rubí teñido con membranas de nitrocelulosa. - Bloqueo
Bloquear la membrana con 5% de leche descremada en TBST (Tris-HCl 10, NaCl 140 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo primario
Diluir anticuerpo anti-epítopo principal en 1% de leche descremada en TBST a la concentración recomendada por el fabricante y se incuba con la membrana se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 º C con agitación suave. - Enjuague
Enjuague la membrana se enjuagó en 20 ml de TBST durante 15 min una vez, y dos veces durante 5 min a temperatura ambiente con agitación suave. - El anticuerpo secundario
Diluir anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-IgG de conejo) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en 1% de leche descremada en TBST como se recomienda por el fabricante y se incuba con la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. - Detección
Enjuague la membrana de nuevo como se describe en el Paso 3.4. Después del enjuague final en TBST, visualizar las proteínas de interés con un sustrato quimioluminiscente de HRP, más comúnmente usando un kit ECL.
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Representative Results
La Figura 1, adaptado de Zaltsman et al. 17, ilustra experimentos representativos para la detección de la degradación proteasomal en un sistema libre de células. En concreto, se demuestra la desestabilización de una planta relacionada con la defensa de proteínas VIP1 por la proteína F-box VBF través de la vía SCF VBF en N. benthamiana. VBF Arabidopsis y HA-etiquetados VIP1 (HA-VIP1) proteínas se coexpresan transitoriamente, y la proteína de contenido de HA-VIP1 dentro de extractos de las hojas que expresan fue analizada por Western Blot. Este análisis demostró que cantidades VIP1 se redujeron en un grado significativo cuando se coexpresan con VBF, pero se mantuvo relativamente estable en ausencia de VBF coexpresión (Figura 1A). Tenga en cuenta que una ligera reducción en el contenido VIP1 sin VBF puede ser debido al bajo nivel de la actividad VBF tabaco endógena. El mecanismo de degradación proteasomal de desestabilización VIP1 por VBF se infiere de su inhibition por MG132 (Figura 1A). La cuantificación de los resultados en la Figura 1A demostró casi completa (≥ 90 ± 5%) VIP1 por VBF, que fue bloqueada por MG132 (Figura 1B). Tenga en cuenta que los niveles ligeramente más altos de VIP1 en presencia de MG132 muy probablemente se explican por la inhibición de la actividad VBF endógena 17.
Figura 1. VBF promueve la degradación proteasomal de VIP1. HA-VIP1 se expresó solo o coexpressed con VBF en N. benthamiana deja. Los extractos de proteína resultantes se incubaron durante los períodos de tiempo indicados y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-HA. La cadena de gran putativo RuBisCO se utilizó como control de carga (A). Quantified señal de western blot se expresó como porcentaje de la señal obtenida en ausencia de VBF al comienzo del período de incubación. Los datos representan valores medios de tres experimentos independientes con desviaciones estándar indicadas (B). Esta figura es una adaptación de Zaltsman et al. 17
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Discussion
Este ensayo se basa en la expresión de las proteínas de la prueba en tejidos de la planta, por lo tanto, el potencial proceso de degradación proteasomal, obviamente, se produce ya dentro de los tejidos vivos. Nosotros ensayamos la desestabilización de proteínas, sin embargo, sólo en los extractos, con el tiempo de la muestra cero que sirve como el punto de referencia inicial. Por lo tanto, se define como un ensayo libre de células.
Un aspecto importante para el éxito de este ensayo es la elección correcta del vector de expresión a partir del cual se produce la proteína (s) de prueba. A menos que los anticuerpos específicos contra la proteína de prueba están disponibles, debe ser etiquetado con epítopo para la detección por Western Blot. La proteína marcada debe ser expresada a partir de un vector binario de Agrobacterium. Mientras que muchos de estos vectores están disponibles 26, se sugiere la utilización de vectores derivados de nuestro sistema de plásmido PSAT modular 24, que permite la inserción de un solo paso de casetes de expresión en los plásmidos binarios pPZP-RCS224-25. Otra ventaja del sistema de PSAT es que permite la expresión de múltiples genes de la misma vector de 25, que es especialmente útil para los experimentos de ensayo de varios sustratos de proteasomal o para estudiar los efectos de los interactores del sustrato probado, por ejemplo co-expresión de la Agrobacterium VirD5 proteína que interacciona con los resultados del sustrato proteasomal VirF en la protección frente a la degradación proteasomal VirF 22. Es importante destacar que la serie PSAT en expansión de vectores ya incluye vectores de epítopo etiquetado 27. Independientemente de la estrategia de clonación elegido, la secuencia que codifica la proteína epítopo de etiquetado de interés debe ser introducido en un vector binario para la posterior expresión en tejidos de las plantas. Dado que este ensayo usa la expresión transitoria, el vector binario no tiene que contener marcadores selección para la transformación estable, aunque su presencia no es perjudicial para la eficiencia del ensayo.
Aunque se logra mejor la coexpresión de varias proteínas de interés usando vectores de expresión de múltiples genes, también se puede hacer mediante la combinación de volúmenes equivalentes de cultivos líquidos de dos o tres cepas de Agrobacterium, cada uno de los cuales lleva una construcción binaria separada.
Otro punto crítico es que, en muchos casos, el ensayo de degradación proteasomal implica la expresión no sólo del sustrato de proteasomal, pero también de un componente de la vía de SCF. Por ejemplo, el objetivo podría ser experimental para probar si una proteína F-box reconoce y objetivos para la degradación de un sustrato específico. En este caso, este sustrato epítopo de etiquetado debe ser coexpressed con la proteína de la caja F sin etiquetar.
Para un análisis más detallado de los datos, el grado de degradación de la proteína puede ser fácilmente cuantificó mediante la medición de la intensidad relativa de las señales occidentales ucantar el último software ImageJ (NIH) 31. Al realizar esa cuantificación, es importante no sobre-desarrollar las transferencias Western para evitar la saturación de la señal. La cuantificación de datos también requiere que todas las muestras se cargan en el gel de SDS-poliacrilamida igualmente con respecto a su contenido en proteínas como la degradación de proteínas en este ensayo se detecta por la reducción en la intensidad de la banda de proteína apropiada. Esto se logra mediante la determinación del contenido de proteína de cada extracto celular y por consiguiente la verificación de la igualdad de carga de cada carril (véase el paso 3.1). Además, en cualquier experimento de transcurso de tiempo dado, todas las muestras deben ser derivados del mismo lote de extracto ayuda a asegurar la igualdad de carga.
El ensayo libre de células para la degradación proteasomal se describe aquí utiliza plantas como un sistema experimental. Sin embargo, el mismo diseño experimental podría ser utilizado para cualquier otro organismo. El ensayo también se puede extender por Further centrándose en la vía SCF. Por ejemplo, el mecanismo de SCF-dependiente de la degradación de proteínas se puede demostrar utilizando una forma dominante negativa de la Cullin1 componente SCF (CUL1 DN). Específicamente, un mutante de Arabidopsis CUL1 con residuos de aminoácidos eliminados entre las posiciones 1 y 420 se ha demostrado que la interacción con el componente Skp1/ASK1 del complejo SCF, pero no con RBX1, que representa el núcleo catalítico de SCF 22. La inhibición o reducción de la degradación del sustrato después de la coexpresión de CUL1 DN indica la implicación de la vía de SCF.
Nuestro ensayo utiliza proteínas de interés expresadas en los tejidos vegetales, en su ambiente natural. Una alternativa a este enfoque es purificar proteínas recombinantes, añadirlos a extractos de plantas, y seguir su degradación por el análisis occidental 32. No recomendamos esta táctica como metodología de elección porque las proteínas recombinantes no todos los díass reflejan fielmente las propiedades biológicas nativas, sin embargo, si la expresión in planta no es factible, el uso de proteínas recombinantes sin duda representa una alternativa valiosa.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido financiación del programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", cofinanciado por la Universidad de Málaga y el Programa de la Unión Europea el 7 º Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo anestesia general N º 246550. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por subvenciones del NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD y BSF a VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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