Summary
Neural progenitor mitose er en kritisk parameter for neurogenese. Meget af vores forståelse af neurale stamfader mitose er baseret på analyse af fast væv. Levende billeddannelse i embryonale hjernen skiver er en alsidig teknik til at vurdere mitose med høj tidslig og rumlig opløsning i et kontrolleret miljø.
Abstract
Skønt af kort varighed, mitose er et komplekst og dynamisk multi-trins proces grundlæggende for udvikling af organer, herunder hjernen. I udviklingslandene hjernebarken kan unormal mitose af neurale progenitorer forårsage defekter i hjernens størrelse og funktion. Der er derfor et kritisk behov for værktøjer til at forstå de mekanismer, neural stamcelle mitose. Cortical udvikling i gnavere er en fremragende model til at studere denne proces. Neural progenitor mitose er almindeligt undersøgt i faste hjernesnit. Denne protokol vil beskrive i detaljer en metode til billeddannelse af mitose i ex vivo embryonale hjernen skiver. Vi vil beskrive de kritiske trin for denne procedure, som omfatter: hjerne udvinding, hjerne indlejring, vibratome sektionering af hjernen skiver, farvning og dyrkning af skiver, og time-lapse billeddannelse. Vi vil derefter vise og beskrive i detaljer, hvordan at udføre post-erhvervelse analyse af mitose. Vi inkluderer repræsentative resultater frabout denne analyse ved hjælp af vital farvestof Syto11, transgene mus (histon H2B-EGFP og centrin-EGFP), og i livmoderen elektroporation (mCherry-α-tubulin). Vi vil diskutere, hvordan denne procedure kan bedst optimeres, og hvordan den kan modificeres til undersøgelse af genetisk regulering af mitose. Levende billeder af mitose i hjernen skiver er en fleksibel tilgang til at vurdere virkningen af alder, anatomi, og genetisk forstyrrelse i et kontrolleret miljø, og for at skabe en stor mængde data med høj tidslig og rumlig opløsning. Derfor denne protokol skal supplere de eksisterende redskaber til analyse af neurale stamfader mitose.
Introduction
Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive, hvordan at optræde live billeddannelse af neurale stamfader mitose i embryonale hjernen skiver. Brug af levende billeddannelse af hjernen skiver i kultur, denne protokol giver en enkel metode til at analysere flere aspekter af mitose i neurale stamfædre i et miljø meget lig en in vivo indstilling. Det kan anvendes til hjerner af mutante dyr og / eller hjerner, der er blevet manipuleret med i utero elektroporation) 1-5. Denne teknik er også ideel til at teste virkningen af farmakologiske midler på neurale prækursorer "mitose ved blot at tilføje et middel til dyrkningsmediet. I summen, vil denne artikel lave en teknisk udfordrende protokol tilgængelig for dem, der studerer neurogenesis.
Under neurogenese, adskilte neurale progenitorpopulationer gennemgå præcise divisioner til at generere neuroner, der i sidste ende bidrager til de seks kortikale lag af voksen neocortex 6-8. Tidligt i kortikale udvikling, den neurale forløber pulje udvider som neuroepitelceller (NE) celler deler symmetrisk til selv at forny. NE celler derefter konvertere til radiale gliaceller (rGCS). Oprindeligt rGCS opdele symmetrisk at producere to nye rGCS dog under hovedparten af neurogenese, rGCS 'vigtigste form for opdeling er asymmetrisk. I asymmetrisk opdeling, 1 RGC giver anledning til en ny RGC og enten en post-mitotisk neuron eller en mere specialiseret progenitor (enten en kort neural precursor (SNP), en ydre radial glia (ORG), eller et mellemprodukt progenitor (INP) 2,3,7,9. natur-, SNP'er og ORGS kan derefter generere neuroner på sub-ventrikulær, ventrikulær og basale regioner af hjernebarken, hhv. Derfor celledeling progenitorer er en grundlæggende fremgangsmåde til at generere neuroner i neocortex.
Talrige undersøgelser peger på en sammenhæng mellem specifikke mitotiske træk rGCS og skæbne datterceller. Haydar et al. Og Takahashi et al.har vist, at RGC mitotisk varighed og cellecyklus længde stigning som neurogenese provenu, en konstatering genlyd i opfølgende undersøgelser 10-13. En række undersøgelser har antydet, at mitotiske spindel-orientering i forhold til hjertekammer påvirker aspekter af neurogenese og corticogenesis, herunder typer af neuroner genererede og placering af afkom i hjernen, henholdsvis 3,10,14-16. Uanset om spaltning plane orientering direkte indflydelse celle skæbne er kontroversiel, men konklusionen er, at denne mitotiske parameter påvirkninger neurogenesis. Yderligere understrege vigtigheden i mitosen er den iagttagelse, at mange gener involveret i mekanikken i mitosen er afgørende for neurogenese og for korrekt hjernens udvikling 17-20.
Mitose er en dynamisk proces, men til dato de fleste undersøgelser beskriver neurale stamfader mitose udnytte analyse af faste vævssnit eller billeddannelse af neurale stamfædre via in vitro-cellekultur. Således mainstream metoder til at evaluere mitose kun give et øjebliksbillede af denne proces, og undlader at afdække, hvordan celler opfører sig på en væv. Live-billeddannelse af neurale stamfader mitose i stigende grad blevet et afgørende redskab til at forstå neurale stamfader funktion. For eksempler se disse referencer 4,8,10,21-25. Flere udestående protokoller er blevet offentliggjort til forberedelse og billeddannelse af hjernen skiver 26,27. Men til dato har en omfattende protokol for billedbehandling og analyse af mitose ikke beskrevet eller demonstreret i video.
Denne teknik giver flere væsentlige fordele i forhold fast analyse af hjernens sektioner. Time-lapse-analyse af hjernen skiver muliggør generering af betydeligt flere datapunkter, der kan analyseres på en fleksibel måde. For det første er data indsamlet på de enkelte tidspunkter i løbet af nogle minutter eller flere timer. Man kan analysere de enkelte tidspunkter (at oprette et statisk montage) ellerkan kombinere forskellige tidspunkter i film. For det andet, konfokal imaging skiver muliggør generering af data på forskellige Z-profiler i hjernen skiver. Som et resultat heraf kan de enkelte sektioner analyseres. Alternativt kan stakke af individuelle sektioner kombineres til en maksimal intensitet projektion. For det tredje analyse udført i forbindelse med et væv, der afslører, hvordan celler deler i forhold til de omkringliggende celler og strukturer. For det fjerde er det ideelt til analyse af mutanter, der viser nogle beviser for mitotiske defekter. Sammen denne protokol vil bidrage til at afklare vigtige skridt til at hjælpe efterforskere, der ønsker at udføre levende billeddannelse af neurale stamfader mitose i deres egne laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af medier (Figur 1, trin 1)
- Slice Culture Medium
- 25 ml skive dyrkningsmedium er tilstrækkelig til at forberede 5 glasbund retter med 2 skiver per brønd.
- I en 50 ml konisk rør, der tilsættes 250 pi af en 100x N2 opløsning og 500 pi af en 50x B27 løsning uden vitamin A. Læg DMEM/F12 til et volumen på 22,5 ml.
- Filtersteriliser opløsning og derefter tilsættes 1,25 ml varmeinaktiveret hesteserum og 1,25 ml føtalt bovint serum.
- Inkuber løsning i et vandbad ved 37 ° C for varigheden af udarbejdelsen af skiver.
- Tilføj vækstfaktorer (FGF og EGF, slutkoncentration på 10 ng / ml og 20 ng / ml) umiddelbart før begyndelsen af kulturen. Sammensætningen af dette medium er blevet optimeret til at fremme overlevelsen af celler i kultur, og at forøge proliferationshastigheden af neurale stamceller. Dette vil dermed maksimere sandsynligheden forobservere mitotiske celler i udsnittet.
- Fuld HBSS Dissektion Solution
- Forbered 500 ml komplet HBSS ved tilsætning af 50 ml 10 x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4, FC 2,5 mM), 6 ml 2,5 M D-glucose (FC 30 mM), 2,2 ml 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) og autoklaveret DIH 2 O til slutvolumen på 500 ml.
- Filtersteriliser opløsning og opbevares ved 4 ° C indtil indsamling af Uterushornene fra den gravide mus. Denne opløsning kan opbevares ved 4 ° C i flere uger.
- Hold HBSS på is under hele dissektion procedure.
- Embedding løsning
- For indlejring af 4 embryonale hjerner, forberede 30 ml 3% lavtsmeltende agarose i fuld HBSS løsning. I et 50 ml konisk rør, tilsættes 0,9 g lavt smeltende agarose og fuld HBSS til 30 ml.
- Bland opløsningen med en vortex mixer, og smelte i en mikrobølgeovn med røret stående og hætten åben.
- Mens der i mikrobølgeovn, overvåge løsningen på pRevent overløb på grund af overdreven kogning. Når kogningen begynder, stoppe mikrobølgeovn og vortex løsningen.
- Gentag disse trin, indtil al agarose er smeltet.
- Opbevar røret i et vandbad ved 42 ° C.
2.. Dissektion af embryoer (figur 1, trin 2)
- Efter nøje dødshjælp af den gravide mus, indsamle Uterushornene og overføre dem i en 10 cm 2 petriskål indeholdende kold fuld 1x HBSS. Alderen af embryonet kan variere afhængigt af undersøgelsen. Denne protokol er blevet anvendt med succes til dyrkning hjerneskiver fra embryonale dage E12.5 til E17.5. På grund af deres størrelse, yngre hjerner har en tendens til at være mere vanskeligt at arbejde med.
- Saml embryoner og dissekere de embryonale hjerner som beskrevet tidligere i rotter og mus 26,27, indtil en fuld embryonale hjerne herunder baghjerne og forhjernen med de to hjernehalvdele er opnået. Disse kan væreopbevares ved stuetemperatur, indtil alle hjerner er dissekeret.
- Saml embryoner og dissekere de embryonale hjerner som beskrevet tidligere i rotter og mus 26,27, indtil en fuld embryonale hjerne herunder baghjerne og forhjernen med de to hjernehalvdele er opnået. Disse kan opbevares ved stuetemperatur, indtil alle hjerner er dissekeret.
3. Integrering af Embryonale Brains (figur 1, trin 3)
- I en spand, som indeholder is, skabe et hul i isen for at indsætte indlægningsbetingelserne forme ind.
- Hæld 3% agarose medium i en plastik mug og placere at skimmelsvamp i hullet fremstillet i isen.
- Rør agarose medium med spidsen af et digitalt termometer, indtil temperaturen når 35 ° C.
- Straks overføre hjernen til indstøbningsmediet.
- Kritisk Trin: For at fjerne den overskydende HBSS på grænsefladen mellem hjernen og agarose, omhyggeligt og forsigtigt tumler / dreje hjernen gentagne gangei indlejring opløsning med pincet.
- En pude af geleret agarose vil danne bunden af formen i kontakt med isen. Når puden kan mærkes med spidsen af tangen under omrøring af hjernen, placere hjernen med den dorsale side opad. Hjernen skal ikke synke til bunden af formen.
4.. Fremstilling af agarose blok (figur 1, trin 4)
- Lad agarose hærde i is i mindst 5 min.
- Ved hjælp af et barberblad, punkt hjørnerne af formen.
- Skære forsigtigt en agarose blok omkring hjernen ved hjælp af et barberblad. Prøv at minimere antallet af nedskæringer for at undgå forstyrrende den indlejrede hjerne.
- Sørg for, at blokken har et større areal i den caudale del af hjernen (versus rostrale område, se figur 1, trin 4) for at øge stabiliteten af blok på sektionering piedestal.
- Den sidste snit bør være den ene på caudale side af hjernen;denne nedskæring vil definere den korrekte snitniveau med vibratome.
- Gør det ved at tilpasse bladet vinkelret på Rostro-caudale akse af hjernen og agarose blok. Glid ned bladet caudally langs Rostro-caudale akse og foretage den endelige cut omkring 5 mm væk fra den mest kaudale region af hjernen.
- Sæt agarose / hjerne blok til side og gentag indlejring af andre hjerner.
5.. Overførsel af de indlejrede Brains i bakken af Vibratome (figur 1, trin 5)
- Tilføj en dråbe lim på bunden af vibratome bakken. Placer lim så agarose blokke vil blive placeret inden for rækkevidde af den vibrerende kniv.
- Placer agarose / hjerne blok caudale nedad på kanten af spatel, med omkring 50% af blokken tippe over kanten af spatel.
- Påfør den kaudale flade af agarose blok til lim og skub spatel væk, opretholdelse agarose blok til bunden af bakken med shoulder af en pincet. Lad ikke spatel kontakte lim.
- Lad limen størkne ved stuetemperatur i 5 min.
6.. Sektionsinddeling af Embedded Brains (Figur 1, trin 6)
- Fyld vibratome bakke med HBSS.
- Definere start og slut positioner vibratome bladet.
- Generer 200-250 um skiver. Med VT1000s vibratome Brug følgende parametre: hastighed 2 - 4, frekvens 8.
- Fjern forsigtigt skiver fra vibratome da de er skåret. Overfør skiverne med en spatel, og bagenden af pincet i 12 brøndskåle fyldt med fuld HBSS. Alternativt nogle forskere har brugt en pensel i stedet for pincet Key punkt:. Under overførslen passe på, at hjernen skiver forbliver fastgjort til den omgivende agarose.
7.. Syto11 Farvning af Skiver (figur 1, trin 7)
- Fortynd Syto11 til en endelig koncentration på0,5-1 uM i skive dyrkningsmedium suppleret med vækstfaktorer.
- I brønden af en 12-brønds plade, inkuberes skiver fra en hjerne i 2,5 ml farvningsopløsningen i 1 time ved 37 ° C.
- Vask skiverne i 2,5 ml skive dyrkningsmedium uden farvning opløsning i 20 minutter.
8.. Montering af skiver i et glas bund Dish (figur 1, trin 8, 9)
- Forbered 15 pi indlejring kollagen opløsning pr skive. Der fremstilles en 1,5 mg / ml collagen-opløsning ved at blande 375 pi af 3 mg / ml collagen type I-opløsning med 75 pi 10x DMEM, 9,4 ul af 1 M NaOH, og 290 pi H2O Opbevar på is.
- Anbring en 15 pi dråbe af kollagen opløsning ved bunden af en 35 mm glasbund Microwell parabol. Spred det med en pipettespids til at matche størrelsen på den skive.
- Overfør skive i drop af kollagen med en spatel og pincet Key punkt:. Montering af flere skiver i forskelligskellige retter øger sandsynligheden for at erhverve skiver egnet til billeddannelse. Screen gennem forskellige skiver, og vælge dem, der bedst opfylder kriterierne beskrevet nedenfor i afsnittet "Repræsentative resultater".
- Lad skiverne inkuber ved stuetemperatur i 10 min før overføre dem i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Efter 20 minutter tilsættes 1,2 ml af skive dyrkningsmedium i Glass Bottom Microwell parabol. Tilsættes 600 pi medium ved en tid og sprede det med en pipettespids.
- Fang et lav forstørrelse billede af hjernesnit at optage den anatomiske niveau og integritet udsnittet.
9.. Levende Imaging af Skiver (figur 1, trin 10, 11)
- Lad skiverne komme i inkubatoren i mindst 1 time og 30 min ved 37 ° C med 5% CO 2, før direkte billedvisning.
- Billede skiverne med mikroskop valg, holde sig for øje, at Syto11 er meget tilbøjelige til at fotoblegning. Her en inverterted spinning disk konfokalt mikroskop anvendes (Andor XD revolution roterende skive konfokalt mikroskop). Alternativt laserscanning konfokal mikroskop kan anvendes. Følgende parametre er for roterende skive mikroskopopstilling.
- Under hele levende billeddannelse session, vedligeholde skiver ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig rugekammeret knyttet til mikroskopet.
- Billede celler med en 60X silicium olie mål med en arbejdsafstand på 300 um og en numerisk åbning på 1,3 (for eksempler se figur 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). En 100X olie mål med en arbejdsafstand på 130 um og en numerisk apertur på 1,4 (se for eksempel figur 4C) kan også anvendes. Opløsningen på kameraet er 512 x 512.
- Billede cellerne i et 30 um z-stak, med midten af z-stakken ligger omkring 40 um under overfladen af den skive. Forsøger at billedet dybere ind i vævet kan forårsage det formål at tilføjemekanisk tryk på den skive. Dette kan påvirke integriteten af hjernesnit. Hvis planlægger at lave 3D rekonstruktioner af cellerne, skal du bruge en z-interval på højst 2 um.
- Juster laser magt og eksponering gange for at begrænse fotoblegning. Brug eksponeringstider spænder fra 30 til 200 millisekunder, afhængigt af intensiteten af Syto11 signal.
- Med en motoriseret scene, billed flere positioner på tværs af flere skiver monteret i 1 fad. For eksempel billede op til 20 stillinger spredt over 4 forskellige skiver i 1 enkelt skål.
- For levende billeddannelse, bruge en tidsmæssig opløsning på mindre end 5 min til at muliggøre identifikation af de forskellige faser i mitosen. Brug Syto11 og / eller histon H2B-EGFP, 4 - 5 timer af levende billeddannelse er tilstrækkelige til at iagttage et betydeligt antal mitotiske celler. Men hvis imaging tyndt mærkede mitotiske celler (såsom dem, der opnås ved in utero elektroporation), derefter en længere imaging parameter (natten) er hensigtsmæssig og arbejder vill.
Bemærk: Brug denne protokol, typisk observere vi i gennemsnit 10 mitotiske celler pr position. Som anført ovenfor, billedbehandling flere monterede skiver øger sandsynligheden for at have en vellykket eksperiment. Med denne tilgang, vi typisk identificere mitotiske celler i næsten alle eksperimenter udført med Syto11 eller histon H2B-EGFP.
10.. Post-køb Analyse af mitosen (figur 2)
Alle de procedurer i dette afsnit er blevet optimeret i Fiji (ImageJ), hvilket er fordelagtigt, fordi det er et gratis open source-software. Andre software-løsninger er tilgængelige til at udføre de samme opgaver, såsom Metamorph, Imaris, og Amira.
- Identifikation af Mitotisk Tal i Fiji
- Efter åbning af datasæt for en position som et "hyperstack", vælg en z-plan (se figur 2A for placeringen af scroll bar) hvor vævet og cellerne ser sunde (se kriterierne i diskussionen afsnit).Rul over den tidslige dimension til at identificere celler går gennem anafase, da det er den nemmeste mitotiske fase at identificere.
- Gå tilbage i tiden for at identificere det tidspunkt, hvor cellen træder mitose (DNA kondens). Cellen kan bevæge sig på tværs z-fly, men den tidsmæssige opløsning og z-stack parametre beskrevet tidligere er blevet optimeret til at muliggøre denne proces.
- I et regneark, optage 4D koordinater cellen i hyperstack (X, Y, Z og tid, se figur 2A at visualisere placeringen af disse tal i Fiji interface) da den går ind mitose. Kendskab til disse koordinater vil forhindre at tælle den samme celle flere gange.
- Rul fremad i tid og registrere det tidspunkt, hvor cellen går fra én fase til en anden. Dokumentere varigheden af hver mitotiske fase for en given celle.
- Fortsæt med andre celler, på tværs af hele datasæt (flere celler inden for og på tværs af positioner).
- 3D Genskabion af cellerne og Kvantificering af Rotation Under Metaphase (Tilpasset fra Haydar et al, 2003) (figur 2B).
- Efter at have identificeret flere mitotiske celler, skal du bruge koordinaterne for en celle, og rul frem i tiden indtil begyndelsen af metafase.
- Drej hele "hyperstack", således at den ventrikulære grænse er plant (ved hjælp af "Image / Transform / Rotate ..." kommando). Brug "vinkel" værktøj til at bestemme vinkel til at ansøge om denne rotation.
- Identificer z-plan, hvor cellen af interesse er de mest synlige. I dette plan, bruge "rektangel udvælgelse" værktøj til at tegne en markering, der omfatter hele cellen.
- Identificer z-planer, der omfatter cellen af interesse. Brug "Image / Dupliker" kommando til at oprette en "sub-stakken". I dialogboksen, forlade "Dupliker hyperstack" markeret. Den "Skiver (z)" parameter svarer til Z-planer, herunder hele cell, og "Frames (t)" parameter, der svarer til det aktuelle tidspunkt.
- Hvis opløsningen er dårlig, øge størrelsen af "sub-stack" ved hjælp af "Image / Adjust / størrelse ..." kommando.
- Generer en 3D-rekonstruktion af cellen på det aktuelle tidspunkt ved hjælp af "Image/Stacks/3D projekt ..." kommando. Parametrene til denne kommando er vist i figur 2B. Den "Udsnit afstand" svarer til intervallet mellem hver af de z-plane billeder (mM). Vigtigt: Sørg for, at den fysiske dimension (mM) i sub-stakken er blevet bevaret. Hvis ikke, vil interpolation af pixels i z dimensionen være ukorrekt, og 3D-rekonstruktion vil være unøjagtig.
- Brug rullepanelet, rotere den resulterende 3D-rekonstruktion, således at kanten af metafaseplade er synlig. Antallet af rammen svarer til beta-vinkel der er beskrevet i figur 3B optage dette nummer. Brugden "vinkel" værktøj og "Analyze / Measure ..." kommando, måle vinklen mellem vandret og en linje som gennemskærer metafaseplade vinkelret (figur 2B). Det er den vinkel alfa.
- Noter disse vinkler for alle metafase tidspunkter i cellen af interesse. Drejningsvinklen mellem tidspunkter (t) og (t-1) er lig med den absolutte værdi af forskellen mellem en vinkel (t), og denne vinkel (t-1).
- Måling af orienteringen af Spaltning Plane
- 3d rekonstruere en celle af interesse på et tidspunkt i løbet anafase følge instruktionerne beskrevet for 3D-rekonstruktion af metafase plader.
- Drej genopbygning indtil kanterne af de to plader, der dannes af segregerende kromosomer er synlige.
- Brug vinkel værktøj til at måle vinklen mellem den vandrette (ventrikulære kant) og en linie parallelt med de to plader dannet af segregerende kromosomer. Det er den vinkel af spaltning plan (figur 2C).
- Generering af film
- Da cellerne bevæger sig ofte på tværs af forskellige z-fly, identificere z-fly besat af cellen i live imaging session. Generer en "Maksimal intensitet fremskrivning" af disse z-fly ved hjælp af "Image / Stacks / Z projekt ..." kommando. Gem den resulterende stak som en ". TIF" fil.
- Åbn denne fil i 1.45-versionen af ImageJ som Fiji ikke omfatter et stabilt plugin til dannelsen af ". Mov" eller ". Avi" filer.
- Brug "File / Gem som / ..." kommando af ImageJ at generere en film i et format kompatibelt med din down-stream-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen for denne analyse og observation af flere mitotiske celler under en live-imaging session i høj grad afhænge af både integritet og anatomiske niveau i skive, hvor opkøb er foretaget. Som diskuteret nedenfor anatomiske niveau af en skive er en vigtig faktor. Figur 3A viser Rostro-caudale medial-lateral steder, hvor vi har været mest vellykkede. For yderligere diskussion af dette emne se Noctor 26.. Integriteten af skive kan variere i forskellige regioner af skive. Dette kan bestemmes forud for begyndelsen af den time-lapse (ved hjælp af scanning af hele skive som i trin 7.6). I et godt område af en E13.5 hjerne kan gøres følgende bemærkninger: mange mitotiske celler vil blive fundet ved ventrikel grænsen, de interfase kerner vil blive formet elliptisk snarere end runde, og interfase kerner vises søjleformede forhold til ventrikel grænsen . I et mindre ønskeligt region af hjernen,kerner vil se afrundet og noget uorganiseret (Sammenlign 3B og 3C, og se figur 3D til et billede af en godt monteret skive).
Når ideelle betingelser opfyldes, vil dette assay muliggøre kvalitativ identifikation af forskellige faser af mitose. Disse kan detekteres ved analyse af DNA-mønster (se figur 3E for eksempler på apikalt delende celler i hver fase af mitose). Under prophase vil DNA kondens har udseende tyndt mærket DNA (DNA-rige og DNA-fattige regioner i kernen). Under metafase, kromosomerne danner et plan ved ækvator af cellen kroppen. Afhængigt af orienteringen af flyet, DNA mønster er enten (i) en tyk streg (Figur 3E, view 1), eller (ii) en "roset" med en DNA-fattig region i midten (figur 3E, view 2) . Under anafase når kromosomer adskilt, de ligner "hænder"; at migrere i modsatte retninger. Denne fase kan være svært at identificere, når spaltningen flyet er i X - Y planet for erhvervelsen. Under telofase DNA slapper af og får en ellipsoide form som reformer af den nukleare kuvert. Individuel tidspunkter kan indsamles at visualisere mitose over tid (se figur 3F).
Ud over at billeddannelse mitose af apikalt delende stamfædre, kan denne analyse bruges til billedet basalt dividere celler såsom orgs eller INPS er sidstnævnte som mest sandsynligt er repræsenteret i figur 3G. Sådanne celler kan identificeres ved deres placering til division i SVZ lag. Men lige markere disse celler er det bedst at koble analyse med ekspression af en fluorescerende markør, etiketter processen i cellen eller skæbne (se figur 4B-D). Natur-hverken vil have en apikal heller basal proces, vil orgs have en basal proces med deres celle, der er beliggende i de yderste lag, og rGCS vil have en basal processen med deres celle organ placeret i VZ lag.
Mitose af progenitorer kan visualiseres med alternative metoder. Figur 4A viser anvendelse af histon H2B-EGFP transgene mus til at mærke kromosomer alle delende celler. Dette markerer celler i et mønster, der svarer til Syto11. Figur 4B viser billeddannelse udført med hjerner i livmoderen elektroporerede med EGFP-α-tubulin og histon H2B-mCherry. Som påvist, dette gør det muligt at visualisere både mikrotubuli og kromosom, og derudover cellen kroppen og basal proces. Figur 4C afbilder billeddannelse udført med hjerner fra et Centrin-EGFP mus, i livmoderen elektroporeret med mCherry-a-tubulin og histon H2B-EGFP . Som påvist, dette gør det muligt at billedet kromosomer og centrioler i den grønne kanal og mitotiske spindel celle krop / proces i den røde kanal. Figur 4D viser billeddannelse udført med hjernes in utero elektroporerede med CMV-Cre tyndt og CALNL-EGFP 28. Denne teknik gør det muligt at tyndt label dividere stamfædre, hvilket gør analyse af de enkelte delende celler lettere. Når du bruger elektroporation dog huske på, at denne metode er rettet mod en forholdsvis synkroniseret kohorte af cykling celler 2,12. Det betyder, at timingen af levende billedbehandling i forhold til elektroporation skal justeres, således at den kohorte af elektroporerede celler nærmer mitose ved begyndelsen af det billeddannende session. Hvis ikke, kan succes af forsøget med at identificere eventuelle mitotiske celler være i fare i en kortsigtet imaging session.
Når ideelle betingelser er opnået, kan de vigtigste funktioner i mitose måles kvantitativt herunder den overordnede mitose varighed, varighed af enkelte faser, drejning af metafase flyet og spaltning plane orientering. I de beskrevne betingelser, har vi observeret en gennemsnitlig samlet mitotisk varighed 1 time30 min ved embryonale dage (E) 13.5 og 14.5. Som tidligere beskrevet kan måles rotation metafase DNA plan i en enkelt tidspunkt eller kumulativt over varigheden af en hel metafase 2,6,9,10. Dette kan opnås ved hjælp af 3D-rekonstruktion af metafase plan af en celle på hvert tidspunkt og måling af vinkler af DNA i forhold til ventriklen. Vi har med succes anvendt den metode i dette dokument til at følge celler i mindst 3 timer.
Figur 1.. Skematisk repræsentation af trin i protokollen. Tidsforbrug til hvert trin er angivet under hvert af trinene. Oplysninger om hvert af disse trin er beskrevet i afsnittet "protokol". Bemærk, at Trin 7 kan omgås, når billeddannelse skiver fra histen H2B-EGFP embryoer eller skiver fra hjerner, der var elektroporeret med plasmider, der udtrykker markører for mitose.
Figur 2.. Post-køb analyse af time-lapse video mikroskopi datasæt i Fiji (ImageJ). A) Placering af de forskellige værktøjer, der anvendes til analyse i Fiji. B) forskellige trin, der er involveret i 3D-rekonstruktion af en celle i metafase. Oplysninger om hvert af disse trin er beskrevet i afsnittet "protokol". C) Måling af spaltning plane orientering i en 3D rekonstrueret celle ved anafase. Bemærk, at tallene i B Trin 6 og C viser sekvensen fulgt for at måle vinklen. D) repræsentative data viser distribution af metafase varighed i en gruppe af mitotiske celler observeret ved den ventrikulære grænse i E13.5 hjerneskiver (n = 35). E) Repræsentative data, der viser den kumulative rotation af metafase plader i E13.5 mitotiske celler ved grænsen af ventriklen . Klik her for at se større billede.
Figur 3.. Eksempler på repræsentative data fra levende billedbehandling analyse. A) Langs dorso-ventrale akse er mitose lettest afbildet i dorsale områder af hjernen skiver, fordi den basale proces rGCS er kortere og dermed mindre tilbøjelige til at blive brudt af vibratom. Langs Rostro-caudale akse, skiver i de caudale regioner af dorsale cortex givermest konsistente resultater i vores hænder. B og C) er vist eksempler på en god region (B) og en dårlig (C) til billeddannelse. I et godt område, er kerner elliptisk formet (kredsede regioner) og mange mitotiske celler observeres ved grænsen til ventriklen før time-lapse imaging (pile). I en dårlig område, er meget få mitotiske celler observeret ved grænsen til ventriklen (single pil) og kerner er runde (kredsede områder). D) Eksempel på en god skive observeret med en lav forstørrelse mikroskop før leve billeddannelse. E) Eksempler på Syto11 mærkede celler i forskellige faser i mitosen, som nævnt F) Montage af et område ved grænsen til ventriklen, hvor to neurale stamfædre gå gennem de forskellige faser i mitosen, markeret med forskellige farver (tid, tt:. mm). G) Montage i en region fremhævet i (B), hvor et neuralt stamfader opdeler i væk fra den ventrikulære grænse. I montager (D) og (E), ceLLS blev pseudo farvet ved hjælp af Photoshop til at fremhæve de forskellige mitotiske faser. (skalapanelerne: B, C, F: 10 m; D: 1 mm, E, G: 5 m).
Fig. 4. Eksempler på alternative værktøjer til at visualisere mitose af neurale stamceller. A) Montage af et område ved grænsen til ventrikel i en hjerne skive fra en histon H2B-EGFP transgene embryo på E13.5. Én stamfader er observeret som det fortsætter gennem de forskellige faser af mitosen. B) Montage af en VZ på E14.5 i den pågældende del af en hjerne, der blev elektroporeret ved E13.5 med vektorer, der udtrykker EGFP-a-tubulin og H2B-mCherry. EGFP-a-tubulin tillader visualisering af mikrotubuli dynamikken under mitosen (B 1-B 2) C) Montage af en ventrikulær region i enn E15.5 hjerne fra en Centrin-EGFP transgene embryo, der blev elektroporeret ved E14.5 med plasmider, der udtrykker mCherry-a-tubulin og H2B-EGFP. Centrin-EGFP tillader visualisering af centrioler dynamik under mitosen (C 1 og C 2). D) Montage i en region, der viser IZ af en E14.5 hjerne skive hvor celler blev tyndt mærkes af elektroporation ved E13.5 med en lav koncentration af et plasmid, der udtrykker Cre og en standard koncentration af et plasmid, der udtrykker EGFP efter Cre rekombination 28. Den dividere celle i denne montage har morfologi en RGosvz med en lang basal proces (lyserøde pile) og ingen apikale proces 9. Målet anvendes til billeddannelse af (A) og (B) eksempler er en 60X silicium objektiv olie, 100X olie mål for eksempel (C) og 10X luft målsætning for eksempel D. tidsmæssige opløsning, der bruges til billedet (A) , (B), (C) og (D) eksempler var 4 min, 4 min, 30 sek, og 5 min, hhv. VZ: Ventrikulær Zen, IZ: mellemzone, RGosvz: ydre subventricular zone radial glia-lignende celle. (skalapanelerne: A: 15 pm, B, C, D: 5 m, C 1, C 2: 2,5 um) Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den største fordel ved protokollen vi har beskrevet, at det giver en dynamisk tidsmæssige opløsning i mitosen af neurale stamceller. Typisk er assays at visualisere mitose i hjernens udvikling udført ved hjælp immunfluorescens af faste vævssnit. Men denne tilgang kun giver et øjebliksbillede af mitose på et tidspunkt.
Der er flere trin, der er mest kritiske for billeddannelse mitose i hjernen skiver: 1) De hjernen skiver skal forblive fastgjort til agarose, for at bevare integriteten af hjernens sektioner under overførsel og montage. 2) For produktion og billeddannelse af skiver, kontrol af Rostro-caudale niveauer er vigtig. Kaudale hjerneskiver er typisk bedst, fordi der i disse skiver, vil de basale processer RGC holdes intakt, hvilket er sundere for cellerne. 3) For levende billeddannelse, brug af en konfokal spinning-disk-mikroskop med en 60X målsætning er bedst for både høj opløsning og for at undgå fotoblegning af ssempler, som kan opstå med Syto11 farvestof. 4) For levende billeddannelse, de tidsmæssige parametre for overtagelsen er kritiske. Afhængig mikroskopet udstyr, kan tidsforskudt udføres spænder fra hver min til hver 10 min. Større end 10 min er typisk for lang tid at opnå dynamikken i mitosen høj opløsning.
Denne protokol har dog visse begrænsninger. Forsøget udføres med ex vivo væv. Det er tænkeligt, at bemærkningerne i hjernen skiver kan være forskellige in vivo. Derfor, når sammenligninger blandt eksperimenter udført på forskellige dage eller ved hjælp af forskellige prøver, følgende parametre skal holdes konstant: brug af lignende Rostro-caudale og dorso-laterale plan, indholdet af medier, brug af mikroskop og virksomhedsovertagelse parametre. Desuden fototoksicitet er muligt med langvarig billeddannelse. Derfor flere eksperimenter bør udføres før konklusioner. Desuden Syto11 selv kunne potentially påvirke mitotiske begivenheder, især i en mutant baggrund. Derfor anbefales det, at når man laver konklusioner om mitose baseret på Syto11, de bekræfter også resultaterne ved hjælp af uafhængige analyser, såsom markører, der er beskrevet i figur 4..
Som beskrevet i protokollen, kan mitose skal afbildes efter mærkning kromosomer og cytoskelettet på forskellige måder. Andre syto farvestoffer kan anvendes til at visualisere mitose i andre fluorescerende kanaler. I stedet for at bruge Syto11 farvning til at visualisere DNA, kan skiverne dannes fra fluorescerende transgene linier. For eksempel, som påvist histon H2B-EGFP transgene linier kan anvendes 29. Anvendelse af histon H2B-EGFP er særlig nyttig og anbefales til bekræftelse af en eventuel fænotype observeret med Syto11 behandling. Desuden kunne det også være nyttigt til at overvinde udfordringer forbundet med fotoblegning med Syto11. Brug af andre transgene linier, såsom centrin-EGFP 30, kanbruges til at visualisere centrioler, komponenterne i centrosomes. Mens disse alene ikke ville være tilstrækkeligt til at visualisere mitose, de arbejder godt sammen med andre markører for kromosomer eller mikrotubuli. Sådanne markører kan indføres ved i livmoderen elektroporation 4,5,10,31,32. Som vist kan ekspression af fusionsproteiner en dag før dissektion være nyttige for denne fremgangsmåde. Det er vores erfaring, kan udtrykke konstruktioner under en KAG promotor ofte give robust udtryk inden for en dag. For eksempel indførte vi α-tubulin og histon H2B-EGFP i embryonale hjerner ved hjælp af denne fremgangsmåde.
Når denne teknik beherskes der yderligere modifikationer, der kan foretages for fremtidige forsøg. In utero elektroporation kan også bruges til at manipulere genekspression. For eksempel kan indførelse af shRNA eller cDNA'erne være nyttigt at fastslå virkningen af tab af funktion eller overekspression af et gen af interesse på neural progenitor mitose 33.. Desuden kan skiver behandles med kemiske stoffer eller små molekyler til at måle effekten af at hæmme signalveje eller molekyler ved mitose 34,35.
I vores procedure beskriver vi imaging udføres ved hjælp af en roterende disk konfokal. Den største fordel ved en roterende skive konfokalt mikroskop er hastigheden af erhvervelsen. Dette muliggør billeddannelse af flere positioner fra forskellige hjernen skiver i en live-imaging session med en høj tidslig opløsning, og en rimelig billedkvalitet. Andre opstillinger, såsom en multi-foton laser scanning konfokal mikroskop give mulighed for at erhverve billeder af høj kvalitet dybt ind i vævet, hvor de radiale glialceller er mindre tilbøjelige til at blive afskåret i niveau af basal proces. Det vil derfor øge sandsynligheden til billede sunde neurale stamceller. Men er dette normalt forbundet med en ofring af hastigheden på overtagelsestidspunktet. Dette vil igen begrænse numtallet af stillinger, der kan afbildes i løbet af en billeddannelse session, såvel som den tidsmæssige opløsning. Billeddannelse af mitose kan også udføres på et bredt felt mikroskop. Men i dette tilfælde er det bedst at billedet tyndt mærkede celler, i modsætning til histon H2B-EGFP eller Syto11, som den generelle lysstyrke af disse reagenser ville gøre imaging meget vanskeligere. Også protokollen beskrevet her anvender et inverteret mikroskop. De vigtigste fordele ved et inverteret mikroskop er mulighed for at bruge høj opløsning mål oliepriser og den frie bevægelighed, når mikroskopet er kombineret med en motoriseret scene. Som en konklusion, forsøgslederen har brug for at finde en balance mellem de fordele og ulemper ved en bestemt opsætning og formålet med et eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne erkender finansiering fra NINDS / NIH, R00-NS064197 og NINDS / NIH, R01NS083897 (både DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
