Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

Abstract

למרות של זמן קצר, מיטוזה היא תהליך רב שלבים מורכב ודינמי בסיסי להתפתחות של איברים, כולל המוח. בפיתוח קליפת המוח, מיטוזה חריגה של אבות עצביים יכולה לגרום למומים בגודל המוח ותפקודו. לפיכך, יש צורך קריטי בכלים להבין את המנגנונים של מיטוזה העצבית. התפתחות קליפת המוח במכרסמים היא מודל יוצא דופן ללימוד התהליך הזה. מיטוזה העצבית נבחנה בדרך כלל בחלקים במוח קבועים. פרוטוקול זה יתאר בפירוט גישה להדמית חיה של מיטוזה בvivo לשעבר פרוסות מוח עובריים. נתאר את השלבים הקריטיים בהליך זה, הכולל: שאיבת מוח, הטבעת מוח, חתך vibratome של פרוסות מוח, מכתים וculturing של פרוסות, וזמן לשגות הדמיה. אז תוכל להפגין ולתאר בפירוט כיצד לבצע ניתוח שלאחר הרכישה של מיטוזה. אנו כוללים fr תוצאות נציגאום assay זה באמצעות הצבע Syto11 החיוני, עכברים הטרנסגניים (היסטון H2B-EGFP וcentrin-EGFP), וelectroporation ברחם (mCherry-α-טובולין). נדון כיצד הליך זה יכול להיות מותאם הכי טוב ואיך זה יכול להיות שונה למחקר של רגולציה הגנטית של מיטוזה. הדמיה חיה של מיטוזה בפרוסות מוח היא גישה גמישה על מנת להעריך את ההשפעה של גיל, אנטומיה, והפרעות גנטיות בסביבה מבוקרת, ולייצר כמות גדולה של נתונים ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה. מכאן פרוטוקול זה ישלים כלים קיימים לניתוח של מיטוזה העצבית.

Introduction

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית בפרוסות מוח עובריים. באמצעות הדמיה חיה של פרוסות מוח בתרבות, פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לassay היבטים רבים של מיטוזה בתאי אב עצבי בסביבה דומה מאוד להגדרת in vivo. זה יכול להיות מיושם על מוחם של בעלי חיים שעברו מוטציה ו / או מוח שעברו מניפולציה עם electroporation ברחם) 1-5. טכניקה זו היא גם אידיאלית כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים תרופתיים במיטוזה 'המבשרים עצביים, פשוט על ידי הוספת סוכן למדיום לתרבות. לסיכום, במאמר זה להפוך את פרוטוקול מאתגר מבחינה טכנית נגיש ללומדי נוירוגנזה.

במהלך נוירוגנזה, אוכלוסיות עצביות שונות לעבור חטיבות מדויקות כדי לייצר נוירונים שסופו של דבר יתרמו לשש שכבות בקליפת המוח של המבוגרים הניאוקורטקס 6-8. בשלב מוקדם בהתפתחות קליפת המוח, הבריכה העצבית המבשרת מתרחבת כneuroepithelial תאים (NE) לחלק באופן סימטרי לחידוש עצמי. תאי NE לאחר מכן להמיר לתאי גלייה רדיאלי (RGCs). בתחילה RGCs לחלק באופן סימטרי כדי לייצר שתי RGCs החדש, לעומת זאת בחלק הארי של נוירוגנזה, המצב העיקרי 'RGCs של החלוקה הוא סימטרי. בחלוקה סימטרית, 1 RGC מוליד RGC חדש וגם נוירון לאחר mitotic, או אב מתמחה יותר (או מבשר קצר עצבי (SNP), גליה חיצונית רדיאלי (ORG), או אב ביניים (INP) 2,3,7,9. INPS, SNPs, וorgs אז ניתן להפיק תאי עצב בתת חדרית, חדרית, ואזורי בסיס של קליפת המוח, בהתאמה. לפיכך, חלוקת תא של אבות הוא תהליך בסיסי ליצירת נוירונים של קליפת מוח.

מחקרים רבים מצביעים על קשר בין תכונות ספציפיות mitotic של RGCs וגורלם של תאי בת. חיידר ואח'. ואל טקהאשי et.הראו כי משך המיטוטי RGC ולהגדיל את אורך מחזור התא כתמורת נוירוגנזה, ממצא הדהד במעקב מחקרים 10-13. מספר המחקרים הציעו כי ציר mitotic אורינטציה ביחס לחדר משפיע על היבטי הנוירוגנזה וcorticogenesis, כוללים סוגים של נוירונים שנוצרו ומיקום של צאצאים במוח, בהתאמה 3,10,14-16. האם נטייה מטוס המחשוף משפיעה ישירות על גורל תא הוא שנוי במחלוקת, אבל המסקנה היא שנוירוגנזה משפיע פרמטר המיטוטי זה. יתר על כן מדגישה את החשיבות של מיטוזה היא התצפית כי גנים רבים המעורבים במכניקה של מיטוזה הם קריטיים עבור הנוירוגנזה להתפתחות מוח תקינה 17-20.

מיטוזה היא תהליך דינמי, אך עד כה רוב המחקרים המפרטים מיטוזה העצבית לנצל ניתוח של סעיפים קבועים רקמה או הדמיה של אבות עצביים באמצעות תרבית תאים במבחנה. לכן, שיטות הזרם המרכזי כדי להעריך מיטוזה רק לספק תמונת מצב של תהליך זה ולא מצליחים לגלות כיצד תאים להתנהג ברקמות. הדמיה חיה של מיטוזה העצבית הפכה יותר ויותר כלי קריטי להבנת תפקוד עצבי. לדוגמאות ראו אזכור אלה 4,8,10,21-25. כמה פרוטוקולים מצטיינים כבר פורסמו לעריכה ולהדמיה של פרוסות מוח 26,27. עם זאת נכון להיום, פרוטוקול מקיף להדמיה וניתוח של מיטוזה לא תואר ולא הוכיח בוידאו.

טכניקה זו מציעה כמה יתרונות משמעותיים על פני ניתוח קבוע של חלקים במוח. ניתוח זמן לשגות של פרוסות המוח מאפשר דור של באופן משמעותי יותר נקודות נתונים שיכולים להיות מנותח באופן גמיש. ראשית, הנתונים שנאספו בנקודות זמן בודדות במהלך כמה דקות או כמה שעות. אפשר לנתח את נקודות זמן בודדות (כדי ליצור מונטאז' סטטית) אוניתן לשלב נקודות זמן שונות לסרטים. שנית, ההדמיה confocal של פרוסות מאפשרת דור של נתונים בסעיפי Z שונים בפרוסות מוח. כתוצאה מכך, ניתן לנתח קטעים בודדים. לחלופין, ערימות של חלקים בודדים ניתן לשלב הקרנת עוצמה מקסימלית. שלישית, ניתוח נעשה בהקשר של רקמה, וחושף כיצד תאים מתחלקים ביחס לתאים ומבנים שכנים. רביעית, הוא אידיאלי לניתוח מוטציות שמראות כמה עדויות של פגמים mitotic. יחד פרוטוקול זה יעזור להבהיר את השלבים קריטיים כדי לסייע לחוקרים המבקשים לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית במעבדות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיה (איור 1, שלב 1)

  1. פורסים תרבות בינונית
    1. 25 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה הוא מספיק כדי להכין את מנות תחתית זכוכית 5 עם 2 פרוסות בכל טוב.
    2. בצינור חרוטי 50 מיליליטר, להוסיף 250 μl של פתרון N2 100x ו500 μl של פתרון 50x B27 ללא ויטמין A. הוספת DMEM/F12 להיקף של 22.5 מיליליטר.
    3. סנן לעקר פתרון ולאחר מכן להוסיף 1.25 מיליליטר של סרום סוס מומת חום ו1.25 מיליליטר של סרום שור העובר.
    4. דגירה פתרון באמבט מים על 37 מעלות צלזיוס למשך הכנת פרוסות.
    5. הוספת גורמי גדילה (FGF וEGF, ריכוז סופי של 10 ng / ml ו20 ng / ml, בהתאמה) מייד לפני תחילתה של התרבות. ההרכב של המדיום הזה בצורה מיטבית כדי לקדם את הישרדותם של תאים בתרבית ולהגביר את קצב ההתפשטות של אבות עצביים. זו ובכך תהיה למקסם את ההסתברות ללהתבונן תאי mitotic בפרוסה.
  2. מלא HBSS Dissection פתרון
    1. הכן 500 מיליליטר של HBSS המלא על ידי הוספת 50 מיליליטר של 10x HBSS, 1.25 מיליליטר של 1 M Hepes (pH 7.4, FC 2.5 מ"מ), 6 מיליליטר של 2.5 M D-גלוקוז (FC 30 מ"מ), 2.2 מיליליטר של 0.9 M NaHCO 3 (4 מ"מ FC) וautoclaved diH 2 O לנפח סופי של 500 מיליליטר.
    2. פתרון סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד האוסף של קרנות רחם מהעכבר בהריון. פתרון זה יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות.
    3. שמור HBSS על קרח במהלך ההליך כולו לנתיחה.
  3. הטבעת פתרון
    1. להטבעה של 4 מוחות עובריים, להכין 30 מיליליטר של 3% agarose התכה הנמוך בפתרון HBSS המלא. בצינור 50 חרוטי מיליליטר, להוסיף 0.9 גרם של התכה נמוכה agarose וHBSS המלא ל30 מיליליטר.
    2. מערבבים את הפתרון עם מיקסר מערבולת, ולהמס במיקרוגל עם מעמד הצינור והכובע פתוח.
    3. בעוד במיקרוגל, לפקח על הפתרון לעמהצפת Revent בשל רתיחה מוגזמת. כשרותח מתחילה, לעצור את המיקרוגל ומערבולת הפתרון.
    4. חזור על שלבים אלה עד שכל agarose נמס.
    5. אחסן את הצינור באמבט מים ב42 ° C.

2. Dissection של העוברים (איור 1, שלב 2)

  1. לאחר המתת חסד זהירה של העכבר בהריון, לאסוף את קרן הרחם ולהעביר אותם לתוך צלחת 10 2 סנטימטר פטרי המכילה 1x HBSS מלא קר. גיל העובר יכול להשתנות בהתאם למחקר. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לculturing פרוסות מוח מE12.5 ימים עובריים כדי E17.5. בשל גודלם, מוחות צעירים נוטים להיות יותר קשה לעבוד איתו.
  2. לאסוף את העוברים ולנתח את המוח העוברי כפי שתואר לעיל בחולדה והעכבר 26,27, עד שמוח עוברי מלא כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי אונות המוח מתקבל. אלה יכולים להיותשמר על RT עד שכל המוחות היו גזורים.
  3. לאסוף את העוברים ולנתח את המוח העוברי כפי שתואר לעיל בחולדה והעכבר 26,27, עד שמוח עוברי מלא כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי אונות המוח מתקבל. יכולים להיות כל הזמן אלה ב RT עד שכל המוחות היו גזורים.

3. הטבעה של המוח עוברי (איור 1, שלב 3)

  1. בדלי קרח המכיל, ליצור חור בקרח כדי להכניס את תבניות הטבעה ל.
  2. יוצקים את מדיום agarose 3% לתוך תבנית פלסטיק ומניח את התבנית שלתוך החור שהוכן בקרח.
  3. מערבבים את מדיום agarose עם הקצה של מדחום דיגיטלי עד שהטמפרטורה מגיעה 35 ° C.
  4. מייד להעביר את המוח למדיום ההטבעה.
  5. שלב קריטי: כדי להסיר את HBSS העודף בממשק שבין המוח וagarose, בזהירות ובעדינות נפילה / לסובב את המוח שוב ושובבפתרון ההטבעה עם המלקחיים.
  6. כרית agarose gelled תהווה בחלק התחתון של העובש במגע עם הקרח. ברגע שהכרית יכולה להיות מורגשת עם הקצה של המלקחיים תוך ערבוב המוח, מקם את המוח עם הצד עד הגב. המוח לא צריך לשקוע בתחתית מאוד של העובש.

4. הכנת Agarose הבלוק (איור 1, שלב 4)

  1. בואו agarose להקשיח בקרח למשך 5 דקות לפחות.
  2. באמצעות סכין גילוח, סעיף הפינות של העובש.
  3. לגלף בזהירות בלוק agarose סביב המוח באמצעות סכין גילוח. נסה לצמצם את מספר הקיצוצים כדי להימנע מביך את המוח המוטבע.
  4. ודא שיש לו את הבלוק שטח פנים גדול יותר באזור הזנב של המוח (לעומת האזור מקורי, ראה איור 1, שלב 4) כדי להגדיל את היציבות של הגוש על הכן חתך.
  5. הקיצוץ האחרון צריך להיות אחד בצד הזנב של מוח;הקיצוץ הזה יגדיר את מטוס חתך הנכון עם vibratome.
  6. לעשות זאת על ידי יישור הלהב בניצב לציר rostro-הזנב של המוח ובלוק agarose. להחליק במורד הלהב caudally לאורך ציר rostro-הזנב והגיע לגמר כ -5 מ"מ מאזור הזנב ביותר של המוח.
  7. הגדר את בלוק agarose / המוח בצד ולחזור על הטבעה של מוחות אחרים.

5. העברה של המוח המשובץ לתוך מגש של Vibratome (איור 1, שלב 5)

  1. הוסף טיפה של דבק על החלק התחתון של מגש vibratome. הנח דבק כך שאובניים agarose ימוקם בהישג ידו של הלהב הרוטט.
  2. הנח את צד הזנב בלוק agarose / מוח על הקצה של המרית, עם כ -50% המפנה לחסום מעבר לקצה של המרית.
  3. להחיל את פניו הזנב של בלוק agarose לדבק ולהחליק את המרית משם, שמירה על בלוק agarose לתחתית המגש עם יםhoulder של פינצטה. אל תתנו מרית קשר ישירות עם הדבק.
  4. תן הדבק לחזק בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.

6. חתך של המוח המשובץ (איור 1, שלב 6)

  1. מלא את מגש vibratome עם HBSS.
  2. הגדר את מיקומי ההתחלה וסיום של להב vibratome.
  3. צור 200-250 מיקרומטר פרוסות. עם vibratome VT1000s, השתמשו בפרמטרים הבאים: המהירות 2 - 4, בתדר 8.
  4. מוציאים בזהירות את הפרוסות מvibratome כפי שהם נחתכים. מעביר את הפרוסות עם מרית והקצה האחורי של פינצטה ל12 מנות גם מלאים בHBSS מלא. לחלופין כמה חוקרים השתמשו במכחול במקום פינצטה נקודת מפתח:. במהלך העברה, דואגים שפרוסות המוח להישאר מחוברות לagarose שמסביב.

7. Syto11 הכתמה של פרוסות (איור 1, שלב 7)

  1. לדלל Syto11 לריכוז סופי של.5-1 מיקרומטר במדיום התרבות הפרוסה בתוספת גורמי גדילה.
  2. בבאר של צלחת 12 היטב, דגירה פרוסות ממוח אחד ב2.5 מיליליטר של הפתרון מכתים עבור שעה 1 ב 37 ° C.
  3. לשטוף את הפרוסות ב2.5 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה ללא כתמי פתרון עבור 20 דקות.

8. הרכבה פרוסות בצלחת זכוכית תחתונה (איור 1, על השלבים 8, 9)

  1. הכן 15 μl של הטבעת פתרון קולגן לכל פרוסה. הכן פתרון 1.5 מ"ג / מיליליטר קולגן על ידי ערבוב 375 μl של 3 מ"ג / מיליליטר פתרון אני סוג קולגן עם 75 μl של 10x DMEM, 9.4 μl של 1 M NaOH, ו290 μl של H 2 O. אחסן על קרח.
  2. מניחים ירידת 15 μl של פתרון קולגן בתחתית צלחת microwell תחתית זכוכית 35 מ"מ. מורחים אותו עם קצה pipet כדי להתאים את הגודל של הפרוסה.
  3. מעביר את הפרוסה לירידה של קולגן עם מרית ופינצטה נקודת מפתח:. הרכבה מספר פרוסות בשונותמנות ent מגדילה את ההסתברות לרכישת פרוסות מתאימות להדמיה. מסך באמצעות פרוסות שונות ולבחור את אלה שהכי הטובים עומדים בקריטריונים שיפורטו להלן בסעיף "נציג התוצאות".
  4. בואו פרוסות לדגור על RT עבור 10 דקות לפני העברתן לחממת 37 ° C עם 5% CO 2.
  5. אחרי 20 דקות, להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה לתוך צלחת microwell תחתית הכוס. הוספת 600 μl של מדיום בכל פעם ולהפיץ אותו עם קצה פיפטה.
  6. לכידת תמונה בהגדלה נמוכה של פרוסת המוח כדי להקליט את הרמה ויושרה האנטומי של הפרוסה.

9. הדמיה חיה של פרוסות (איור 1, צעדי 10, 11)

  1. בואו פרוסות להתאושש בחממה במשך שעה לפחות 1 ו30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO 2 לפני הדמיה בשידור חי.
  2. תמונת פרוסות עם המיקרוסקופ של בחירה, תוך התחשבות כי Syto11 הוא נוטה מאוד photobleaching. הנה Inverמיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב טד משמש (מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מהפכה אנדור XD). לחלופין לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal ניתן להשתמש. הפרמטרים הבאים הם למיקרוסקופ הדיסק מסתובב ההגדרה.
  3. במהלך פגישת ההדמיה חיה כולה, לשמור על פרוסות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתא דגירה humidified המחובר למיקרוסקופ.
  4. תאי תמונה עם אובייקטיבי 60x סיליקון שמן עם מרחק עבודה של 300 מיקרומטר, וצמצם מספרי של 1.3 (לדוגמאות ראו 3B דמויות, 3C, 3E, 3F, 4 א, ​​4 ב). מטרת שמן 100X עם מרחק עבודה של 130 מיקרומטר וצמצם מספרי של 1.4 (לדוגמא ראה איור 4C) יכולה לשמש גם. הרזולוציה של המצלמה היא 512 x 512.
  5. תמונת התאים בZ-מחסנית 30 מיקרומטר, עם המרכז של Z-המחסנית ממוקמת כ 40 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה. מנסה תמונה עמוקה יותר לתוך הרקמה יכול לגרום למטרה להוסיףלחץ מכאני על הפרוסה. זה יכול להשפיע על השלמות של פרוסת המוח. אם מתכנן לעשות שחזורי 3D של התאים, השתמש Z-מרווח של לא יותר מ 2 מיקרומטר.
  6. להתאים את כוח הלייזר וזמני חשיפה להגביל photobleaching. השתמש בזמני חשיפה נעים 30-200 אלפיות שניים, תלוי בעוצמת אות Syto11.
  7. עם במה ממונעת, מספר עמדות תמונה על פני מספר פרוסות רכובים בצלחת 1. לדוגמא, תמונה עד 20 עמדות פזורות על פני 4 פרוסות שונות במנה אחת 1.
  8. הדמיה חיה, השתמש ברזולוציה זמנית של פחות מ -5 דקות, כדי לאפשר זיהוי של השלבים השונים של מיטוזה. שימוש Syto11 ו / או היסטון H2B-EGFP, 4 - 5 שעות של הדמיה חיה מספיקות כדי לבחון מספר משמעותי של תאי mitotic. עם זאת, אם הדמיה שכותרתו בדלילות תאי mitotic (כגון אלה שהושגו על ידי ב electroporation ברחם), ואז פרמטר כבר הדמיה (לילה) הוא מתאים ועובדיםll.
    הערה: שימוש בפרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להתבונן בממוצע 10 תאים mitotic למשרה. כאמור לעיל, מספר רב של הדמיה רכוב פרוסות מגדיל את ההסתברות שיש ניסוי מוצלח. עם גישה זו בדרך כלל אנו מזהים תאי mitotic כמעט בכל הניסויים שבוצעו עם Syto11 או היסטון H2B-EGFP.

10. לאחר רכישת ניתוח של מיטוזה (איור 2)

כל ההליכים בסעיף זה כבר מותאם בפיג'י (ImageJ), אשר יש יתרון משום שהיא תוכנת קוד פתוח בחינם. פתרונות תוכנה אחרים זמינים כדי לבצע את אותן משימות, כמו Metamorph, Imaris, ועמירה.

  1. זיהוי של mitotic איורים בפיג'י
    1. לאחר פתיחת בסיס הנתונים לעמדה אחת כ" hyperstack ", בחר Z-מטוס אחד (ראה איור 2 א למיקום של פס הגלילה) שבו הרקמות ותאים נראים בריאים (ראה קריטריונים בסעיף הדיון).לגלול על פני ממד הזמן כדי לזהות תאים עוברים anaphase, כפי שהוא בשלב mitotic הכי קל לזהות.
    2. לגלול אחורה בזמן כדי לזהות את נקודת הזמן שבו התא נכנס מיטוזה (עיבוי ה-DNA). התא עשוי לנוע על פני Z-מטוסים, אבל הרזולוציה של הזמן ופרמטרי Z-המחסנית שתוארו קודם לכן היו מותאם כדי לאפשר את התהליך הזה.
    3. בגיליון אלקטרוני, להקליט 4D קואורדינטות של התא בhyperstack (X, Y, Z וזמן, ראה איור 2 א לדמיין את המיקום של דמויות אלה בממשק פיג'י) כפי שהוא נכנס מיטוזה. ידיעת קואורדינטות אלה תמנע סופרים את אותו התא מספר פעמים.
    4. לגלול קדימה בזמן, ורשום את הזמן שבו התא עם התקדמות משלב אחד למשנו. לתעד את משך הזמן של כל שלב mitotic לתא נתון אחד.
    5. המשך עם תאים אחרים, מעבר לבסיס נתונים המלא (מספר תאים בתוך ובין עמדות).
  2. 3D בנייה מחדשיון של התאים וQuantitation של הרוטציה במהלך Metaphase (מעובד מתוך חיידר ואח', 2003) (איור 2).
    1. לאחר שזיהה תאי mitotic מרובים, השתמש בקואורדינטות של תא ולגלול קדימה בזמן עד לתחילת metaphase.
    2. סובב "hyperstack" השלם, כך שגבול חדרית הוא מישורי (באמצעות "תמונה / המרה / סובב ..." הפקודה). השתמש בכלי "הזווית" כדי לקבוע את הזווית להגיש בקשה לסיבוב זה.
    3. זהה את Z-המטוס שבו התא של עניין הוא הבולט ביותר. במישור זה, להשתמש בכלי "מלבן בחירה" לצייר מבחר הכולל את התא כולו.
    4. זהה את Z-המטוסים הכוללים את התא של עניין. השתמש בפקודה "תמונה / כפל" כדי ליצור "תת מחסנית". בתיבת הדו שיח, יעזוב "hyperstack כפול" בדק. "פרוסות (z)" פרמטר תואם את Z-המטוסים כוללים את כל cell, ו" מסגרות (t) "פרמטר מתאים לנקודת הזמן הנוכחית.
    5. אם ההחלטה היא גרועה, להגדיל את הגודל של "תת הערימה" באמצעות "תמונה / התאם / גודל ..." הפקודה.
    6. ליצור שחזור 3D של התא בנקודת הזמן הנוכחית באמצעות "פרויקט Image/Stacks/3D ..." הפקודה. הפרמטרים לפקודה זו מוצגים באיור 2. "מרווח Slice" מתאים למרווח הזמן בין כל אחת מתמונות המטוס-z (מיקרומטר). חשוב: לוודא כי הממד הפיזי (מיקרומטר) של משנה הערימה כבר נשמרים. אם לא, אינטרפולציה של פיקסלים בממד z תהיה שגויה, ושחזור 3D יהיה לא מדויק.
    7. שימוש בפס הגלילה, לסובב את שחזור 3D וכתוצאה מכך שהקצה של צלחת metaphase גלוי. מספר המסגרת מתאים לזווית בטא המתוארת באיור 3 ב, להקליט מספר זה. באמצעותבאפשרות "הזווית" ועל "נתח / מדוד ..." הפקודה, למדוד את הזווית בין אופקי וקו שחצה את צלחת metaphase בניצב (איור 2). זוהי אלפא הזווית.
    8. הקלט את הזוויות הללו לכל נקודות זמן metaphase של התא של עניין. זווית הסיבוב בין נקודות זמן (t) ו( t-1) שווה לערך המוחלט של ההפרש בין זווית (t) וזווית זו ב( t-1).
  3. מדידת כיוון של מטוס המחשוף
    1. 3D לשחזר תא של עניין בנקודת זמן אחת במהלך anaphase ביצוע ההוראות תיארו לשחזור 3D של צלחות metaphase.
    2. סובב את השיקום עד לקצותיהם של שתי הצלחות שהוקמו על ידי הכרומוזומים ההפרדה גלויים.
    3. השתמש בכלי הזווית כדי למדוד את הזווית בין האופקי (קצה חדרית) וקו מקביל לשתי צלחות שהוקמו על ידי הכרומוזומים ההפרדה. זוהי הזווית של מישור המחשוף (איור 2 ג).
  4. דור של סרטים
    1. כתאים לעתים קרובות לעבור על פני Z-מישורים שונים, לזהות z-המטוסים שנכבשו על ידי התא במהלך פגישת ההדמיה חי. צור "הקרנת עוצמה המרבית" של Z-מטוסים אלה באמצעות "סטאקס פרויקט תמונה / / ת ..." הפקודה. שמור את הערימה וכתוצאה מכך כקובץ ". TIF".
    2. פתח את הקובץ בגרסה 1.45 של ImageJ כמו פיג'י אינה כוללת תוסף יציב לדור של קבצים ". Avi" ". Mov" או.
    3. השתמש "קובץ / שמירה בשם / ..." פיקוד ImageJ כדי ליצור סרט בפורמט תואם עם היישומים במורד הזרם שלך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההצלחה של assay זה וההתבוננות בתאי mitotic המרובים במהלך פגישת הדמיה חיה אחת תלויה במידה רבה על שניהם את השלמות והרמה האנטומי של הפרוסה שבו רכישות נעשות. כפי שנראה להלן, ברמה האנטומי של הפרוסה היא גורם חשוב. איור 3 א מציג rostro-הזנב והמדיאלי לרוחב במקומות בהם יש לנו היו מוצלח ביותר. לדיון נוסף בעניין זה אנא ראה Noctor 26. היושרה של הפרוסה יכולה להשתנות באזורים שונים של הפרוסה. זה יכול להיקבע לפני תחילת הזמן לשגות (באמצעות הדמיה של כל פרוסה כמו בשלב 7.6). באזור טוב של מוח E13.5 התצפיות הבאות יכולות להתבצע: רבים תאי mitotic יימצאו בגבול החדר, גרעיני ביניים יהיו בצורה אליפטית ולא עגול, וגרעיני ביניים יופיעו ביחס עמודים לגבול החדר . באזור הפחות טוב של המוח,גרעינים ייראו מעוגלים ולא מאורגנים במידה מסוימת (השוו 3B דמויות ו3C, וראו איור 3D עבור תמונה של הפרוסה רכוב היטב).

כאשר תנאים אידיאליים מושגים, assay זה יאפשר זיהוי האיכותי של שלבים שונים של מיטוזה. אלה יכולים להיות מזוהים על ידי ניתוח של תבנית ה-DNA (ראה איור 3E לדוגמאות של apically חלוקת תאים בכל שלב של מיטוזה). במהלך prophase, עיבוי DNA יצטרך את המראה של ה-DNA שכותרתו בדלילות (DNA עשיר ובאזורי ה-DNA העני בגרעין). במהלך metaphase, הכרומוזומים יוצרים מטוס בקו המשווה של גוף התא. בהתאם לכיוון של המטוס, את דפוס ה-DNA הוא גם (i) קו עבה (איור 3E, נוף 1) או (ב) "שושנה" באזור ה-DNA העני באמצע (איור 3E, להציג 2) . במהלך anaphase כאשר כרומוזומים להפריד, הם נראים כמו "ידיים"; שנודד בכיוונים מנוגדים. שלב זה יכול להיות קשה לזהות כאשר מטוס המחשוף הוא בX - מטוס Y של רכישה. במהלך telophase, DNA מרגיע ורוכש צורת אליפסה כרפורמות מעטפת גרעין. ניתן לאסוף נקודות זמן בודד לדמיין מיטוזה לאורך זמן (ראה איור 3F).

בנוסף להדמית מיטוזה של אבות apically החלוקה, assay זה יכול לשמש לתמונה basally חלוקת תאים כגון orgs או INPS, האחרון שבם הם סביר ביותר מיוצגים באיור 3G. תאים כאלה הם זיהוי על ידי מיקומם לחטיבה בSVZ שכבה. עם זאת כדי באמת לסמן תאים אלה הוא הטוב ביותר לבני זוג הניתוח עם ביטוי של סמן פלואורסצנטי שמתייג את תהליך התא או גורל (ראה איורים 4 ב-D). INPS יהיה לא תהליך הפסגה ולא בסיס, orgs יהיה תהליך בסיסי עם גוף התא שלהם נמצא בשכבות החיצוניות, וRGCs יצטרך baתהליך סאל עם גוף התא שלהם ממוקם בשכבת VZ.

מיטוזה של אבות יכולה להיות דמיינו עם שיטות חלופיות. איור 4A מדגים שימוש בעכבר המהונדס היסטון H2B-EGFP לתייג הכרומוזומים של כל התאים המתחלקים. זה מסמן תאים בדפוס דומה לSyto11. איור 4 מתאר את ההדמיה שבוצעה עם המוח ברחם electroporated עם EGFP-α-טובולין והיסטון H2B-mCherry. כפי שראה, זה מאפשר לאדם לדמיין שני microtubules וכרומוזום, ובנוסף גוף התא והתהליך בסיסי. איור 4C מתאר הדמיה שבוצעה עם מוח של עכבר Centrin-EGFP, ברחם electroporated עם mCherry-טובולין והיסטון H2B-EGFP . כפי שראה, זה מאפשר לכרומוזומים תמונה וcentrioles בערוץ הירוק וגוף ציר mitotic ותא / התהליך במסלול האדום. איור 4D מתאר הדמיה שבוצעה עם מוחים ברחם electroporated עם CMV-Cre בדלילות וCALNL-EGFP 28. טכניקה זו מאפשרת לאדם אבות תווית דלילות החלוקה, מה שהופך את הניתוח של חלוקת תאים בודדים קל יותר. בעת שימוש electroporation עם זאת, יש לזכור כי שיטה זו מתמקדת עוקבה מסונכרנת למדי של תאי אופניים 2,12. משמעות הדבר היא כי העיתוי חי הדמיה ביחס לelectroporation צריך להיות מותאם, כדי שהקבוצה של תאי electroporated גישות מיטוזה בתחילת פגישת ההדמיה. אם לא, הצלחת הניסוי בזיהוי תאי mitotic עלולה להיות בסכנה בפגישת הדמיה לטווח קצר.

כאשר תנאים אידיאליים מושגים, תכונות עיקריות של מיטוזה ניתן למדידת כמותית כוללים משך כולל מיטוזה, משך זמן של שלבים בודדים, סיבוב של מטוס metaphase וכיוון מטוס מחשוף. בתנאים שתוארו, יש לנו ציינו משך המיטוטי כולל ממוצע של 1 שעות30 דקות בימים עובריים (E) 13.5 ו14.5. כפי שתואר לעיל, הסיבוב של מטוס ה-DNA metaphase ניתן למדוד בנקודת זמן בודדת או במצטבר על פני משך metaphase כל 2,6,9,10. זו יכולה להיות מושגת באמצעות שחזור 3D של מטוס metaphase של תא בכל נקודת זמן ומדידת זוויות היחסית DNA לחדר. יש לנו ליישם בהצלחה את השיטה במאמר זה כדי לעקוב אחר תאים לפחות 3 שעות.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של שלבים בפרוטוקול. זמן דרוש לכל שלב מצויינים בכל אחד מהשלבים. פרטים על כל אחד מהשלבים הבאים מתוארים בסעיף "הפרוטוקול". שים לב שהשלב 7 אפשר לעקוף כאשר פרוסות הדמיה מהייעוברי האבן H2B-EGFP, או פרוסות מהמוחין שelectroporated עם פלסמידים המבטאים סמנים למיטוזה.

איור 2
איור 2. ניתוח שלאחר רכישה של מערכי נתונים מיקרוסקופיה הזמן לשגות וידאו בפיג'י מיקום.) של הכלים השונים מנוצלים לניתוח בפיג'י. ב ') מעורבים בשחזור 3D של תא בmetaphase צעדים שונים (ImageJ). מדידת פרטים לכל אחד מהשלבים הבאים מתוארים בסעיף "הפרוטוקול". C) של נטייה מטוס מחשוף ב3D שיחזרה תא בanaphase. שים לב שהמספרים בB שלב 6 ו-C להראות את הרצף אחריו כדי למדוד את הזווית. ד ') נתונים נציג מראים distribution של משך metaphase בקבוצה של תאי mitotic נצפתה בגבול חדרית בפרוסות מוח E13.5 (n = 35). ה) נציגי נתונים המראים את הסיבוב המצטבר של צלחות metaphase בתאי mitotic E13.5 בגבול של החדר . לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. דוגמאות לנתוני נציג מניתוח הדמיה לחיות. א) לאורך ציר dorso-הגחון, מיטוזה הוא צילם אותם בקלות באזורי גב של פרוסות מוח, משום שהתהליך הבסיסי של RGCs הוא קצר יותר ולכן פחות סביר שנותק על ידי vibratome. לאורך ציר rostro-הזנב, פרוסות באזורי הזנב של קליפת המוח הגבית נותניםתוצאות עקביות ביותר בידינו דוגמאות. B ו-C) מוצגות באזור טוב (ב ') ואזור רע (C) להדמיה. באזור טוב, גרעינים הם בצורת אליפסות (אזורים מוקפים בעיגול) ורבים תאי mitotic הם נצפו בגבול של החדר לפני הזמן לשגות הדמיה (חיצים). באזור רע, מעט מאוד תאי mitotic הם נצפו בגבול של החדר (חץ בודד) וגרעינים הם עגולים (אזורים מוקפים בעיגול) דוגמא. ד ') של פרוסת טובה שנצפתה במיקרוסקופ בהגדלה נמוך לפני גר הדמיה. ה) דוגמאות לSyto11 שכותרתו תאים בשלבים שונים של מיטוזה, כאמור F) Montage של אזור בגבול של החדר שבו שני אבות עצביים לעבור את השלבים השונים של מיטוזה, מסומן בצבעים שונים (זמן, hh:. מ"מ). G) Montage של אזור מסומן ב( ב ') שבו אב עצבי בחלק מהגבול חדרית. במצרפים (ד) ו (ה), CELLS היו פסאודו בצבע באמצעות פוטושופ כדי להדגיש את שלבי mitotic השונים. (סולם ברים: B, C, F: 10 מיקרומטר; D: 1 מ"מ, E, G: 5 מיקרומטר).

איור 4
איור 4. דוגמאות לכלים חלופיים כדי להמחיש מיטוזה של אבות עצביים. א) מונטאז' של אזור בגבול של החדר בפרוסת מוח מעובר מהונדס היסטון H2B-EGFP בE13.5. אב אחד הוא ציין כפי שהוא ממשיך דרך השלבים השונים של מיטוזה. B) Montage של VZ בE14.5 בפרוסת מוח שelectroporated ב E13.5 עם וקטורים להביע EGFP-טובולין וH2B-mCherry. EGFP-טובולין מאפשר ההדמיה של דינמיקת microtubule במהלך מיטוזה (B 1-B 2) C) Montage של אזור חדרית במוח E15.5 n מעובר מהונדס Centrin-EGFP שelectroporated ב E14.5 עם פלסמידים המבטאים mCherry-טובולין וH2B-EGFP. Centrin-EGFP מאפשר ההדמיה של דינמיקת centrioles במהלך מיטוזה (C 1 ו-C 2). ד ') Montage של אזור מראה א.ת. של פרוסת מוח E14.5 שבו תאים תויגו בדלילות על ידי electroporation בE13.5 עם נמוך ריכוז של פלסמיד המבטא Cre וריכוז סטנדרטי של פלסמיד להביע EGFP לאחר רקומבינציה Cre 28. תא החלוקה במונטאז' זה יש את המורפולוגיה של RGosvz עם תהליך ארוך בסיסי (חיצים הוורודים) ולא פסגת תהליך 9. האובייקטיבי המשמש להדמית חיה של (A) ודוגמאות (ב) הוא אובייקטיבי 60x סיליקון שמן, אובייקטיבי 100X שמן למשל (C), ומטרת מיזוג 10X למשל ד ההחלטה הזמנית המשמשת לתמונה () דוגמאות, (ב), (ג), ו (ד ') היו 4 דקות, 4 דקות, 30 שניות, ו 5 דקות, בהתאמה. VZ: חדרית Zאחד, א.ת.: אזור ביניים, RGosvz: תא כמו גליה-רדיאלי אזור subventricular החיצוני. (סולם ברים:: 15 מיקרומטר, B, C, D: 5 מיקרומטר, 1 C, C 2: 2.5 מיקרומטר) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרון העיקרי של הפרוטוקול שתארנו הוא שהיא מספקת פתרון זמני דינמי של מיטוזה של אבות עצביים. בדרך כלל, מבחני לדמיין מיטוזה במוח המתפתח מבוצעים באמצעות immunofluorescence של חלקי רקמות קבועים. אך גישה זו מספקת רק תמונת מצב של מיטוזה בנקודת זמן אחת.

ישנם מספר צעדים שהם קריטיים ביותר להדמית מיטוזה בפרוסות מוח: 1) פרוסות המוח צריכה להישאר מחובר לagarose, כדי לשמור על שלמות חלקים במוח בעת העברה וההרכבה. 2) עבור הדור וההדמיה של פרוסות, הבקרה של רמות rostro-הזנב היא חשובה. פרוסות מוח הזנב הן בדרך כלל הטובות ביותר, כי בפרוסות אלה, התהליכים הבסיסיים של RGC יישמרו ללא פגע, וזה בריא לתאים. 3) עבור הדמיה חיה, השימוש במיקרוסקופ ספינינג דיסק confocal עם מטרת 60x הוא הטוב ביותר עבור שניהם ברזולוציה הגבוהה וכדי למנוע photobleaching של יםamples, אשר יכול להתרחש עם צבע Syto11. 4) להדמית חיה, הפרמטרים זמניים של רכישה הם קריטיים. בהתאם לציוד המשמש מיקרוסקופ, זמן לשגות יכול להתבצע החל מכל דק 'לכל 10 דקות. יותר מ 10 דקות היא בדרך כלל זמן רב מדי כדי להשיג את הדינמיקה ברזולוציה גבוהה של מיטוזה.

פרוטוקול זה יש מגבלות מסוימות. הניסוי מתבצע עם vivo לשעבר רקמות. זה מתקבל על הדעת כי תצפיות שנעשו בפרוסות מוח יכולה להיות שונות בגוף חי. לפיכך, בעת ביצוע השוואות בין ניסויים שבוצעו בימים שונים או שימוש במדגמים שונים, יש לשמור את הפרמטרים הבאים קבועה: שימוש ברמות דומות rostro-הזנב וdorso-הרוחב, תוכן של תקשורת, שימוש במיקרוסקופ ופרמטרי רכישה. בנוסף, phototoxicity אפשרי עם הדמיה לטווח ארוך. לכן צריכים להתבצע ניסויים רבים לפני קבלת מסקנות. יתר על כן, Syto11 עצמו יכול חזקially להשפיע על אירועי mitotic, במיוחד ברקע מוטציה. לכן מומלץ שכאשר אחד עושה מסקנות לגבי מיטוזה מבוסס על Syto11, הם גם לאשר את הממצאים באמצעות מבחני בלתי תלויים, כגון סמנים מתוארים באיור 4.

כפי שתואר בפרוטוקול, מיטוזה ניתן הדמיה לאחר סימון הכרומוזומים ושלד התא בדרכים שונות. צבעי Syto אחרים יכולים לשמש כדי לחזות מיטוזה בערוצי ניאון אחרים. במקום באמצעות מכתים Syto11 לדמיין DNA, יכולות להיות שנוצרו פרוסות מהקווים מהונדסים ניאון. לדוגמא, כפי שהוכח, ניתן להשתמש בקווים מהונדסים היסטון H2B-EGFP 29. השימוש בהיסטון H2B-EGFP שימושי במיוחד ומומלץ לכל המאשר את הפנוטיפ שנצפה עם טיפול Syto11. בנוסף זה יכול להיות שימושי גם להתגברות על אתגרים הקשורים photobleaching עם Syto11. שימוש בקווים מהונדסים אחרים, כגון 30, centrin-EGFP יכוללשמש כדי לחזות centrioles, הרכיבים של centrosomes. בעוד אלה לבד לא יספיקו להמחשת מיטוזה, הם עובדים היטב בשילוב עם סמנים אחרים של כרומוזומים או microtubules. יכולים להיות הציגו סמנים כאלה על ידי ב4,5,10,31,32 electroporation ברחם. כפי שהוכח, ביטוי של חלבוני היתוך יום אחד לפני לנתיחה יכול להיות שימושי לגישה זו. מניסיוננו, להביע את המבנים תחת אמרגן CAG יכול לעתים קרובות להניב ביטוי חזק בתוך יום אחד. לדוגמא, אנו הצגנו α-טובולין והיסטון H2B-EGFP לתוך מוח עוברי באמצעות גישה זו.

ברגע שטכניקה זו היא שולטת יש שינויים נוספים שניתן לעשות לניסויים עתידיים. גם ברחם electroporation ניתן להשתמש כדי לתפעל ביטוי גנים. לדוגמא, כניסתה של shRNA או cDNAs יכולה להיות שימושית כדי לקבוע את ההשפעה של אובדן-of-פונקציה או על הביטוי של גן של עניין על פרוג העצביenitor מיטוזה 33. בנוסף, ניתן לטפל בפרוסות עם תרופות כימיות או מולקולות קטנות כדי למדוד את ההשפעה של עיכוב מסלולים או מולקולות איתות על מיטוזה 34,35.

בהליך שלנו אנו מתארים הדמיה שבוצעה באמצעות confocal דיסק מסתובב. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב הוא המהירות של רכישה. זה מאפשר הדמיה של מספר רב של עמדות מפרוסות מוח שונות בפגישה הדמיה לחיות אחד עם רזולוציה גבוהה זמנית, ואיכות תמונה סבירה. הגדרות אחרות כגון לייזר הסריקה מיקרוסקופ confocal רב פוטון להרשות לעצמם את האפשרות לרכוש תמונות באיכות גבוהות לעומק הרקמות, שבו תאי גלייה רדיאלי נוטים פחות להיות מנותקים ברמה של התהליך הבסיסי. זה ולכן יגדיל את ההסתברות לאבות עצביים בריאים תמונה. עם זאת, זה מזוהה בדרך כלל עם הקרבת המהירות של רכישה. זה בתורו להגביל את numבער של עמדות שיכולות להיות צילמו במהלך פגישה אחת חיה הדמיה, כמו גם את ההחלטה הזמנית. הדמיה של מיטוזה יכולה גם להתבצע על מיקרוסקופ שדה רחב. אולם במקרה זה עדיף לתאי שכותרתו בדלילות תמונה, בניגוד להיסטון H2B-EGFP או Syto11, כבהירות הכללית של חומרים כימיים האלה תגרום הדמיה הרבה יותר קשה. כמו כן, הפרוטוקול המתואר כאן מנצל מיקרוסקופ הפוכה. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופ הפוכה הם האפשרות להשתמש במטרות נפט ברזולוציה גבוהה וחופש התנועה כשאת המיקרוסקופ בשילוב עם שלב ממונע. כמסקנה, הנסיין צריך למצוא איזון בין היתרונות והחסרונות של הגדרה מסוימת ומטרת ניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים מימון NINDS / NIH, r00-NS064197 וNINDS / NIH, R01NS083897 (שניהם לDLS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Tags

Neuroscience גיליון 88 מיטוזה תאי גלייה רדיאלי קליפת פיתוח אבות עצביים פרוסת המוח הדמיה חי
הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live… More

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter