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Neuroscience

विकासशील माउस भ्रूण प्रांतस्था में सूत्रीविभाजन के रहते इमेजिंग

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा neurogenesis के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के बारे में हमारी समझ के ज्यादातर तय ऊतक के विश्लेषण पर आधारित है. भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में लाइव इमेजिंग एक नियंत्रित वातावरण में उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ पिंजरे का बँटवारा का आकलन करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक है.

Abstract

कम अवधि की है, पिंजरे का बँटवारा मस्तिष्क सहित अंगों के विकास के लिए मौलिक एक जटिल और गतिशील बहु कदम प्रक्रिया है. विकासशील मस्तिष्क प्रांतस्था में तंत्रिका progenitors के असामान्य पिंजरे का बँटवारा मस्तिष्क के आकार और समारोह में दोष पैदा कर सकता है. इसलिए, तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के तंत्र को समझने के लिए इस उपकरण के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. कृन्तकों में cortical विकास इस प्रक्रिया के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा सामान्यतः निश्चित मस्तिष्क वर्गों में जांच की है. इस प्रोटोकॉल में विस्तार से पूर्व vivo भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में पिंजरे का बँटवारा के रहते इमेजिंग के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे. मस्तिष्क निकासी, मस्तिष्क एम्बेडिंग, मस्तिष्क स्लाइस की vibratome सेक्शनिंग, धुंधला और स्लाइस के संवर्धन, और समय चूक इमेजिंग: हम शामिल है, जो इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करेंगे. हम तो प्रदर्शन और पिंजरे का बँटवारा के बाद अधिग्रहण विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विस्तार से वर्णन करेंगे. हम प्रतिनिधि परिणाम fr शामिलओम महत्वपूर्ण डाई Syto11, ट्रांसजेनिक चूहों (histone H2B-EGFP और centrin-EGFP), और utero electroporation में (mCherry-α-ट्यूबिलिन) का उपयोग करते हुए इस परख. हम इस प्रक्रिया का सबसे अच्छा अनुकूलित किया जा सकता है और कैसे यह पिंजरे का बँटवारा की आनुवंशिक विनियमन के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है पर चर्चा करेंगे. मस्तिष्क स्लाइसें में पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग एक नियंत्रित वातावरण में उम्र, शरीर रचना विज्ञान, और आनुवंशिक गड़बड़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए, और उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ डेटा की एक बड़ी राशि उत्पन्न करने के लिए एक लचीला दृष्टिकोण है. इसलिए इस प्रोटोकॉल तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के विश्लेषण के लिए मौजूदा उपकरणों के पूरक होगा.

Introduction

इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन करने के लिए है. संस्कृति में मस्तिष्क के स्लाइस के रहते इमेजिंग का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल एक Vivo में स्थापित करने के लिए अत्यधिक समान वातावरण में तंत्रिका progenitors में पिंजरे का बँटवारा के कई पहलुओं परख के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. यह) utero electroporation में से 1-5 चालाकी से किया गया है कि उत्परिवर्ती जानवरों और / या दिमाग के दिमाग के लिए लागू किया जा सकता है. इस तकनीक को बस संस्कृति के माध्यम से एक एजेंट जोड़कर, तंत्रिका व्यापारियों 'पिंजरे का बँटवारा पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भी आदर्श है. संक्षेप में, इस लेख न्यूरोजेनेसिस का अध्ययन करने वालों के लिए एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल सुलभ बनाना होगा.

Neurogenesis के दौरान अलग तंत्रिका पूर्वज आबादी अंततः 6-8 neocortex वयस्क के छह cortical परतों के लिए योगदान है कि न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए सटीक डिवीजनों से गुजरना. Neuroepithelial (पूर्वोत्तर) कोशिकाओं स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए संतुलित रूप से विभाजित के रूप में जल्दी cortical विकास में, तंत्रिका अग्रदूत पूल फैलता है. पूर्वोत्तर कोशिकाओं तो रेडियल glial कोशिकाओं (RGCs) में परिवर्तित. प्रारंभ में RGCs हालांकि neurogenesis के थोक दौरान, विभाजन की RGCs 'मुख्य मोड असममित है, दो नए RGCs उत्पादन को संतुलित रूप से विभाजित करते हैं. असममित विभाजन में, 1 RGC एक नया RGC और या तो एक के बाद mitotic न्यूरॉन, या एक अधिक विशिष्ट पूर्वज (या तो एक छोटी तंत्रिका अग्रदूत (SNP), एक बाहरी रेडियल glia (ओआरजी), या एक मध्यवर्ती पूर्वज (INP) को जन्म देता है 2,3,7,9. INPS, SNPs, और orgs तो उप निलय, निलय में न्यूरॉन्स उत्पन्न कर सकते हैं, और प्रांतस्था के बेसल क्षेत्रों, क्रमशः. इसलिए, progenitors की कोशिका विभाजन के न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया है neocortex.

कई अध्ययनों से विशिष्ट mitotic RGCs के लक्षण और बेटी की कोशिकाओं के भाग्य के बीच एक संबंध को इंगित करें. हैदर एट अल. और ताकाहाशी एट अल.RGC mitotic अवधि और neurogenesis आय के रूप में सेल चक्र लंबाई बढ़ाने, एक ढूँढने पढ़ाई 10-13 अनुवर्ती कार्रवाई में गूँजती दिखाया है. अध्ययन का एक नंबर निलय को mitotic धुरा उन्मुखीकरण सापेक्ष क्रमश मस्तिष्क में उत्पन्न न्यूरॉन्स के प्रकार और संतान का स्थान, 3,10,14-16 सहित न्यूरोजेनेसिस और corticogenesis के पहलुओं, को प्रभावित करती है कि सुझाव दिया है. दरार विमान अभिविन्यास सीधे सेल भाग्य को प्रभावित करती है चाहे विवादास्पद है, लेकिन निष्कर्ष है कि इस mitotic पैरामीटर प्रभावों न्यूरोजेनेसिस बनी हुई है. इसके अलावा पिंजरे का बँटवारा के महत्व को रेखांकित पिंजरे का बँटवारा के यांत्रिकी में शामिल कई जीनों neurogenesis के लिए और उचित मस्तिष्क विकास 17-20 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अवलोकन है.

सूत्रीविभाजन एक गतिशील प्रक्रिया है, अभी तक तारीख करने के लिए तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा ब्यौरा ज्यादातर अध्ययनों में इन विट्रो सेल संस्कृति के माध्यम से तय ऊतक वर्गों या तंत्रिका progenitors की इमेजिंग के विश्लेषण का उपयोग. इस प्रकार, पिंजरे का बँटवारा मूल्यांकन करने के लिए मुख्यधारा के तरीकों केवल इस प्रक्रिया का एक स्नैपशॉट प्रदान करने और कोशिकाओं को एक ऊतक में कैसे व्यवहार को उजागर करने में विफल. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग तेजी से तंत्रिका पूर्वज समारोह को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. उदाहरण के लिए इन संदर्भों को देखने के लिए कृपया 4,8,10,21-25. कई बकाया प्रोटोकॉल तैयारी और मस्तिष्क स्लाइसें 26,27 की इमेजिंग के लिए प्रकाशित किया गया है. हालांकि आज तक, इमेजिंग और पिंजरे का बँटवारा के विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया है और न ही वीडियो में प्रदर्शन किया.

इस तकनीक मस्तिष्क वर्गों की अचल विश्लेषण पर कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. मस्तिष्क के स्लाइस के समय चूक विश्लेषण एक लचीला फैशन में विश्लेषण किया जा सकता है कि काफी अधिक डेटा बिंदुओं की पीढ़ी सक्षम बनाता है. सबसे पहले, डेटा कई मिनट या कई घंटे के कोर्स पर व्यक्तिगत समय बिंदुओं पर इकट्ठे हुए है. एक व्यक्ति समय अंक (एक स्थिर असेंबल बनाने के लिए) या विश्लेषण कर सकते हैंफिल्मों में अलग अलग समय बिंदुओं को जोड़ सकते हैं. दूसरा, स्लाइस की confocal इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइसें में अलग जेड वर्गों में डेटा की पीढ़ी सक्षम बनाता है. नतीजतन, व्यक्तिगत वर्गों का विश्लेषण किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अलग अलग वर्गों के ढेर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में जोड़ा जा सकता है. तीसरा, विश्लेषण कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं और संरचनाओं के सापेक्ष विभाजित खुलासा कैसे, एक ऊतक के संदर्भ में किया जाता है. चौथा, यह आदर्श mitotic दोषों के कुछ सबूत बताते हैं कि म्यूटेंट के विश्लेषण के लिए अनुकूल है. साथ में इस प्रोटोकॉल उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए जो चाहते हैं जांचकर्ताओं सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण कदम स्पष्ट करने में मदद करेगा.

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Protocol

मीडिया के 1. तैयारी (चित्रा 1, चरण 1)

  1. टुकड़ा संस्कृति मध्यम
    1. टुकड़ा संस्कृति के माध्यम से 25 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से 2 स्लाइस के साथ 5 गिलास नीचे व्यंजन तैयार करने के लिए पर्याप्त है.
    2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, एक 100x एन 2 समाधान के 250 μl और विटामिन ए 22.5 मिलीलीटर की एक मात्रा को DMEM/F12 जोड़ें बिना एक 50x B27 समाधान के 500 μl जोड़ें.
    3. फ़िल्टर समाधान बाँझ और बाद में गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम की 1.25 मिलीग्राम और भ्रूण गोजातीय सीरम के 1.25 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. स्लाइस की तैयारी की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में समाधान सेते हैं.
    5. वृद्धि कारक (FGF और EGF, 10 की अंतिम एकाग्रता जोड़ें एनजी / एमएल और 20 तुरंत पहले संस्कृति की शुरुआत करने के लिए) क्रमश: / एमएल एनजी. इस माध्यम की रचना संस्कृति में कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए और तंत्रिका progenitors के प्रसार की दर को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है. यह इस प्रकार की संभावना को अधिकतम जाएगाटुकड़ा में mitotic कोशिकाओं का पालन.
  2. पूर्ण HBSS विच्छेदन समाधान
    1. , 0.9 एम 3 NaHCO की 2.2 एमएल 1 एम Hepes के 1.25 मिलीलीटर (7.4 पीएच, एफसी 2.5 मिमी), 2.5 एम डी ग्लुकोज के 6 मिलीलीटर (एफसी 30 मिमी) 10x HBSS के 50 मिलीलीटर जोड़कर पूरा HBSS के 500 मिलीलीटर की तैयारी 500 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को DIH 2 हे autoclaved (एफसी 4 मिमी) और.
    2. गर्भवती माउस से गर्भाशय सींग का संग्रह जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर समाधान और दुकान. यह समाधान हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.
    3. पूरे विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर HBSS रखें.
  3. समाधान एम्बेड
    1. 4 भ्रूण दिमाग का एम्बेड करने के लिए, पूर्ण HBSS समाधान में 3% कम पिघलने agarose की 30 मिलीलीटर की तैयारी. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, 30 मिलीग्राम agarose कम पिघलने और पूरा HBSS के 0.9 ग्राम जोड़ें.
    2. एक भंवर मिक्सर के साथ समाधान मिक्स, और ट्यूब खड़े और टोपी खोलने के साथ एक माइक्रोवेव में पिघला.
    3. माइक्रोवेव में, पी का हल नजर रखने जबकिअत्यधिक गर्म होने के कारण REVENT अतिप्रवाह. शुरू होता है जब उबलते, माइक्रोवेव बंद करो और समाधान भंवर.
    4. सभी agarose पिघल गया है जब तक इन चरणों को दोहराएँ.
    5. 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब की दुकान

भ्रूण की 2. विच्छेदन (चित्रा 1, चरण 2)

  1. गर्भवती माउस से सावधान इच्छामृत्यु के बाद, गर्भाशय सींग इकट्ठा करने और ठंड पूर्ण 1x HBSS युक्त एक 10 सेमी 2 पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरण. भ्रूण की उम्र अध्ययन के आधार पर भिन्न हो सकती हैं. इस प्रोटोकॉल E17.5 भ्रूण दिनों E12.5 से मस्तिष्क स्लाइसें संवर्धन के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. अपने आकार के कारण, युवा दिमाग के साथ काम करने के लिए और अधिक कठिन हो जाते हैं.
  2. भ्रूण लीजिए और दो ​​मस्तिष्क गोलार्द्धों के साथ पश्चमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क सहित एक पूर्ण भ्रूण मस्तिष्क प्राप्त किया जाता है, जब तक चूहे और माउस 26,27 में पहले से वर्णित के रूप में भ्रूण दिमाग काटना. ये हो सकता हैसभी के दिमाग विच्छेदित कर दिया गया है जब तक आरटी पर रखा.
  3. भ्रूण लीजिए और दो ​​मस्तिष्क गोलार्द्धों के साथ पश्चमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क सहित एक पूर्ण भ्रूण मस्तिष्क प्राप्त किया जाता है, जब तक चूहे और माउस 26,27 में पहले से वर्णित के रूप में भ्रूण दिमाग काटना. सभी के दिमाग विच्छेदित कर दिया गया है जब तक ये आरटी पर रखा जा सकता है.

3. भ्रूण दिमाग की एम्बेडिंग (चित्रा 1, चरण 3)

  1. एक बाल्टी युक्त बर्फ में एम्बेड करने के नए नए साँचे में डालने के लिए बर्फ में एक छेद बना.
  2. एक प्लास्टिक मोल्ड में 3% agarose मध्यम डालो और बर्फ में तैयार छेद में ढालना है कि जगह है.
  3. तापमान 35 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक एक डिजिटल थर्मामीटर की नोक के साथ agarose मध्यम हलचल
  4. तुरंत एम्बेडिंग मध्यम में मस्तिष्क हस्तांतरण.
  5. महत्वपूर्ण कदम: ध्यान से, मस्तिष्क और agarose के बीच इंटरफेस में अतिरिक्त HBSS निकालने के लिए और धीरे बार बार / मस्तिष्क बारी बारी से हुई बातसंदंश के साथ एम्बेड समाधान में.
  6. Gelled agarose की एक तकिया बर्फ के साथ संपर्क में ढालना के तल पर बनेगी. मस्तिष्क सरगर्मी जबकि तकिया संदंश की नोक से महसूस किया जा सकता है एक बार, पृष्ठीय पक्ष के साथ मस्तिष्क की स्थिति. मस्तिष्क मोल्ड के बहुत नीचे सिंक नहीं करना चाहिए.

Agarose ब्लॉक के 4. तैयारी (चित्रा 1, चरण 4)

  1. Agarose कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ में कड़ा करते हैं.
  2. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, खंड मोल्ड के कोनों.
  3. ध्यान से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर मस्तिष्क के चारों ओर एक agarose ब्लॉक उत्कीर्ण. एम्बेडेड मस्तिष्क perturbing से बचने के लिए कटौती की संख्या को कम करने की कोशिश करें.
  4. सेक्शनिंग कुरसी पर ब्लॉक की स्थिरता को बढ़ाने के लिए (चित्रा 1, चरण 4 देखें, व्याख्यान चबूतरे वाला क्षेत्र बनाम) ब्लॉक मस्तिष्क की दुम क्षेत्र में एक बड़ा सतह क्षेत्र है कि सुनिश्चित करें.
  5. पिछले कटौती मस्तिष्क की दुम पक्ष पर एक होना चाहिए;इस कटौती vibratome साथ सही सेक्शनिंग विमान को परिभाषित करेगा.
  6. मस्तिष्क की rostro दुम अक्ष और agarose ब्लॉक करने के लिए खड़ा ब्लेड aligning से ऐसा करते हैं. दुमदारी rostro दुम अक्ष के साथ ब्लेड नीचे स्लाइड और के बारे में 5 मिमी दूर मस्तिष्क के सबसे दुम क्षेत्र से अंतिम कट कर.
  7. एक तरफ agarose / मस्तिष्क ब्लॉक सेट और अन्य दिमाग के embedding दोहराएँ.

Vibratome की ट्रे में एम्बेडेड दिमाग के 5. हस्तांतरण (चित्रा 1, चरण 5)

  1. Vibratome ट्रे के तल पर गोंद की एक बूंद जोड़ें. Agarose ब्लॉक हिल ब्लेड की पहुंच के भीतर तैनात किया जाएगा ताकि गोंद रखें.
  2. रंग के किनारे पर ब्लॉक ढोने के बारे में 50% के साथ, रंग के किनारे पर agarose / मस्तिष्क ब्लॉक दुम नीचे की ओर रखें.
  3. गोंद के लिए agarose ब्लॉक की दुम का चेहरा लागू करें और एस के साथ ट्रे की तह तक agarose ब्लॉक बनाए रखने, दूर रंग स्लाइडचिमटी की एक जोड़ी की houlder. रंग सीधे गोंद से संपर्क मत देना.
  4. गोंद 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमना.

एंबेडेड दिमाग के 6. सेक्शनिंग (चित्रा 1, 6)

  1. HBSS के साथ vibratome ट्रे भरें.
  2. Vibratome ब्लेड के शुरू और खत्म पदों को परिभाषित करें.
  3. 250 माइक्रोन स्लाइस - 200 उत्पन्न करें. - 4, आवृत्ति 8 गति 2: VT1000S vibratome साथ, निम्नलिखित मानकों का उपयोग करें.
  4. वे काट रहे हैं सावधानीपूर्वक vibratome से स्लाइस को हटा दें. पूर्ण HBSS के साथ भरा 12 अच्छी तरह से बर्तन में एक रंग और चिमटी के पीछे के अंत के साथ स्लाइस स्थानांतरण. वैकल्पिक रूप से कुछ शोधकर्ताओं चिमटी के एवज में एक तूलिका का इस्तेमाल किया है मुख्य बिंदु:. स्थानांतरण के दौरान, मस्तिष्क स्लाइसें आसपास agarose में जुड़े रहते हैं कि ध्यान रखना.

स्लाइस की 7. Syto11 धुंधला (चित्रा 1, चरण 7)

  1. एक अंतिम एकाग्रता के लिए Syto11 पतला0.5 - टुकड़ा संस्कृति के माध्यम में 1 माइक्रोन वृद्धि कारकों के साथ पूरक.
  2. 12 अच्छी तरह से थाली के कुएं में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए धुंधला समाधान के 2.5 मिलीलीटर में एक मस्तिष्क से स्लाइस सेते
  3. 20 मिनट के लिए समाधान धुंधला बिना टुकड़ा संस्कृति के माध्यम से 2.5 मिलीलीटर में स्लाइस धो लें.

8. एक गिलास नीचे डिश में स्लाइस बढ़ते (चित्रा 1, चरण 8, 9)

  1. टुकड़ा प्रति कोलेजन समाधान embedding के 15 μl तैयार करें. 10x DMEM, 1 एम NaOH के 9.4 μl, और एच 2 की 290 μl ओ के 75 μl के साथ 3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन प्रकार मैं समाधान के 375 μl मिश्रण से एक 1.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान तैयार बर्फ पर दुकान.
  2. एक 35 मिमी गिलास नीचे microwell डिश के तल पर कोलेजन समाधान की एक 15 μl बूंद रखें. टुकड़ा के आकार से मिलान करने के लिए एक pipet टिप के साथ यह बिखरा हुआ है.
  3. चिमटी की एक रंग और जोड़ी के साथ कोलेजन की बूंद में टुकड़ा हस्तांतरण मुख्य बिंदु:. अलग में कई स्लाइस बढ़तेईएनटी व्यंजन इमेजिंग के लिए उपयुक्त स्लाइस के अधिग्रहण की संभावना बढ़ जाती है. स्क्रीन अलग स्लाइस के माध्यम से और सबसे अच्छा "प्रतिनिधि परिणाम" खंड में नीचे वर्णित मापदंड को पूरा करने वाले लोगों का चयन करें.
  4. स्लाइस 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उन्हें स्थानांतरित करने से पहले 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते करते हैं.
  5. 20 मिनट के बाद, गिलास नीचे microwell डिश में टुकड़ा संस्कृति के माध्यम से 1.2 मिलीलीटर जोड़ें. एक समय में मध्यम के 600 μl जोड़ें और एक विंदुक टिप के साथ यह फैल गया.
  6. टुकड़ा की संरचनात्मक स्तर और अखंडता को रिकॉर्ड करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा की एक कम बढ़ाई छवि पर कब्जा.

स्लाइस की 9. लाइव इमेजिंग (चित्रा 1, 10, 11 पदों)

  1. स्लाइस रहते इमेजिंग से पहले 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटा और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वसूली करते हैं.
  2. Syto11 photobleaching के लिए बहुत संभावना है कि ध्यान में रखते हुए चुनाव की खुर्दबीन के साथ छवि स्लाइस,. एक Inver यहाँटेड कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (Andor एक्सडी क्रांति कताई डिस्क confocal खुर्दबीन) प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया जा सकता है. निम्नलिखित मानकों कताई डिस्क माइक्रोस्कोप सेट अप के लिए कर रहे हैं.
  3. पूरे रहते इमेजिंग सत्र के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस, माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक humidified ऊष्मायन चैम्बर में 5% सीओ 2 स्लाइस बनाए रखें.
  4. 300 मीटर की दूरी काम के साथ एक 60X सिलिकॉन तेल उद्देश्य, और 1.3 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ छवि कोशिकाओं (उदाहरण आंकड़े 3 बी, 3 सी, 3E, 3F, 4 ए, देखने के लिए 4 बी). 130 मीटर की दूरी काम और 1.4 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 100x तेल उद्देश्य (उदाहरण के लिए चित्रा 4C देखें) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. कैमरे के संकल्प 512 x 512 है.
  5. के बारे में 40 माइक्रोन टुकड़ा की सतह के नीचे स्थित z ढेर के केंद्र के साथ एक 30 माइक्रोन z ढेर, में छवि कोशिकाओं. ऊतक में गहरी छवि की कोशिश कर रहा उद्देश्य जोड़ने के लिए पैदा कर सकता हैटुकड़ा पर यांत्रिक दबाव. यह मस्तिष्क टुकड़ा की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं. नियोजन कोशिकाओं के 3D पुनर्निर्माण बनाने के लिए है, तो कोई और अधिक माइक्रोन 2 से की एक Z-अंतराल का उपयोग करें.
  6. Photobleaching सीमित करने के लिए लेजर शक्ति और जोखिम बार समायोजित करें. 30 से Syto11 संकेत की तीव्रता के आधार पर 200 मिसे, को लेकर कई बार प्रदर्शन का प्रयोग करें.
  7. एक मोटर चालित मंच, कई स्लाइस भर में छवि कई स्थानों 1 डिश में रखा होगा. 1 सिंगल पकवान में 4 अलग स्लाइस भर में फैले 20 पदों के लिए उदाहरण के लिए, छवि.
  8. लाइव इमेजिंग के लिए, पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों की पहचान सकें कम से कम 5 मिनट के लिए एक अस्थायी समाधान का उपयोग करें. Syto11 और / या histone H2B-EGFP का प्रयोग, 4 - रहते इमेजिंग के 5 घंटा mitotic कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त हैं. इमेजिंग कम (जैसे utero electroporation में से हासिल होते हैं) को mitotic कोशिकाओं लेबल हालांकि, अगर, फिर एक लंबे समय तक इमेजिंग पैरामीटर (रातोंरात) उपयुक्त है और हम काम करता हैकरूँगा.
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम आम तौर पर स्थिति प्रति औसत 10 mitotic कोशिकाओं पर निरीक्षण करते हैं. जैसा कि ऊपर कहा, इमेजिंग कई स्लाइसें घुड़सवार एक सफल प्रयोग होने की संभावना बढ़ जाती है. इस दृष्टिकोण के साथ हम आम तौर पर Syto11 या histone H2B-EGFP के साथ प्रदर्शन लगभग सभी प्रयोगों में mitotic कोशिकाओं की पहचान.

10. सूत्रीविभाजन के बाद अधिग्रहण विश्लेषण (चित्रा 2)

इस खंड में सभी प्रक्रियाओं यह एक मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है क्योंकि लाभप्रद है जो फिजी (ImageJ), में अनुकूलित किया गया है. अन्य सॉफ्टवेयर समाधान ऐसे Metamorph, Imaris, और अमीरा के रूप में ही कार्य करने के लिए उपलब्ध हैं.

  1. Mitotic की पहचान फिजी में आंकड़े
    1. एक "hyperstack" के रूप में एक पद के लिए डाटासेट खोलने के बाद, ऊतक और कोशिकाओं को स्वस्थ देखने के लिए जहां (चर्चा अनुभाग में मापदंड देखें) (स्क्रॉल पट्टी के स्थान के लिए चित्रा 2A देखें) एक Z-विमान का चयन करें.यह पहचान करने के लिए सबसे आसान mitotic चरण के रूप में है, पश्चावस्था के माध्यम से जा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अस्थायी आयाम भर में स्क्रॉल.
    2. सेल पिंजरे का बँटवारा (डीएनए संक्षेपण) में प्रवेश करती है जहां समय बिंदु की पहचान करने के लिए समय में वापस आएँ. सेल Z-विमानों भर में स्थानांतरित कर सकते हैं, लेकिन अस्थायी समाधान है और पहले बताया z ढेर मापदंडों इस प्रक्रिया को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
    3. किसी स्प्रेडशीट में, यह पिंजरे का बँटवारा में प्रवेश करती है (फिजी अंतरफलक में इन आंकड़ों का स्थान कल्पना 2A चित्रा देख, एक्स, वाई, जेड और समय) 4D hyperstack में सेल के निर्देशांक रिकॉर्ड. इन निर्देशांक को जानने का एक ही सेल में कई बार गिनती नहीं कर पाएगा.
    4. समय में आगे स्क्रॉल और सेल एक चरण से दूसरे के लिए प्रगति जब समय रिकॉर्ड है. एक दिया सेल के लिए प्रत्येक mitotic चरण की अवधि दस्तावेज़.
    5. पूर्ण डाटासेट भर में अन्य कोशिकाओं, (भीतर और पदों को भर में कई कोशिकाओं) के साथ आगे बढ़ें.
  2. 3 डी फिर से संगठितप्रकोष्ठों के आयन और मेटाफ़ेज़ दौरान रोटेशन के quantitation (हैदर एट अल, 2003 से अनुकूलित) (चित्रा 2 बी).
    1. मेटाफ़ेज़ की शुरुआत तक कई mitotic कोशिकाओं की पहचान होने के बाद, एक सेल के निर्देशांक का उपयोग करें और समय में आगे पुस्तक.
    2. निलय सीमा ("छवि / रूपांतरण / घुमाएँ ..." आदेश का उपयोग) तलीय है कि ताकि पूरे "hyperstack" घुमाएँ. इस रोटेशन के लिए लागू करने के लिए कोण निर्धारित करने के लिए "कोण" उपकरण का उपयोग करें.
    3. ब्याज की सेल सबसे अधिक दिखाई है जहां Z-विमान को पहचानें. उस विमान में, पूरे सेल भी शामिल है कि एक चयन आकर्षित करने के लिए "आयत चयन" उपकरण का उपयोग करें.
    4. ब्याज की सेल भी शामिल है कि Z-विमानों को पहचानें. एक "उप ढेर" बनाने के लिए "छवि / डुप्लीकेट" आदेश का उपयोग करें. संवाद बॉक्स में, जाँच "डुप्लिकेट hyperstack" छोड़ दें. "स्लाइस (जेड)" पैरामीटर पूरे CE सहित Z-विमानों से मेल खाती हैडालूँगा, और "फ्रेम (टी)" पैरामीटर वर्तमान समय बिंदु से मेल खाती है.
    5. संकल्प गरीब है, "छवि / समायोजित / आकार ..." आदेश का उपयोग "उप ढेर" के आकार में वृद्धि.
    6. "Image/Stacks/3D परियोजना ..." आदेश का उपयोग वर्तमान समय बिंदु पर सेल के एक 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करें. इस आदेश के लिए मापदंडों चित्रा 2B में प्रदर्शित कर रहे हैं. "स्लाइस दूरी" Z-विमान छवियों (माइक्रोन) में से प्रत्येक के बीच अंतराल से मेल खाती है. महत्वपूर्ण: उप ढेर के शारीरिक आयाम (माइक्रोन) संरक्षित किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें. यदि नहीं, तो Z आयाम में पिक्सल के प्रक्षेप गलत हो जाएगा, और 3 डी पुनर्निर्माण गलत हो जाएगा.
    7. मेटाफ़ेज़ प्लेट के किनारे दिखाई दे रहा है कि ताकि स्क्रॉलबार का प्रयोग, जिसके परिणामस्वरूप 3D पुनर्निर्माण घुमाएगी. फ्रेम की संख्या चित्रा 3 बी में वर्णित बीटा कोण से मेल खाती है, यह संख्या रिकॉर्ड है. का प्रयोग"कोण" उपकरण और "विश्लेषण / उपाय ..." कमांड, क्षैतिज और चित्रा (2 बी) लंबरूप मेटाफ़ेज़ प्लेट bisecting एक लाइन के बीच के कोण को मापने. इस कोण अल्फा है.
    8. ब्याज की सेल के सभी मेटाफ़ेज़ समय अंक के लिए इन कोणों रिकार्ड. समय अंक (टी) और (टी -1) के बीच रोटेशन के कोण (टी -1) पर (टी) पर एक कोण और इस कोण के बीच अंतर का निरपेक्ष मूल्य के बराबर होती है.
  3. विखंडन विमान के अभिविन्यास मापने
    1. मेटाफ़ेज़ प्लेटों के 3D पुनर्निर्माण के लिए वर्णित निर्देशों का पालन पश्चावस्था दौरान एक समय बिंदु पर ब्याज की एक कोशिका का पुनर्निर्माण 3D.
    2. Segregating गुणसूत्रों द्वारा गठित दो प्लेटों के किनारों दिखाई दे रहे हैं जब तक पुनर्निर्माण घुमाएँ.
    3. क्षैतिज के बीच कोण (निलय धार) और segregating गुणसूत्रों द्वारा गठित दो प्लेटों के समानांतर एक रेखा को मापने के लिए कोण उपकरण का प्रयोग करें. इस दरार विमान (चित्रा -2) का कोण है.
  4. सिनेमा की पीढ़ी
    1. कोशिकाओं अक्सर विभिन्न Z-विमानों के पार ले जाने के रूप में, लाइव इमेजिंग सत्र के दौरान सेल के कब्जे Z-विमानों की पहचान. "छवि / ढेर / जेड परियोजना ..." आदेश का उपयोग इन Z-विमानों के एक "अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण" उत्पन्न. एक ". Tif" फ़ाइल के रूप में जिसके परिणामस्वरूप ढेर बचाओ.
    2. फिजी ". Mov" या ". AVI" फ़ाइलों की पीढ़ी के लिए एक स्थिर प्लगइन शामिल नहीं है के रूप में ImageJ के 1.45 संस्करण में इस फ़ाइल को खोलने.
    3. आपके नीचे धारा अनुप्रयोगों के साथ संगत प्रारूप में एक फिल्म उत्पन्न करने के लिए ImageJ का आदेश ... "के रूप में / फ़ाइल / सहेजें" का प्रयोग करें.

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Representative Results

इस परख की सफलता और एक लाइव इमेजिंग सत्र के दौरान कई mitotic कोशिकाओं का अवलोकन काफी हद तक ईमानदारी और अधिग्रहण बना रहे हैं जहां टुकड़ा के संरचनात्मक स्तर दोनों पर निर्भर करते हैं. नीचे चर्चा के रूप में, एक टुकड़ा की संरचनात्मक स्तर एक महत्वपूर्ण कारक है. चित्रा 3A rostro दुम से पता चलता है और औसत दर्जे का पार्श्व हम सबसे सफल रहे हैं जहां स्थानों. इस विषय के अतिरिक्त चर्चा के लिए Noctor 26 देखें. टुकड़ा की अखंडता टुकड़ा के विभिन्न क्षेत्रों में भिन्न हो सकती हैं. इस से पहले (चरण 7.6 में के रूप में पूरे टुकड़ा की इमेजिंग का उपयोग) समय चूक की शुरुआत करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है. कई mitotic कोशिकाओं अंतरावस्था नाभिक बल्कि दौर से अंडाकार आकार का हो जाएगा, निलय सीमा पर पाया जाएगा, और अंतरावस्था नाभिक निलय सीमा के स्तंभ का रिश्तेदार दिखाई देगा: एक E13.5 मस्तिष्क का एक अच्छा क्षेत्र में निम्नलिखित टिप्पणियों बनाया जा सकता है . मस्तिष्क के एक कम वांछनीय क्षेत्र मेंनाभिक (आंकड़े 3B और 3 सी की तुलना करें, और एक अच्छी तरह से मुहिम शुरू टुकड़ा की एक तस्वीर के लिए चित्रा 3 डी देखें) गोल और कुछ हद तक अव्यवस्थित दिखेगा.

आदर्श स्थिति हासिल कर रहे हैं, इस परख पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों के गुणात्मक पहचान सक्षम हो जाएगा. ये (ऊर्ध्वस्थ होते हुए पिंजरे का बँटवारा के प्रत्येक चरण में कोशिकाओं को विभाजित करने के उदाहरण के लिए चित्रा 3E देखें) डीएनए पैटर्न के विश्लेषण से पता लगाया जा सकता है. Prophase के दौरान, डीएनए संक्षेपण कम लेबल डीएनए (नाभिक में डीएनए अमीर और डीएनए गरीब क्षेत्रों) की उपस्थिति होगा. मेटाफ़ेज़ दौरान गुणसूत्रों सेल शरीर की भूमध्य रेखा पर एक विमान के रूप में. विमान के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है, डीएनए पैटर्न एक मोटी रेखा (चित्रा 3E, देखें 1) या बीच में एक डीएनए गरीब क्षेत्र के साथ (द्वितीय) एक "थाली" (चित्रा 3E, देखने 2) या तो (मैं) है . अलग क्रोमोसोम जब पश्चावस्था के दौरान, वे "हाथ" की तरह दिखते; कि विपरीत दिशाओं में चले जाते हैं. अधिग्रहण के वाई विमान - दरार विमान एक्स में है जब इस चरण की पहचान करने के लिए कठिन हो सकता है. Telophase के दौरान, डीएनए आराम और परमाणु लिफाफा सुधारों के रूप में एक दीर्घवृत्ताभ आकार प्राप्त. व्यक्तिगत समय अंक (चित्रा 3F देखें) समय के साथ पिंजरे का बँटवारा कल्पना करने के लिए एकत्र किया जा सकता है.

ऊर्ध्वस्थ होते हुए विभाजित progenitors के पिंजरे का बँटवारा इमेजिंग के अलावा, इस परख basally ऐसे orgs या INPS के रूप में कोशिकाओं को विभाजित छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें से बाद सबसे अधिक संभावना आंकड़ा 3 जी में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. ऐसी कोशिकाओं SVZ में विभाजन के लिए अपने स्थान से पहचाने जाने योग्य हैं परत. हालांकि सही मायने में यह सेल प्रक्रिया या भाग्य (आंकड़े 4 बी डी देखें) लेबल है कि एक फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति के साथ विश्लेषण जोड़े के लिए सबसे अच्छा है कि इन कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए. INPS न तो होगा एक शिखर और न ही बेसल प्रक्रिया, orgs बाहरी परत में स्थित अपने सेल शरीर के साथ एक बेसल प्रक्रिया है, और RGCs एक बीए होगाVZ परत में स्थित अपने सेल शरीर के साथ SAL प्रक्रिया.

Progenitors के सूत्रीविभाजन वैकल्पिक तरीकों के साथ देखे जा सकते हैं. चित्रा -4 ए सभी कोशिकाओं को विभाजित के गुणसूत्रों लेबल करने histone H2B-EGFP ट्रांसजेनिक माउस के उपयोग को दर्शाता है. इस Syto11 समान पैटर्न में कोशिकाओं के निशान. 4B चित्रा EGFP-α-ट्यूबिलिन और histone H2B-mCherry साथ electroporated utero में दिमाग के साथ प्रदर्शन इमेजिंग दर्शाया गया है. प्रदर्शन के रूप में, यह सूक्ष्मनलिकाएं और गुणसूत्र दोनों कल्पना करने के लिए एक सक्षम बनाता है, और इसके साथ ही सेल शरीर और बेसल प्रक्रिया. चित्रा 4C एक Centrin-EGFP माउस से दिमाग के साथ प्रदर्शन इमेजिंग दर्शाया गया है, mCherry-A-ट्यूबिलिन और histone H2B-EGFP साथ electroporated utero में . प्रदर्शन किया, इस ग्रीन चैनल में छवि क्रोमोसोम और centrioles के लिए एक सक्षम बनाता है और mitotic धुरा और सेल शरीर / प्रक्रिया लाल चैनल में. चित्रा 4D मस्तिष्क के साथ प्रदर्शन इमेजिंग दर्शाया गया हैकम सीएमवी Cre और CALNL-EGFP 28 के साथ electroporated गर्भ में है. इस तकनीक को व्यक्तिगत विभाजित कोशिकाओं का विश्लेषण आसान बनाने, कम लेबल विभाजित progenitors के लिए एक सक्षम बनाता है. हालांकि electroporation का उपयोग करते हैं, तो इस विधि साइकिल कोशिकाओं 2,12 के एक काफी सिंक्रनाइज़ पलटन है कि लक्ष्य को ध्यान में रखना. इस electroporation के लिए रहते इमेजिंग रिश्तेदार के समय electroporated कोशिकाओं की पलटन इमेजिंग सत्र की शुरुआत में पिंजरे का बँटवारा दृष्टिकोण है, ताकि समायोजित करने की जरूरत है. यदि नहीं, किसी भी mitotic कोशिकाओं की पहचान करने में प्रयोग की सफलता के लिए एक अल्पकालिक इमेजिंग सत्र में समझौता किया जा सकता है.

आदर्श स्थिति हासिल कर रहे हैं, पिंजरे का बँटवारा की प्रमुख विशेषताओं मात्रात्मक समग्र पिंजरे का बँटवारा अवधि, व्यक्तिगत चरणों की अवधि, मेटाफ़ेज़ विमान और दरार विमान उन्मुखीकरण के रोटेशन सहित मापा जा सकता है. वर्णित परिस्थितियों में, हम 1hr के एक औसत समग्र mitotic अवधि मनायाभ्रूण दिनों में 30 मिनट (ई) 13.5 और 14.5. पहले से वर्णित है, मेटाफ़ेज़ डीएनए विमान के रोटेशन एक व्यक्ति समय बिंदु पर या संचयी एक पूरे मेटाफ़ेज़ 2,6,9,10 की अवधि से अधिक मापा जा सकता है. यह हर समय बिंदु पर एक सेल का मेटाफ़ेज़ विमान के 3D पुनर्निर्माण का उपयोग और निलय को डीएनए रिश्तेदार के कोण को मापने प्राप्त किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक कम से कम 3 घंटे के लिए कोशिकाओं का पालन करने के लिए इस पत्र में विधि आवेदन किया है.

चित्रा 1
हर कदम चरणों में से प्रत्येक के तहत संकेत दिया है के लिए चित्रा 1. प्रोटोकॉल में कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. समय की जरूरत है. इन चरणों में से प्रत्येक के लिए विवरण "प्रोटोकॉल" खंड में वर्णित हैं. हाय से स्लाइस जब इमेजिंग कि चरण 7 को नजरअंदाज किया जा सकता है कृपया ध्यान देंplasmids पिंजरे का बँटवारा के लिए मार्करों व्यक्त साथ electroporated थे कि दिमाग से पत्थर H2B-EGFP भ्रूण, या स्लाइस.

चित्रा 2
फिजी (ImageJ) फिजी. बी) मेटाफ़ेज़ में एक सेल के 3D पुनर्निर्माण में शामिल विभिन्न चरणों में विश्लेषण के लिए उपयोग विभिन्न उपकरणों की. ए) स्थान में समय व्यतीत हो वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटासेट के चित्रा 2. बाद अधिग्रहण विश्लेषण. एक 3 डी में दरार विमान उन्मुखीकरण के इन चरणों में से प्रत्येक के लिए विवरण "प्रोटोकॉल" खंड में वर्णित हैं. सी) मापन पश्चावस्था पर सेल को खंगाला. बी 6 और सी में संख्या अनुक्रम कोण को मापने के लिए पीछा किया है कि शो कृपया ध्यान दें. डी) distributio दिखा प्रतिनिधि डेटा(एन = 35). ई) E13.5 मस्तिष्क स्लाइसें में निलय सीमा पर मनाया mitotic कोशिकाओं के एक समूह में मेटाफ़ेज़ अवधि के एन वेंट्रिकल की सीमा पर E13.5 mitotic कोशिकाओं में मेटाफ़ेज़ प्लेटों की संचयी रोटेशन दिखा प्रतिनिधि डेटा . बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. रहते इमेजिंग विश्लेषण से प्रतिनिधि डेटा का उदाहरण. RGCs के बेसल प्रक्रिया कम है और इस प्रकार कम vibratome से कटे होने की संभावना है क्योंकि ए) dorso-उदर अक्ष के साथ, पिंजरे का बँटवारा सबसे आसानी से, मस्तिष्क के स्लाइस के पृष्ठीय क्षेत्रों में imaged है. Rostro दुम अक्ष, पृष्ठीय प्रांतस्था की दुम क्षेत्रों में स्लाइस देहमारे हाथ में सबसे अनुरूप परिणाम). बी और सी उदाहरण एक अच्छा क्षेत्र (बी) और इमेजिंग के लिए एक बुरी क्षेत्र (सी) के दिखाए जाते हैं. एक अच्छा क्षेत्र में, नाभिक elliptically (परिक्रमा क्षेत्रों) आकार के हैं और कई mitotic कोशिकाओं से पहले समय चूक इमेजिंग (तीर) को वेंट्रिकल की सीमा पर मनाया जाता है. एक बुरा क्षेत्र में, बहुत कुछ mitotic कोशिकाओं वेंट्रिकल की सीमा पर मनाया जाता है (एक तीर) और नाभिक इमेजिंग जीने के लिए पिछले एक कम बढ़ाई खुर्दबीन के साथ मनाया एक अच्छा टुकड़ा की. डी) उदाहरण (परिक्रमा) क्षेत्रों गोल कर रहे हैं. ई) . मिमी): एफ) के अलग अलग रंग में चिह्नित दो तंत्रिका progenitors पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों के माध्यम से जाना जहां वेंट्रिकल की सीमा पर एक क्षेत्र के असेंबल, (समय, एचएच के रूप में विख्यात Syto11 के उदाहरण, पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं लेबल. एक क्षेत्र का जी) असेंबल एक तंत्रिका पूर्वज दूर निलय सीमा से में बिताते हैं, जहां (बी) में प्रकाश डाला. Montages (डी) और (ई), CE मेंLLS छद्म अलग mitotic चरणों को उजागर करने के लिए फ़ोटोशॉप का उपयोग कर रंग थे. (स्केल सलाखों: बी, सी, एफ: 10 माइक्रोन, डी: 1 मिमी, ई, जी: 5 माइक्रोन).

चित्रा 4
चित्रा 4. वैकल्पिक उपकरणों के उदाहरण तंत्रिका progenitors के पिंजरे का बँटवारा कल्पना करने के लिए. E13.5 पर एक histone H2B-EGFP ट्रांसजेनिक भ्रूण से एक मस्तिष्क टुकड़ा में वेंट्रिकल की सीमा पर एक क्षेत्र के एक) असेंबल. यह पिंजरे का बँटवारा. बी के विभिन्न चरणों के माध्यम से आय के रूप में एक पूर्वज) मनाया जाता है EGFP-A-ट्यूबिलिन और H2B-mCherry व्यक्त वैक्टर साथ E13.5 पर electroporated किया गया था कि एक मस्तिष्क का टुकड़ा में E14.5 पर एक VZ के असेंबल. EGFP-A-ट्यूबिलिन अनुमति देता पिंजरे का बँटवारा दौरान microtubule गतिशीलता के दृश्य (बी 1 बी 2) एक में एक निलय क्षेत्र के सी) असेंबलmCherry-A-ट्यूबिलिन और H2B-EGFP व्यक्त plasmids के साथ E14.5 पर electroporated किया गया था कि एक Centrin-EGFP ट्रांसजेनिक भ्रूण से n E15.5 मस्तिष्क. Centrin-EGFP पिंजरे का बँटवारा (सी 1 और सी 2). डी) कोशिकाओं कम एक कम के साथ E13.5 पर electroporation द्वारा चिह्नित किया गया है, जहां एक E14.5 मस्तिष्क टुकड़ा की IZ दिखा क्षेत्र के असेंबल के दौरान centrioles गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता Cre व्यक्त एक प्लाज्मिड की एकाग्रता और रचनात्मक पुनर्संयोजन 28 के बाद EGFP व्यक्त एक प्लाज्मिड के एक मानक एकाग्रता. इस असेंबल में विभाजित सेल एक लंबे बेसल प्रक्रिया (गुलाबी तीर) के साथ एक RGosvz की आकृति विज्ञान और कोई शिखर प्रक्रिया 9 है. लाइव (ए) के इमेजिंग और (बी) उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया उद्देश्य एक 60X सिलिकॉन तेल उद्देश्य, उदाहरण के लिए 100X तेल उद्देश्य (सी), और उदाहरण के लिए 10X हवा उद्देश्य है डी. छवि के लिए इस्तेमाल किया अस्थायी समाधान (एक) , (ख), (ग) और (घ) उदाहरण क्रमशः 4 मिनट, 4 मिनट, 30 सेकंड, और 5 मिनट थे. VZ: वेंट्रिकुलर Zएक, IZ: मध्यवर्ती क्षेत्र, RGosvz: बाहरी subventricular क्षेत्र रेडियल glia की तरह सेल. (स्केल सलाखों: एक: 15 माइक्रोन, बी, सी, डी: 5 माइक्रोन, सी 1, सी 2: 2.5 माइक्रोन) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हम वर्णन किया है प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह तंत्रिका progenitors के पिंजरे का बँटवारा की एक गतिशील अस्थायी समाधान प्रदान करता है. आमतौर पर, विकासशील मस्तिष्क में पिंजरे का बँटवारा कल्पना करने के लिए assays तय ऊतक वर्गों के immunofluorescence का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं. लेकिन इस दृष्टिकोण केवल एक समय बिंदु पर पिंजरे का बँटवारा की एक स्नैपशॉट प्रदान करता है.

मस्तिष्क स्लाइसें में पिंजरे का बँटवारा इमेजिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं कि कई कदम उठाए हैं: 1) मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरण और बढ़ते दौरान मस्तिष्क वर्गों की अखंडता की रक्षा के लिए, agarose से जुड़ी रहना चाहिए. 2) पीढ़ी और स्लाइस की इमेजिंग के लिए, rostro दुम के स्तर के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है. इन स्लाइस में, RGC के बेसल प्रक्रियाओं कोशिकाओं के लिए स्वस्थ है, जो अक्षुण्ण रखा जाएगा क्योंकि दुम मस्तिष्क स्लाइस, आम तौर पर अच्छा कर रहे हैं. 3) रहते इमेजिंग के लिए, एक 60x उद्देश्य के साथ एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग दोनों उच्च संकल्प के लिए सबसे अच्छा है और एस के photobleaching से बचने के लिएSyto11 डाई के साथ हो सकता है जो amples,. 4) रहते इमेजिंग के लिए अधिग्रहण की अस्थायी मापदंडों महत्वपूर्ण हैं. इस्तेमाल किया सूक्ष्मदर्शी यंत्र पर निर्भर करता है, समय चूक हर मिनट से हर 10 मिनट से लेकर प्रदर्शन किया जा सकता है. अधिक से अधिक 10 मिनट आमतौर पर पिंजरे का बँटवारा के उच्च संकल्प गतिशीलता हासिल करने के लिए बहुत लंबा है.

इस प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं. प्रयोग पूर्व vivo ऊतक के साथ किया जाता है. यह मस्तिष्क के स्लाइस में की गई टिप्पणियों विवो में अलग हो सकता है कि बोधगम्य है. इसी तरह rostro दुम और dorso पार्श्व स्तर, मीडिया की सामग्री, माइक्रोस्कोप का उपयोग और अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग: अलग अलग दिनों या विभिन्न नमूनों के प्रयोग पर प्रदर्शन प्रयोगों के बीच तुलना कर इसलिए, जब, निम्नलिखित मानकों स्थिर रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, phototoxicity लंबी अवधि इमेजिंग के साथ संभव है. इसलिए कई प्रयोगों के निष्कर्ष करने से पहले बाहर किया जाना चाहिए. इसके अलावा, Syto11 ही शक्तिशाली सकाially विशेष रूप से एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में mitotic घटनाओं, प्रभावित करते हैं. इसलिए यह एक Syto11 पर आधारित पिंजरे का बँटवारा के बारे में निष्कर्ष बनाता है, वे भी इस तरह के चित्रा 4 में वर्णित मार्कर के रूप में स्वतंत्र assays, का उपयोग निष्कर्षों की पुष्टि की सिफारिश की है.

प्रोटोकॉल में वर्णित है, पिंजरे का बँटवारा क्रोमोसोम और विभिन्न तरीकों से cytoskeleton अंकन के बाद imaged किया जा सकता है. अन्य Syto रंजक अन्य फ्लोरोसेंट चैनलों में पिंजरे का बँटवारा कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डीएनए कल्पना करने Syto11 धुंधला का उपयोग के एवज में, स्लाइस फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों से उत्पन्न हो सकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में प्रदर्शन, histone H2B-EGFP ट्रांसजेनिक लाइनों 29 इस्तेमाल किया जा सकता है. Histone H2B-EGFP का उपयोग विशेष रूप से उपयोगी है और Syto11 उपचार के साथ मनाया किसी भी फेनोटाइप की पुष्टि के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा यह भी Syto11 साथ photobleaching के साथ जुड़े चुनौतियों पर काबू पाने के लिए उपयोगी हो सकता है. ऐसे centrin-EGFP 30, कर सकते हैं जब अन्य ट्रांसजेनिक लाइनों का प्रयोग करेंcentrioles, centrosomes के घटक कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इन अकेले पिंजरे का बँटवारा दृश्यमान करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा, वे गुणसूत्रों या सूक्ष्मनलिकाएं की अन्य मार्कर के साथ संयोजन में अच्छी तरह से काम करते हैं. इस तरह मार्करों utero electroporation 4,5,10,31,32 में द्वारा शुरू किया जा सकता है. प्रदर्शन के रूप में, विच्छेदन के लिए एक दिन पूर्व संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति इस दृष्टिकोण के लिए उपयोगी हो सकता है. हमारे अनुभव में, एक सीएजी प्रमोटर के तहत निर्माणों व्यक्त अक्सर एक दिन के भीतर मजबूत अभिव्यक्ति प्राप्ति कर सकते हैं. उदाहरण के लिए हम इस दृष्टिकोण का उपयोग भ्रूण दिमाग में α-ट्यूबिलिन और histone H2B-EGFP की शुरुआत की.

इस तकनीक में महारत हासिल हो जाने के बाद भविष्य के प्रयोगों के लिए किया जा सकता है कि अतिरिक्त संशोधनों रहे हैं. Utero electroporation में भी जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, shRNA या cDNAs की शुरूआत के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है नुकसान समारोह के या अधिक अभिव्यक्ति तंत्रिका ठेला पर ब्याज की एक जीन कीपिंजरे का बँटवारा 33 ENITOR. इसके अलावा, स्लाइस पिंजरे का बँटवारा 34,35 पर संकेत दे रास्ते या अणुओं बाधा के प्रभाव को मापने के लिए रासायनिक दवाओं या छोटे अणुओं के साथ इलाज किया जा सकता है.

हमारी प्रक्रिया में हम एक कताई डिस्क confocal का उपयोग कर प्रदर्शन इमेजिंग का वर्णन. एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के प्रमुख लाभ अधिग्रहण की गति है. यह एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ एक लाइव इमेजिंग सत्र में विभिन्न मस्तिष्क के स्लाइस से कई पदों की इमेजिंग, और एक उचित छवि गुणवत्ता में सक्षम बनाता है. इस तरह के एक बहु - फोटोन लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के रूप में अन्य setups गहरी रेडियल glial कोशिकाओं बेसल प्रक्रिया के स्तर पर कटे होने की संभावना है जहां ऊतक, में उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए संभावना बनती हैं. यह इसलिए छवि स्वस्थ तंत्रिका progenitors करने की संभावना में वृद्धि होगी. बहरहाल, यह आमतौर पर अधिग्रहण की गति की एक बलिदान के साथ जुड़ा हुआ है. यह बदले में संख्या सीमित कर देगाएक लाइव इमेजिंग सत्र, साथ ही अस्थायी समाधान दौरान imaged किया जा सकता है कि पदों की संख्या. पिंजरे का बँटवारा की इमेजिंग भी एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया जा सकता है. इन अभिकर्मकों के समग्र चमक ज्यादा मुश्किल इमेजिंग होगा के रूप में, H2B-EGFP या Syto11 histone विरोध के रूप में हालांकि इस मामले में यह छवि कम लेबल की कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा है. इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक औंधा माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करता. एक औंधा माइक्रोस्कोप का मुख्य लाभ उच्च संकल्प तेल उद्देश्यों और माइक्रोस्कोप एक मोटर चालित मंच के साथ युग्मित है जब आंदोलन की स्वतंत्रता का उपयोग करने की संभावना हैं. एक निष्कर्ष के रूप में, प्रयोगकर्ता के एक विशेष सेट अप और एक प्रयोग के उद्देश्य के फायदे और नुकसान के बीच एक संतुलन की जरूरत है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों NINDS / एनआईएच, R00-NS064197 और NINDS / एनआईएच, R01NS083897 (DLS के लिए दोनों) से धन स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 88 पिंजरे का बँटवारा रेडियल glial कोशिकाओं विकासशील प्रांतस्था तंत्रिका progenitors मस्तिष्क टुकड़ा लाइव इमेजिंग
विकासशील माउस भ्रूण प्रांतस्था में सूत्रीविभाजन के रहते इमेजिंग
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Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live… More

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

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