Summary
Neural stamfar mitose er en kritisk parameter for neurogenesis. Mye av vår forståelse av neural stamceller mitose er basert på analyse av fast vev. Live-bildebehandling i embryonale hjernen skiver er en allsidig teknikk for å vurdere mitose med høy tidsmessig og romlig oppløsning i et kontrollert miljø.
Abstract
Selv om det av kort varighet, i mitose, og en kompleks dynamisk flertrinnsprosessen fundamental for utvikling av organer, inkludert hjernen. I utviklings hjernebarken, kan unormal mitose av nevrale stamceller føre til defekter i hjernens størrelse og funksjon. Derfor er det et kritisk behov for verktøy til å forstå mekanismene for nevrale stamceller mitose. Hjernebarken hos gnagere er en enestående modell for å studere denne prosessen. Neural stamfar mitose er ofte undersøkt i faste hjerne seksjoner. Denne protokollen vil beskrive i detalj en tilnærming for levende avbildning av mitose i ex vivo embryonale hjernen skiver. Vi vil beskrive de kritiske trinn for denne prosedyren, som inkluderer: hjernen utvinning, hjerne embedding, vibratome seksjonering av hjernen skiver, farging og dyrkning av skiver, og time-lapse bildebehandling. Vi vil da vise og beskrive i detalj hvordan du skal utføre etter overtakelsen analyse av mitose. Vi inkluderer representative resultater frOM denne analysen bruker vital fargestoff Syto11, transgene mus (histone H2B-EGFP og centrin-EGFP), og i utero elektroporering (mCherry-α-tubulin). Vi vil diskutere hvordan denne prosedyren kan være best optimalisert og hvordan det kan bli endret for studie av genetisk regulering av mitose. Sanntids avbildning av mitose i hjerneskiver er en fleksibel tilnærming for å vurdere virkningen av alder, anatomi, og genetisk forstyrrelse i et kontrollert miljø, og for å generere en stor mengde av data med høy tidsmessig og romlig oppløsning. Derfor denne protokollen vil utfylle eksisterende verktøy for analyse av nevrale stamceller mitose.
Introduction
Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive hvordan man skal opptre live avbildning av nevrale stamceller mitose i embryonale hjernen skiver. Ved hjelp av direkte avbildning av hjernen skiver i kultur, gir denne protokollen en enkel metode for å bestemme flere aspekter av mitose i nevrale stamceller i et miljø svært lik en in vivo setting. Det kan brukes på hjernen hos mutante dyr og / eller hjernen som er blitt manipulert med in utero electroporation) 1-5. Denne teknikken er også ideelt for å teste virkningen av farmakologiske midler på nevrale forløpere 'mitose, ved ganske enkelt å legge til en agent til kulturmediet. I sum vil denne artikkelen være en teknisk utfordrende protokoll tilgjengelig for de som studerer neurogenesis.
Under neurogenesis, distinkte nevrale stamceller populasjoner gjennomgå presise divisjoner for å generere nevroner som til slutt bidrar til de seks cortical lag av den voksne neocortex 6-8. Tidlig i hjernebarken, utvider den nevrale forløper bassenget som neuroepithelial (NE) celler deler symmetrisk til selv fornye. NE celler deretter konvertere til radiale gliaceller (RGCs). Utgangspunktet RGCs dele symmetrisk å produsere to nye RGCs, men under mesteparten av neurogenesis, er asymmetrisk RGCs 'viktigste modusen for divisjonen. I asymmetrisk fordeling, gir en RGC opphav til en ny RGC og enten en post-mitotiske neuron, eller en mer spesialisert progenitor (enten en kort neural forløper (SNP), en ytre radial gliaceller (ORG), eller i en mellomliggende progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS, SNP'er, og orgs kan deretter generere neuroner på sub-ventrikulær, ventrikulær og basal regioner i cortex, respektivt. Derfor er celledeling stamceller som en grunnleggende prosess for generering av nevronene i neocortex.
Tallrike studier peker på en sammenheng mellom bestemte mitotiske trekk av RGCs og skjebnen til datterceller. Haydar et al. Og Takahashi et al.har vist at RGC mitotisk varighet og cellesykluslengde økning som neurogenesis provenyet, et funn ekko i oppfølging studier 10-13. En rekke studier har antydet at mitotisk spindel orientering i forhold til ventrikkelen påvirker aspekter av neurogenesis og corticogenesis, inkludert typer av nerveceller som genereres og plasseringen av avkom i hjernen, henholdsvis 3,10,14-16. Enten cleavage fly orientering påvirker celle skjebne direkte er kontroversielt, men konklusjonen er fortsatt at dette mitotic parameter virkninger neurogenesis. Videre understreker viktigheten av mitose er den observasjon at mange gener involvert i mekanikken i mitose er avgjørende for neurogenesis og for riktig hjernens utvikling 17-20.
Mitose er en dynamisk prosess, men til dags dato de fleste studier detaljering nevrale stamceller mitose utnytte analyse av faste vevssnitt eller avbildning av nevrale stamceller via in vitro cellekultur. Dermed blir mainstream metoder for å vurdere mitose kun gir et øyeblikksbilde av denne prosessen og ikke klarer å avdekke hvordan cellene oppfører seg i en vev. Live-avbildning av nevrale stamceller mitose har i økende grad blitt et viktig redskap for å forstå nevrale stamceller funksjon. For eksempler se disse referansene 4,8,10,21-25. Flere fremragende protokoller har blitt publisert for forberedelse og avbildning av hjernen skiver 26,27. Men til dags dato, har en omfattende protokoll for bildebehandling og analyse av mitose ikke beskrevet eller vist i videoen.
Denne teknikk byr på flere vesentlige fordeler i forhold til faste analyse av hjerneseksjoner. Time-lapse analyse av hjernen skiver muliggjør generering av vesentlig flere datapunkter som kan analyseres på en fleksibel måte. For det første blir data samlet på enkelte tidspunkter i løpet av flere minutter eller flere timer. Man kan analysere individuelle tidspunkter (for å lage en statisk montasje) ellerkan kombinere ulike tidspunkt i filmer. For det andre, confocal avbildning av skiver muliggjør generering av data på ulike Z seksjoner i hjernen skiver. Som et resultat, kan de enkelte seksjoner analyseres. Alternativt kan stabler av individuelle seksjoner kombineres til en maksimal intensitet projeksjon. Tredje, er analyse gjort i sammenheng med en vev, avslører hvordan celler deler seg i forhold til nabocellene og strukturer. Fjerde, er det ideelt til analyse av mutanter som viser noen tegn til mitotiske defekter. Sammen denne protokollen vil bidra til å avklare viktige skritt for å hjelpe etterforskere som ønsker å gjennomføre direkte avbildning av nevrale stamceller mitose i egne laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Media (figur 1, trinn 1)
- Slice Kultur Medium
- 25 ml kulturmedium stykke er tilstrekkelig til å tilberede 5 glassbunn retter med to skiver per brønn.
- I et 50 ml konisk rør, tilsett 250 pl av en 100x N2-løsning og 500 pl av en 50x B27 oppløsning uten vitamin A. Tilsett DMEM/F12 til et volum på 22,5 ml.
- Filter sterilisere løsningen og deretter legge 1,25 ml varme-inaktivert hesteserum og 1,25 ml føtalt bovint serum.
- Inkuber løsningen i et vannbad ved 37 ° C i løpet av fremstillingen av skivene.
- Legg vekstfaktorer (FGF-og EGF, sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml og 20 ng / ml, respektivt) umiddelbart forut for begynnelsen av kulturen. Sammensetningen av dette medium har blitt optimalisert for å fremme overlevelsen av celler i kultur, og for å øke formeringshastigheten av nevrale stamceller. Dette vil dermed maksimere sannsynligheten for åobservere mitotiske celler i stykket.
- Full HBSS Dissection Solution
- Forbered 500 ml fullt HBSS ved tilsetning av 50 ml 10 x HBSS, 1,25 ml 1M Hepes (pH 7,4, 2,5 mM FC), 6 ml 2,5 M D-glukose (FC 30 mM), 2,2 ml 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) og autoklavert DIH 2 O til sluttvolum på 500 ml.
- Filter sterilisere løsning og oppbevar ved 4 ° C til innsamling av livmor horn fra den gravide mus. Denne oppløsningen kan holdes ved 4 ° C i flere uker.
- Hold HBSS på isen under hele disseksjon prosedyren.
- Embedding løsning
- For innstøping av 4 embryoniske hjernene, klar 30 ml av 3% lavtsmeltende agarose i den fulle HBSS-løsning. I et 50 ml konisk rør, tilsett 0,9 g lavtsmeltende agarose og full HBSS til 30 ml.
- Bland-løsning med en vortex-blander, og smelte i en mikrobølgeovn med røret stående og lokket åpnes.
- Mens i mikrobølgeovn, overvåke løsningen på pRevent overløp på grunn av overdreven koking. Når kokende starter, stoppe mikrobølgeovn og virvle løsningen.
- Gjenta disse trinnene til alle agarose har smeltet.
- Oppbevar røret i et vannbad ved 42 ° C.
2.. Disseksjon av embryoene (fig. 1, trinn 2)
- Etter nøye dødshjelp av den gravide mus, samle livmor horn og overføre dem til en 10 cm 2 petriskål med kaldt fulle 1x HBSS. Alderen av embryoet, kan variere avhengig av studien. Denne protokollen har blitt brukt med hell for dyrking hjernen skiver fra embryonale dager E12.5 til E17.5. På grunn av sin størrelse, yngre hjerner har en tendens til å være mer vanskelig å jobbe med.
- Samle embryoene og dissekere ut den embryoniske hjernene som er beskrevet tidligere i rotte og mus 26,27, før en fullstendig embryonale hjerne, inkludert hindbrain og forhjernen med de to cerebrale hemisfærer er oppnådd. Disse kan bliholdt på RT til alle hjerner har blitt dissekert.
- Samle embryoene og dissekere ut den embryoniske hjernene som er beskrevet tidligere i rotte og mus 26,27, før en fullstendig embryonale hjerne, inkludert hindbrain og forhjernen med de to cerebrale hemisfærer er oppnådd. Disse kan holdes ved romtemperatur inntil alle hjernene er dissekert.
Tre. Inkludering av de Embryonale Brains (figur 1, trinn 3)
- I en bøtte med is, lage et hull i isen for å sette inn de embedding muggsopp inn.
- Hell 3% agarose medium inn i en plast-form og plassere at formen i hullet fremstilt i isen.
- Omrør agarose medium med spissen av et digitalt termometer til temperaturen når 35 ° C.
- Omgående overføre hjernen til den innebygging medium.
- Kritisk trinn: For å fjerne overflødig HBSS i grenseflaten mellom hjernen og agarose, nøye og forsiktig riste / roter hjernen gjentatte gangeri embedding løsning med pinsett.
- En pute av gelatinert agarose vil dannes på bunnen av støpeformen i kontakt med isen. Når puten kan føles med spissen av tangen under omrøring hjernen, posisjonere hjernen med ryggsiden opp. Hjernen bør ikke synke til bunnen av formen.
4.. Fremstilling av Agarose Blokk (fig. 1, trinn 4)
- La den herde agarose i is i minst 5 min.
- Ved hjelp av et barberblad, seksjon hjørnene av formen.
- Skjære omhyggelig et agarose blokk rundt hjernen ved hjelp av et barberblad. Prøv å minimere antall kutt for å unngå perturbing den innebygde hjernen.
- Kontroller at blokken har et større overflateareal i kaudal region av hjernen (versus rostral område, se figur 1, trinn 4) for å øke stabiliteten av blokken på snitt pidestall.
- Det siste kuttet bør være en på hale side av hjernen;Dette kuttet vil definere riktig seksjonering flyet med vibratome.
- Gjøre så ved å justere bladet vinkelrett på rostro-kaudal aksen av hjernen og agarose blokken. Skyv ned bladet caudally langs rostro-caudal aksen og gjøre det endelige kuttet ca 5 mm bort fra de mest caudal region av hjernen.
- Sett agarose / hjerne blokk til side og gjenta innebygging av andre hjerner.
5. Overføring av Embedded Brains i skuffen av vibratome (Figur 1, Trinn 5)
- Tilsett en dråpe lim på undersiden av vibratome skuffen. Plasser limet slik at agarose blokkene vil bli plassert innen rekkevidde av den vibrerende blad.
- Plasser agarose / hjerne blokk caudal side ned på kanten av spatel, med omtrent 50% av blokken tipping over kanten av spatelen.
- Påfør hale ansiktet av agarose blokk til lim og skyver spatelen bort, opprettholde agarose blokk til bunnen av skuffen med shoulder av en pinsett. Ikke la slikkepott direkte kontakt med limet.
- La limet størkner ved romtemperatur i 5 min.
6. Seksjonering av Embedded Brains (figur 1, trinn 6)
- Fyll vibratome skuffen med HBSS.
- Definer start-og sluttposisjoner vibratome bladet.
- Generere 200-250 mikrometer skiver. Med VT1000s vibratome, kan du bruke følgende parametere: Speed 2 - 4, frekvens åtte.
- Fjern forsiktig skivene fra vibratome som de er kuttet. Overfør skivene med en stekespade og baksiden slutten av pinsett inn i 12 vel retter fylt med full HBSS. Alternativt noen forskere har brukt en pensel i stedet for pinsett Nøkkelpunkt:. Under overføring, passe på at hjernen skiver forbli festet til omliggende agarose.
7. Syto11 Farging av Slices (figur 1, trinn 7)
- Spe Syto11 til en endelig konsentrasjon på0,5 til 1 uM i stykkedyrkingsmedium supplert med vekstfaktorer.
- I brønn i en 12-brønns plate, inkuber skiver fra en hjernen i 2,5 ml fargings løsningen i 1 time ved 37 ° C.
- Vask skivene i 2,5 ml kulturmedium uten skive farging løsningen i 20 min.
8. Montere Slices i en glassbunn Dish (figur 1, trinn 8, 9)
- Forbered 15 mL av embedding kollagen løsning per skive. Tilbered en 1,5 mg / ml kollagen-løsning ved å blande 375 pl av 3 mg / ml kollagen type I-løsning med 75 ul av 10 x DMEM, 9,4 yl 1 M NaOH og 290 pl H2O Oppbevar på is.
- Plasser en 15 pl dråpe av kollagen-løsning i bunnen av en 35 mm glassbunn mikro oppvask. Spre det med en pipette spissen for å matche størrelsen på stykket.
- Overfør skive i slipp av kollagen med en slikkepott og pinsett Nøkkelpunkt:. Montering flere stykker i forskjelligent retter øker sannsynligheten for å skaffe skiver egnet for bildebehandling. Skjermen gjennom forskjellige skiver og velge de som best oppfyller kriteriene som er beskrevet nedenfor i "Representant Resultater"-delen.
- La skivene Inkuber ved RT i 10 min før de overføres til en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Etter 20 min, tilsett 1,2 ml skive kultur medium inn i Glass Bottom mikro Dish. Legg 600 ul medium på et tidspunkt og å spre den med en pipettespiss.
- Fang en lav forstørrelse bilde av hjernen skive for å spille inn den anatomiske nivå og integritet av stykket.
9. Levende Imaging av Slices (figur 1, trinn 10, 11)
- La skivene komme i inkubatoren i minst 1 time og 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO 2 før levende avbildning.
- Bilde skivene med mikroskop av valget, husk at Syto11 er svært utsatt for fotobleking. Her en inverterted spinne disk confocal mikroskop brukes (Andor XD revolusjon roterende disk confocal mikroskop). Alternativt kan en laser scanning mikroskop confocal kan brukes. Følgende parametere er for roterende disk mikroskop set-up.
- Under hele direkte avbildning sesjon, vedlikeholde skiver ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubering kammer festet til mikroskopet.
- Bilde celler med en 60X silikonolje objektiv med en arbeidsavstand på 300 mikrometer, og en numerisk blenderåpning på 1,3 (for eksempler se figur 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Et 100X olje-objektiv med en arbeidsavstand på 130 mikrometer og en numerisk apertur på 1,4 (se for eksempel figur 4C) kan også benyttes. Oppløsningen på kameraet er 512 x 512.
- Bilde cellene i en 30 mikrometer z-stabel, med sentrum av z-stabel som ligger omtrent 40 mikrometer under overflaten av det stykket. Prøver å bilde dypere inn i vevet kan føre til målet å leggemekanisk press på skive. Dette kan påvirke integriteten av hjernen skive. Ved planlegging for å gjøre 3D rekonstruksjoner av cellene bruke en z-intervall på ikke mer enn 2 mikrometer.
- Juster laser makt og eksponeringstider for å begrense fotobleking. Bruk eksponeringstider som varierer mellom 30 og 200 millisekunder, avhengig av intensiteten av Syto11 signal.
- Med en motorisert scene, bilde flere posisjoner på tvers av flere skiver montert på en tallerken. For eksempel, bildet opp til 20 stillinger spredt over fire forskjellige skiver i en enkelt rett.
- For levende bildebehandling, bruk en tidsmessig oppløsning på mindre enn 5 min å muliggjøre identifisering av de ulike fasene i mitosen. Ved hjelp av Syto11 og / eller histon H2B-EGFP, 4-5 timer for direkte avbildning er tilstrekkelig til å observere en betydelig antall mitotiske celler. Men hvis bildebehandling tynt merket mitotiske celler (for eksempel de som oppnås ved in utero elektroporering), deretter en lengre bildebehandling parameter (over natten) er hensiktsmessig og fungerer vill.
Merk: Bruk av denne protokollen, vi vanligvis observere i gjennomsnitt 10 mitotiske celler per stilling. Som nevnt ovenfor, bildebehandling flere montert skiver øker sannsynligheten for å ha et vellykket eksperiment. Med denne tilnærmingen vi vanligvis identifisere mitotiske celler i nesten alle eksperimenter utført med Syto11 eller histone H2B-EGFP.
10. Post-oppkjøpet Analyse av Mitosis (figur 2)
Alle prosedyrene i denne delen har blitt optimalisert i Fiji (ImageJ), noe som er en fordel fordi det er en gratis programvare med åpen kildekode. Andre programvareløsninger er tilgjengelige for å utføre de samme oppgavene, for eksempel Metamorph, Imaris, og Amira.
- Identifisering av Mitotisk Tall i Fiji
- Etter åpning av datasettet for en posisjon som en "hyperstack", velg en z-planet (se figur 2A for plasseringen av rullefeltet) hvor vev og celler ser sunn (se kriterier i diskusjonskapittelet).Rull over tidsdimensjonen for å identifisere celler går gjennom anaphase, da det er den enkleste mitotisk fasen å identifisere.
- Rull tilbake i tid for å identifisere tidspunktet hvor cellen trer mitose (DNA-kondensasjon). Cellen kan bevege seg på tvers av z-plan, men tidsmessig oppløsning og z-stack parametre som er beskrevet tidligere har blitt optimalisert for å muliggjøre denne prosessen.
- I et regneark, registrere 4D koordinatene for cellen i hyperstack (X, Y, Z og tid, se figur 2A å visualisere plasseringen av disse tallene i Fiji-grensesnitt) som det går inn i mitose. Kjenner disse koordinater vil hindre telling samme celle flere ganger.
- Bla fremover i tid og registrere tiden når cellen utvikler seg fra en fase til en annen. Dokumentere varigheten av hver mitotic fase for en gitt celle.
- Fortsett med andre celler, på tvers av hele datasettet (flere celler innenfor og på tvers posisjoner).
- 3D Gjenoppbyggion av cellene og Kvanitifisering av rotasjon under metafase (Tilpasset fra Haydar et al, 2003) (figur 2B).
- Etter å ha identifisert flere mitotiske celler, bruker koordinatene til en celle og bla fremover i tid til begynnelsen av metafase.
- Rotere hele "hyperstack" slik at ventrikkel grensen er planar (ved hjelp av "Image / Transform / Roter ..." kommandoen). Bruk "vinkel" verktøy for å bestemme vinkelen for å søke om denne rotasjonen.
- Identifiser z-planet, hvor cellen av interesse er den mest synlige. I det flyet, bruke "rektangel utvalg"-verktøyet til å tegne et utvalg som omfatter hele cellen.
- Identifiser z-plan som omfatter cellen av interesse. Bruk "Image / Duplicate" kommando for å opprette en "sub-stack". I dialogboksen forlate "Duplicate hyperstack" sjekket. Den "Slices (z)" parameter tilsvarer z-flyene inkludert hele cell, og "Frames (t)"-parameteren svarer til det aktuelle tidspunkt.
- Hvis oppløsningen er dårlig, øker størrelsen på "sub-stack" bruke "Image / Adjust / størrelse ..." kommandoen.
- Generere et 3D-rekonstruksjon av cellen på dagens tidspunkt ved hjelp av "Image/Stacks/3D prosjekt ..." kommandoen. Parametrene for denne kommando er vist i figur 2B. Den "Slice avstand" tilsvarer intervallet mellom hver av z-plane bilder (mikrometer). Viktig: Sørg for at den fysiske dimensjonen (mikrometer) av sub-stakken har blitt bevart. Hvis ikke, vil det interpolering av piksler i z dimensjonen være feil, og 3D-rekonstruksjon vil være unøyaktig.
- Ved hjelp av rullefeltet, rotere den resulterende 3D rekonstruksjon slik at kanten av metaplaten er synlig. Antallet av rammen svarer til den vinkel beta som er beskrevet i figur 3B, ned dette nummeret. Brukei "vinkel"-verktøyet og "Analyse / Measure ..."-kommandoen, måle vinkelen mellom horisontalen og en linje som deler metafase platen vinkelrett (fig. 2B). Dette er vinkelen alfa.
- Ned disse vinklene for alle metafase tidspunkter i cellen av interesse. Den rotasjonsvinkelen mellom tidspunktene (t) og (t-1) er lik den absolutte verdi av differansen mellom en vinkel (t), og denne vinkel (t-1).
- Måling orienteringen til Cleavage Plane
- 3D rekonstruere en celle av interesse på et tidspunkt i løpet anaphase følge instruksjonene for 3D rekonstruksjon av metafase plater.
- Roter rekonstruksjon inntil kantene av de to plater som er dannet av de segregerende kromosomer er synlige.
- Bruk vinkel verktøyet for å måle vinkelen mellom den vannrette (den ventrikulære kanten) og en linje parallell med de to plater som er dannet av de segregerende kromosomer. Dette er vinkelen for spalting planet (figur 2C).
- Generering av filmer
- Som cellene ofte bevege seg på tvers av ulike z-flyene, identifisere z-flyene okkupert av cellen under live bildebehandling økten. Generere et "Maksimal intensitet projeksjon" av disse z-flyene ved hjelp av "Image / Stacks / Z-prosjektet ..." kommandoen. Lagre den resulterende stabelen som en "TIF."-Filen.
- Åpne denne filen i 1.45-versjonen av ImageJ som Fiji inkluderer ikke en stabil plugin for generering av ". Mov" eller ". Avi" filer.
- Bruk "Fil / Lagre som / ..." kommando av ImageJ å generere en film i et format som er kompatibelt med dine nedstrømsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen til denne analysen, og observasjon av flere mitotiske celler i løpet av en levende avbildning økt i stor grad være avhengig av både integriteten og anatomiske nivået av skive hvor kjøp foretas. Som omtalt nedenfor, er den anatomiske nivået av en skive en viktig faktor. Figur 3A viser rostro-kaudal og medial-lateral steder hvor vi har vært mest vellykket. For ytterligere diskusjon om dette emnet kan du se Noctor 26. Integriteten til stykket kan variere i ulike regioner av stykket. Dette kan bestemmes før begynnelsen av time-lapse (ved hjelp av avbildning av hele skive som i trinn 7.6). I en god region av en E13.5 hjernen kan bli gjort følgende observasjoner: mange mitotiske celler vil bli funnet i ventrikkelen grensen, de interfase kjerner vil bli formet elliptiske snarere enn rund, og interfase kjerner vises columnar forhold til ventrikkelen grensen . I en mindre ønskelig område av hjernen,kjerner vil se avrundet og litt uorganisert (Sammenlign Tall 3B og 3C, og se Figur 3D for et bilde av en godt montert skive).
Når ideelle forhold er oppnådd, vil dette assay mulig kvalitativ identifisering av ulike faser av mitose. Disse kan påvises ved analyse av DNA-mønster (se figur 3E for eksempler på apikalt delende celler i hver fase av mitose). Under prophase, vil DNA-kondensasjon har utseendet av tynt merket DNA (DNA-DNA-rike og fattige områder i kjernen). I metafasen, kromosomene danner et plan ved ekvator av cellelegemet. Avhengig av orienteringen av planet, er det DNA-mønsteret enten (i) en tykk linje (figur 3E, vis 1) eller (ii) et "rosett" med en DNA-regionen dårlig i midten (figur 3E, vis 2) . Under anaphase når kromosomer skille, de ser ut som "hender"; som vandrer i motsatt retning. Denne fase kan være vanskelig å identifisere når spalting flyet er i X - Y planet anskaffelse. Under telophase, slapper DNA og får en ellipsoideform som kjernefysiske konvolutten reformer. Individuell tidspunkter kan samles for å visualisere mitose over tid (se figur 3F).
I tillegg til avbildning mitose av apikalt skille stamceller, kan denne analysen brukes til bilde basalt delende celler slik som orgs eller INPS, er sistnevnte som sannsynligvis representeres på figur 3G. Slike celler kan identifiseres ved deres plassering for inndeling i SVZ lag. Men for å virkelig markere disse cellene er det best å feste analyse med ekspresjon av et fluoriserende markør som etiketter celleprosess eller skjebne (se figurene 4B-D). INPS vil ha verken en apikale eller basal prosess, vil orgs ha en basal prosess med sin celle kroppen som ligger i de ytre lagene, og RGCs vil ha en BAsal prosess med sine cellelegemet som ligger i VZ lag.
Mitose stamceller kan visualiseres med alternative metoder. Figur 4A demonstrerer bruk av histone H2B-EGFP transgene mus til å merke kromosomer i alle delende celler. Dette markerer celler i et mønster som ligner på Syto11. Figur 4B viser bildebehandling utført med hjerner i utero electroporated med EGFP-α-tubulin og histone H2B-mCherry. Som vist, gjør dette enkelt å visualisere både mikrotubuli og kromosom, og i tillegg cellekroppen og basal prosess. Figur 4C viser bildebehandling utført med hjerne fra en Centrin-EGFP mus, in utero elektroporert med mCherry-a-tubulin og histone H2B-EGFP . Som vist, gjør det mulig for denne å avbilde kromosomer og Sentrioler i den grønne kanalen og den mitotiske spindel-og cellekroppen / prosess i den røde kanal. Figur 4D viser avbildning utført med hjernes i utero electroporated med CMV-Cre tynt og CALNL-EGFP 28. Denne teknikken gjør det mulig å spredt label dele stamfedre, noe som gjør analyser av enkelt dele celler enklere. Når du bruker elektroporering imidlertid huske på at denne metoden er rettet mot en forholdsvis synkronisert kohort av sykkel celler 2,12. Dette innebærer at tidspunktet for direkte avbildning i forhold til electroporation må justeres, slik at kullet electroporated cellene nærmer mitose ved begynnelsen av bilde sesjon. Hvis ikke, kan lykkes i forsøket på å identifisere eventuelle mitotiske celler bli svekket på kort sikt bildebehandling økten.
Når ideelle forhold er oppnådd, kan viktige funksjoner i mitose bli målt kvantitativt med generelle mitose varighet, varigheten av de enkelte faser, rotasjon av metafase planet og spalting plane orientering. I de beskrevne betingelser, har vi observert en gjennomsnittlig total mitotisk varighet på 1 hr30 min på embryonale dager (E) 13,5 og 14,5. Som tidligere beskrevet, kan rotasjonen av metafase-DNA planet måles ved en enkelt tidspunkt eller kumulativt over varigheten av en hel metafase 2,6,9,10. Dette kan oppnås ved bruk av 3D-rekonstruksjon av metafaseplanet i en celle ved hvert tidspunkt, og måling av vinkler i DNA i forhold til ventrikkelen. Vi har med hell benyttet metoden i dette papiret til å følge celler i minst 3 timer.
Figur 1. Skjematisk representasjon av trinnene i protokollen. Tid nødvendig for hvert trinn er angitt under hvert av trinnene. Detaljer for hvert av disse trinnene er beskrevet i "protokollen"-delen. Vær oppmerksom på at Trinn 7 kan omgås når imaging skiver fra histein H2B-EGFP embryoer, eller skiver fra hjerner som ble electroporated med plasmider uttrykke markører for mitose.
Figur 2. Post-oppkjøpsanalyse av time-lapse video mikros datasett i Fiji (ImageJ). A) Plassering av de ulike verktøyene som benyttes for analyse i Fiji. B) Ulike trinn involvert i 3D-rekonstruksjon av en celle i metafase. Detaljer for hvert av disse trinnene er beskrevet i "protokollen"-delen. C) Måling av spalting planet orientering i en 3D rekonstruert celle på anaphase. Vær oppmerksom på at tallene i B Trinn 6 og C viser sekvensen fulgt for å måle vinkelen. D) Representative data som viser distribution av meta varighet i en gruppe av mitotiske celler observert på ventrikkel grensen i E13.5 hjernen skiver (n = 35). E) Representative data som viser den kumulative rotasjon av metafase plater i E13.5 mitotiske celler på grensen av ventrikkelen . Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Eksempler på representative data fra sanntidsavbildning analyse. A) Langs dorso-ventral akse, er mitose lettest avbildes i dorsal regioner av hjernen skiver, fordi den basale prosessen RGCs er kortere og derfor mindre tilbøyelige til å bli brutt av vibratome. Langs rostro-kaudal akse, skiver i caudal regioner av dorsal cortex gimest konsekvente resultater i hendene. B og C) Eksempler er vist av en god region (B) og en dårlig region (C) for avbildning. I en god region, er atomkjerner elliptisk formet (sirklet regioner) og mange mitotiske celler er observert på grensen av ventrikkelen før time-lapse bildebehandling (piler). I en dårlig regionen, er svært få mitotiske celler observert på grensen av ventrikkelen (én pil) og atomkjerner er runde (sirklet regioner). D) Eksempel på en god skive observert med en lav forstørrelse mikroskop før leve bildebehandling. E) Eksempler på Syto11 merket celler i ulike faser av mitose, som nevnt F) Montage av en region på grensen av ventrikkelen hvor to nevrale stamceller gå gjennom de ulike fasene av mitose, markert i forskjellige farger (tid, hh:. mm). G) Montage av en region uthevet i (B) der en neural stamfar skiller i bort fra ventrikkel grensen. I montasjer (D) og (E), cells ble pseudo farget ved hjelp av Photoshop for å fremheve de forskjellige mitotiske fasene. (Scale barer: B, C, F: 10 mikrometer, D: 1 mm, E, G: 5 mikrometer).
Figur 4 Eksempler på alternative verktøy for å visualisere mitose av nevrale stamceller.. A) Montasje av en region på grensen av ventrikkelen i en hjerne skive fra en histone H2B-EGFP transgen embryo ved E13.5. En stamfar er observert som den fortsetter gjennom de ulike fasene av mitose. B) Montage av en VZ på E14.5 i bit av en hjerne som ble elektroporert på E13.5 med vektorer som uttrykker EGFP-a-tubulin og H2B-mCherry. EGFP-a-tubulin tillater visualisering av mikrotubulidynamikk under mitose (B 1-B 2) C) Montage av en ventrikkel region i enn E15.5 hjernen fra en Centrin-EGFP transgen embryo som ble elektroporert på E14.5 med plasmider uttrykker mCherry-a-tubulin og H2B-EGFP. Centrin-EGFP tillater visualisering av Sentrioler dynamikk under mitose (C 1 og C 2). D) Montage av en region som viser IZ av en E14.5 hjernen skive hvor cellene ble sparsomt merket av electroporation på E13.5 med en lav Konsentrasjonen av et plasmid som uttrykker Cre og en standard konsentrasjon av et plasmid som uttrykker EGFP etter Cre rekombinasjon 28.. Det å dele celle i denne montasjen har morfologi av en RGosvz med en lang basal prosess (rosa piler) og ingen apikale prosess ni. Målet som brukes for direkte avbildning av (A) og (B) Eksempler er en 60X silikonolje objektive, 100X olje-objektiv for eksempel (C), og 10X luft mål for eksempel D. Den tidsmessig oppløsning som brukes til å avbilde (A) , (B), (C) og (D) eksemplene var 4 min, 4 min, 30 sek, og 5 min, respektivt. VZ: Ventrikulær Zett, IZ: middels Zone, RGosvz: ytre subventricular sone radial gliaceller-lignende celle. (Scale barer: A: 15 mikrometer, B, C, D: 5 mikrometer, C 1, C 2: 2,5 mikrometer) Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den store fordelen med protokollen vi har beskrevet er at det gir en dynamisk temporal oppløsning på mitose av nevrale stamceller. Vanligvis er analyser for å visualisere mitose i utviklingen av hjernen utføres ved hjelp av immunfluorescens av faste vevssnitt. Men denne tilnærmingen gir bare et øyeblikksbilde av mitose på ett tidspunkt.
Det er flere trinn som er mest kritisk for avbilding av mitose i hjernen skiver: 1) De hjernen skiver bør forbli festet til agarose, for å bevare integriteten av hjerneseksjoner under transport og montering. 2) For den generasjonen og avbildning av skiver, er kontroll av rostro-caudal nivåer viktig. Kaudal hjernen skiver er vanligvis best, fordi i disse skiver, vil de basale prosesser av RGC holdes intakt, noe som er sunnere for cellene. 3) For levende avbildning, er bruk av en confocal spinning disk mikroskop med en 60X objektiv best for både høy oppløsning og for å unngå fotobleking av samples, som kan oppstå med Syto11 fargestoff. 4) For levende avbildning, tidsmessige parametere for oppkjøpet er kritisk. Avhengig av mikroskoputstyr benyttes, kan time-lapse utføres som strekker seg fra hver min til hvert 10 min. Større enn 10 minutter er vanligvis for lang for å oppnå høy oppløsning dynamikken i mitose.
Denne protokollen har visse begrensninger. Forsøket er utført med ex vivo vev. Det kan tenkes at observasjoner gjort i hjernen skiver kunne være annerledes in vivo. Derfor, når du gjør sammenligninger blant eksperimenter utført på ulike dager eller ved hjelp av forskjellige prøver, følgende parametre bør holdes konstant: bruk av lignende rostro-caudal og dorso-laterale nivåer, innholdet i media, bruk av mikroskop og oppkjøps parametere. I tillegg er det mulig fototoksisitet med langvarig avbildning. Derfor flere eksperimenter skal utføres før konklusjoner. Videre Syto11 selv kunne potentially påvirke mitotiske hendelser, spesielt i en mutant bakgrunn. Derfor anbefales det at når man gjør konklusjoner om mitose basert på Syto11 de også bekrefte funnene ved hjelp av uavhengige analyser, slik som markører er beskrevet i figur 4..
Som beskrevet i protokollen, kan mitose bli fotografert etter merking kromosomer og cytoskjelettet på forskjellige måter. Andre Syto fargestoffer kan anvendes for å visualisere mitose i andre fluoriserende kanaler. I stedet for å bruke Syto11 farging for å visualisere DNA, kan skiver genereres fra fluoriserende transgene linjer. For eksempel, som vist, histon H2B-EGFP transgene linjer kan brukes 29. Bruk av histone H2B-EGFP er spesielt nyttig og anbefales for å bekrefte eventuelle fenotype observert med Syto11 behandling. I tillegg kan det også være nyttig for å overvinne utfordringer knyttet til fotobleking med Syto11. Bruk av andre transgene linjer som centrin-EGFP 30, kanbli brukt til å visualisere Sentrioler, komponentene i centrosomes. Mens disse alene ikke ville være tilstrekkelig for å visualisere mitose, de fungerer godt i kombinasjon med andre markører av kromosomer eller mikrotubuli. Slike markører kan bli introdusert av in utero electroporation 4,5,10,31,32. Som vist, kan ekspresjon av fusjonsproteiner én dag før disseksjon være nyttig for denne tilnærming. I vår erfaring, kan uttrykke konstruerer under en CAG promoter ofte gir robust uttrykk løpet av én dag. For eksempel innførte vi α-tubulin og histone H2B-EGFP inn embryonale hjerner bruker denne tilnærmingen.
Når denne teknikken blir mestret det er flere modifikasjoner som kan gjøres for fremtidige eksperimenter. In utero elektroporering kan også brukes til å manipulere genekspresjon. For eksempel kan innføring av shRNA-eller cDNA være nyttig for å fastslå effekten av tap-av-funksjon-eller over-ekspresjon av et gen av interesse ved neural progenitor mitose 33. I tillegg kan skivene behandles med kjemiske stoffer eller små molekyler for å måle virkningen av å inhibere signalveier eller molekyler ved mitose 34,35.
I vår prosedyre beskriver vi bildebehandling utført ved hjelp av en roterende disk confocal. Den store fordelen med en roterende disk konfokalmikroskop er hastigheten på oppkjøpet. Dette muliggjør avbildning av flere posisjoner fra forskjellige hjerneskiver i en levende avbildning økt med en høy tidsmessig oppløsning, og en rimelig bildekvalitet. Andre oppsett slik som en multifoton laser scanning mikroskop confocal gi mulighet for å skaffe bilder med høy kvalitet på dypt inn i vevet, hvor de radiale gliacellene er mindre sannsynlig for å bli kuttet på nivået av basal prosessen. Dette vil derfor øke sannsynligheten til bilde sunne nevrale stamceller. Men, er dette vanligvis forbundet med et offer av hastigheten på oppkjøpet. Dette vil igjen begrense number poler som kan avbildes i løpet av en levende avbildning økt, i tillegg til den tidsmessig oppløsning. Imaging of mitosis kan også utføres innenfor et vidt felt mikroskop. Men i dette tilfelle er det best å avbilde tynt merkede celler, i motsetning til histon H2B-EGFP-eller Syto11, som den totale lysheten av disse reagenser ville gjøre avbildning mye vanskeligere. Også den protokoll som er beskrevet her anvender en invertert mikroskop. De viktigste fordelene med en invertert mikroskop er det mulig å bruke høyoppløselige olje mål og bevegelsesfrihet når mikroskopet er kombinert med en motorisert scenen. Som en konklusjon, må eksperimentator å finne en balanse mellom de fordeler og ulemper ved et bestemt oppsett, og hensikten med et eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner midler fra ninds / NIH, R00-NS064197 og ninds / NIH, R01NS083897 (både til DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
