Summary
Neural митоза предшественников является критическим параметром нейрогенеза. Большая часть нашего понимания нейронной митоза предшественников на основе анализа основного ткани. Онлайн изображений в эмбриональных срезах мозга является универсальный метод для оценки митоза с высоким временным и пространственным разрешением в контролируемой среде.
Abstract
Хотя непродолжительны, митоз является сложной и динамичной многоступенчатый процесс основополагающее значение для развития органов, включая мозг. В развивающихся коры головного мозга, нарушение митоза нейронных клеток-предшественников может вызвать дефекты в размере мозга и функции. Таким образом, существует острая необходимость в инструментах, чтобы понять механизмы нервной митоза предшественников. Развития коры у грызунов является выдающимся моделью для изучения этого процесса. Neural митоза предшественников обычно рассматриваются в фиксированных срезов головного мозга. Этот протокол будет подробно описать подход к живого изображения митоза в бывших естественных условиях эмбриональных срезах мозга. Мы опишем важные шаги для этой процедуры, которые включают в себя: добычу мозга, мозг вложение, Vibratome секционирования срезах мозга, окрашивание и культивирование срезов и покадровой обработки изображений. Затем мы продемонстрировать и подробно описывают, как выполнять анализ после приобретения митоза. Мы включаем Представитель Результаты фром этот анализ с использованием жизненно красителя Syto11 трансгенные мыши (гистонов H2B-EGFP и ЦентрИН-EGFP) и внутриутробное электропорации (mCherry-α-тубулина). Мы обсудим, как эта процедура может быть лучше оптимизирован и как он может быть изменен для изучения генетической регуляции митоза. Живая съемка митоза в срезах мозга является гибкий подход к оценке влияния возраста, анатомии, и генетической возмущения в контролируемой среде, и генерировать большое количество данных с высоким временным и пространственным разрешением. Поэтому этот протокол будет дополнять существующие инструменты для анализа нейронной митоза предшественников.
Introduction
Общая цель этого протокола заключается в описании, как выполнять Живая съемка нервной митоза предшественников в эмбриональных срезах мозга. Использование живых изображений срезах мозга в культуре, этот протокол обеспечивает простой метод для анализа несколько аспектов митоза в нейронных клеток-предшественников в среде высоко аналогичной обстановке в естественных условиях. Он может быть применен к мозгу мутантных животных и / или мозгов, которые были изменены с внутриутробное электропорации) 1-5. Этот метод также идеально подходит для проверки эффекта фармакологических агентов на митоз нейронных предшественников, путем простого добавления агента к культуральной среде. В целом, эта статья будет сделать технически сложный протокол доступным для тех, кто учится нейрогенез.
Во время нейрогенеза, различные нервные популяции предшественников пройти точные подразделения генерировать нейроны, которые в конечном итоге способствуют шести корковых слоев взрослого неокортекс 6-8. В начале развития коры, нейронная бассейн предшественником расширяется нейроэпителиальные (NE) клетки делятся симметрично самообновлению. NE клетки затем конвертировать в радиальных глиальных клеток (РГК). Первоначально РГК разделить симметрично производить два новых РГК, однако во время навалом нейрогенеза, основным видом РГК "деления является асимметричной. В асимметричных делений, 1 РГК приводит к новому РГК и либо постмитотических нейрона, или более специализированный прародителя (либо короткий нейронная предшественника (SNP), внешней радиальной глии (ORG), или промежуточного прародителя (ИЯФ) 2,3,7,9. INPS, ОНП, и Orgs может генерировать нейроны в суб-желудочка, желудочка и базальных отделах коры, соответственно. Таким образом, деление клетки из клеток-предшественников является фундаментальным процессом генерации нейронов неокортекс.
Многочисленные исследования указывают на корреляции между конкретными митоза черт РГК и судьбе дочерних клеток. Хайдар и др.., А Такахаши и др..показали, что продолжительность митотического РГК и длина клеточного цикла увеличение как нейрогенез доходов, нахождение отражение в последующих исследованиях 10-13. Ряд исследований показали, что митотического веретена ориентации по отношению к желудочка влияет аспекты нейрогенеза и corticogenesis, в том числе типов нейронов, генерируемых и месте потомства в мозгу, соответственно 3,10,14-16. Будь декольте самолет ориентация напрямую влияет судьбы клеток является спорным, но вывод остается, что это митотический воздействие параметров нейрогенез. Далее подчеркивает важность митоза является наблюдение, что многие гены, участвующие в механике митоза имеют решающее значение для нейрогенеза и для правильного развития мозга 17-20.
Митоз представляет собой динамический процесс, но на сегодняшний день большинство исследований подробно нейронной митоза предшественников используют анализ разделов фиксированных тканей или изображений нейронных клеток-предшественников через в пробирке культуре клеток. Таким образом, способы господствующие для оценки митоза только дают представление о данном процессе и не в состоянии раскрыть, как клетки ведут себя в ткани. Живая съемка нервной митоза предшественников все чаще становится важным инструментом для понимания нейронной функции предшественников. Примеры см. эти ссылки 4,8,10,21-25. Несколько выдающихся протоколы были опубликованы для подготовки и обработки изображений срезов мозга 26,27. Однако до настоящего времени, комплексный протокол для обработки изображений и анализа митоза не было описано и не показано в видео.
Этот метод имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с фиксированной анализа срезов головного мозга. Покадровый анализ срезах мозга позволяет поколение значительно более точек данных, которые могут быть проанализированы в гибкой форме. Во-первых, данные собираются в отдельных точках времени в течение нескольких минут или нескольких часов. Можно анализировать отдельные моменты времени (для создания статического монтаж) илиможно совмещать различные моменты времени в кино. Во-вторых, конфокальной микроскопии срезов позволяет генерировать данные на разных Z секций в срезах мозга. В результате отдельные секции могут быть проанализированы. Кроме того, стеки отдельных секций могут быть объединены в максимальной проекции интенсивности. В-третьих, анализ выполняется в контексте ткани, показывая, как клетки делятся относительно соседних ячеек и сооружений. В-четвертых, он идеально подходит для анализа мутантов, которые показывают некоторые признаки митоза дефектов. Вместе этот протокол поможет прояснить важные шаги, чтобы помочь следователям, которые желают осуществлять живую съемку нервной митоза предшественников в их собственных лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка информации (рис. 1, стадия 1)
- Кусочек Культура Средний
- 25 мл ломтик культуральной среде достаточно, чтобы подготовить 5 стеклянным дном блюда с 2 ломтика на лунку.
- В 50 мл коническую трубку, добавить 250 мкл 100x N2 решения и 500 мкл 50x B27 раствора без витамина А. Добавить DMEM/F12 до объема 22,5 мл.
- Фильтр стерилизовать раствор, а затем добавить 1,25 мл инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки и 1,25 мл фетальной бычьей сыворотки.
- Инкубировать раствор в водяной бане при 37 ° С в течение всего срока подготовки ломтиками.
- Добавить факторы роста (FGF и EGF, конечную концентрацию 10 нг / мл и 20 нг / мл, соответственно), непосредственно перед началом культуры. В состав этой среды была оптимизирована для содействия выживанию клеток в культуре и увеличить скорость пролиферации нервных клеток-предшественников. Это будет таким образом максимизировать вероятностьнаблюдать митотических клеток в срезе.
- Полный ССРХ Вскрытие Решение
- Приготовления 500 мл HBSS полной добавлением 50 мл 10-кратного HBSS, 1,25 мл 1 М Hepes (рН 7,4, 2,5 мМ FC), 6 мл 2,5 М D-глюкозы (FC 30 мм), 2,2 мл 0,9 М NaHCO 3 (FC 4 мМ) и обрабатывали в автоклаве DIH 2 O до конечного объема 500 мл.
- Решение Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С до сбора рогов матки от беременной мыши. Это решение может быть выдерживали при 4 ° С в течение недели.
- Держите HBSS на льду во время всей процедуры вскрытия.
- Встраивание решение
- Для вложения 4 эмбриональных мозгов, подготовить 30 мл 3% низкоплавкой агарозе в полном решения HBSS. В 50 мл коническую пробирку, добавляют 0,9 г агарозы с низкой температурой плавления и полного HBSS до 30 мл.
- Смешайте раствор с вихревой смеситель, и растопить в микроволновой печи с репутацией трубки и открытой крышкой.
- В то время как в микроволновой печи, следить за решение рRevent переполнения из-за чрезмерного кипения. При кипячении начинается, остановить микроволновая печь и вихрь решение.
- Повторите эти действия, пока все агарозном не растает.
- Хранить трубку в водяной бане при 42 ° С
2. Рассечение эмбрионов (рис. 1, стадия 2)
- После тщательного эвтаназии беременной мыши, собирать рога матки и передавать их в 10 см 2 чашки Петри, содержащей холодной полный 1x HBSS. Возраст эмбриона может варьироваться в зависимости от исследования. Этот протокол был успешно использован для культивирования ломтики мозга от эмбриональных дней E12.5 к E17.5. Благодаря своим размерам, молодые мозги, как правило, сложнее работать.
- Сбор эмбрионов и рассекать из эмбриональных мозг, как описано выше в крыс и мышей 26,27 до полного эмбрионального мозга в том числе заднего мозга и переднего мозга с помощью двух полушарий головного мозга не будет получена. Они могут бытьдержали при комнатной температуре, пока все мозги не были расчленены.
- Сбор эмбрионов и рассекать из эмбриональных мозг, как описано выше в крыс и мышей 26,27 до полного эмбрионального мозга в том числе заднего мозга и переднего мозга с помощью двух полушарий головного мозга не будет получена. Они могут быть сохранены при комнатной температуре, пока все мозги не были расчленены.
3. Погружение эмбриональных Brains (рис. 1, шаг 3)
- В ведро с льда, создать дыру в лед, чтобы вставить вложения форм в.
- Налейте 3% агарозном среды в пластиковые формы и разместить эту форму в отверстие, полученного на льду.
- Перемешивают в агарозном среду с кончиком цифровым термометром, пока температура не достигнет 35 ° С.
- Оперативно передавать в мозг в вложения среды.
- Важнейший шаг: Чтобы удалить избыток HBSS на границе между мозгом и агарозы, тщательно и аккуратно падать / вращать мозг неоднократнов вложения раствора с пинцетом.
- Подушка из гелеобразного агарозы образуют в нижней части пресс-формы в контакте со льдом. После того, как подушка может ощущаться кончиком пинцета при перемешивании мозг, поместите мозг спинной стороной вверх. Мозг не должны опускаться до самого дна формы.
4. Подготовка агарозном блока (рис. 1, Стади 4)
- Пусть агароза затвердеет в льду в течение по меньшей мере 5 мин.
- Использование лезвие, раздел углы формы.
- Осторожно вырезать агарозы блок вокруг мозга с помощью лезвия бритвы. Постарайтесь свести к минимуму количество сокращений, чтобы избежать возмущения встроенный мозг.
- Убедитесь, что блок имеет большую площадь поверхности в хвостовой части головного мозга (по сравнению с ростральной области, см. рисунок 1, шаг 4) для улучшения стабильности блока на секционирования пьедестала.
- Последнее сокращение должно быть тем, на хвостовом стороне мозга;это сокращение будет определять правильный секционирования самолет с Vibratome.
- Ли так, совместив лезвие перпендикулярно к ростро-хвостовой оси мозга и агарозном блока. Сдвиньте вниз лезвие каудально вдоль ростро-каудальном оси и сделать окончательный вариант около 5 мм от наиболее хвостового отдела головного мозга.
- Установите блок агарозы / мозга в сторону и повторите вложение других мозгов.
5. Передача Embedded Мозги в лоток на Vibratome (рис. 1, шаг 5)
- Добавить каплю клея на нижней части Vibratome лотка. Поместите клей, так что агарозы блоки будут расположены в пределах досягаемости вибрирующей лезвия.
- Поместите блок агарозы / мозг хвостовой стороной вниз на краю лопатки, причем около 50% от опрокидывания блока краю шпателя.
- Применить хвостовой лицо агарозном блока на клей и сдвиньте шпатель далеко, поддерживая агарозном блок в нижней части лотка с сhoulder из пинцетом. Не позволяйте шпатель напрямую связаться с клеем.
- Пусть клей затвердеть при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Секционирование из встроенных Brains (рис. 1, Шаг 6)
- Заполните Vibratome поднос с HBSS.
- Определить начало и конец позиции Vibratome лезвия.
- Создать 200 - 250 мкм ломтиками. С Vibratome VT1000s, используйте следующие параметры: скорость 2 - 4, частотные 8.
- Осторожно снимите ломтики из Vibratome как они отрезаны. Передача ломтики с помощью шпателя и заднем конце пинцетом в 12-луночные планшеты, заполненные полной HBSS. В качестве альтернативы некоторые исследователи использовали кисть вместо пинцета ключевой момент:. Во время передачи, позаботиться о том, ломтики мозга остаются прикрепленными к окружающей агарозы.
7. Syto11 Окрашивание срезов (рис. 1, стадия 7)
- Развести Syto11 в конечной концентрации0,5 - 1 мкм в ломтик культуральной среде с добавлением факторов роста.
- В лунку 12-луночного планшета, инкубировать ломтиками от одного мозга в 2,5 мл окрашивающего раствора в течение 1 часа при 37 ° С.
- Промыть срезы в 2,5 мл культуральной среды среза без окрашивания раствор в течение 20 мин.
8. Монтаж фрагменты В стеклянный Блюдо (рис. 1, шаги 8, 9)
- Подготовка 15 мкл встраивания коллагена раствора на срез. Готовят раствор 1,5 мг / мл коллагена путем смешивания 375 мкл 3 мг / мл коллагена типа I раствора с 75 мкл 10х DMEM, 9,4 мкл 1 М NaOH и 290 мкл H 2 O. Храните на льду.
- Поместите каплю 15 мкл раствора коллагена в нижней части 35 мм Стекло нижней Microwell Блюдо. Распространение его с концом пипетки, чтобы соответствовать размеру среза.
- Перенести кусочек в каплю коллагена с помощью шпателя и пинцетом Ключевой момент:. Монтаж несколько фрагментов в отличаютсяЛОР блюда увеличивает вероятность приобрести ломтики подходящие для работы с изображениями. Экран с помощью различных срезах и выберите те, которые наилучшим образом отвечают критериям, описанным ниже в разделе "Представительства Результаты".
- Пусть ломтики инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин до передачи их в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2.
- Через 20 мин, добавить 1,2 мл ломтик культуральной среде в стеклянным дном Microwell Блюдо. Добавить 600 мкл среды в то время, и развернул его с кончика пипетки.
- Захват низкой кратности изображение среза мозга для записи анатомическую уровень и целостность среза.
9. Живая съемка ломтики (рис. 1, стадии 10, 11)
- Пусть ломтики восстановить в инкубаторе в течение по крайней мере 1 часа и 30 минут при 37 ° С с 5% CO 2 до живого изображения.
- Изображение ломтики с микроскопом выбора, имея в виду, что Syto11 очень склонны к фотообесцвечивания. Здесь инверсииТед спиннинг диск конфокальной микроскопии используется (Андор XD революция вращающийся диск конфокальной микроскопии). В качестве альтернативы лазерной сканирующей конфокальной микроскопии может быть использован. Следующие параметры для прядения диска микроскопом настройки.
- В течение всего сеанса живого изображения, поддерживать ломтики при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненной инкубационной камере, прикрепленной к микроскопом.
- Клетки изображения с 60X кремния нефти объективом с рабочим расстоянием 300 мкм, и числовой апертурой 1,3 (для примера см. рис 3B, 3C, 3E, 3F, 4А, 4В). Масло цель 100X с рабочей дистанции 130 мкм и числовой апертурой 1,4 (см., например, рис 4C) также могут быть использованы. Разрешение камеры составляет 512 х 512.
- Изображение ячейки в Z-Stack 30 мкм, с центром Z-Stack, расположенной примерно 40 мкм ниже поверхности среза. Попытка изображение глубже в ткани может вызвать цель, чтобы добавитьмеханическое давление на срезе. Это может повлиять на целостность мозга срез. Если планируете сделать 3D реконструкции ячеек, использовать Z-интервал не более 2 мкм.
- Отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции, чтобы ограничить фотообесцвечивания. Использование время экспозиции в диапазоне от 30 до 200 мс, в зависимости от интенсивности сигнала Syto11.
- С моторизованным этапе изображений несколько позиций по нескольким ломтиками установлен в 1 блюдо. Например, изображение до 20 позиций, разбросанных по 4-х различных срезов в 1 одном блюде.
- Для живого изображения, использовать временное разрешение менее 5 мин для обеспечения возможности выявления различных фаз митоза. Использование Syto11 и / или гистон H2B-EGFP, 4 - 5 час из живого изображения достаточно, чтобы наблюдать значительное количество митотических клеток. Однако, если томография редко помечены митотических клеток (например, те, достигается в маточно электропорации), то больше визуализации параметров (на ночь) подходит и работает мыLL.
Примечание: Используя этот протокол, мы обычно наблюдаем в среднем 10 митоза клеток на месте. Как указано выше, множественный изображения установлен ломтики увеличивает вероятность имеющих успешный эксперимент. При таком подходе мы обычно определить митотических клеток практически во всех экспериментов, выполненных с Syto11 или гистона H2B-EGFP.
10. После приобретения Анализ Митоз (рис. 2)
Все процедуры в этом разделе были оптимизированы на Фиджи (ImageJ), что выгодно, потому что это бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом. Другие программные решения доступны для выполнения тех же задач, таких как Metamorph, Imaris и Amira.
- Идентификация митотических фигур на Фиджи
- После открытия набора данных для одной позиции, как "HyperStack" выберите один плоскость г (см. рис 2А для расположения на полосе прокрутки), где ткань и клетки выглядят здоровыми (см. критерии в разделе обсуждения).Выделите через временном измерении определить клетки, проходящие через анафазе, как это самый простой митотический фаза идентифицировать.
- Выделите назад во времени, чтобы определить точку во времени, когда клетка вступает в митоз (конденсация ДНК). Клетка может перемещаться по Z-плоскостей, но временное разрешение и параметры Z-Stack, описанные ранее были оптимизированы для того, чтобы этот процесс.
- В электронной таблице, запишите 4D координаты ячейки в HyperStack (X, Y, Z и времени, см. рисунок 2А визуализировать расположение этих фигур в интерфейсе Фиджи), поскольку это входит в митоз. Зная эти координаты помешает считая той же клетке в несколько раз.
- Прокрутка вперед во времени и записывать время, когда клетка переходит из одной фазы в другую. Документ продолжительность каждого митотического фазы для одного данной ячейки.
- Перейдите с другими клетками, по всей набора данных (несколько клеток в учебных позиций).
- 3D Реконструкционный из клеток и Количественное определение вращения во время метафазы (адаптировано из Гейдара и др., 2003) (рис. 2В).
- Выявив несколько митотических клеток, не использовать координаты ячейки и прокрутите вперед во времени до начала метафазы.
- Поверните весь "HyperStack" таким образом, чтобы желудочка граница плоская (с помощью команды "Изображение / Transform / Rotate ..."). Используйте "угол" инструмент для определения угла применять для этого вращения.
- Определить плоскость г, где клетка представляет интерес является наиболее наглядным. В этой плоскости, используйте "прямоугольник выбора" инструмент, чтобы нарисовать выбор, который включает всю ячейку.
- Определить Z-самолеты, которые включают в клетку интересов. Используйте команду "Изображение / Дублировать», чтобы создать "суб-стек". В диалоговом окне, оставить "Duplicate HyperStack" проверили. "Кусочки (г)" параметр соответствует Z-плоскостей в том числе всей сеLL, и "Рамки (т)" параметр соответствует текущей момент времени.
- Если разрешение оставляет желать лучшего, увеличить размер "к югу от стека", используя "Изображение / Adjust / размер ..." команду.
- Создайте 3D-реконструкция ячейки в текущей момент времени, используя "Image/Stacks/3D проект ...» команду. Параметры этой команды отображаются на рисунке 2B. "Расстояние между Slice" соответствует интервалу между каждой из Z-Plane изображений (мкм). Важно: убедитесь, что физический размер (мкм) к югу от стека был сохраняется. Если нет, то интерполяция пикселей в размерности г будет неправильным, и реконструкция 3D будет неточным.
- Используя полосу прокрутки, вращать полученный 3D-реконструкция, так что край метафазной пластинки видна. Номер кадра соответствует бета углом, описанной на фигуре 3В, записать этот номер. Использование"Угол" инструмент и "Анализ / Мера ..." команду, измерить угол между горизонтальной плоскости и линии рассекает метафазной пластинки перпендикулярно (рис. 2В). Это угол альфа.
- Запись эти углы для всех временных точках метафазных клетки интереса. Угол поворота между точками времени (Т) и (Т-1) равна абсолютной величине разницы между углом в (Т) и под этим углом на (Т-1).
- Измерение ориентации плоскости спайности
- 3D реконструкции ячейку интереса в свое время точку во время анафазы, следуя инструкциям, описанным для 3D реконструкции метафазных пластинок.
- Поворот реконструкцию до края двух пластин, образованных сегрегирующих хромосом не видны.
- Используйте инструмент угол, чтобы измерить угол между горизонтальной (желудочковая край) и линию, параллельную двух пластин, образованных сегрегирующих хромосом. Это угол плоскости спайности (рис. 2в).
- Генерация Фильмы
- Как клетки часто перемещаются между различными Z-плоскостей, определить Z-самолеты, занятые ячейки во время прямого сессии изображений. Генерация "Максимальная проекцию интенсивности» этих Z-плоскостях с помощью "Image / стеки / Z проект ...» команду. Сохраните полученное стек в виде файла ". TIF».
- Откройте этот файл в 1,45 версии ImageJ как Фиджи не включает стабильный плагин для генерации ". Мов" или ". Ави" файлов.
- Используйте "Файл / Сохранить как / ..." командованием ImageJ для создания фильма в формат, совместимый с вашим ниже по течению приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех этого анализа и наблюдение нескольких митотических клеток в течение одного живого изображений сессии в значительной степени зависит от обоих целостности и анатомической уровне среза, где приобретения сделаны. Как будет показано ниже, анатомическая уровень кусочком является важным фактором. 3А показывает ростро-каудально и медиально-латеральной места, где мы оказались наиболее успешными. Для дополнительного обсуждения этого вопроса см. Noctor 26. Целостность ломтик может варьироваться в разных регионах среза. Это может быть определено до начала покадровой (с использованием визуализации всего среза, как на стадии 7.6). В хорошем районе в E13.5 мозга следующие замечания могут быть сделаны: многие митоза клетки будут найдены на желудочка границы, интерфазных ядрах будет формироваться эллиптической, а не тура, и интерфазных ядрах появится столбчатый отношению к желудочка границе . В менее желательным области мозга,ядра будет выглядеть округлены и несколько дезорганизованы (сравните рисунки 3B и 3C, и см. рисунок 3D для картины хорошо смонтированной ломтик).
Когда идеальные условия будут достигнуты, этот анализ позволит качественно идентификации различных фаз митоза. Они могут быть обнаружены с помощью анализа структуры ДНК (см. рис 3E примеры апикально делящиеся клетки в каждой фазе митоза). Во время профазы, конденсация ДНК будет иметь вид редко меченой ДНК (ДНК-богатых и ДНК-бедные регионы в ядре). Во время метафазы хромосомы образуют плоскость на экваторе тела клетки. В зависимости от ориентации плоскости, шаблон ДНК либо (я) жирная линия (рис. 3E, вид 1) или (II) "розетка" с участка ДНК бедных в середине (рис. 3E, вид 2) . Во анафазе, когда хромосомы расходятся, они выглядят как "руками"; , которые мигрируют в противоположных направлениях. Эта фаза может быть трудно определить, когда самолет расщепление в X - Y самолет приобретения. Во телофазе, ДНК расслабляется и приобретает в форме эллипсоида, как реформ ядерной оболочки. Точки Индивидуальный времени могут собираться для визуализации митоза в течение долгого времени (см. рисунок 3F).
В дополнение к отображению митоз апикально разделительных предшественников, этот анализ может быть использован для изображения в основании деления клеток, таких как Orgs или INPS, последний из которых, скорее всего, представлена на Рисунке 3G. Такие клетки могут быть идентифицированы по их расположению для разделения в SVZ слой. Однако по-настоящему отметить эти клетки лучше всего пару анализ с выражением флуоресцентным маркером, которая маркирует процесс клеток или судьбу (см. рис 4B-D). INPS не будет иметь ни верхушечный ни базальной процесс, Orgs будет иметь базальной процесс с их тела клетки, расположенной во внешних слоях, и РГК будет иметь басал процесс с их тела клетки, расположенной в VZ слоя.
Митоз из предшественников могут быть визуализированы с альтернативными методами. 4А демонстрирует использование гистона H2B-EGFP трансгенной мыши маркировать хромосомы всех делящихся клеток. Это знаменует клетки в схеме, похожей на Syto11. 4б изображений выполняется с мозгами в утробе электропорации с EGFP-α-тубулина и гистона H2B-mCherry. Как было показано, это дает возможность визуализировать обе микротрубочки и хромосомы, и, кроме того тело клетки и базальных процесс. Фиг.4С изображает изображений выполняется с мозгами от мыши Центрин-EGFP, внутриутробно электропорации с mCherry-а-тубулина и гистона H2B-EGFP . Как было показано, это дает возможность изображения хромосом и центриолей в зеленом канале и митотического веретена и тела клетки / процесс в красном канале. Рисунок 4D изображает изображений выполняется с мозгомс в утробе электропорированные с CMV-Cre рассеянно и CALNL-EGFP 28. Этот метод дает возможность малонаселенных этикеток разделительных предшественников, что делает анализ отдельных делящихся клеток проще. При использовании электропорации однако, иметь в виду, что этот метод предназначается для довольно синхронизированный когорту велосипедных клеток 2,12. Это означает, что время живого изображения по отношению к электропорации необходимо отрегулировать так, чтобы когорты электропорации клеток подходы митоза в начале сеанса изображения. Если нет, успех эксперимента в определении любых митотических клеток может быть нарушена в короткий срок изображений сессии.
Когда идеальные условия достигаются, ключевые особенности митоза могут быть количественно измерены в том числе общей продолжительности митоза, продолжительность отдельных фаз, вращения метафазной плоскости и плоскости спайности ориентации. В описанных условиях, мы наблюдали в среднем общую продолжительность митоза из 1 час30 мин при эмбриональных дней (E) 13,5 и 14,5. Как описано выше, вращение плоскости метафазы ДНК может быть измерена на индивидуальном момент времени или в совокупности в течение длительности всего метафазе 2,6,9,10. Это может быть достигнуто с помощью 3D реконструкции метафазы плоскости клетки в каждый момент времени и измерения углов ДНК по отношению к желудочка. Мы успешно применил метод в данной статье, чтобы следовать клетки, по крайней мере 3 часов.
Рисунок 1. Схематическое изображение этапов протокола. Время, необходимое для каждого шага указывается по каждому из этапов. Подробная информация для каждого из этих шагов описаны в разделе "Протокол". Обратите внимание, что Шаг 7 можно обойти при визуализации ломтики из приветэмбрионы камень H2B-EGFP, или ломтики из мозгов, которые были электропорации с плазмиды выражения маркеры для митоза.
Рисунок 2. Анализ после приобретения покадровой видео микроскопии наборов данных на Фиджи (ImageJ).) Расположение различных инструментов, используемых для анализа на Фиджи. B) Различные операций, связанных с 3D реконструкции ячейки в метафазе. Подробная информация для каждого из этих шагов описаны в разделе "Протокол". C) Измерение расщепления плоскости ориентации в 3D реконструкция ячейки в анафазе. Пожалуйста, обратите внимание, что числа в B шаге 6 и C показывают последовательность затем измерить угол. D) Представительства данные, показывающие distributioн продолжительности метафазной в группе митотических клеток наблюдается при желудочковой границы в E13.5 срезах мозга (п = 35). Е) Представительства данные, показывающие, совокупный вращение метафазных пластинок в E13.5 митотических клеток на границе желудочка . Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Примеры репрезентативных данных из живой анализа изображений. А) По спинно-вентральной оси, митоз наиболее легко отображается в дорзальных отделах срезах мозга, так как базальный процесс РСК короче и, следовательно, менее вероятно, будут разорваны по Vibratome. Вдоль ростро-хвостового оси, ломтики в каудальных областях спинного мозга даютНаиболее последовательные результаты в наших руках. В и С) Примеры приведены хорошего регионе (B) и плохой области (С) для работы с изображениями. В хорошем районе, ядра эллиптической формы (обведены регионы) и многие митоза клетки наблюдаются на границе желудочка до покадровой съемки (стрелки). В плохом районе, очень мало митоза клетки наблюдаются на границе желудочка (единственная стрелка) и ядра раунд (обведены регионы). D) Пример хорошей ломтик наблюдается с низким увеличением микроскопа предварительного жить визуализации. Е) Примеры Syto11 меченых клеток в разных фазах митоза, как отмечалось F) Монтаж области на границе желудочка, где две нейронные клетки-предшественники пройти через разные фазы митоза, отмеченные в разные цвета (время, чч:. мм). G) Монтаж области выделены (B), где нейронная предшественников делит в сторону от желудочковой границы. В монтажей (D) и (E), CELLS были псевдо окрашенные с помощью Photoshop, чтобы выделить различные фаз митоза. (масштаб бары: B, C, F: 10 мкм, D: 1 мм, E, G: 5 мкм).
Рисунок 4. Примеры альтернативных инструментов для визуализации митоза нейронных клеток-предшественников. А) Монтаж области на границе желудочка в ломтик мозга от трансгенного эмбриона гистона H2B-EGFP в E13.5. Один предшественников наблюдается по мере продвижения через различные фазы митоза. B) Монтаж в ВЗ в E14.5 в срезе мозга, который был электропорации в E13.5 с векторами, выражающих EGFP-а-тубулина и H2B-mCherry. EGFP-а-тубулина позволяет визуализация динамики микротрубочек во время митоза (B 1-B 2) С) Монтаж желудочковой региона вн E15.5 мозга от Центрин-EGFP трансгенных эмбрионов, который был электропорации в E14.5 плазмидами, выражающих mCherry-а-тубулина и H2B-EGFP. Центрин-EGFP позволяет визуализировать Центриоли динамики во время митоза. (С 1 и С 2) D) Монтаж региона с указанием IZ из ломтик E14.5 мозга, где клетки редко помеченного электропорации в E13.5 с низким Концентрация плазмиды, экспрессирующей Cre и стандартную концентрацию плазмиды, экспрессирующей EGFP после рекомбинации Cre 28. Деления клеток в этом монтажа имеет морфологию RGosvz с длинной базальной процесса (розовые стрелки) и не верхушечный процесс 9. Цель используется для живых изображений (А) и (В) примеров является 60X силиконовое масло цель, 100X масло задача например (С), и 10X воздух задача например D. временное разрешение используется для изображения (A) , (B), (C) и (D) примеров были 4 мин, 4 мин, 30 сек, и 5 мин соответственно. В.З.: желудочковая Zодин, И.З.: промежуточная зона, RGosvz: Внешняя зона субвентрикулярной радиальной глии, как клетка. (масштаб бары: A: 15 мкм, B, C, D: 5 мкм, C 1, C 2: 2,5 мкм) Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основным преимуществом протокола мы описали, что она обеспечивает динамический временное разрешение митоза нейронных клеток-предшественников. Как правило, анализы визуализировать митоза в развивающемся мозге выполняются с помощью иммунофлюоресценции секций фиксированных тканей. Но такой подход только обеспечивает моментальный снимок митоза в одной временной точке.
Есть несколько шагов, которые являются наиболее критическим для работы с изображениями митоза в срезах мозга: 1) Ломтики мозга должны оставаться прикрепленной к агарозы, чтобы сохранить целостность срезов головного мозга во время передачи и монтажа. 2) Для поколения и обработки изображений срезов, контроль ростро-каудальном уровнях имеет важное значение. Каудальные ломтики мозга, как правило, лучше, потому что в этих срезах, базальные процессы РГК будут сохранены, что здоровее для клеток. 3) Для живого изображения, использование конфокальной вращающимся диском микроскоп с целью 60X лучше как для высокого разрешения и, чтобы избежать фотообесцвечивания сные примеры, которые могут произойти с Syto11 красителя. 4) Для живого изображения, временные параметры приобретения являются критическими. В зависимости от микроскопа используемого оборудования, покадровой может быть выполнена в пределах от каждой минуты, чтобы каждые 10 мин. Превышает 10 мин, как правило, слишком долго, чтобы достичь динамику с высоким разрешением митоза.
Этот протокол имеет определенные ограничения. Эксперимент проводится с экс естественных тканей. Вполне возможно, что замечания, высказанные в срезах мозга может отличаться в естественных условиях. Таким образом, при сравнении ключи экспериментов, выполненных в разные дни или с использованием различных образцов, следующие параметры должны храниться постоянный: использование подобных ростро-хвостовых и спинно-боковых уровнях, содержание средств массовой информации, использование микроскопа и параметров сбора. Кроме того, фототоксичность можно с долгосрочным изображений. Поэтому несколько эксперименты следует проводить до принятия выводов. Более того, сама Syto11 мог мощнымially влиять митотических событий, особенно в мутантного фоне. Поэтому рекомендуется, что, когда один делает выводы о митоза на основе Syto11, они также подтверждают результаты, используя независимые анализы, такие как маркеров, описанных на рисунке 4.
Как описано в протоколе, митоз могут быть отображены после маркировки хромосомы и цитоскелет различными способами. Другие красители SYTO может быть использован для визуализации митоз в других флуоресцентных каналов. Вместо использованием окрашивания Syto11 визуализировать ДНК, ломтики могут быть получены из флуоресцентных трансгенных линий. Например, как показано, гистон H2B-EGFP трансгенных линий могут быть использованы 29. Использование гистона H2B-EGFP особенно полезен и рекомендован для подтверждения любой фенотип наблюдается при лечении Syto11. Кроме того, он также может быть полезным для преодоления проблем, связанных с фотообесцвечивания с Syto11. Использование других трансгенных линий, таких как ЦентрИН-EGFP 30, можетиспользоваться для визуализации центриоли, компоненты центросомах. Хотя эти сами по себе не будет достаточно для визуализации митоза, они хорошо работают в сочетании с другими маркерами хромосом или микротрубочек. Такие маркеры могут быть введены в маточно электропорации 4,5,10,31,32. Как было показано, что экспрессия слитых белков за один день до вскрытия может быть полезно для такого подхода. По нашему опыту, выражая конструкции под CAG промоутер может часто дают сильную экспрессию в течение одного дня. Например, мы ввели α-тубулина и гистонов H2B-EGFP в эмбриональных мозгов с помощью этого подхода.
После того, как этот метод освоен существуют дополнительные модификации, которые могут быть сделаны для будущих экспериментов. В маточно электропорации также может быть использован для управления генной экспрессии. Например, введение shRNA или кДНК может быть полезно для определения влияния с потерей функции или избыточная экспрессия интересующего гена при нервной прогenitor митоза 33. Кроме того, кусочки можно лечить с помощью химических препаратов или малых молекул для измерения воздействия ингибирования сигнальных путей или молекул на митоза 34,35.
В нашей процедуре мы описываем изображений выполняется с помощью вращающийся диск конфокальной. Основным преимуществом вращающийся диск конфокальной микроскопии является скорость получения. Это позволяет визуализацию нескольких позициях разных срезах мозга в одной живой сессии изображений с высоким временным разрешением, а также приемлемое качество изображения. Другие установок, такие как многофотонной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии в себе возможность приобрести высококачественные изображения глубоко в ткани, где радиальные глиальные клетки являются менее вероятно, будут разорваны на уровне базальных процесса. Поэтому Это увеличит вероятность изображений здоровых нервных клеток-предшественников. Однако это, как правило, связаны с жертвой скорости приобретения. Это в свою очередь будет ограничивать питBER позиций, которые могут быть отображены в течение одного живой сессии изображений, а также временным разрешением. Визуализация митоза также может быть выполнена на широком поле микроскопа. Однако в этом случае лучше всего изображения редко меченых клеток, в отличие от гистона H2B-EGFP или Syto11, как общая яркость этих реагентов бы визуализацию намного сложнее. Кроме того, протокол, описанный здесь использует инвертированного микроскопа. Основные преимущества инвертированного микроскопа являются возможность использовать нефтяные целей с высоким разрешением и свободу передвижения, когда микроскоп, соединенный с моторизованным этапе. В заключение, экспериментатор должен найти баланс между преимуществами и недостатками конкретной установки и с целью эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы признают, финансирование из NINDS / NIH, R00-NS064197 и NINDS / NIH, R01NS083897 (как в DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
