Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Abstract

Kısa süreli de, mitoz beyin de dahil olmak üzere organların gelişimi için temel karmaşık ve dinamik çok adımlı bir işlemdir. Gelişmekte olan serebral korteks, sinir atalarıdır anormal mitoz beyin büyüklüğü ve işlevi bozukluklara neden olabilir. Bu nedenle, nöral progenitör mitoz mekanizmalarını anlamak için araçlar için kritik bir ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde kortikal gelişim bu sürecin eğitim için olağanüstü bir modeldir. Nöral progenitör mitoz sık sabit beyin bölümlerinde incelenmiştir. Bu protokol ayrıntılı olarak ex vivo embriyonik beyin dilimleri mitoz canlı görüntüleme için bir yaklaşım anlatacağız. Beyin çıkarma, beyin gömme, beyin dilimleri Vibratome bölümlendirilmeleri, lekelenme ve dilimleri kültürlemenin ve time-lapse görüntüleme: Biz dahil olan bu işlem için kritik adımları anlatacağız. Biz o göstermek ve mitoz alım sonrası analizi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Biz temsili sonuçları fr dahilom hayati boya Syto11, transgenik fareler (histon H2B-EGFP ve merkezleme-EGFP) ve utero elektroporasyon (MCherry α-tubulin) kullanarak bu deneyi. Bu işlem en iyi optimize edilebilir nasıl ve mitoz genetik düzenleme çalışması için modifiye edilebilir nasıl tartışacağız. Beyin dilimleri mitoz Canlı görüntüleme kontrollü bir ortamda yaş, anatomi ve genetik pertürbasyonun etkisini değerlendirmek ve yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile veri büyük miktarda üretmek için esnek bir yaklaşımdır. Dolayısıyla bu protokol nöral progenitör mitoz analizi için mevcut araçları tamamlayacak.

Introduction

Bu protokolün genel amacı embriyonik beyin dilimleri nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl tarif etmektir. Kültürde beyin dilimleri canlı görüntüleme kullanarak, bu protokol, bir in vivo ortamda yüksek oranda benzer bir ortamda sinir progenitörlerin mitoz yönlerine bir çok yönü tahlil için basit bir yöntem sağlamaktadır. It) utero elektroporasyon ile 1-5 manipüle edilmiş olan mutant hayvan ve / ya da beyin beyinlerine uygulanabilir. Bu teknik sadece kültür ortamına bir madde eklenmesi ile, sinir ön-'mitoz ile ilgili farmakolojik maddelerin etkisini test etmek için de idealdir. Özetle, bu makalede nörogenezi okuyan bir teknik zorlu protokol erişilebilir hale getirecek.

Nöron sırasında, farklı nöral progenitör popülasyonları sonunda 6-8 neokorteks yetişkin altı kortikal katmanları katkıda nöronlar oluşturmak için kesin bölünmeler tabi. Nöroepitel (NE) hücreler, kendini yenileme simetrik bölmek gibi erken kortikal geliştirme, nöral prekürsör havuzu genişler. NE hücreler daha sonra radyal glial hücreler (RGCs) dönüştürmek. Başlangıçta RGCs ancak nöron toplu sırasında, bölünme RGCs 'ana mod asimetrik olup, iki yeni RGCs üretmek için simetrik bölmek. Asimetrik bir bölümü olarak, 1 RGC yeni RGC ve ya bir post-mitotik nöron ya da daha özel bir progenitör (ya da kısa sinir öncü (SNP), bir dış radyal glia (ORG), ya da bir ara progenitör (INP) yol açar 2,3,7,9. INPS, SNP ve Orgs sonra alt ventrikül, ventriküler nöronların üretebilir, ve korteks bazal bölgeleri, sırasıyla. Dolayısıyla, atalarıdır hücre bölünmesi nöronları üretmek için temel bir süreçtir neokorteks.

Çeşitli çalışmalar belirli mitoz RGCs özellikleri ve kızı hücrelerinin kaderi arasında bir korelasyon olduğuna işaret. Haydar et al. Ve Takahashi et al.RGC mitoz süresi ve nöron ilerledikçe hücre döngüsü uzunluğu artışı, bir bulgu çalışmalar 10-13 takip yankılandı olduğunu göstermiştir. Bir dizi çalışma ventriküle mitotik iğ yönlendirme göre, sırasıyla, beyinde üretilen nöronların türleri ve döl konumu, 3,10,14-16 içeren nöron ve kortikogenezin yönlerini etkileyen olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yarılma düzlemi yönlendirilmesi, doğrudan hücre kaderini etkiler tartışmalıdır, ama sonuç bu mitoz parametre etkiler nöron kalır. Daha fazla mitoz önemini vurgulayan mitoz mekaniği oynayan çok sayıda gen nöron ve uygun beyin gelişimi için 17-20 çok önemli olduğunu gözlemdir.

Mitoz dinamik bir süreç, henüz bugüne kadar nöral progenitör mitoz ayrıntılı çalışmaların çoğu in vitro hücre kültürü yoluyla sabit doku bölümleri veya nöral atalarıdır görüntüleme analizini kullanmak. Böylece, mitoz değerlendirmek için genel yöntemleri sadece bu sürecin bir anlık sağlamak ve hücreler bir dokuda nasıl davrandığını ortaya çıkarmak için başarısız. Nöral progenitör mitoz Canlı görüntüleme giderek nöral progenitör işlevini anlamak için kritik bir araç haline gelmiştir. Örnekler için bu referanslar bakınız 4,8,10,21-25. Çeşitli seçkin protokoller hazırlanması ve beyin dilimleri 26,27 görüntülenmesi için yayınlanmıştır. Ancak bugüne kadar, görüntüleme ve mitoz analizi için geniş kapsamlı bir protokolü tarif edilmemiştir veya video gösterdi.

Bu teknik, beyin bölümlerinin sabit analizi üzerinde çeşitli önemli avantajlar sunar. Beyin dilimleri Time-lapse analiz esnek bir şekilde analiz edilebilir ölçüde daha fazla veri noktaları nesil sağlar. İlk olarak, veri birkaç dakika veya birkaç saat boyunca ayrı zaman noktalarında toplanmıştır. Bir birey zaman noktaları (statik bir montaj oluşturmak için) ya da analiz edebilirsinizfilm içine farklı zaman noktaları birleştirebilirsiniz. İkincisi, dilim konfokal görüntüleme beyin dilimleri farklı Z bölümlerde veri nesil sağlar. Sonuç olarak, ayrı ayrı bölümler analiz edilebilir. Seçenek olarak ise, tek tek bölümlerin yığınları maksimum yoğunluk çıkıntı halinde birleştirilebilir. Üçüncü olarak, analiz hücreler komşu hücreler ve yapılarına göre bölmek ortaya koyarak, bir doku bağlamında yapılır. Dördüncü olarak, bu ideal mitotik kusurları bazı kanıtlar göstermektedir mutantların analizi için uygundur. Birlikte bu protokol, kendi laboratuarlarında nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme yürütmek isteyen araştırmacılara yardımcı olmak için önemli adımlar netleştirmeye yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Medya 1. Hazırlanması (Şekil 1, Aşama 1)

  1. Dilim Kültür Ortamı
    1. Dilim kültür ortamı içinde 25 mi, oyuk başına 2 ile 5 dilim cam alt yemekler hazırlamak için yeterlidir.
    2. 50 ml konik bir tüp içinde, bir N2 100x çözeltisi 250 ul ve A vitamini 22,5 ml 'lik bir hacme kadar DMEM/F12 ekle olmayan bir 50x B27 çözeltisi 500 ul ekleyin.
    3. Filtre solüsyonu sterilize etmek ve daha sonra ısı ile inaktive edilmiş at serumu 1.25 ml ve fetal inek serumu, 1.25 ml.
    4. Dilimlerinin hazırlanması süresince 37 ° C'de bir su banyosunda solüsyon inkübe edin.
    5. Büyüme faktörleri (FGF ve EGF, 10 nihai konsantrasyona ekleme ng / ml ve 20 hemen önce kültür başına), sırasıyla, ng / ml. Bu ortamın bir bileşim kültürde hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için ve sinir progenitörlerin proliferasyonunu oranını artırmak için optimize edilmiştir. Bu, böylece için olasılık maksimize edecekdilim mitotik hücreler görüyoruz.
  2. Tam HBSS Diseksiyon Çözüm
    1. , 0.9 M NaHCO 3 2.2 ml 1 M Hepes, 1.25 ml (pH 7.4, 2.5 mM FC), 2.5 M D-Glukoz 6 ml (FC 30 mM) HBSS 10x, 50 ml ilave etmek suretiyle, tam HBSS 500 ml hazırlayın 500 ml'lik nihai hacme kadar diH 2 O otoklav (FC 4 mM) ve.
    2. Gebe fare rahim boynuzları koleksiyonu kadar 4 ° C'de sterilize çözüm ve mağaza. Bu çözelti hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    3. Bütün diseksiyon prosedür sırasında buz üzerinde HBSS tutun.
  3. Çözüm gömme
    1. 4 embriyonik beyinlerin gömme için, tam HBSS çözeltisi içinde% 3 düşük erime noktalı agarozun 30 ml hazırlar. 50 ml konik tüp, 30 ml düşük erime noktalı agaroz ve tam HBSS 0.9 g.
    2. , Bir girdaplı karıştırıcı ile çözüm karıştırın ve tüp duran ve kapak açık olan bir mikrodalga içinde eritin.
    3. Mikrodalgada, p çözüm izlemek daAşırı kaynama nedeniyle Revent taşması. Başlar kaynarken, mikrodalga durdurmak ve çözüm vorteks.
    4. Tüm agaroz eriyene kadar bu adımları tekrarlayın.
    5. 42 ° C'de bir su banyosu içinde tüpü saklayın

Embriyoların 2. Diseksiyonu (Şekil 1, Adım 2)

  1. Hamile fare dikkatli ötenazi sonra, rahim boynuzları toplamak ve soğuk dolu 1x HBSS içeren 10 cm 2 Petri kabı içine aktarabilirsiniz. Embriyonun yaşı çalışmaya bağlı olarak değişebilir. Bu protokol E17.5 embriyonik gün E12.5 beyin dilimleri kültürlemek için başarıyla kullanılmaktadır. Onların büyüklüğü nedeniyle, genç beyinleri ile çalışmak daha zor olma eğilimindedir.
  2. Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare 26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Bu olabilir,tüm beyinleri edilene kadar oda sıcaklığında tutulması.
  3. Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare 26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Tüm beyinleri edilmiştir kadar bu, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

3.. Embriyonik Brain gömülmesi (Şekil 1, Adım 3)

  1. Bir kova içeren buz olarak, gömme kalıp içine eklemek için buz içinde bir delik oluşturmak.
  2. Plastik bir kalıba% 3 agaroz orta dökün ve buz içinde hazırlanan delik kalıp içine yerleştirin.
  3. Sıcaklık 35 ° C'ye ulaşana kadar dijital bir termometre ucu ile agaroz orta karıştırın
  4. Derhal gömme ortamı içine beyin aktarın.
  5. Kritik Basamak: dikkatli bir şekilde, beyin ve agaroz arasındaki ara yüzeyde fazla HBSS kaldırmak için tekrar tekrar ve yavaşça / beyin döndürme çamaşırforseps ile gömme çözeltide.
  6. Agaroz jel bir yastık buz ile temas kalıbın altındaki oluşturacaktır. Beyin karıştırılırken yastık forseps ucu ile hissedilebilir kez, dorsal yüzü yukarı ile beyin yerleştirin. Beyin kalıp çok dibine batırmak olmamalıdır.

Agaroz Blok 4. Hazırlama (Şekil 1, Adım 4)

  1. Agaroz en az 5 dakika boyunca buz içinde sertleşmeye olsun.
  2. Bir tıraş bıçağı kullanarak, bölüm kalıbın köşelerinde.
  3. Dikkatli bir jilet kullanarak beyin çevresinde bir agaroz blok bölmek. Gömülü beyin karışmasını önlemek için kesim sayısını en aza indirmek için deneyin.
  4. Kesit kaide üzerinde bloğun kararlılığını arttırmak için (Şekil 1, Adım: 4, rostral bölge karşı) blok beynin kaudal bölgede daha büyük bir yüzey alanına sahip olduğundan emin olun.
  5. Son kesim beynin kaudal tarafında biri olmalıdır;Bu kesim Vibratome ile doğru kesit düzlemini tanımlamak olacaktır.
  6. Beyin rostro-kaudal ekseni ve agaroz bloğuna dik olarak bıçağın bunu. Caudally rostro-kaudal ekseni boyunca bıçak aşağı kaydırın ve yaklaşık 5 mm uzakta beynin en kaudal bölgeden son kesim yapmak.
  7. Kenara agaroz / beyin bloğu ayarlayın ve diğer beyinleri gömülmesini tekrarlayın.

Vibratome Tepsi içine gömülü Brain 5. Transferi (Şekil 1, Adım 5)

  1. Vibratome tepsinin dibine üzerine tutkal bir damla ekleyin. Agaroz blok titreşimli kanadın ulaşılabilecek yerleştirilmiş olacak, böylece yapıştırıcı yerleştirin.
  2. Spatula kenarı üzerinde blok devrilme yaklaşık% 50 ile, spatula kenarında agaroz / beyin blok kaudal tarafı aşağı yerleştirin.
  3. Tutkal agaroz blok kaudal yüzünü uygulayın ve s ile tepsinin altına agaroz blok bakımı, uzakta spatula kaydırıncımbız bir çift houlder. Spatula doğrudan tutkal temasa izin vermeyin.
  4. Tutkal 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya olsun.

Gömülü Brain 6. Kesit (Şekil 1, Adım 6)

  1. HBSS ile vibratome tepsiyi doldurun.
  2. Vibratome bıçak başlangıç ​​ve bitiş pozisyonları tanımlayın.
  3. 250 mikron dilimleri - 200 oluşturun. - 4, frekans 8 hız 2: VT1000S Vibratome ile, aşağıdaki parametreleri kullanın.
  4. Onlar kesilir gibi dikkatle Vibratome gelen dilim çıkarın. Tam HBSS ile dolu 12 iyi yemekleri içine bir spatula ve cımbız arka ucu ile dilimleri aktarın. Alternatif olarak bazı araştırmacılar, cımbız yerine bir fırça kullanmış Anahtar nokta:. Transferi sırasında, beyin dilimleri çevreleyen agaroz takılı kalması dikkat.

Dilimler 7. Syto11 lekelenmesi (Şekil 1, Adım 7)

  1. Bir son konsantrasyon için Syto11 seyreltin0,5 - Dilim kültür ortamı içinde 1 uM büyüme faktörleri ile takviye edilmiştir.
  2. Bir 12-yuvalı plaka oyuğuna olarak, 37 ° C'de 1 saat boyunca boyama çözeltisinin 2.5 ml bir beyin dilimleri inkübe
  3. 20 dakika boyunca solüsyon lekelemeden dilim kültür ortamına 2.5 ml dilimleri yıkayın.

8. A Glass Bottom Bulaşık Dilimleri Montaj (Şekil 1, Adım 8, 9)

  1. Dilim başına kollajen çözüm gömme 15 ul hazırlayın. 10x DMEM, 1 M NaOH 9.4 ul ve H 2 290 ul O'dan 75 ul ile 3 mg / ml tip I kolajen çözeltisi 375 ul karıştırılarak bir 1.5 mg / ml kolajen çözeltisi hazırlayın Buz üzerinde saklayın.
  2. 35 mm bir cam taban Microwell Bulaşık altındaki kolajen çözeltisi, 15 ul damla yerleştirin. Dilimin büyüklüğüne uygun bir pipet ucu ile yayıldı.
  3. Cımbız, bir spatula ve çift kollajen düşüş içine dilim aktarın Anahtar nokta:. Farklı birden çok dilim Montajent yemekler görüntüleme için uygun dilimleri elde etmek için olasılığını arttırır. Ekran farklı dilimlerde ve en iyi "Temsilcisi Sonuçlar" bölümünde, aşağıda açıklanan kriterlere uygun olanları seçin.
  4. Dilimleri% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine transfer etmeden önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. 20 dakika sonra, cam alt Microwell çanağı içine dilim kültür ortamı, 1.2 ml. Bir seferde ortamın 600 ul ilave edin ve bir pipet ucu ile yayıldı.
  6. Dilim anatomik seviyesini ve bütünlüğünü kaydetmek için beyin dilim düşük bir büyütme görüntü yakalayın.

Dilimleri 9. Canlı Görüntüleme (Şekil 1, 10, 11 Steps)

  1. Dilimleri canlı görüntüleme önce,% 5 CO2 ile 37 ° C'de en az 1 saat ve 30 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde geri olsun.
  2. Syto11 Photobleaching çok eğilimli olduğunu göz önünde tutarak seçim mikroskop ile görüntü dilimleri. Bir inver Buradated dönen disk konfokal mikroskop (Andor XD devrim dönen disk konfokal mikroskop) kullanılır. Alternatif olarak, bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılabilir. Aşağıdaki parametreler dönen disk mikroskop set-up için vardır.
  3. Bütün canlı görüntüleme oturumu sırasında, 37 ° C, mikroskop bağlı bir inkübasyon odası içinde nemlendirilmiş% 5 CO2 de dilim korumak.
  4. 300 mikron bir çalışma mesafesi ile 60X silikon yağı objektif ve 1.3 bir sayısal diyafram ile Görüntü hücreler (örnekler Şekil 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B için bkz). 130 um'lik bir çalışma mesafesi ve 1.4 'lük bir sayısal açıklığı olan bir 100X yağ amacı, (örneğin, Şekil 4C bakınız) de kullanılabilir. Kameranın çözünürlüğü 512 x 512 olduğunu.
  5. Yaklaşık 40 um dilim yüzeyinin altında yer alan z-yığınının merkezi ile bir 30 um-z yığını, Görüntü hücreler. Doku içine daha derin görüntü çalışırken amaç eklemek neden olabilirdilim mekanik basınç. Bu beyin dilim bütünlüğünü etkileyebilir. Planlama hücrelerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için ise, artık mikron 2 den bir z-aralığı kullanınız.
  6. Photobleaching sınırlamak için lazer güç ve maruz kalma sürelerini ayarlayın. 30 ila Syto11 sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak 200 ms arasında değişen maruz bırakma sürelerinin kullanılması.
  7. , Bir motorlu kaide ile, birden fazla görüntü dilimleri üzerinde birden fazla pozisyon 1 kabına monte edilmiştir. 1 tek tabak 4 farklı dilimlere dağılmış 20 pozisyonları Örneğin, görüntü yukarı.
  8. Canlı görüntüleme için, mitoz farklı aşamalarının belirlenmesini sağlamak için en az 5 dakika bir zamansal çözünürlük kullanın. Syto11 ve / veya histon H2B-EGFP kullanılarak, 4 - canlı görüntüleme 5 saat mitotik hücre önemli sayıda gözlemlemek için yeterlidir. Görüntüleme seyrek (örneğin utero elektroporasyon elde gibi) mitotik hücreleri etiketli Ancak, daha sonra uzun bir görüntüleme parametresi (gece) uygun olduğunu ve biz işlerill.
    Not: Bu protokolü kullanarak, biz genellikle pozisyon başına ortalama 10 mitotik hücreler üzerinde gözlemlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, görüntüleme birden çok dilim monte başarılı bir deney sahip olasılığını artırır. Bu yaklaşım ile, tipik haliyle Syto11 ya da histon H2B-EGFP ile yapılan hemen hemen tüm deneylerde, hücreler mitotik belirlemek.

10. Mitoz Post-satın alma Analizi (Şekil 2)

Bu bölümdeki tüm işlemler bu ücretsiz açık kaynak kodlu bir yazılım olduğu için avantajlıdır Fiji (İmageJ), optimize edilmiştir. Diğer yazılım çözümleri gibi Metamorph, Imaris ve Amira gibi aynı görevleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.

  1. Mitotik tanımlanması Fiji Rakamlar
    1. Bir "hyperstack" gibi bir pozisyon için veri kümesini açtıktan sonra, doku ve hücrelerin sağlıklı bakmak yere (tartışma bölümünde Kriterler) (kaydırma çubuğunun konumu için Şekil 2A) bir z-düzlem seçin.Bu tanımlamak için en kolay mitotik faz olarak, Anafazda geçiyor hücreleri tanımlamak için zamansal boyutu boyunca ilerleyin.
    2. Hücre mitoz (DNA yoğunlaşması) girdiği zaman noktasını belirlemek için zamanda geriye gidin. Hücre z-düzlemleri üzerinde hareket edebilir, ama zamansal çözünürlük ve daha önce açıklanan z-yığın parametreleri bu süreci sağlamak için optimize edilmiştir.
    3. Bir elektronik olarak, mitoz girerken (Fiji arayüzünde bu rakamların yerini görselleştirmek için Şekil 2A, X, Y, Z ve zaman) 4D hyperstack hücrenin koordinatlarını kaydetmek. Bu koordinatlarını bilerek aynı hücreye birkaç kez sayım önleyecektir.
    4. Zaman içinde ilerlemek ve hücre bir fazdan diğerine ilerledikçe zamanı kaydedecektir. Bir belirli bir hücre için, her bir mitotik fazının süresini belge.
    5. Tam bir veri kümesi üzerinde diğer hücreler, (içinde ve konumlarındaki birden hücreler) ile devam edin.
  2. 3D Yeniden İnşaHücreler iyon ve metafaz sırasında dönme kantitasyonu (Haydar et al, 2003 'den uyarlanmıştır) (Şekil 2B).
    1. Metafaz başına kadar birden mitoz hücre tespit ettikten sonra, bir hücrenin koordinatlarını kullanmak ve zaman içinde ilerleyin.
    2. Ventriküler sınır ("Resim / Transform / Döndür ..." komutunu kullanarak) düzlemsel böylece tüm "hyperstack" döndürün. Bu dönüş için başvuruda açısını belirlemek için "açı" aracını kullanın.
    3. Ilgi hücre en görünür olduğu z-düzlemi tanımlayın. Bu düzlemde, tüm hücreyi içeren bir seçim çizmek için "dikdörtgen seçim" aracını kullanın.
    4. Ilgi konusu hücre, z-uçakları belirlenmesi. Bir "alt-yığını" yaratmak için "Image / Kopyala" komutunu kullanın. Iletişim kutusunda, kontrol "Duplicate hyperstack" bırakın. "Dilimler (z)" parametresi de dahil olmak üzere bütün ce z-düzlemlerine karşılıkll, ve "Çerçeve (t)" parametresi, geçerli zaman noktasına karşılık gelir.
    5. Çözünürlük kötü ise, "Resim / ayarla / Boyutu ..." komutunu kullanarak "alt yığın" boyutunu artırır.
    6. "Image/Stacks/3D projesini ..." komutunu kullanarak şimdiki zaman noktasında hücrenin bir 3D yeniden oluşturun. Bu komut için parametreler Şekil 2B'de görüntülenir. "Dilim aralık" z-düzlemi görüntüleri (um) her biri arasındaki aralığa karşılık gelir. Önemli: alt yığın fiziksel boyutu (mikron) muhafaza edilmiş olduğundan emin olun. Eğer değilse, z boyutta piksel interpolasyon yanlış olacaktır ve 3D rekonstrüksiyonu yanlış olacaktır.
    7. Metafaz plakasının kenar görülebilir, böylece kaydırma çubuğunu kullanarak, sonuçta elde edilen 3D yeniden döndürün. Çerçevenin sayısı, Şekil 3B'de tarif edilen beta açıya karşılık gelir, bu numarayı kaydedin. Kullanma"açı" aracı ve "Analiz / Tedbir ..." komutu, yatay ve (Şekil 2B) dik metafaz plakayı ikiye ayıran bir çizgi arasındaki açıyı ölçmek. Bu açı alfa.
    8. Ilgi konusu hücrenin tüm metafaz zaman noktaları için bu açıları kaydedin. Zaman noktalarında (t) ve (t-1) arasındaki dönme açısı (t-1), (T) bir açı ve bu açısı arasındaki farkın mutlak değerine eşittir.
  3. Yarılması Plane Yönünü Ölçme
    1. Metafaz plakaların 3D rekonstrüksiyon için açıklanan talimatları izleyerek Anafazda sırasında bir zaman noktasında bir ilgi hücreyi yeniden 3D.
    2. Ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki levhanın kenarları görebilir kadar yeniden döndürün.
    3. Yatay arasındaki açı (ventriküler kenar) ve bir ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki plakalara paralel bir çizgi ölçmek için açı aracını kullanarak. Bu yarılma düzleminin (Şekil 2C) açıdır.
  4. Film Üretimi
    1. Hücreler genellikle farklı z-düzlemleri üzerinde hareket olarak, canlı görüntüleme oturumu sırasında hücre tarafından işgal z uçakları tespit. "Görüntü / Bacalar / Z projesi ..." komutunu kullanarak bu z-uçaklık bir "Maksimum yoğunluk projeksiyonu" oluşturun. Bir ". TIF" dosyası olarak çıkan yığını kaydedin.
    2. Fiji ". Mov" veya ". Avi" dosya nesil için istikrarlı bir eklenti içermez gibi ImageJ 1.45 sürümünde bu dosyayı açın.
    3. Aşağı-akış uygulamaları ile uyumlu bir formatta bir film oluşturmak için ImageJ komuta "... / olarak Dosya / Kaydet" kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu deneyde başarısı ve bir canlı görüntüleme oturumu sırasında birden fazla mitotik hücre gözlem büyük ölçüde bütünlüğü ve satın yapılır dilimin anatomik düzeyde hem bağlıdır. Aşağıda tartışıldığı gibi, bir dilim anatomik düzeyi önemli bir faktördür. Şekil 3A rostro-caudal gösterir ve medial-lateral biz en başarılı olmuştur yerleri. Bu konuda ek tartışma için Noctor 26 bakın. Dilimin bütünlüğü dilim farklı bölgelerinde değişiklik gösterebilir. Bu önceki (Kademe 7.6 olarak tüm dilimin görüntüleme kullanarak) geçen zaman başlangıcına kadar tespit edilebilir. Birçok mitotik hücreler interfaz çekirdekleri yerine yuvarlak elips şeklinde olacak, ventrikül sınırında bulunan olacak ve interfaz çekirdekleri ventrikül sınırına sütunlu göreli görünecektir: E13.5 beyin iyi bir bölgede aşağıdaki gözlemler yapılabilir . Beyin, daha az arzu edilen bir bölgedeçekirdekler (Şekil 3B ve 3C karşılaştırın ve iyi monte dilim bir resim için Şekil 3D bakınız) yuvarlak ve biraz dağınık bakacağız.

İdeal şartlar elde edilir, bu deney, mitoz farklı evreleri nitel tespit edilmesine olanak verecektir. Bu (apikal mitoz her aşamada, bölünen hücrelerin örnekleri için Şekil 3E bakınız) DNA model analizi ile tespit edilebilir. Ön fazı esnasında, DNA yoğunlaştırma seyrek etiketli DNA (çekirdeğinde DNA açısından zengin ve zayıf bölgeler DNA-) görünümünü olacaktır. Metafaz sırasında kromozomlar hücre vücudun ekvatorda bir düzlem oluştururlar. Uçağın yönlenmesine bağlı olarak, DNA model kalın bir çizgi (Şekil 3E, 1) ya da ortasında bir DNA-zayıf bölge ile (ii) bir "rozet" (Şekil 3E, 2) ya da (i) . Kromozomlar ayrı zaman Anafazda sırasında, "eller" gibi bakmak; bu ters yönde değiştirmektedir. Edinimi Y düzlemi - yarılma düzlemi X olduğunda bu aşama tespit etmek zor olabilir. Telofaz sırasında, DNA rahatlatır ve nükleer zarf reformları gibi bir elips şeklini alır. Bireysel zaman noktaları (Şekil 3F bakınız) zamanla mitoz görselleştirmek için toplanabilir.

Apikal bölünmesi progenitörlerinin mitoz görüntüleme ek olarak, bu deney, örneğin, bazal biçimde Orgs veya INPS gibi bölünen hücreleri görüntü için kullanılabilir, ve ikinci büyük olasılıkla Şekil 3G de temsil edilir. Bu tür hücreler in SVZ'unda bölümü için kendi konumuna göre tanımlanabilir katmanı. Ancak gerçekten hücre işlem veya kader (Şekil 4B-D) etiketler bir floresan işaretleyici ifade ile analiz çift iyisi bu hücreleri işaretlemek için. INPS ne olacak bir tepe ne de bazal süreç, Orgs dış katmanlarında bulunan kendi hücre gövdesi ile bazal süreci olacaktır, ve RGCs bir ba var olacakVZ tabakasında bulunan kendi hücre gövdesi ile sal süreçtir.

Progenitörlerinin Mitoz alternatif yöntemler ile görselleştirilebilir. Şekil 4A, tüm bölünen hücreleri etiketlemek için kromozom histon H2B-EGFP transgenik fare kullanımını gösterir. Bu Syto11 benzer bir desen hücreleri işaretler. Şekil 4B EGFP-α-tubulin ve histon H2B-mCherry ile elktroporatlandı rahimde beyinleri ile yapılan görüntüleme gösteriyor. Gösterildiği gibi, bu mikrotübülleri ve kromozom hem görselleştirmek için bir olanak sağlar ve buna ek olarak hücre gövdesi ve bazal yöntem. Şekil 4C, bir merkezleme-EGFP fare beyinleri ile gerçekleştirildi görüntüleme göstermektedir, mCherry-a-tubulin ve histon H2B-EGFP ile elektroporasyona rahimde . Gösterildiği gibi, bu yeşil kanaldaki görüntü kromozom ve sentriyoller için bir olanak sağlar ve mitotik iğ ve hücre gövdesi / proses kırmızı kanalda. Şekil 4D, beyin ile gerçekleştirildi görüntüleme tasvirseyrek CMV-Kretasedekine ve CALNL-EGFP'nin 28 ile elktroporatlandı rahimde s. Bu teknik, tek tek bölünen hücrelerin analizi, kolay hale seyrek etiket soylarının bölünmesi için bir olanak sağlar. Ancak elektroporasyon kullanırken, bu yöntem bisiklet hücrelerinin 2,12 oldukça senkronize kohort hedefleri olduğunu akılda tutmak. Bu, elektroporasyon canlı görüntüleme nisbetle zamanlama Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin kohort görüntüleme oturumunun başlangıcında mitoz yaklaşımlar, böylece ayarlanması gerektiği anlamına gelmektedir. Eğer değilse, herhangi bir mitotik hücrelerin belirlenmesinde deney başarısı kısa vadeli bir görüntüleme oturumda bozulabilir.

İdeal şartlar elde edildiğinde, mitoz temel özellikleri kantitatif genel mitoz süresi, bireysel evrelerin süresi, metafaz düzlemi ve yarılma düzlemi yönelim rotasyon dahil ölçülebilir. Tarif edilen koşullar altında, 1 saat biz bir ortalama genel mitotik süresi gözlemledikEmbriyonik günde 30 dakika (E) 13.5 ve 14.5. Daha önce tarif edildiği gibi, metafaz DNA düzleminin rotasyon tek bir zaman noktasında veya kümülatif olarak bütün bir metafaz 2,6,9,10 süresi boyunca ölçülebilir. Bu, her bir zaman noktasında bir hücrenin metafaz düzleminin 3D rekonstrüksiyonu ile ve ventriküle DNA nisbetle açı ölçüleri elde edilebilir. Biz başarıyla en az 3 saat boyunca hücrelerin takip etmek, bu yazıda yöntemini uyguladık.

Şekil 1
Her adım adım her birinin altında gösterilir Şekil 1. Protokol adımların şematik. Zaman gerekli. Bu adımların her biri için detayları "protokol" bölümünde açıklanmaktadır. Merhaba dilimler görüntülerken, Adım 7 baypas edilebilir unutmayınplazmidler mitoz için belirteçlerin ifade ile elktroporatlandı beyinleri taş H2B-EGFP embriyolar veya dilimleri.

Şekil 2,
Fiji (ImageJ) Fiji. B) metafaz bir hücrenin 3D rekonstrüksiyon katılan farklı adımlar analizi için kullanılan farklı araçlar. A) Yer time-lapse video mikroskopi veri setlerinin Şekil 2.. Post-satın alma analizi. Bir 3D yarılma düzlemi yönelim bu adımların her biri için Ayrıntıları "protokol" bölümünde açıklanmıştır. C) Ölçüm Anafazda de hücreyi yeniden. B Adım 6 ve C sayılar dizisi açısını ölçmek için takip göstermek unutmayın. D) DISTRIBUTIO gösteren Temsilcisi veri(n = 35). E) E13.5 Beyin dilimleri ventriküler sınırında görülen mitotik hücre bir grup metafaz süresi n ventrikül sınırında E13.5 mitotik hücrelerde metafaz plakaların kümülatif dönüşünü gösterir Örnek veri . resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. Canlı görüntüleme analizi için temsili verilerin örnekler. RGCs bazal süreci daha kısadır ve bu nedenle daha az vibratom tarafından kesilmiş olması muhtemeldir çünkü) ön-ventral eksen, mitoz en kolay, beyin dilimleri dorsal bölgelerde görüntülü. Rostro-kaudal ekseni boyunca, dorsal korteks kaudal bölgelerinde dilimleri vermekElimizde en tutarlı sonuçlar)., B ve C Örnekleri iyi bir bölge (B) ve görüntüleme için kötü bir bölge (C) gösterilmektedir. İyi bir bölgede, çekirdekler eliptik (daire bölgeler) şekillenir ve birçok mitotik hücrelerin önceki time-lapse görüntüleme (oklar) ventrikül sınırında görülmektedir. Kötü bir bölgede, çok az mitotik hücrelerin ventrikül sınırında görülmektedir (tek ok) ve çekirdekleri görüntüleme yaşamak için önce bir düşük büyütme mikroskobunda iyi bir dilim. D) Örnek (daire bölgeler) yuvarlak. E) . mm): F) farklı renklerde işaretlenmiş iki nöral atalarıdır mitoz farklı aşamaları geçmesi ventrikül sınırında bir bölge Montaj, (zaman, hh belirtildiği gibi Syto11 örnekleri, mitoz farklı fazlarda hücreleri etiketli. Bir bölgenin G) Montage nöral progenitör uzakta ventriküler sınırına ayrılıyorsa (B) vurgulanmıştır. Montajlanmasında (D) ve (E), CElls sözde farklı mitotik aşamalarını vurgulamak için Photoshop kullanarak renkli edilmiştir. (Ölçek çubukları: B, C, F: 10 um; D: 1 mm, E, G: 5 um).

Şekil 4,
Şekil 4. Alternatif araçlar örnekleri sinir atalarıdır mitoz görselleştirmek için. E13.5 bir histon H2B-EGFP transgenik embriyo bir beyin dilim ventrikül sınırında bir bölgeye A) Montaj. Bu mitoz. B'nin farklı aşamalarında ilerlerken bir progenitör) görülmektedir EGFP-a-tubulin ve H2B-mCherry ifade vektörleri ile E13.5 elektroporatlanmış bir beyin dilim E14.5 bir VZ Montaj. EGFP-a-tubulin sağlar: mitoz sırasında mikrotübül dinamiklerinin görselleştirme (B 1-B 2) bir ventriküler bölgenin C) MontageMCherry a-tubulin ve H2B-EGFP ifade plazmid ile E14.5 electroporated bir merkezleme-EGFP transgenik embriyo n E15.5 beyin. Merkezleme-EGFP mitoz (C 1 ve C 2). D) hücreleri seyrek bir düşük ile E13.5 elektroporasyon ile etiketlenmiş bir E14.5 beyin dilim IZ gösteren bir bölgenin Montaj sırasında sentriyoller dinamikleri görselleştirme sağlar Cre eksprese eden bir plazmid konsantrasyonu ve rekombinasyon Cre 28 sonra EGFP ifade eden bir plazmid standart bir konsantrasyonu. Bu montajda bölünmesi hücre uzun bir bazal süreç (pembe oklar) ile bir RGosvz morfolojisini ve hiçbir apikal süreci 9 sahiptir. Canlı (A) görüntüleme ve (B) örnekleri için kullanılan amacı, 60X silikon yağı amaçlardan biri, örneğin 100X yağ objektif (C) ve örneğin 10X hava amacıdır D. görüntü için kullanılan zamansal çözünürlüğü (A) , (B), (C) ve (D) örnekleri, ayrı ayrı 4 dakika ve 4 dakika, 30 saniye ve 5 dakika idi. VZ: Ventriküler Zbir, IZ: orta Bölgesi, RGosvz: dış bölge subventricular radial glia-benzeri hücre. (Ölçek çubukları: A: 15 um, B, C, D: 5 um, C 1, C 2: 2,5 mikron) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarif ettiğimiz protokolün önemli bir avantajı sinir atalarıdır mitoz dinamik bir zamansal çözünürlük sağlamasıdır. Tipik olarak, gelişmekte olan beyinde mitoz görselleştirmek için deneyler, sabit bir doku bölümlerinin immünofloresan kullanılarak gerçekleştirilir. Ama bu yaklaşım sadece bir zaman noktasında mitoz bir anlık görüntüsünü sağlar.

Beyin dilimleri mitoz görüntüleme için en kritik olan birkaç adım vardır: 1) beyin dilimleri transferi ve montaj sırasında beyin bölümlerinin bütünlüğünü korumak için, agaroz bağlı kalmalıdır. 2) oluşturulması ve dilimlerin görüntüleme için, rostro-kaudal seviyelerinin kontrolü önemlidir. Bu dilimler halinde, RGC bazal işlemleri hücreleri için daha sağlıklı olan, değişmeden kalır, çünkü kuyruk Beyin dilimleri, tipik haliyle en iyisidir. 3) canlı görüntüleme için, 60X objektif ile bir konfokal dönen disk mikroskop kullanımı hem yüksek çözünürlük için en iyi ve s photobleaching önlemek içinSyto11 boya ile oluşabilir depas'lar. 4) canlı görüntüleme için, satın alma zamansal parametreleri önemlidir. Kullanılan mikroskop ekipman bağlı olarak, zaman atlamalı her dakika her 10 dakika arasında değişen gerçekleştirilebilir. Büyüktür 10 dakika tipik mitoz yüksek çözünürlüklü dinamiklerini elde etmek için çok uzun.

Bu protokol, belli sınırlamalar var. Deney, ex vivo doku ile gerçekleştirilir. Beyin dilimleri yapılan gözlemler, in vivo olarak farklı olabileceğini akla uygundur. Benzer rostro-kaudal ve ön-yan kat, medya içeriği, mikroskop kullanımı ve satın alma parametrelerinin kullanımı: Farklı günde ya da farklı numuneler kullanılarak gerçekleştirilen deneyler arasında karşılaştırmalar yapmak Bu yüzden, aşağıdaki parametreler sabit tutulmalıdır. Buna ek olarak, fototoksisite uzun süreli görüntüleme mümkündür. Bu nedenle birçok deney sonuçları yapmadan önce yapılmalıdır. Ayrıca, Syto11 kendisi etkili olabilirially özellikle mutant arka mitotik etkinlik etkileyebilir. Bu nedenle, bir Syto11 göre mitoz ilgili sonuçlar yaptığında, aynı zamanda, Şekil 4 'de tarif marker bağımsız tahlilleri kullanılarak bulguları teyit önerilir.

Protokolde tarif edildiği gibi, mitoz kromozom ve çeşitli şekillerde iskeletinin işaretleme sonra görüntülenebilir. Diğer Syto boyalar diğer floresan kanallarda mitoz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. DNA görselleştirmek Syto11 boyaması kullanılarak yerine, dilim floresan transjenik oluşturulabilir. Örneğin, gösterildiği gibi, histon H2B-EGFP transjenik soy, 29 kullanılabilir. Histon H2B-EGFP kullanımı özellikle faydalı ve Syto11 tedavi ile gözlenen herhangi bir fenotipi teyit için önerilir. Buna ek olarak da Syto11 ile Photobleaching ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için yararlı olabilir. Örneğin merkezleme-EGFP 30 olabildiğince diğer transjenik, Kullanımısentriyoller, sentrozom bileşenleri görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Bu yalnız mitoz görselleştirilmesi için yeterli olmaz iken, onlar kromozomlar veya mikrotübüllerde diğer belirteçleri ile birlikte iyi çalışır. Bu tür belirteçler utero elektroporasyon 4,5,10,31,32 de sokulabilir. Gösterildiği gibi, diseksiyon bir gün önce, füzyon proteinlerinin ekspresyonu, bu yaklaşım için faydalı olabilir. Bizim tecrübelerimize göre, CAG organizatörü altında yapıları ifade genellikle bir gün içinde sağlam ifade verebilir. Örneğin bu yaklaşımı kullanarak embriyonik beyinleri α-tubulin ve histon H2B-EGFP tanıttı.

Bu teknik hakim sonra gelecekteki deneyler için yapılabilir ek değişiklikler vardır. Utero elektroporasyon ayrıca gen ekspresyonunu değiştirmek için kullanılabilir. Örneğin, shRNA veya cDNAların tanıtılması etkisini belirlemek için yararlı olabilir kaybı işleve veya aşırı ifadesi sinir prog üzerine ilgi bir geninmitoz 33 ENITOR. Buna ek olarak, dilim mitoz 34,35 üzerine yolakları inhibe etme veya moleküller etkisini ölçmek için kimyasal ilaçlar veya küçük moleküller ile tedavi edilebilir.

İşlemde bir döner disk kullanılarak gerçekleştirilmiştir konfokal görüntüleme açıklar. Bir dönen disk konfokal mikroskop en büyük avantajı, satın alma hızıdır. Bu yüksek zamansal çözünürlüğe sahip bir canlı görüntüleme oturumu farklı beyin dilimleri birden fazla pozisyon görüntüleme ve makul bir görüntü kalitesi sağlar. Böyle bir çoklu foton lazer konfokal tarama mikroskobu gibi diğer kurulumları derin radyal glial hücreler bazal işleminin seviyesinde kesilmiş olması olasılığı daha düşüktür doku içine yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için imkanı elde. Bu nedenle görüntü, sağlıklı sinir atalarıdır için olasılığı artacaktır. Ancak, bu genellikle satın alma hızının bir kurban ile ilişkilidir. Bu da num sınırlayacaktırBir canlı görüntüleme oturumu, hem de zamansal çözünürlüğü sırasında görüntülenebilir pozisyonları ber. Mitoz Görüntüleme aynı zamanda, geniş bir alan mikroskobu üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu reaktiflerin genel parlaklık çok daha zor hale görüntüleme gibi, H2B-EGFP ya da Syto11 histon karşı Ancak bu durumda, resim seyrek işaretli hücrelerin en iyisidir. Ayrıca, burada tarif edilen protokol, bir ters mikroskop kullanır. Bir ters mikroskop ana avantajları, yüksek çözünürlüklü yağ amaçları ve Mikroskop bir motorize kademe ile birleştirilmiştir hareket özgürlüğünü kullanma olasılığı vardır. Sonuç olarak, deneyci belirli bir set-up ve bir denemenin amacı avantaj ve dezavantajları arasında bir denge bulmak gerekiyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Acknowledgments

Yazarlar NINDS / NIH, R00-NS064197 ve NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS hem de) fon kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Tags

Nörobilim Sayı 88 mitoz radyal glial hücreler gelişmekte olan korteks sinir atalarıdır beyin dilim canlı görüntüleme
Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live… More

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter