Summary
Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.
Abstract
Bien que de courte durée, la mitose est un processus multi-étapes complexe et dynamique fondamentale pour le développement des organes, y compris le cerveau. Dans le cortex cérébral en développement, la mitose anormale de cellules progénitrices neurales peut causer des malformations à la taille et la fonction du cerveau. Par conséquent, il existe un besoin critique des outils pour comprendre les mécanismes de neurones progéniteurs mitose. Développement cortical chez les rongeurs est un modèle exceptionnel pour l'étude de ce processus. Progénitrices neurales mitose est souvent examiné dans les sections du cerveau fixes. Ce protocole décrit en détail une approche de l'imagerie en direct de la mitose en ex vivo des tranches de cerveau embryonnaires. Nous allons décrire les étapes essentielles de cette procédure, qui comprennent: l'extraction du cerveau, intégration, vibratome découpe des tranches de cerveau, la coloration et la culture de tranches, et imagerie time-lapse. Nous allons ensuite montrer et décrire en détail comment effectuer une analyse post-acquisition de la mitose. Nous incluons résultats représentatifs from ce dosage en utilisant le colorant vital Syto11, des souris transgéniques (histone H2B-EGFP et centrine-EGFP), et l'électroporation in utero (mCherry-α-tubuline). Nous allons discuter de la façon dont cette procédure peut être mieux optimisé et comment il peut être modifié pour l'étude de la régulation génétique de la mitose. Imagerie en temps réel de la mitose dans des tranches de cerveau est une approche souple pour évaluer l'impact de l'âge, de l'anatomie, et la perturbation génétique dans un environnement contrôlé, et de générer une grande quantité de données avec une résolution spatiale et temporelle. Ainsi ce protocole vient compléter les outils existants pour l'analyse des neurones progéniteurs mitose.
Introduction
L'objectif global de ce protocole est de décrire comment effectuer l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans des tranches de cerveau embryonnaires. En utilisant l'imagerie en direct de tranches de cerveau de la culture, ce protocole fournit une méthode simple pour analyser les multiples aspects de la mitose dans les progéniteurs neuronaux dans un environnement très similaire à un cadre in vivo. Il peut être appliqué sur le cerveau des animaux et / ou les cerveaux mutantes qui ont été manipulés par électroporation in utero) 5.1. Cette technique est également idéal pour tester l'effet d'agents pharmacologiques sur la mitose de précurseurs neuronaux, par le simple ajout d'un agent pour le milieu de culture. En somme, cet article va faire un protocole défi technique accessible à ceux qui étudient la neurogenèse.
Au cours de la neurogenèse, les populations progénitrices neurales distinctes subissent divisions précises pour générer des neurones qui contribuent finalement à six couches corticales de l'adulte néocortex 6-8. Au début du développement cortical, la piscine de précurseur neural se développe comme neuroépithéliales (NE) les cellules se divisent de manière symétrique à se renouveler. cellules NE transforment en cellules gliales radiales (CGR). Initialement CGR divisent symétriquement à produire deux nouveaux CGR, mais pendant la plus grande partie de la neurogenèse, principal mode de CGR de division est asymétrique. Dans la division asymétrique, une RGC donne lieu à un nouveau RGC et soit un neurone post-mitotique, ou un progéniteur plus spécialisé (soit un précurseur neuronal court (SNP), une glie radiale externe (ORG), ou un progéniteur intermédiaire (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, et ORG peuvent alors générer des neurones à la sous-ventriculaire, ventriculaire, et les régions du cortex basaux, respectivement. conséquent, la division cellulaire des progéniteurs est un processus fondamental pour générer des neurones de l' néocortex.
De nombreuses études font état d'une corrélation entre les traits spécifiques de la mitose CGR et le destin des cellules filles. Haydar et al. Et Takahashi et al.ont montré que RGC durée mitotique et augmentation de la longueur du cycle cellulaire comme neurogenèse produit, une constatation fait écho dans le suivi des études 10-13. Un certain nombre d'études ont suggéré que fuseau mitotique orientation par rapport au ventricule influe sur les aspects de la neurogenèse et corticogenèse, y compris les types de neurones générés et le placement de la descendance dans le cerveau, respectivement 3,10,14-16. Que plan de clivage orientation influe directement sur le destin des cellules est controversée, mais la conclusion reste que cette mitotique impacts de paramètres neurogenèse. Souligne en outre l'importance de la mitose est l'observation que de nombreux gènes impliqués dans les mécanismes de la mitose sont cruciales pour la neurogenèse et de bon développement du cerveau 17-20.
La mitose est un processus dynamique, encore à ce jour la plupart des études détaillant progénitrices neurales mitose utiliser l'analyse des coupes de tissus fixes ou imagerie de progéniteurs neuronaux via la culture de cellules in vitro. Ainsi, les procédés traditionnels pour évaluer la mitose ne fournissent qu'un aperçu de ce processus et ne parviennent pas à découvrir comment les cellules se comportent dans un tissu. L'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose est progressivement devenu un outil essentiel pour comprendre la fonction neuronale progénitrice. Pour des exemples s'il vous plaît voir ces références 4,8,10,21-25. Plusieurs protocoles en circulation ont été publiées pour la préparation et l'imagerie des tranches de cerveau 26,27. Toutefois à ce jour, un protocole détaillé pour l'imagerie et l'analyse de la mitose n'a pas été décrite ni démontré dans la vidéo.
Cette technique offre plusieurs avantages importants par rapport à l'analyse fixe de coupes de cerveau. Analyse Time-lapse de tranches de cerveau permet la génération de beaucoup plus de points de données qui peuvent être analysées de manière flexible. Tout d'abord, les données sont collectées à des instants individuels sur une période de plusieurs minutes ou plusieurs heures. On peut analyser des points de temps individuels (pour créer un montage statique) oupeut combiner différents moments dans les films. Deuxièmement, l'imagerie confocale de tranches permet la génération de données au niveau des sections de Z différents dans des tranches de cerveau. En conséquence, les sections individuelles peuvent être analysées. En variante, des piles de sections individuelles peuvent être combinées en une projection d'intensité maximale. Troisièmement, l'analyse se fait dans le cadre d'un tissu, révélant comment les cellules se divisent par rapport à des cellules et des structures voisines. Quatrièmement, il est parfaitement adapté à l'analyse de mutants qui montrent des signes de défauts mitotiques. Ensemble, ce protocole permettra de clarifier les étapes critiques pour aider les chercheurs qui souhaitent faire de l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans leurs propres laboratoires.
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Protocol
1. Préparation des milieux (figure 1, étape 1)
- Tranche milieu de culture
- 25 ml de milieu de culture de la tranche est suffisante pour préparer des plats de fond 5 de verre avec deux tranches par puits.
- Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 250 ul d'une solution de N2 100x et 500 ul d'une solution 50x B27 sans vitamine A. Ajouter DMEM/F12 à un volume de 22,5 ml.
- Stériliser par filtration, puis ajouter une solution de 1,25 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur et de 1,25 ml de sérum de veau fœtal.
- Incuber la solution dans un bain d'eau à 37 ° C pendant la durée de la préparation des tranches.
- Ajouter facteurs de croissance (FGF, l'EGF et la concentration finale de 10 ng / ml et 20 ng / ml, respectivement) immédiatement avant le début de la culture. La composition de ce milieu a été optimisé pour favoriser la survie des cellules en culture et d'augmenter le taux de prolifération de cellules progénitrices neurales. Ce sera donc maximiser la probabilité deobserver les cellules en mitose dans la tranche.
- Plein HBSS Dissection Solution
- Préparer 500 ml de HBSS complet en ajoutant 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de 1 M Hepes (pH 7,4, 2,5 mM FC), 6 ml de 2,5 M D-glucose (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) et autoclavé diH 2 O à volume final de 500 ml.
- Solution filtre à stériliser et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que la collection de cornes utérines de la souris enceinte. Cette solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
- Gardez HBSS sur la glace pendant toute la procédure de dissection.
- Solution Intégration
- Pour l'encastrement de 4 cerveaux embryonnaires, de préparer 30 ml de 3% d'agarose à faible point de fusion dans la solution HBSS complet. Dans un tube de 50 ml conique, ajouter 0,9 g de bas point de fusion d'agarose et plein HBSS à 30 ml.
- Mélanger la solution avec un vortex, et faites le fondre au micro-ondes avec la position du tube et le bouchon ouvert.
- Alors que dans le micro-ondes, surveiller la solution de pdébordement revent due à ébullition excessive. Lorsque l'ébullition commence, arrêter le four micro-ondes et vortex la solution.
- Répétez ces étapes jusqu'à ce que tout l'agarose a fondu.
- Stocker le tube dans un bain-marie à 42 ° C.
2. Dissection du embryons (Figure 1, étape 2)
- Après euthanasie attention de la souris enceinte, recueillir les cornes utérines et les transférer dans un plat de 10 cm 2 de Pétri contenant plein froid 1x HBSS. L'âge de l'embryon peut varier en fonction de l'étude. Ce protocole a été utilisé avec succès pour la culture des tranches de cerveau de jours embryonnaires E12.5 E17.5 à. En raison de leur taille, les jeunes cerveaux ont tendance à être plus difficile de travailler avec.
- Recueillir les embryons et disséquer les cerveaux embryonnaires tels que décrits précédemment chez le rat et la souris 26,27, jusqu'à ce qu'un cerveau embryonnaire complet, y compris le cerveau postérieur et le cerveau antérieur avec les deux hémisphères cérébraux est obtenu. Ceux-ci peuvent êtreconservé à température ambiante jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été disséqués.
- Recueillir les embryons et disséquer les cerveaux embryonnaires tels que décrits précédemment chez le rat et la souris 26,27, jusqu'à ce qu'un cerveau embryonnaire complet, y compris le cerveau postérieur et le cerveau antérieur avec les deux hémisphères cérébraux est obtenu. Ceux-ci peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été disséqués.
3. Incorporation des cerveaux embryonnaires (Figure 1, étape 3)
- Dans un seau contenant de la glace, créer un trou dans la glace pour insérer les moules d'inclusion dans.
- Verser le milieu d'agarose à 3% dans un moule plastique et placer ce moule dans le trou préparé dans la glace.
- On agite le milieu d'agarose avec la pointe d'un thermomètre numérique jusqu'à ce que la température atteigne 35 ° C.
- Rapidement transférer le cerveau dans le milieu d'inclusion.
- Étape: Pour éliminer l'excès de HBSS à l'interface entre le cerveau et l'agarose, avec soin et sèche doucement / faire tourner le cerveau à plusieurs reprisesdans la solution d'enrobage avec la pince.
- Un coussin d'agarose gélifié se forme au fond du moule en contact avec la glace. Une fois le coussin peut se faire sentir avec le bout de la pince tout en agitant le cerveau, positionner le cerveau avec la dorsale vers le haut. Le cerveau ne doit pas couler au fond de la moule.
4. Préparation du bloc d'agarose (figure 1, étape 4)
- Laissez le agarose durcir dans la glace pendant au moins 5 min.
- En utilisant une lame de rasoir, la section des coins du moule.
- Tailler soigneusement un bloc d'agarose autour du cerveau en utilisant une lame de rasoir. Essayez de réduire le nombre de coupures pour éviter de perturber le cerveau intégré.
- Assurez-vous que le bloc a une plus grande surface dans la région caudale du cerveau (par rapport à la région rostrale, voir la figure 1, étape 4) pour augmenter la stabilité du bloc sur le socle de sectionnement.
- La dernière coupe doit être celui sur le côté caudal de cerveau;cette coupe définira le plan de découpe correcte avec le vibratome.
- Faire en alignant la lame perpendiculaire à l'axe rostro-caudale du cerveau et le bloc d'agarose. Faites glisser la lame caudale long de l'axe rostro-caudale et faire le montage final d'environ 5 mm de la région la plus caudale du cerveau.
- Réglez le bloc d'agarose / cerveau de côté et répétez l'incorporation d'autres cerveaux.
5. Transfert des cerveaux embarqués dans le bac de la Vibratome (Figure 1, étape 5)
- Ajouter une goutte de colle sur le fond du plateau de vibratome. Placer la colle de sorte que les blocs d'agarose sont positionnées à l'intérieur de la portée de la lame vibrante.
- Placez le côté caudal bloc d'agarose / cerveau vers le bas sur le bord de la spatule, avec environ 50% de la bascule de bloc sur le bord de la spatule.
- Appliquer la face caudale du bloc d'agarose pour la colle et le faire glisser la spatule à une distance, en maintenant le bloc d'agarose à la partie inférieure du plateau avec la shoulder d'une paire de pinces. Ne laissez pas la spatule contacter directement la colle.
- Laissez la colle se solidifier à la température ambiante pendant 5 min.
6. Sectionnement des cerveaux embarqués (Figure 1, étape 6)
- Remplissez le bac à vibratome avec HBSS.
- Définir les positions de départ et d'arrivée de la lame de vibratome.
- Générer de 200 à 250 um tranches. Avec la vibratome VT1000S, utilisez les paramètres suivants: vitesse de 2 - 4, 8 fréquences.
- Retirez délicatement les tranches de la vibratome comme ils sont coupés. Transférer les tranches avec une spatule et l'extrémité arrière de pince à épiler dans 12 plats et remplis de plein HBSS. Sinon certains chercheurs ont utilisé un pinceau en lieu et place de pinces Point clé:. Pendant le transfert, veiller à ce que les tranches de cerveau restent attachés à la gélose environnante.
7. Syto11 coloration des tranches (Figure 1, étape 7)
- Diluer Syto11 à une concentration finale de0,5 à 1 uM dans du milieu de culture de tranche complétées par des facteurs de croissance.
- Dans le puits d'une plaque à 12 puits, incuber les tranches de cerveau dans une 2,5 ml de la solution de coloration pendant 1 heure à 37 ° C.
- Laver les tranches dans 2,5 ml de milieu de culture de tranche sans solution de coloration pendant 20 min.
8. Montage de la de tranches dans un plat à fond de verre (figure 1, les étapes 8, 9)
- Préparer 15 pi de l'intégration solution de collagène par tranche. Préparer une solution à 1,5 mg / ml de collagène en mélangeant 375 ul de 3 mg / ml de solution de collagène de type I avec 75 ul de DMEM 10x, 9,4 pi de NaOH 1 M et 290 ul de H 2 O. Stocker sur la glace.
- Placer une goutte de 15 ul de la solution de collagène en bas d'un fond en verre de 35 mm de micropuits vaisselle. Etalez avec une pointe de pipette pour correspondre à la taille de la tranche.
- Transférer la tranche dans la goutte de collagène avec une spatule et pince Point clé:. Montage de plusieurs tranches de différerplats de rentes augmente la probabilité d'acquérir tranches appropriés pour l'imagerie. Écran à travers différentes tranches et sélectionner celles qui répondent le mieux aux critères décrits ci-dessous dans la section «Les résultats représentatifs".
- Laissez les tranches incuber à température ambiante pendant 10 min avant de les transférer dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Après 20 min, ajouter 1,2 ml de milieu de culture de tranche dans le fond plat en verre Microwell. Ajouter 600 ul de milieu à la fois et l'étaler avec une pointe de pipette.
- Capturer une image à faible grossissement de la tranche de cerveau pour enregistrer le niveau anatomique et l'intégrité de la tranche.
9. Imagerie en direct de la tranches (figure 1, les étapes 10, 11)
- Laissez les tranches de récupérer dans l'incubateur pendant au moins 1 heure et 30 minutes à 37 ° C avec 5% de CO 2 avant l'imagerie en direct.
- Image les tranches avec le microscope de choix, en gardant à l'esprit que Syto11 est très sujette au photoblanchiment. Voici une inversionted disque en rotation microscope confocal est utilisé (Andor XD révolution disque rotatif microscope confocal). En variante, un microscope confocal à balayage laser peut être utilisé. Les paramètres suivants sont pour le microscope à disque en rotation mis en place.
- Durant toute la session d'imagerie en temps réel, de maintenir les tranches à 37 ° C, 5% CO 2 dans une chambre d'incubation humidifié fixée au microscope.
- les cellules d'image avec un objectif 60X de silicium à l'huile avec une distance de travail de 300 um, et une ouverture numérique de 1,3 (pour des exemples, voir figures 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un objectif de l'huile 100X avec une distance de travail de 130 um et une ouverture numérique de 1,4 (voir par exemple la figure 4C) peut également être utilisé. La résolution de la caméra est de 512 x 512.
- L'image des cellules dans un 30 um z-pile, avec le centre de la z-pile située à environ 40 um sous la surface de la tranche. Essayer de l'image profondément dans les tissus peut causer l'objectif d'ajouterune pression mécanique sur la tranche. Cela peut affecter l'intégrité de la tranche de cerveau. Si la planification de faire des reconstitutions en 3D des cellules, utilisez un z-intervalle de pas plus de 2 um.
- Régler la puissance du laser et le temps d'exposition afin de limiter le photoblanchiment. Utiliser des temps d'exposition allant de 30 à 200 ms, en fonction de l'intensité du signal Syto11.
- Avec une platine motorisée, une image de plusieurs positions sur plusieurs tranches montés dans une boîte. Par exemple, l'image jusqu'à 20 postes répartis sur 4 tranches différentes dans 1 seul plat.
- Pour l'imagerie en temps réel, utilisez une résolution temporelle inférieure à 5 min pour permettre l'identification des différentes phases de la mitose. Utilisation Syto11 et / ou histone H2B-EGFP, le 4 - 5 heures de l'imagerie en direct sont suffisantes pour observer un nombre important de cellules en mitose. Toutefois, si l'imagerie peu marqué les cellules en mitose (tels que ceux obtenus par électroporation in utero), alors un paramètre plus imagerie (la nuit) est appropriée et fonctionne, nousll.
Remarque: En utilisant ce protocole, nous observons généralement en moyenne 10 cellules en mitose par position. Comme indiqué plus haut, l'imagerie multiple monté tranches augmente la probabilité d'avoir une expérience réussie. Avec cette approche, nous identifions généralement les cellules en mitose dans pratiquement toutes les expériences réalisées avec Syto11 ou histone H2B-EGFP.
10. Post-acquisition Analyse de la mitose (Figure 2)
Toutes les procédures de cette section ont été optimisés à Fidji (ImageJ), ce qui est avantageux, car il est un logiciel libre et open source. Autres solutions logicielles sont disponibles pour effectuer les mêmes tâches, telles que Metamorph, Imaris, et Amira.
- Identification des mitotique Chiffres à Fidji
- Après l'ouverture de l'ensemble de données pour une position de "HyperStack", sélectionnez un plan z (voir la figure 2A pour l'emplacement de la barre de défilement) où le tissu et les cellules semblent en bonne santé (voir les critères dans la section de discussion).Faites défiler à travers la dimension temporelle pour identifier les cellules en passant par l'anaphase, car il est le plus facile de phase mitotique à identifier.
- Retour dans le temps pour identifier le point de temps où la cellule entre la mitose (condensation de l'ADN). La cellule peut se déplacer à travers z-avions, mais la résolution temporelle et les paramètres z-stack décrits précédemment ont été optimisés pour permettre à ce processus.
- Dans une feuille de calcul, enregistrent leurs coordonnées en 4D de la cellule dans le HyperStack (X, Y, Z et l'heure, voir la figure 2A pour visualiser l'emplacement de ces chiffres dans l'interface Fidji) à son entrée dans la mitose. La connaissance de ces coordonnées empêchera compter de la même cellule à plusieurs reprises.
- Défiler vers l'avant dans le temps et d'enregistrer le moment où la cellule progresse d'une phase à l'autre. Documenter la durée de chaque phase mitotique pour une cellule donnée.
- Procéder à d'autres cellules, à travers l'ensemble de données complet (plusieurs cellules à l'intérieur et à travers les positions).
- 3D Reconstructionion des cellules et quantification de rotation durant la métaphase (Adapté de Haydar et al, 2003) (Figure 2B).
- Après avoir identifié plusieurs cellules en mitose, utiliser les coordonnées d'une cellule et avancez dans le temps jusqu'à ce que le début de la métaphase.
- Tourner l'ensemble "HyperStack" de sorte que la frontière ventriculaire est plane (en utilisant le "Image / Transformation / Rotation ..." commande). Utilisez l'outil "angle" pour déterminer l'angle d'appliquer cette rotation.
- Identifier le plan z où la cellule d'intérêt est le plus visible. Dans ce plan, utilisez l'outil "Rectangle de sélection" pour dessiner une sélection qui comprend l'ensemble de la cellule.
- Identifier les z-plans qui comprennent la cellule d'intérêt. Utilisez la commande "Image / Dupliquer" pour créer un "sous-pile". Dans la boîte de dialogue, laissez "HyperStack Dupliquer" cochée. Le "tranches (z)" paramètre correspond à la z-plans contenant l'ensemble CEll, et les «Cadres (t)" paramètre correspond à l'instant présent.
- Si la résolution est faible, augmenter la taille de la "sous-pile" en utilisant le "Image / Réglage / Taille ..." commande.
- Générer une reconstruction 3D de la cellule au point d'heure à l'aide du "projet de Image/Stacks/3D ..." commande. Les paramètres de cette commande sont affichés dans la figure 2B. La "tranche espacement" correspond à l'intervalle entre chacune des images planes z-(um). Important: assurez-vous que la dimension physique (um) de la sous-pile a été conservée. Si non, l'interpolation des pixels dans la dimension z sera incorrecte, et la reconstruction 3D sera inexacte.
- Utilisation de la barre de défilement, faire tourner la reconstruction 3D résultant de telle sorte que le bord de la plaque métaphasique est visible. Le numéro de la trame correspond à l'angle bêta est décrit sur la figure 3B, enregistrer ce numéro. Utilisationl'outil «angle» et «Analyse / Mesure ..." commande, mesurer l'angle entre l'horizontale et une bissectrice la plaque métaphasique perpendiculairement (figure 2B). Il s'agit de l'angle alpha.
- Enregistrer ces angles pour tous les points dans le temps en métaphase de la cellule d'intérêt. L'angle de rotation entre les points dans le temps (t) et (t-1) est égale à la valeur absolue de la différence entre un angle (t) et cet angle à (t-1).
- Mesure de l'orientation de la plan de clivage
- 3D reconstruire une cellule d'intérêt à un moment donné du temps lors de l'anaphase en suivant les instructions décrites pour la reconstruction 3D de plaques métaphasiques.
- Tourner la reconstruction jusqu'à ce que les bords des deux plaques formées par ségrégation des chromosomes sont visibles.
- Utiliser l'outil d'angle pour mesurer l'angle entre l'horizontale (le bord ventriculaire) et une ligne parallèle aux deux plaques formées par ségrégation des chromosomes. Il s'agit de l'angle du plan de clivage (figure 2C).
- Génération de Films
- Comme les cellules se déplacent souvent entre différents z-avions, identifier les z-avions occupées par la cellule lors de la session en direct de l'imagerie. Générer une "projection d'intensité maximale" de ces z-avions en utilisant le "/ / projet de Z piles de l'image ..." commande. Enregistrer la pile résultante comme un "TIF". Fichier.
- Ouvrez ce fichier dans la version 1.45 de ImageJ que Fidji ne comprend pas un plugin stable pour la génération des «. Mov" ou ". Avi" fichiers.
- Utilisez le menu "Fichier / Enregistrer sous / ..." commande de ImageJ pour générer un film dans un format compatible avec vos applications en aval.
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Representative Results
Le succès de cet essai et l'observation de plusieurs cellules en mitose au cours d'une session live d'imagerie dépendent en grande partie à la fois l'intégrité et le niveau anatomique de la tranche où les acquisitions sont réalisées. Comme discuté ci-dessous, le niveau anatomique d'une tranche est un facteur important. Figure 3A montre rostro-caudale et médio-latérale des endroits où nous avons le mieux réussi. Pour une discussion supplémentaire sur ce sujet s'il vous plaît voir Noctor 26. L'intégrité de la tranche peut varier dans les différentes régions de la tranche. Ceci peut être déterminé avant le début de la time-lapse (en utilisant l'imagerie de l'ensemble de tranche comme à l'étape 7.6). Dans une bonne région d'un cerveau de E13.5 les observations suivantes peuvent être faites: de nombreuses cellules en mitose se trouvent à la frontière du ventricule, les noyaux en interphase seront de forme elliptique plutôt que ronde, et les noyaux en interphase apparaissent en colonne par rapport à la frontière du ventricule . Dans une région moins souhaitable du cerveau, l'noyaux se penchera arrondie et un peu désorganisé (comparer les figures 3B et 3C, et voir la figure 3D pour une image d'une tranche bien monté).
Lorsque les conditions idéales sont atteints, ce test permettra à l'identification qualitative des différentes phases de la mitose. Ceux-ci peuvent être détectés par analyse de la structure de l'ADN (voir la figure 3E pour des exemples de division apicale des cellules dans chacune des phases de la mitose). Au cours de la prophase, condensation de l'ADN aura l'apparence de l'ADN peu marqué (riche en ADN et des régions d'ADN-pauvres dans le noyau). Au cours de la métaphase, les chromosomes forment un plan à l'équateur du corps de cellule. Selon l'orientation du plan, le motif de l'ADN est soit (i) une ligne épaisse (figure 3E, vue 1) ou (ii) une "rosette" avec une région d'ADN-pauvres dans le milieu (Figure 3E, vue 2) . Au cours de l'anaphase quand les chromosomes se séparent, ils ressemblent à des "mains"; qui migrent dans des directions opposées. Cette phase peut être difficile de déterminer le moment où le plan de clivage est dans le X - Y plan d'acquisition. Au cours de la télophase, l'ADN se détend et acquiert une forme ellipsoïde que les réformes de l'enveloppe nucléaire. Points dans le temps individuel peuvent être collectées pour visualiser la mitose dans le temps (voir la figure 3F).
En plus de l'imagerie de la mitose de précurseurs de division apicale, ce dosage peut être utilisé pour diviser l'image en position basale des cellules telles que INP ou ORG, dont le dernier est le plus probable représenté dans la figure 3G. Telles cellules sont identifiables par leur emplacement de division dans la SVZ couche. Cependant, pour marquer vraiment ces cellules, il est préférable de coupler l'analyse de l'expression d'un marqueur fluorescent qui marque le processus cellulaire ou sort (voir les figures 4B-D). INP n'aura ni un processus apicale ni base, ORG aura un processus de base avec leur corps cellulaire situé dans les couches externes, et CGR aura un baProcédé sal avec leur corps cellulaire situé dans la couche de VZ.
Mitose des progéniteurs peut être visualisé avec des méthodes alternatives. Figure 4A illustre l'utilisation de l'histone H2B-EGFP souris transgénique pour marquer chromosomes de toutes les cellules qui se divisent. Il s'agit de cellules dans une configuration similaire à Syto11. Figure 4B représente l'imagerie réalisée avec le cerveau in utero électroporation avec EGFP-α-tubuline et histone H2B-mCherry. Comme l'a montré, celui-ci permet de visualiser les deux microtubules et le chromosome, et en outre le corps de la cellule et le processus de base. Figure 4C représente imagerie effectué avec le cerveau d'une souris Centrin-EGFP, in utero électroporation avec mCherry-a-tubuline et de l'histone H2B-EGFP . Comme l'a montré, celui-ci permet de chromosomes et les centrioles l'image dans le canal vert et le corps de fuseau mitotique et cellule / processus dans le canal rouge. Figure 4D représente l'imagerie cérébrale réalisée avecs in utero électroporation avec CMV-Cre peu et CALNL-EGFP 28. Cette technique permet à un faible densité étiquette progéniteurs division, ce qui rend l'analyse des cellules en division individuels plus facile. Lors de l'utilisation électroporation cependant garder à l'esprit que cette méthode vise une cohorte assez synchronisée des cellules de cyclisme 2,12. Cela signifie que le moment de l'imagerie en temps réel par rapport à l'électroporation a besoin d'être ajusté, de sorte que la génération de cellules électroporées s'approche de la mitose au début de la session d'imagerie. Dans le cas contraire, le succès de l'expérience pour identifier des cellules en mitose peut être compromise lors d'une session de formation d'image à court terme.
Lorsque les conditions idéales sont obtenues, les principales caractéristiques de la mitose peut être mesuré quantitativement, y compris la durée de la mitose dans l'ensemble, la durée des phases individuelles, la rotation du plan de la métaphase et plan de clivage orientation. Dans les conditions décrites, nous avons observé une durée mitotique globale moyenne de 1h30 min à jours embryonnaires (E) 13,5 et 14,5. Comme décrit précédemment, la rotation de l'ADN plan de métaphase peut être mesurée à un point de temps individuel ou cumulativement sur la durée de toute une métaphase 2,6,9,10. Ceci peut être réalisé en utilisant la reconstruction 3D de l'avion en métaphase d'une cellule à chaque point de temps et de mesurer des angles par rapport à l'ADN du ventricule. Nous avons appliqué cette méthode avec succès dans le présent document à suivre cellules pendant au moins 3 h.
Figure 1. Représentation schématique des étapes de protocole Time. Nécessaire pour chaque étape est indiqué dans chacune des étapes. Détails pour chacune de ces étapes sont décrites dans la section «protocole». S'il vous plaît noter que l'étape 7 peut être contournée lors de l'imagerie tranches de salutembryons pierre H2B-EGFP, ou des tranches de cerveaux qui ont été soumis à une électroporation avec des plasmides exprimant des marqueurs de la mitose.
Figure 2. Analyse post-acquisition de time-lapse ensembles de données de microscopie vidéo à Fidji (ImageJ). A) Localisation des différents outils utilisés pour l'analyse dans les îles Fidji. B) Les différentes étapes de la reconstruction 3D d'une cellule en métaphase. Détails pour chacune de ces étapes sont décrites dans la section "protocole". C) Mesure de plan de clivage orientation en 3D reconstruite cellule à l'anaphase. S'il vous plaît noter que le nombre de B l'étape 6 et C montrent la séquence suivie pour mesurer l'angle. D) Les données représentatives montrant la distribution de la durée de la métaphase dans un groupe de cellules en mitose observé à la frontière ventriculaire à E13.5 tranches de cerveau (n = 35). E) Les données représentatives montrant la rotation cumulé des plaques métaphasiques dans des cellules mitotiques en E13.5 à la frontière du ventricule . Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Exemples de données représentatives de l'analyse en temps réel d'imagerie. A) Le long de l'axe dorso-ventral, la mitose est le plus facilement dans les régions imagées dorsales de tranches de cerveau, car le processus de base de RGC est plus courte et donc moins susceptible d'être rompu par vibratome. Le long de l'axe rostro-caudal, des tranches dans les régions du cortex caudale dorsale donnentrésultats les plus constants dans nos mains exemples. B et C) sont présentés d'une bonne région (B) et une mauvaise région (C) pour l'imagerie. Dans une bonne région, les noyaux sont de forme elliptique (régions encerclées) et de nombreuses cellules en mitose sont observés à la frontière du ventricule avant imagerie time-lapse (flèches). Dans un mauvais région, très peu de cellules en mitose sont observés à la frontière du ventricule (flèche simple) et les noyaux sont ronds (régions encerclées). D) Exemple d'une bonne tranche observée avec une faible microscope de grossissement avant de vivre imagerie. E) Exemples de Syto11 cellules marquées dans les différentes phases de la mitose, comme l'a noté F) Montage d'une région à la frontière du ventricule où deux progéniteurs neuronaux passent par les différentes phases de la mitose, marqué en différentes couleurs (temps, hh:. mm). G) Montage d'une région a mis en évidence dans (B) où un ancêtre de neurones se divise en loin de la frontière ventriculaire. En montages (D) et (E), CElls ont été pseudo couleur avec Photoshop pour mettre en évidence les différentes phases de mitose. (barres d'échelle: B, C, F: 10 pm; D: 1 mm, E, G: 5 um).
Figure 4. Exemples d'outils alternatifs de visualiser la mitose des cellules progénitrices neurales. A) Montage d'une région à la frontière du ventricule dans une tranche de cerveau d'un embryon transgénique histone H2B-EGFP à E13.5. Un progéniteur est observée à mesure qu'il avance à travers les différentes phases de la mitose. B) Montage d'un VZ à E14.5 dans la tranche d'un cerveau qui a été soumis à une électroporation à E13.5 avec des vecteurs exprimant EGFP-a-tubuline et H2B-mCherry. EGFP-a-tubuline permet la visualisation de la dynamique des microtubules pendant la mitose (B 1-B 2) C) Montage d'une région ventriculaire dans unn E15.5 cerveau d'un embryon transgénique Centrin-EGFP qui a été électroporation à E14.5 avec des plasmides exprimant mCherry-a-tubuline et H2B-EGFP. Centrin-EGFP permet la visualisation de centrioles dynamique lors de la mitose (C 1 et C 2). D) Montage d'une région montrant la ZI d'une tranche E14.5 du cerveau où les cellules ont été peu marqués par l'électroporation à E13.5 avec une faible concentration d'un plasmide exprimant Cre et une concentration standard d'un plasmide exprimant l'EGFP après Cre recombinaison 28. La division cellulaire dans ce montage a la morphologie d'un RGosvz avec un long processus de base (flèches roses) et aucun processus apical 9. L'objectif utilisée pour l'imagerie en temps réel de l'(A) et (B) des exemples est un objectif 60X de silicium à l'huile, l'objectif de l'huile 100X par exemple (C), et 10X objectif de l'air par exemple D. La résolution temporelle utilisée pour l'imagerie du (A) , (B), (C) et (D) sont des exemples 4 min, 4 min, 30 s et 5 min, respectivement. VZ: ventriculaire Zun, IZ: Zone intermédiaire, RGosvz: zone sous-ventriculaire externe radiale cellules gliales comme. (barres d'échelle: A: 15 pm, B, C, D: 5 um, C 1, C 2: 2,5 um) Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
L'avantage majeur du protocole que nous avons décrit est qu'il fournit une résolution temporelle dynamique de la mitose de cellules progénitrices neurales. Typiquement, les dosages de visualiser la mitose dans le cerveau en développement sont effectuées par immunofluorescence de coupes de tissus fixés. Mais cette approche ne donne qu'un aperçu de la mitose à un point de temps.
Il existe plusieurs étapes qui sont les plus critiques pour l'imagerie de la mitose dans des tranches de cerveau: 1) Les tranches de cerveau devraient rester attachés à la gélose, afin de préserver l'intégrité des coupes de cerveau pendant le transfert et le montage. 2) Pour la génération et l'imagerie de tranches, le contrôle des niveaux Rostro-caudale est important. Des tranches de cerveau caudales sont généralement mieux, parce que dans ces tranches, les processus basales de la GRC seront conservés, ce qui est plus sain pour les cellules. 3) Pour l'imagerie en temps réel, l'utilisation d'un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif 60X est préférable pour une haute résolution et d'éviter photoblanchiment de sexemples, qui peuvent se produire avec Syto11 colorant. 4) Pour l'imagerie en temps réel, les paramètres temporels d'acquisition sont essentiels. Selon l'équipement de microscope utilisé, time-lapse peut être effectuée allant de chaque min toutes les 10 min. Plus de 10 min est généralement trop long pour atteindre la dynamique à haute résolution de la mitose.
Ce protocole comporte certaines limites. L'expérience est réalisée avec un tissu ex vivo. Il est concevable que les observations faites dans des tranches de cerveau pourraient être différentes in vivo. Par conséquent, lorsqu'on fait des comparaisons entre les expériences réalisées à des jours différents ou en utilisant différents échantillons, les paramètres suivants doivent être maintenus constants: utilisation de rostro-caudale et dorso-latérales des niveaux similaires, le contenu de médias, l'utilisation d'un microscope et les paramètres d'acquisition. En outre, phototoxicité est possible avec l'imagerie à long terme. Par conséquent plusieurs expériences devraient être menées avant de tirer des conclusions. En outre, elle pourrait Syto11 puissantinfluencer ially événements mitotiques, en particulier dans un contexte mutant. Par conséquent, il est recommandé que lorsque l'on fait des conclusions sur la mitose basé sur Syto11, ils confirment également les résultats en utilisant des tests indépendants, tels que les marqueurs décrits dans la figure 4.
Comme décrit dans le protocole, la mitose peut être imagée après chromosomes et le cytosquelette de diverses manières marquage. D'autres colorants SYTO peuvent être utilisés pour visualiser la mitose dans les autres canaux fluorescents. Au lieu d'utiliser Syto11 coloration pour visualiser l'ADN, les tranches peuvent être générées à partir de lignées transgéniques fluorescentes. Par exemple, comme l'a démontré, l'histone H2B-EGFP lignées transgéniques peuvent être utilisées 29. L'utilisation de l'histone H2B-EGFP est particulièrement utile et recommandée pour confirmer tout phénotype observé avec le traitement Syto11. En outre, il pourrait également être utile pour relever les défis associés à photoblanchiment avec Syto11. L'utilisation d'autres lignées transgéniques, tels que centrine-EGFP 30, peutêtre utilisé pour visualiser les centrioles, les composants de centrosomes. Bien que ces seuls ne suffirait pas pour visualiser la mitose, ils fonctionnent bien en combinaison avec d'autres marqueurs de chromosomes ou microtubules. De tels marqueurs peuvent être introduits par électroporation in utero 4,5,10,31,32. Comme l'a démontré, l'expression de protéines de fusion un jour avant la dissection peut être utile pour cette approche. Dans notre expérience, exprimer des constructions sous un promoteur CAG peut souvent donner l'expression robuste en une journée. Par exemple, nous avons introduit α-tubuline et histone H2B-EGFP dans des cerveaux embryonnaires utilisant cette approche.
Une fois que cette technique est maîtrisée, il ya des modifications supplémentaires qui peuvent être faites pour des expériences futures. Électroporation in utero peut également être utilisé pour manipuler l'expression des gènes. Par exemple, l'introduction de shRNA ou ADNc peut être utile pour déterminer l'impact de la perte de fonction ou la sur-expression d'un gène d'intérêt sur prog neuronesenitor 33 mitose. En outre, les tranches peuvent être traités avec des médicaments chimiques ou de petites molécules pour mesurer l'impact de l'inhibition des voies ou des molécules de signalisation sur la mitose 34,35.
Dans notre procédure, nous décrivons l'imagerie réalisée en utilisant un microscope confocal à disque rotatif. Le principal avantage d'un microscope confocal à disque rotatif est la vitesse d'acquisition. Cela permet à l'imagerie de multiples positions de différentes tranches de cerveau dans une session d'imagerie en temps réel avec une haute résolution temporelle, et une qualité d'image raisonnable. D'autres configurations telles que multi-photons confocal à balayage laser microscope offrent la possibilité d'acquérir des images de haute qualité en profondeur dans le tissu, où les cellules gliales radiales sont moins susceptibles d'être coupé au niveau du processus de base. Ce sera donc augmenter la probabilité d'images progéniteurs neuronaux sains. Cependant, ceci est généralement associée à un sacrifice de la vitesse d'acquisition. Cela permettra de limiter le nombrenombre de positions qui peuvent être imagés au cours d'une séance d'imagerie en temps réel, ainsi que la résolution temporelle. Imagerie de la mitose peut également être réalisée sur un microscope à champ large. Toutefois, dans ce cas, il est préférable de l'image cellules faiblement marquées, par opposition à histone H2B-EGFP ou Syto11, comme la luminosité globale de ces réactifs ferait imagerie beaucoup plus difficile. En outre, le protocole décrit ici utilise un microscope inversé. Les principaux avantages d'un microscope inversé sont la possibilité d'utiliser les objectifs de l'huile à haute résolution et la liberté de mouvement lorsque le microscope est couplé avec une platine motorisée. En conclusion, l'expérimentateur a besoin de trouver un équilibre entre les avantages et les inconvénients d'une mise en place particulière et le but d'une expérience.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent financement du NINDS / NIH, R00-NS064197 et NINDS / NIH, R01NS083897 (à la fois pour DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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