Summary
신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.
Abstract
짧은 기간이지만, 유사 분열은 뇌를 포함한 장기의 개발을위한 기초 복잡하고 역동적 인 여러 단계의 프로세스입니다. 개발 대뇌 피질에서 신경 전구 세포의 비정상적인 분열이 뇌의 크기와 기능에 결함을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 신경 전구 세포의 유사 분열의 메커니즘을 이해하는 도구를위한 중요한 필요가있다. 쥐의 대뇌 피질의 발달 과정을 연구하기위한 뛰어난 모델입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열은 일반적으로 고정 된 뇌 부분에서 검토된다. 이 프로토콜은 자세히 생체 배아 뇌 조각의 유사 분열의 라이브 영상에 대한 접근 방법을 설명합니다. 뇌 추출, 뇌 매립, 뇌 조각의 vibratome 절편, 염색과 조각의 배양 및 시간 경과 영상 : 우리는 포함하는이 절차의 중요한 단계를 설명합니다. 우리는 그 입증하고 유사 분열의 취득 후 분석을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 대표적인 결과의 fr을톰 중요한 염료 Syto11, 형질 전환 마우스 (히스톤 H2B-EGFP와 centrin-EGFP), 및 자궁 일렉트로에 (mCherry-α-튜 불린)를 사용하여이 분석. 우리는이 방법이 가장 최적화 할 수있는 방법과 유사 분열의 유전자 규제의 연구를 위해 수정하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각에서 유사 분열의 라이브 영상은 제어 된 환경에서 연령, 해부학 적 및 유전 적 교란의 영향을 평가하기 위해, 높은 공간적 해상도를 가진 많은 양의 데이터를 생성하는 유연한 방법이다. 따라서이 프로토콜은 신경 전구 세포의 유사 분열의 분석을 위해 기존 도구를 보완합니다.
Introduction
이 프로토콜의 전반적인 목표는 배아 뇌 조각에 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 문화 뇌 조각의 라이브 영상을 사용하여,이 프로토콜은 생체 설정에 매우 유사한 환경에서 신경 전구 세포에서 유사 분열의 여러 측면을 검정하는 간단한 방법을 제공한다. 그것은) 자궁 일렉트로에 1-5을 조작 한 돌연변이 동물 및 / 또는 뇌의 두뇌에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 단순히 배지에 제를 첨가함으로써, 신경 전구체 '에 유사 분열되는 약물의 효과를 시험하는 것이 이상적이다. 결론적으로,이 문서가 신경을 공부하는 사람들에게 기술적으로 도전적인 프로토콜에 액세스 할 수 있도록합니다.
신경 동안 별개의 신경 전구 인구는 결국 6-8 신피질 성인의 여섯 대뇌 피질의 층에 기여하는 신경 세포를 생성하는 정확한 분열을 받다. neuroepithelial (NE) 세포가 자기 갱신에 대칭 적 분할로 초기 대뇌 피질의 개발, 신경 전구체 풀을 확장합니다. NE 세포는 레이디 얼 glial 세포 (망막 신경절)로 변환합니다. 초기 망막 신경절 그러나 신경의 대부분 동안, 분열의 망막 신경절의 주요 모드 비대칭, 두 개의 새로운 망막 신경절을 생산하기 위해 대칭 적으로 나눕니다. 비대칭 부문에서 1 RGC는 새로운 RGC와 하나 후 유사 분열 신경 세포, 또는보다 전문적인 전구 (하나 짧은 신경 전구체 (SNP), 바깥 지름의 아교 (ORG), 또는 중간 전구 (INP)에 상승을 제공합니다 2,3,7,9. INPS, SNP를, 그리고 개 기관은 다음 하위 심실, 심실에 신경을 생성 할 수 있고, 대뇌 피질의 기초 영역은 각각. 따라서, 전구 세포의 세포 분열은의 신경 세포를 생성하는 기본 과정이다 신피질.
많은 연구는 특정 유사 분열 망막 신경절의 특성과 딸 세포의 운명 사이의 상관 관계를 가리 킵니다. 하이다르 등.와 다카하시 외 여러분.RGC의 유사 분열의 기간과 신경이 진행됨에 따라 세포주기의 길이 증가, 발견은 연구 10-13를 따라있는 에코 것으로 나타났습니다. 연구의 수는 심실에 방추사 방향의 상대는 각각 뇌에서 생성 된 신경 세포의 종류와 자손의 위치, 3,10,14-16 등의 신경과 corticogenesis의 측면을, 영향을 미치는 것을 제안했습니다. 절단 평면 방향이 직접 세포의 운명에 영향을 미치는 여부는 논란의 여지가 있지만, 결론은이 유사 분열 매개 변수의 영향을 신경 남아있다. 또한 유사 분열의 중요성을 강조하는 것은 유사 분열의 메커니즘에 관련된 많은 유전자가 신경에 대한 적절한 뇌 발달에 중요한 17-20 있다는 관측이다.
유사 분열은 역동적 인 과정입니다, 아직 날짜에 신경 전구 세포의 유사 분열을 자세히 대부분의 연구는 체외 세포 배양을 통해 고정 된 조직 절편 또는 신경 전구 세포의 이미지 분석을 이용. 따라서, 유사 분열을 평가하는 주류의 방법은이 프로세스의 스냅 샷을 제공하고 세포 조직에서 행동하는 방법을 발견하지 못한다. 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상은 점점 더 신경 전구의 기능을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어 이러한 참조를 참조하십시오 4,8,10,21-25. 몇 가지 눈에 띄는 프로토콜은 준비와 뇌 조각 (26, 27)의 영상에 발표되었다. 그러나 현재까지, 이미징 및 유사 분열의 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 설명되지도 비디오에서 보여 주었다.
이 기술은 뇌 부분의 고정 분석을 통해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 뇌 조각의 시간 경과 분석은 유연한 방식으로 분석 할 수있는 훨씬 더 많은 데이터 포인트의 생성을 가능하게한다. 첫째, 데이터는 몇 분 또는 몇 시간의 과정을 통해 각각의 시점에서 수집됩니다. 하나는 각각의 시점 (정적 몽타주를 만들려면) 또는 분석 할 수 있습니다영화로 서로 다른 시간의 포인트를 결합 할 수 있습니다. 둘째, 조각 공 촛점 이미징은 뇌 조각의 다른 Z 섹션에서 데이터의 생성을 가능하게한다. 결과적으로, 각각의 섹션은 분석 될 수있다. 또한, 개별 섹션의 스택은 최대 강도 투사로 결합 할 수 있습니다. 셋째, 분석 세포는 이웃 세포와 구조를 기준으로 분할하는 방법을 공개, 조직의 맥락에서 이루어집니다. 넷째, 이상적으로 유사 분열 결함의 증거를 보여 돌연변이의 분석에 적합합니다. 함께이 프로토콜은 자신의 실험실에서 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하고자하는 연구자를 지원하기 위해 중요한 단계를 명확히하는 데 도움이 될 것이다.
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Protocol
미디어 1. 준비 (그림 1, 1 단계)
- 슬라이스 문화 매체
- 슬라이스 배지 25 ㎖를 잘 당 2 조각을 5 유리 바닥 요리를 준비하기에 충분하다.
- 50 ML 원뿔 관에서 100 배 N2 용액 250 μL와 비타민 A 22.5 ML의 볼륨에 DMEM/F12를 추가하지 않고 50 배 B27 솔루션 500 μl를 추가합니다.
- 필터 솔루션을 살균 이후에 열 불 활성화 된 말 혈청 1.25 ㎖ 및 소 태아 혈청 1.25 ㎖를 추가합니다.
- 조각의 준비 기간 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 솔루션을 품어.
- 성장 인자 (FGF와 EGF, 10의 최종 농도 추가 NG / ML 20 직전 문화의 시작 부분에) 각각 / ㎖를 겨. 이 배지의 조성은 배양에서 세포의 생존을 촉진하고, 신경 전구 세포의 증식 속도를 높이기 위해 최적화되었다. 이는 이와에 확률을 최대화 할 것이다슬라이스의 유사 분열 세포를 관찰합니다.
- 전체 HBSS 해부 솔루션
- , 0.9 M 탄산 수소 나트륨 2.2 ML 1 M 헤 페스 1.25 ㎖ (산도 7.4, FC 2.5 ㎜), 2.5 M D-포도당 6 ㎖ (FC 30 mm)를 10 배 HBSS 50 ㎖를 추가하여 전체 HBSS 500 ㎖를 준비 500 ML의 최종 볼륨에 DIH 2 O 오토 클레이브 (FC 4 MM) 및.
- 임신 한 마우스에서 자궁 뿔의 컬렉션까지 4 ° C에서 소독 필터 솔루션 및 저장. 이 솔루션은 주 4 ° C로 유지 될 수있다.
- 전체 해부 절차를 수행하는 동안 얼음에 HBSS를 유지합니다.
- 솔루션을 포함하기
- 4 배아 두뇌의 매립의 경우, 전체 HBSS 용액에서 3 % 저 융점 아가로 오스 30 ㎖를 준비합니다. 50 ML 원뿔 관에 30 ml의 아가로 오스 저 융점 및 전체 HBSS의 0.9 g을 추가합니다.
- 와류 믹서 솔루션을 혼합, 튜브 서 및 모자를 오픈과 함께 전자 레인지에 녹아.
- 전자 레인지에서, P의 해결책을 모니터링하면서과도한 비등에 의한 못하 오버 플로우. 시작 비등 할 때, 전자 레인지를 중지하고 솔루션을 소용돌이.
- 모든 아가로 오스가 녹을 때까지이 단계를 반복합니다.
- 42 ℃에서 수욕 튜브를 저장할
태아의 2. 해부 (그림 1, 2 단계)
- 임신 한 쥐의주의 안락사 후, 자궁 뿔을 수집하고 차가운 전체 1X HBSS를 포함하는 10cm 2 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 배아의 나이는 연구 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 E17.5에 배아 일 E12.5에서 뇌 조각을 배양하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 크기 때문에, 젊은 두뇌가 작동하기 어려운 경향이있다.
- 배아를 수집하고 두 대뇌 반구와 후뇌와 전뇌를 포함한 전체 배아 뇌를 얻을 때까지, 쥐, 마우스 (26, 27)에서 설명한 바와 같이 태아의 뇌를 해부하다. 이들은이 될 수 있습니다모든 뇌 해부 될 때까지 실온에서 보관.
- 배아를 수집하고 두 대뇌 반구와 후뇌와 전뇌를 포함한 전체 배아 뇌를 얻을 때까지, 쥐, 마우스 (26, 27)에서 설명한 바와 같이 태아의 뇌를 해부하다. 모든 뇌 해부 될 때까지이 실온에서 유지 될 수있다.
3. 배아 두뇌의 포함 (그림 1, 3 단계)
- 양동이 포함하는 얼음에 삽입 금형에 삽입 얼음에 구멍을 만들 수 있습니다.
- 플라스틱 금형에 3 % 아가로 오스 매체를 붓고 얼음에서 제조 된 구멍에 그 형을 배치합니다.
- 온도가 35 ° C.에 도달 할 때까지 디지털 온도계의 끝이 아가로 오스 매체를 저어
- 즉시 삽입 매체로 뇌를 전송합니다.
- 중요한 단계 :주의 깊게, 뇌와 아가로 오스 사이의 인터페이스에서 초과 HBSS를 제거하고 부드럽게 반복 / 두뇌를 회전 공중제비집게로 매립 솔루션.
- 아가 로스 겔의 쿠션 얼음과 접촉 금형의 아래쪽에 형성된다. 뇌를 교반하면서 쿠션 집게의 끝으로 느낄 수 있습니다되면, 지느러미 쪽이 위로 머리를 놓습니다. 뇌는 금형의 맨 아래에 가라 앉지한다.
아가로 오스 블록 4. 준비 (그림 1, 4 단계)
- 아가로 오스는 적어도 5 분 동안 얼음에 굳어하자.
- 면도날을 사용하여, 부분 금형의 모서리.
- 정중 면도날을 사용하여 뇌 주위 아가 블록을 새긴다. 포함 된 두뇌를 교란 방지하기 위해 상처의 수를 최소화하려고합니다.
- 장절 받침대에 블록의 안정성을 높이기 위해 (그림 1, 4 단계를 참조 주동이의 지역 대) 블록은 뇌의 꼬리 지역에서 더 큰 표면적을 가지고 있는지 확인합니다.
- 마지막 컷은 뇌의 꼬리 쪽의 하나가 될한다이 컷은 vibratome와 올바른 단면 평면을 정의합니다.
- 뇌의 rostro - 꼬리 축과 아가로 오스 블록에 수직 블레이드를 정렬하여 이렇게. 꼬리 쪽 rostro - 꼬리 축을 따라 칼날을 아래로 밀어 약 5 ㎜ 떨어져 뇌의 가장 꼬리 영역에서 최종 컷을합니다.
- 옆 아가로 오스 / 뇌 블록을 설정하고 다른 뇌의 매립을 반복합니다.
Vibratome의 트레이에 포함 된 두뇌의 5. 전송 (그림 1, 5 단계)
- vibratome 트레이의 바닥에 접착제 한 방울을 추가합니다. 아가로 오스 블록 진동 블레이드의 범위 내에 위치 될 수 있도록 접착제를 놓습니다.
- 주걱의 가장자리에 블록 팁의 약 50 %로, 주걱의 가장자리에 아가로 오스 / 뇌 블록 꼬리 쪽을 아래로 놓습니다.
- 접착제에 아가로 오스 블록의 꼬리의 얼굴을 적용하고의와 트레이의 바닥에 아가로 오스 블록을 유지, 멀리 주걱을 밀어핀셋의 houlder. 주걱 직접 접착제를 문의하게하지 마십시오.
- 접착제는 5 분 동안 실온에서 고화하자.
임베디드 두뇌의 6. 단면 (그림 1, 6 단계)
- HBSS와 vibratome 트레이를 기입하십시오.
- vibratome 블레이드의 시작과 끝 위치를 정의합니다.
- 250 μm의 조각 - (200)를 생성합니다. - 4, 주파수 8 속도 2 : VT1000s의 vibratome으로, 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다.
- 그들이 잘리는으로 조심스럽게 vibratome에서 조각을 제거합니다. 전체 HBSS로 채워진 12 잘 접시에 주걱 및 핀셋의 백 엔드와 조각을 전송합니다. 또는 일부 연구자들은 핀셋 대신 붓을 사용하고 키 포인트 :. 전송하는 동안 뇌 조각이 주변의 아가로 오스에 부착 남아주의하십시오.
조각 7. Syto11 염색 (그림 1, 7 단계)
- 최종 농도에 Syto11 희석0.5 - 슬라이스 배양 배지에서 1 μM가 성장 인자로 보충.
- 12 - 웰 플레이트의 우물에서, 37 ℃에서 1 시간 동안 염색 용액 2.5 ㎖에 하나의 머리에서 조각을 품다
- 20 분을위한 솔루션을 얼룩없이 슬라이스 배지 2.5 ㎖에 조각을 씻으십시오.
8. 유리 바닥 접시에 조각 설치 (그림 1은, 단계 8, 9)
- 조각 당 콜라겐 솔루션을 내장의 15 μl를 준비합니다. 배 DMEM, 1 M NaOH를 9.4 μL, 그리고 H 2의 290 μL O.의 75 μL로 3 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 형 솔루션 375 μl를 혼합하여 1.5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비합니다 얼음에 보관합니다.
- 35mm 유리 바닥 마이크로 웰 접시의 바닥에 콜라겐 솔루션 15 μl의 드롭 놓습니다. 슬라이스의 크기와 일치하는 피펫 팁으로 깔아.
- 족집게 주걱과 쌍 콜라겐의 드롭에 조각을 이동 키 포인트 :. 다른 여러 조각을 설치엔트 요리 영상에 적합한 조각을 획득 할 수있는 확률을 증가시킨다. 화면의 다른 조각을 통해 최고 "대표 결과"절에서 아래에 설명 된 조건에 맞는 사람을 선택합니다.
- 슬라이스 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 그들을 전송하기 전에 실온에서 10 분 동안 품어 보자.
- 20 분 후, 유리 바닥 마이크로 웰 접시에 슬라이스 문화 매체의 1.2 ML를 추가합니다. 한 번에 매체 600 μl를 추가하고 피펫 팁으로 확산.
- 슬라이스의 해부학 레벨 및 무결성을 기록하는 뇌 슬라이스의 저배율 이미지를 캡처.
조각의 9. 라이브 영상 (그림 1, 10, 11 단계)
- 조각 라이브 영상 전에 5 % CO 2와 37 ° C에서 최소 1 시간 30 분 동안 인큐베이터에서 복구 할 수 있습니다.
- Syto11가 photobleaching에 매우 경향이 있음을 염두에두고 선택의 현미경 이미지 조각. 인버 여기에테드 회전 디스크 공 초점 현미경 (도르 XD 혁명 회전 디스크 공 초점 현미경)을 사용합니다. 대안 적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용할 수있다. 다음 매개 변수는 회전 디스크 현미경 셋업에 대한 것입니다.
- 전체 라이브 영상 세션 동안, 37 ° C, 현미경에 부착 된 가습 배양 챔버에서 5 % CO 2에서 조각을 유지한다.
- 300 ㎛의 작동 거리와 60X 실리콘 오일 목적 및 1.3의 개구와 이미지 세포 (예도 3B, 3C, 3E, 3F, 4A를 참조하십시오 4B). 130 ㎛의 작동 거리 및 1.4의 개구 수 100X 유 목적 (예를 들어도 4C 참조)를 사용할 수도있다. 카메라의 해상도는 512 X 512입니다.
- 약 40 μm의 조각의 표면 아래에있는 Z-스택의 센터와 30 μM의 Z-스택의 이미지 세포. 조직에 깊이 이미지에 노력하는 것은 목적이 추가 될 수 있습니다슬라이스 기계적인 압력. 이것은 뇌 조각의 무결성에 영향을 미칠 수 있습니다. 계획은 세포의 3 차원 복원을 할 경우, 더 이상 2 ㎛ 이하의 Z-간격을 사용합니다.
- 광표백을 제한하기 위해, 레이저 파워 및 노출 시간을 조정한다. 30 Syto11 신호의 강도에 따라 200 밀리 초에 이르기까지 노출 시간을 사용합니다.
- 자동화 된 단계로, 여러 조각을 통해 이미지를 여러 위치는 1 접시에 장착. 1 하나의 접시에 4 개의 조각에 흩어져있는 20 위치로 예를 들어, 이미지까지.
- 라이브 영상의 경우, 유사 분열의 다른 단계의 식별을 가능하게하여 5 분 이하의 시간 해상도를 사용합니다. Syto11 및 / 또는 히스톤 H2B-EGFP를 사용하여, 4 - 실시간 이미징 5 시간은 유사 분열 세포의 상당수를 관찰하기에 충분하다. 영상은 띄엄 띄엄 (예 : 자궁 일렉트로에 의해 달성 된 것과 같은) 유사 분열 세포를 표시하는 경우에는, 다음, 더 이상 이미징 매개 변수 (야간) 적절한 지와 우리 작품LL.
참고 :이 프로토콜을 사용하여, 우리는 일반적으로 위치 당 평균 10 유사 분열 세포에서 관찰합니다. 전술 한 바와 같이, 영상 여러 조각을 설치는 성공적인 실험을 갖는 확률을 증가시킨다. 이 방법으로 우리는 일반적으로 Syto11 또는 히스톤 H2B-EGFP 수행 거의 모든 실험에서 유사 분열 세포를 식별합니다.
10. 유사 분열의 인수 후 분석 (그림 2)
이 단원의 모든 절차는 무료 오픈 소스 소프트웨어이기 때문에 유리하다 피지 (ImageJ에)에 최적화되었습니다. 기타 소프트웨어 솔루션은 Metamorph의, Imaris 및 아미라과 같은 작업을 수행 할 수 있습니다.
- 유사 분열의 식별 피지 피규어
- "hyperstack"와 같은 하나의 위치에 대한 데이터 집합을 연 후, 조직과 세포를 건강하게 보이는 곳 (토론 섹션에서 기준을 참조) (스크롤 막대의 위치를 그림 2A 참조) 하나의 Z-평면을 선택합니다.그것을 확인하는 가장 쉬운 유사 분열 단계이기 때문에, anaphase를 통과 세포를 식별 할 시간적 차원에 걸쳐 이동합니다.
- 세포가 유사 분열 (DNA의 응축을) 진입 시점을 확인하는 시간을 거슬러 이동합니다. 세포는 Z-평면을 가로 질러 이동할 수 있지만, 시간 해상도 앞에서 설명한 Z-스택 매개 변수는이 과정을 수 있도록 최적화되었다.
- 스프레드 시트에서, 유사 분열을 입력으로 (피지 인터페이스에서 이러한 수치의 위치를 시각화하기 위해 그림 2a 참조, X, Y, Z 및 시간) 4D가 hyperstack 셀의 좌표를 기록한다. 이러한 좌표를 알고있는 것은 동일한 셀을 여러 번 계산하는 것을 방지 할 수 있습니다.
- 시간을 앞으로 이동하고 셀이 하나의 단계에서 다른 진행 할 때 시간을 기록. 하나의 특정 셀에 대한 각각의 유사 분열 단계의 기간을 문서화합니다.
- 전체 데이터 집합을 통해 다른 세포 (내부 및 위치에서 여러 세포)를 진행합니다.
- 3D 재구성세포의 이온 메타 페이즈 동안 회전의 정량 (하이다르 등 2003에서 적응) (그림 2B).
- 중기의 시작까지 여러 유사 분열 세포를 식별 한 후, 셀의 좌표를 사용하여 시간에 순방향 스크롤.
- 심실 테두리 ( "이미지 / 변환 / 회전 ..."명령을 사용하여) 평면이되도록 전체 "hyperstack"을 돌립니다. 이 회전을 적용 할 각도를 결정하기 위해 "각도"도구를 사용합니다.
- 그 세포가 가장 눈에 띄는 곳은 z 평면을 확인합니다. 비행기에서 전체 셀을 포함하는 선택 영역을 그릴 "사각형 선택"도구를 사용합니다.
- 관심의 세포를 포함하는 Z-평면을 확인합니다. "하위 스택"을 만들기 위해 "이미지 / 중복"명령을 사용하십시오. 대화 상자에서 확인 "중복 hyperstack"남긴다. "슬라이스 (Z)는"파라미터를 포함한 전체 CE Z-평면에 상당LL 및 "액자 (t)가"파라미터는 현재의 시점에 대응한다.
- 해상도가 불량 인 경우, "이미지 / 조정 / 크기 ..."명령을 사용하여 "서브 - 스택"의 크기를 증가시킨다.
- "Image/Stacks/3D 프로젝트"명령을 이용하여 현재 시점에서 셀의 3D 재구성을 생성한다. 이 명령에 대한 매개 변수는 그림 (b)에 표시됩니다. "조각의 간격은"Z-평면 이미지 (μm의)의 각 사이의 간격에 해당합니다. 중요 : 하위 스택의 물리적 치수 (μm의)가 보존되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 Z 차원의 화소 보간은 잘못 될 것이며, 3D 재구성은 부정확 할 것이다.
- 중기 판의 가장자리를 볼 수 있도록 스크롤 막대를 사용하여 생성 된 3 차원 재구성을 돌립니다. 프레임의 수는도 3b에 설명 된 베타 각도에 대응하고,이 번호를 기록한다. 사용"각도"도구 "분석 / 측정은 ..."명령, 수평 (그림 2B) 수직 중기 판을 양분하는 선 사이의 각도를 측정합니다. 이 각도 (α)이다.
- 그 셀의 모든 중기 시점에 이러한 각도를 기록한다. 시점 (t) 및 (t-1) 사이의 회전 각도 (t-1)에서 (t)에서의 각도와이 각도의 차이의 절대 값과 동일하다.
- 절단 평면의 방향을 측정
- 중기 판의 3 차원 재구성에 대해 설명 된 지침에 따라 anaphase 동안 한 시점에서 그 셀을 재구성 3D.
- 분리하는 염색체에 의해 형성되는 두 접시의 가장자리가 보일 때까지 재건을 돌립니다.
- 수평 사이의 각도 (심실 단) 및 편석 염색체에 의해 형성된 두 개의 플레이트에 평행 한 선을 측정하기 위해 각 공구를 사용. 이 벽개면 (도 2c)의 각도이다.
- 영화의 생성
- 셀은 종종 상이한 Z-평면을 가로 질러 이동함에 따라, 실시간 영상 세션 동안 셀에 의해 점유 Z-평면을 식별한다. "이미지 / 스택 / Z 프로젝트 ..."명령을 사용하여 이러한 Z-평면의 "최대 강도 투사"를 생성합니다. ". TIF '파일로 생성 된 스택을 저장합니다.
- 피지. "MOV"또는 ". AVI"파일의 생성을위한 안정적인 플러그인을 포함하지 않는 ImageJ에의 1.45 버전에서이 파일을 엽니 다.
- 당신의 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는 형식으로 동영상을 생성하는 ImageJ에의 명령 "... /로 파일 / 저장"을 사용합니다.
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Representative Results
이 분석의 성공과 하나의 라이브 영상 세션 동안 여러 유사 분열 세포의 관찰은 크게 무결성 및 인수가 만든 조각의 해부학 적 수준의 양에 따라 다릅니다. 아래에 설명 된 바와 같이, 슬라이스의 해부학 적 수준은 중요한 요소입니다. 그림 3a는 rostro - 꼬리를 보여줍니다 내측 - 외측 우리가 가장 성공적이었다 위치. 이 주제의 자세한 설명은 Noctor 26를 참조하십시오. 슬라이스의 무결성은 슬라이스의 다른 지역에서 다를 수 있습니다. 이것은 이전에 (단계 7.6에서와 같이 전체 슬라이스의 이미징을 사용하여) 시간 경과의 시작 부분에 결정될 수있다. 많은 유사 분열 세포는 계면 핵 오히려 원형보다 타원형 모양 될 것입니다, 심실 국경에서 발견되며, 계면 핵은 심실의 경계에 원주 상대를 나타납니다 E13.5 두뇌의 좋은 지역에서 다음과 같은 관찰 결과를 얻을 수 있습니다 . 뇌의 덜 바람직한 지역핵은 (그림 3B 및 3C를 비교하고 잘 장착 조각의 그림은 그림 3D 참조) 둥근 다소 무질서하게 보일 것입니다.
이상적인 조건이 달성되면,이 분석은 유사 분열의 다른 단계의 질적 식별을 가능하게 할 것이다. 이들은 (치근단 유사 분열의 각 단계에서 세포 분열의 예는도 3e 참조) DNA 패턴의 분석에 의해 검출 될 수있다. 의향 동안, DNA의 응축이 띄엄 띄엄 표시 DNA (핵에있는 DNA-DNA 풍부하고 가난한 지역)의 모양을해야합니다. 중기 동안에, 염색체는 전지 본체의 적도 평면을 형성한다. 비행기의 방향에 따라, DNA 패턴은 굵은 선 (그림 3E,보기 1) 또는 중간에 DNA 가난한 지역과 (ⅱ) "장미"(그림 3E,보기 2)은 (i)입니다 . 염색체 분리 할 때 anaphase 동안, 그들은 "손"처럼; 그 반대 방향으로 이동한다. 인수의 Y 평면 - 절단 평면 X에있을 때이 단계는 식별하기 어려울 수 있습니다. telophase 동안, DNA 이완 및 핵 봉투 개혁으로 타원 모양을 취득한다. 개인 시간 지점 (그림 3 층 참조) 시간이 지남에 따라 유사 분열을 시각화하기 위해 수집 할 수 있습니다.
치근단 나누어 전구 세포의 유사 분열을 이미징하는 것 외에도,이 분석은 basally 같은 개 기관 또는 INPS으로 세포를 분할 이미지로 사용할 수 있습니다, 후자는 가능성도 3G에 표시됩니다. 이러한 세포가 SVZ의 부문에 대한 자신의 위치로 확인할 수있다 층. 그러나 실제로는 세포 프로세스 또는 운명 (그림 4B-D 참조) 라벨 형광 마커의 발현과 분석 커플에게 적합한이 세포를 표시합니다. INPS는 어느 쪽도 없을 것이다 정점 또는 기초 과정, 개 기관이 외부 층에있는 자신의 휴대 몸 기초 과정을해야합니다, 그리고 망막 신경절은 학사 학위를해야합니다VZ 층에있는 자신의 휴대 몸 샐 과정.
전구 세포의 유사 분열은 다른 방법으로 시각화 할 수 있습니다. 그림 4a는 모두 나누어 세포의 염색체에 레이블을하는 히스톤 H2B-EGFP 유전자 변형 마우스를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 Syto11 유사한 패턴의 셀을 표시합니다. 그림 (b)는 EGFP-α-튜 불린과 히스톤 H2B - mCherry와 일렉트로 자궁 내 두뇌로 수행 영상을 보여줍니다. 알 수 있듯이,이 미세 소관과 염색체를 모두 시각화를 가능하게하고, 또한 세포 본체와 기초 과정. 그림 4C는 Centrin-EGFP 마우스의 두뇌로 수행 영상을 묘사 mCherry-A-튜 불린과 히스톤 H2B-EGFP와 일렉트로 자궁 내 . 알 수 있듯이, 이것은 녹색 채널의 이미지 염색체 중심 소체에 1을 활성화하고 유사 분열 스핀들 세포 바디 / 프로세스는 빨강 채널에서. 그림 4D 뇌 수행 영상을 보여줍니다띄엄 띄엄 CMV-크레과 CALNL-EGFP (28) 일렉트로 자궁의. 이 기술은 각각의 분할 세포의 분석을 쉽게하고, 띄엄 띄엄 라벨 나누어 조상에 하나를 할 수 있습니다. 그러나 전기 충격을 사용하는 경우,이 방법은 순환 세포 2,12 상당히 동기화 코호트를 대상으로 염두에 유지. 이는 전기 천공에 라이브 영상의 타이밍이 electroporation하여 세포의 코호트는 촬상 세션 시작시 분열 접근되도록 조정할 필요가 있다는 것을 의미한다. 그렇지 않은 경우, 임의의 유사 분열 세포를 식별하는 실험의 성공은 단기간 촬상 세션에서 손상 될 수있다.
이상적인 조건이 달성되는 경우, 유사 분열의 주요 기능은 정량적으로 전체 유사 분열의 기간, 각각의 단계의 기간, 중기 평면과 분열 평면 방향의 회전을 포함하여 측정 할 수있다. 설명 된 상황에서, 우리는 1 시간의 평균 전체 유사 분열의 지속 시간을 관찰배아 일에서 30 분 (E) 13.5 14.5. 전술 한 바와 같이, 중기 DNA 평면의 주위는 개별 시점 또는 누적 전체 중기 2,6,9,10의 기간에 걸쳐 측정 될 수있다. 이것은 각각의 시점에서 셀의 중기 평면의 3D 재구성을 사용하여 심실로 DNA의 상대 각도를 측정 달성 될 수있다. 우리는 성공적으로 적어도 3 시간 동안 세포를 따라이 문서의 방법을 적용했습니다.
각 단계는 각 단계에서 표시되는 그림 1. 프로토콜의 단계 도식 표현. 시간이 필요했습니다. 각 단계에 대한 세부 사항은 "프로토콜"절에 설명되어 있습니다. 하이에서 조각 이미징 때 7 단계는 생략 할 수 있습니다주의하시기 바랍니다플라스미드는 유사 분열에 대한 마커를 표현하는 일렉트로 된 두뇌에서 돌 H2B-EGFP 배아, 또는 조각.
피지 (ImageJ에) 피지. B) 중기에있는 세포의 3 차원 재구성에 관련된 여러 단계의 분석을 위해 사용되는 다른 도구. A) 위치에서 시간 경과 비디오 현미경 데이터 세트의 그림 2. 인수 후 분석. 3D에서 절단 평면 방향의 각 단계에 대한 자세한 사항은 "프로토콜"절에 설명되어 있습니다. C) 측정 anaphase에서 셀을 재구성. B 단계 6과 C의 숫자를 순서가 각도를 측정하기 위해 다음에 보여주의하시기 바랍니다. D) distributio을 보여주는 대표적인 데이터(N = 35). E) E13.5의 뇌 조각의 심실 국경에서 관찰 유사 분열 세포의 그룹의 중기 기간 n은 심실의 국경에서 E13.5의 유사 분열 세포에서 중기 판의 누적 회전을 보여주는 대표적인 데이터 . 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 라이브 영상 분석에서 대표 데이터의 예. 망막 신경절의 기초 과정이 짧고, 따라서 적은 vibratome에 의해 절단 될 가능성이 있기 때문에 A) dorso - 복부 축을 따라, 유사 분열은 가장 쉽게, 뇌 조각의 등쪽 지역에서 이미지가됩니다. rostro - 꼬리 축을 따라, 지느러미 피질의 꼬리 지역에서 슬라이스 제공우리의 손에 가장 일관된 결과). B와 C 예는 좋은 영역 (B) 및 이미징에 대한 나쁜 지역 (C)으로 표시됩니다. 좋은 지역에서 핵은 타원형 (동그라미 지역) 모양의하고 많은 유사 분열 세포는 이전의 시간 경과 영상 (화살표)에 심실의 경계에서 관찰된다. 나쁜 지역에서 거의 유사 분열 세포는 심실의 경계에서 관찰된다 (단일 화살표) 및 핵 이미징을 살 이전에 낮은 배율의 현미경으로 관찰 좋은 슬라이스. D) 예 (동그라미 지역) 라운드입니다. E)에게 . mm) : F) 다른 색으로 표시된 두 개의 신경 전구 세포가 유사 분열의 다른 단계를 통해 이동 심실의 국경에서 지역의 몽타주 (시간, HH 언급 한 바와 같이 Syto11의 예는 유사 분열의 다른 단계에서 세포를 표시. 지역의 G) 몽타주는 신경 전구 멀리 심실 국경에서의 분할 (B)에서 강조했다. 몽타주 (D)와 (E), 기원LLS는 의사 다른 유사 분열 단계를 강조하기 위해 포토샵을 사용하여 색했다. (스케일 바 : B, C, F : 10 ㎛, D : 1mm, E, G : 5 μm의).
그림 4. 다른 도구의 예로는 신경 전구 세포의 유사 분열을 시각화. E13.5에서 히스톤 H2B-EGFP 유전자 변형 배아에서 뇌 조각의 심실의 국경에서 지역의 A) 몽타주. 그것은 유사 분열. B의 여러 단계를 통해 진행되는 하나의 전구가) 관찰 EGFP-A-튜 불린과 H2B - mCherry을 표현하는 벡터와 E13.5에서 일렉트로 된 뇌의 슬라이스에 E14.5에서 VZ의 몽타주. EGFP-A-튜 불린은 허용 유사 분열 중에 미세 소관 역학의 시각화 (B 1-B 2)에서 심실 지역의 C) 몽타주mCherry-A-튜 불린과 H2B-EGFP를 발현하는 플라스미드와 E14.5에서 일렉트로 된 Centrin-EGFP 유전자 변형 배아에서 N의 E15.5 뇌. Centrin-EGFP는 유사 분열 (C 1과 C 2). D) 세포가 띄엄 띄엄 저와 E13.5에서 전기 충격에 의해 표시했다 E14.5 뇌 조각의 IZ을 보여주는 지역의 몽타주 동안 중심 소체 역학의 시각화를 할 수 있습니다 크레을 발현하는 플라스미드의 농도 및 크레 재결합 28 후 EGFP를 발현하는 플라스미드의 표준 농도. 이 장면에있는 분할 셀은 긴 기초 과정 (분홍색 화살표)와 RGosvz의 형태없이 혀끝의 과정 9 있습니다. 라이브 (A)의 화상과 (B)의 예에 사용 목적 60X 실리콘 오일 대물 예 100X 유 목적 (C), 및 예를 들어 10X 공기 목적이다 D. 화상에 사용되는 시간 해상도 (A) , (B), (C) 및 (D)의 예는 각각 4 분, 5 분, 30 초, 5 분이었다. VZ : 심실 Z하나, IZ : 중간 지대, RGosvz : 외부 subventricular 영역 방사형의 glia 같은 세포. (스케일 바 : A : 15 μm의, B, C, D : 5 μm의, C 1, C 2 : 2.5 μm의) 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리가 기술 한 프로토콜의 주요 장점은 신경 전구 세포의 유사 분열의 동적 시간 해상도를 제공하는 것입니다. 일반적으로, 두뇌 개발에 유사 분열을 시각화 분석은 고정 된 조직 절편의 면역을 사용하여 수행됩니다. 그러나이 방법은 한 시점에서 유사 분열의 스냅 샷을 제공한다.
뇌 조각의 유사 분열 이미징을위한 가장 중요한 몇 가지 단계가 있습니다 : 1) 뇌 조각은 전송 및 설치하는 동안 뇌 부분의 무결성을 유지하기 위해, 아가로 오스에 부착 된 유지해야합니다. 2) 생성 및 조각의 영상은, rostro - 꼬리 수준의 제어가 중요하다. 이 조각에서, RGC의 기초 과정은 세포 건강, 이는 그대로 유지되기 때문에 꼬리 뇌 조각은 일반적으로 최고입니다. 3) 라이브 영상의 경우, 60X의 목적으로 공 촛점 회전 디스크 현미경의 사용은 모두 높은 해상도에 가장와 s의 광 탈색을 방지하기 위해Syto11 염료 발생할 수 amples. 4) 라이브 영상의 경우, 인수의 시간 매개 변수가 중요합니다. 사용되는 현미경 장비에 따라, 시간 경과는 모든 분부터 매 10 분까지 수행 할 수 있습니다. 보다 큰 10 분 전형적 유사 분열의 고해상도 역학을 달성하기에는 너무 길다.
이 프로토콜은 일정한 한계를 가지고있다. 실험은 생체 조직으로 수행된다. 그것은 뇌 조각에서의 관찰은 생체 내에서 다른 될 수 있다고 생각할 수있다. 비슷한 rostro - 꼬리와 dorso-측면 수준, 매체의 내용, 현미경의 사용과 인수 매개 변수의 사용 : 다른 일이나 다른 샘플을 사용하여 수행 실험 사이에 비교를 할 때 따라서, 다음과 같은 매개 변수가 상수를 유지해야한다. 또, 광독성 장기 촬상 가능. 따라서 여러 실험 결론을하기 전에 수행되어야한다. 또한, Syto11 자체가 강력 할 수ially 특히 돌연변이 배경에서 유사 분열 이벤트를, 영향을 미친다. 따라서 하나가 Syto11에 따라 유사 분열에 대한 결론을 할 때, 그들은 또한 그림 4에 설명 마커 독립적 인 분석을 사용하여 연구 결과를 확인하는 것이 좋습니다.
프로토콜에 기술 된 바와 같이, 유사 분열은 염색체 및 여러가지 세포 골격 마킹 후에 묘화 될 수있다. 기타 SYTO 염료 다른 형광 채널에서 유사 분열을 시각화 할 수있다. DNA를 시각화 Syto11 염색법을 사용하는 대신에, 슬라이스 형광 유전자 변형 라인에서 발생 될 수있다. 예를 들어, 설명 된대로, 히스톤 H2B-EGFP 유전자 도입 라인 (29)을 사용할 수있다. 히스톤 H2B-EGFP를 사용하면 특히 유용하고 Syto11 처리를 관찰하는 표현형을 확인하는 것이 좋습니다. 또한 그것은 또한 Syto11와 photobleaching에와 관련된 문제를 극복하기위한 도움이 될 수 있습니다. 이러한 centrin-EGFP 30, 할 수있는 다른 유전자 변형 라인의 사용중심 소체, 중심체의 구성 요소를 가시화하는 데 사용될. 이 형은 유사 분열을 시각화에 충분하지 않을 동안, 그들은 염색체 또는 미세 소관의 다른 마커와 함께 잘 작동합니다. 이러한 마커는 자궁의 electroporation 4,5,10,31,32에 의해 도입 될 수있다. 알 수 있듯이, 해부 한 전날 융합 단백질의 발현이 방법에 유용 할 수 있습니다. 우리의 경험에서, CAG 프로모터에서 구조를 표현하는 것은 종종 하루 만에 강력한 표현을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 우리는이 방법을 사용하여 배아의 뇌에 α-튜 블린과 히스톤 H2B-EGFP를 소개했다.
이 기술은 마스터되면 미래 실험 할 수있는 추가 변형이있다. 자궁 일렉트로에서는 또한 유전자 발현을 조작하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, shRNA를 또는 cDNA를 도입의 영향을 결정하기 위해 유용 할 수 있습니다 손실 함수의 이상 발현 신경 음식물에 따라 그 유전자의유사 분열 33 enitor. 또, 슬라이스는 유사 분열 34,35시 신호 통로 또는 분자를 억제하는 효과를 측정하기 위해 화학 약품 또는 작은 분자로 처리 될 수있다.
우리의 과정에서 우리는 회전 디스크 공 촛점을 사용하여 수행 영상에 대해 설명합니다. 회전하는 디스크 공 초점 현미경의 가장 큰 장점은 수집의 속도입니다. 이것은 높은 시간 해상도를 가진 하나의 라이브 영상 세션에서 다른 뇌 조각에서 여러 위치의 영상, 그리고 합리적인 이미지 품질을 제공 할 수 있습니다. 이러한 다중 광자 레이저 스캐닝 공 초점 현미경과 같은 다른 설정 깊은 방사형 신경교 세포 기저 프로세스 레벨에서 절단 될 가능성이 적은 조직으로 고품질의 이미지를 얻기위한 가능성을 수득. 이 때문에 이미지 건강한 신경 전구 세포에 확률을 증가시킬 것이다. 그러나, 이것은 일반적으로 획득 속도의 희생과 연관된다. 이것은 차례로 숫자를 제한합니다하나의 라이브 영상 세션뿐만 아니라, 시간 해상도 중에 이미징 될 수있는 위치의 BER. 유사 분열의 이미징 또한 넓은 시야 현미경상에서 수행 될 수있다. 이 시약의 전체적인 밝기가 훨씬 더 어려운 영상을 만들 것 같은, H2B-EGFP 또는 Syto11를 히스톤에 반대 그러나이 경우에는, 이미지 띄엄 띄엄 표시 셀에 최고입니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜은 도립 현미경을 이용한다. 도립 현미경의 주요 이점은 고해상도 오일 목적 및 현미경은 동력 스테이지와 결합되어 이동의 자유를 사용 가능하다. 결론적으로, 실험은 특정 설정과 실험의 목적의 장점과 단점 사이의 균형을 찾을 필요가있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 NINDS / NIH, R00-NS064197 및 NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS에 모두)에서 자금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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