Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

Neural progenitor mitos är en kritisk parameter för neurogenes. Mycket av vår förståelse av neurala progenitorceller mitos bygger på analyser av fast vävnad. Live avbildning i embryonala hjärnan skivor är en mångsidig teknik för att bedöma mitos med hög tids-och rumsupplösning i en kontrollerad miljö.

Abstract

Även om en kort tid, är mitos en komplex och dynamisk process i flera steg av avgörande betydelse för utvecklingen av organ, inklusive hjärnan. I utvecklings hjärnbarken, kan abnorm mitos av neurala stamceller orsakar defekter i hjärnans storlek och funktion. Därför finns det ett kritiskt behov av verktyg för att förstå mekanismerna bakom neurala progenitorceller mitos. Kortikal utveckling hos gnagare är en enastående modell för att studera denna process. Neural progenitor mitos som brukar granskas i fasta hjärnsektioner. Detta protokoll kommer att i detalj beskriva ett tillvägagångssätt för live-avbildning av mitos i ex vivo embryonala hjärnan skivor. Vi kommer att beskriva de kritiska stegen för detta förfarande, som innefattar: hjärna utvinning, hjärna inbäddning, vibratome sektionering av hjärnan skivor, färgning och odling av skivor, och time-lapse avbildning. Vi kommer då att demonstrera och i detalj beskriva hur man utför efter förvärvsanalys av mitos. Vi inkluderar representativa resultat frOM denna analys med hjälp av det vitala färgämnet Syto11, transgena möss (histon H2B-EGFP och centrin-EGFP), och i livmodern elektroporering (mCherry-α-tubulin). Vi kommer att diskutera hur detta förfarande kan bäst optimeras och hur den kan modifieras för studier av genetiska regleringen av mitos. Live avbildning av mitos i hjärnan skivor är en flexibel metod för att bedöma effekterna av ålder, anatomi, och genetisk störning i en kontrollerad miljö, och för att generera en stor mängd data med hög tids-och rumsupplösning. Därav detta protokoll kommer att komplettera befintliga verktyg för analys av neurala progenitorceller mitos.

Introduction

Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva hur man ska spela live avbildning av neurala progenitorceller mitos i embryonala hjärnan skivor. Med hjälp av live-avbildning av hjärnan skivor i kultur, ger detta protokoll en enkel metod för att analysera olika aspekter av mitos i neurala stamceller i en miljö som i hög grad liknar en in vivo-miljö. Den kan tillämpas på hjärnan hos muterade djur och / eller hjärnor som har manipulerats med i livmodern elektroporering) 1-5. Denna teknik är också idealiskt för att testa effekten av farmakologiska medel på neurala prekursorer "mitos genom att helt enkelt tillsätta ett medel till odlingsmediet. Sammanfattningsvis kommer den här artikeln att göra ett tekniskt utmanande protokoll tillgänglig för dem som studerar neurogenes.

Under neurogenes, distinkta neurala stamceller populationer genomgår noggranna divisioner att generera nervceller som så småningom bidrar till de sex kortikala skikt av den vuxna neocortex 6-8. Tidigt i kortikal utveckling, det neurala föregångare poolen expanderar som neuroepiteliala (NE) celler delar symmetriskt att själv förnya. NE celler omvandlar därefter in i radiella gliaceller (RGC). Inledningsvis RGC dela symmetriskt att producera två nya RGC, men under större delen av neurogenes, är asymmetrisk RGC främsta läge för division. I asymmetrisk uppdelning ger en RGC upphov till en ny RGC och antingen en post-mitotiska neuron, eller en mer specialiserad progenitor (antingen en kort neural prekursor (SNP), en yttre radiell glia (ORG), eller en mellanprodukt progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS SNPs och Orgs kan sedan generera nervceller på sub-ventrikulära, ventrikulär och basala regionerna av cortex, respektive. Därför är celldelning av progenitorer en grundläggande process för att generera nervceller i neocortex.

Ett flertal studier pekar på ett samband mellan specifika mitotiska drag av RGC: er och ödet av dotterceller. Haydar et al. Och Takahashi et al.har visat att RGC mitotiska varaktighet och cellcykel ökad längd som neurogenesis fortskrider, ekade en slutsats i uppföljningsstudier 10-13. Ett antal studier har visat att mitotiska spindeln orientering i förhållande till kammaren påverkar aspekter av neurogenes och corticogenesis, däribland typer av nervceller genereras och placering av avkomma i hjärnan, respektive 3,10,14-16. Oavsett om klyvning plan orientering påverkar direkt cell öde är kontroversiell, men slutsatsen kvarstår att detta mitotiska parameter effekter neurogenes. Vidare understryker vikten av mitos är iakttagelsen att många gener som är involverade i mekaniken i mitos är avgörande för neurogenes och för korrekt hjärnans utveckling 17-20.

Mitos är en dynamisk process, men hittills mest studier som beskriver neurala progenitorceller mitos utnyttja analys av sektioner eller avbildning av neurala stamceller fast vävnad via cellodling in vitro. Således, de traditionella metoder för att utvärdera mitos bara ge en ögonblicksbild av denna process och misslyckas med att avslöja hur celler beter sig i en vävnad. Live avbildning av neurala progenitorceller mitos har allt mer blivit ett viktigt verktyg för att förstå neural progenitor funktion. För exempel hänvisas till dessa referenser 4,8,10,21-25. Flera framstående protokoll har publicerats för förberedelse och avbildning av hjärnan skivor 26,27. Men till dags dato har ett omfattande protokoll för avbildning och analys av mitosen inte beskrivits eller visats i videon.

Denna teknik ger flera viktiga fördelar jämfört med fasta analys av hjärnsektioner. Time-lapse analys av hjärnan skivor möjliggör generering av betydligt fler datapunkter som kan analyseras på ett flexibelt sätt. För det första är data som samlats in vid enskilda tidpunkter under loppet av flera minuter eller flera timmar. Man kan analysera enskilda tidpunkter (för att skapa en statisk montage) ellerkan kombinera olika tidpunkter i filmer. För det andra, konfokal avbildning av skivor gör det möjligt att ta fram uppgifter på olika Z-sektioner i hjärnan skivor. Som ett resultat kan de enskilda sektionerna skall analyseras. Alternativt kan högar av enskilda avsnitt kombineras till en maximal intensitet projektion. För det tredje, är analys görs i samband med en vävnad, avslöjar hur celler delar i förhållande till angränsande celler och strukturer. För det fjärde är den idealisk för analys av mutanter som visar vissa tecken på mitotiska defekter. Tillsammans detta protokoll kommer att bidra till att klargöra viktiga steg för att hjälpa utredarna som vill utföra live-avbildning av neurala progenitorceller mitos i sina egna laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av media (figur 1, steg 1)

  1. Slice Kultur Medium
    1. 25 ml skiva odlingsmedium är tillräcklig för att bereda 5 glas botten rätter med 2 skivor per brunn.
    2. I ett 50 ml koniskt rör, tillsätt 250 | il av en 100x N2 lösning och 500 | il av en 50x B27 lösning utan vitamin A. Lägg DMEM/F12 till en volym av 22,5 ml.
    3. Filtrera sterilisera lösningen och därefter lägga till 1,25 ml värmeinaktiverat hästserum och 1,25 ml fetalt bovint serum.
    4. Inkubera lösning i ett vattenbad vid 37 ° C för varaktigheten av framställningen av skivorna.
    5. Lägg tillväxtfaktorer (FGF-och EGF, slutlig koncentration av 10 ng / ml och 20 ng / ml) omedelbart före början av kulturen. Sammansättningen av detta medium har optimerats för att främja överlevnaden av celler i odling och att öka proliferationshastighet av neurala stamceller. Detta kommer således att maximera sannolikheten för attobservera mitotiska celler i segmentet.
  2. Full HBSS Dissection Lösning
    1. Bered 500 ml komplett HBSS genom tillsats av 50 ml av 10x HBSS, 1,25 ml 1 M Hepes (pH 7,4, FC 2,5 mM), 6 ml av 2,5 M D-glukos (FC 30 mM), 2,2 ml av 0,9 M NaHCO 3 (FC 4 mM) och autoklaveras DIH 2 O till en slutlig volym av 500 ml.
    2. Filtrera sterilisera lösningen och förvara vid 4 ° C fram till insamling av livmoderhornen från gravid mus. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i flera veckor.
    3. Håll HBSS på is under hela dissekering förfarandet.
  3. Inbäddning lösning
    1. För inbäddning av fyra embryonala hjärnor, framställa 30 ml av 3% lågsmältande agaros i komplett HBSS-lösning. I ett 50 ml koniskt rör, tillsätt 0,9 g lågsmältande agaros och fullständig HBSS till 30 ml.
    2. Blanda lösningen med en virvelblandare, och smälta i en mikrovågsugn med röret stående och locket öppet.
    3. Medan i mikron, övervaka lösningen till pRevents spill på grund av alltför kokning. När kokar startar, stoppar mikrovågsugn och skaka lösningen.
    4. Upprepa dessa steg tills alla agarosen har smält.
    5. Förvara röret i ett vattenbad vid 42 ° C.

2. Dissekering av embryon (figur 1, steg 2)

  1. Efter noggrann dödshjälp av den gravida musen, samla livmoderhornen och överföra dem till en 10 cm 2 petriskål med kallt hela 1x HBSS. Åldern av embryot kan variera beroende på studien. Detta protokoll har använts framgångsrikt för odling av hjärnan skivor från embryonala dagar E12.5 till E17.5. På grund av sin storlek, yngre hjärnor tenderar att vara svårare att arbeta med.
  2. Samla embryon och dissekera de embryonala hjärnor som tidigare beskrivits hos råtta och mus 26,27, innan en fullständig embryonal hjärna inklusive bakhjäman och framhjärnan med de två hjärnhalvorna erhålls. Dessa kan varahålls vid RT tills alla hjärnor har dissekeras.
  3. Samla embryon och dissekera de embryonala hjärnor som tidigare beskrivits hos råtta och mus 26,27, innan en fullständig embryonal hjärna inklusive bakhjäman och framhjärnan med de två hjärnhalvorna erhålls. Dessa kan förvaras i rumstemperatur tills alla hjärnor har dissekeras.

3. Inbäddning av de embryonala Hjärnor (Figur 1, steg 3)

  1. I en hink med is, skapa ett hål i isen för att infoga bädda formar in.
  2. Häll på 3% agaros medium i en plastform och placera det mögel i hålet beredd på isen.
  3. Omrör agarosmedium med spetsen på en digital termometer tills temperaturen når 35 ° C.
  4. Omedelbart överföra hjärnan i inbäddningsmediet.
  5. Kritiska steg: För att ta bort överskottet HBSS i gränssnittet mellan hjärnan och agaros, noggrant och försiktigt tumla / rotera hjärnan upprepade gångeri inbäddning lösning med pincett.
  6. En kudde av gelat agaros bildas vid botten av formen i kontakt med isen. När kudden kan kännas med spetsen av tången under omrörning av hjärnan, positionera hjärnan med ryggsidan uppåt. Hjärnan bör inte sjunka till botten av formen.

4. Beredning av Agarose Block (figur 1, steg 4)

  1. Låt agarosen stelna i is under åtminstone 5 min.
  2. Med hjälp av ett rakblad, avsnitt hörnen av formen.
  3. Noggrant rista en agaros blocket runt hjärnan med användning av ett rakblad. Försök att minimera antalet nedskärningar för att undvika att störa den inbäddade hjärnan.
  4. Se till att blocket har en större yta i den kaudala delen av hjärnan (kontra den rostrala regionen, se figur 1, steg 4) för att öka stabiliteten i blocket på sektione piedestal.
  5. Den sista snittet bör vara ett på den kaudala sida av hjärnan;denna minskning kommer att definiera den rätta snittplanet med vibratome.
  6. Gör så genom att rikta in bladet vinkelrätt mot rostro-kaudala axel av hjärnan och agarosen blocket. Skjut ner bladet kaudalt längs rostro-caudal axeln och innan finalen ca 5 mm från den mest kaudala regionen av hjärnan.
  7. Ställ agaros / hjärnblocket åt sidan och upprepa inbäddning av andra hjärnor.

5. Överföring av de inbäddade Brains i facket för Vibratome (figur 1, steg 5)

  1. Tillsätt en droppe lim på botten av vibratome facket. Placera lim så att agarosen blocken kommer att befinna sig inom räckhåll för den vibrerande blad.
  2. Placera agaros / hjärnblocket caudal sidan nedåt på kanten av spateln, med ca 50% av blocket tippar över kanten på spateln.
  3. Applicera den kaudala yta agaros blocket till limmet och skjut spatel bort, upprätthålla agaros blocket till botten av facket med shoulder av en pincett. Låt inte spateln direkt kontakt med limmet.
  4. Låt limmet stelna vid rumstemperatur under 5 min.

6. Sektione av Embedded Brains (figur 1, steg 6)

  1. Fyll vibratome brickan med HBSS.
  2. Definiera start-och slutpositioner vibratome bladet.
  3. Generera 200-250 ìm skivor. Med VT1000s vibratome Använd följande parametrar: hastighet 2-4, frekvens 8.
  4. Ta försiktigt bort skivorna från vibratome när de klipps. Överför skivor med en spatel och den bakre änden av en pincett i 12 brunnar fyllda med full HBSS. Alternativt kan en del forskare har använt en pensel istället för pincett Nyckel punkt:. Under överföringen, se till att hjärnan skivor förblir fäst vid omgivande agaros.

7. Syto11 Färgning av skivor (figur 1, steg 7)

  1. Späd Syto11 till en slutlig koncentration av0,5-1 uM i skiva odlingsmedium kompletterat med tillväxtfaktorer.
  2. I brunn i en 12-brunnsplatta, inkubera skivor från en hjärna i 2,5 ml av färglösningen under 1 h vid 37 ° C.
  3. Tvätta skivorna i 2,5 ml av skiva odlingsmedium utan att färga lösningen under 20 min.

8. Montering av skivor i en Glass Bottom Dish (figur 1, steg 8, 9)

  1. Förbered 15 l av inbäddning kollagenlösning per skiva. Bered en 1,5 mg / ml kollagenlösning genom att blanda 375 | il av 3 mg / ml kollagen typ I-lösning med 75 | il av 10x DMEM, 9,4 | il av 1 M NaOH, och 290 | il av H2O Förvara på is.
  2. Placera en 15 pl droppe av kollagenlösning i botten av en 35 mm Glas Bottnade mikro skålen. Sprid den med en pipett spets för att matcha storleken på skiva.
  3. Överför bit in i nedgången av kollagen med en spatel och pincett Nyckel punkt:. Montering flera segment i skiljer sigent rätter ökar sannolikheten att skaffa skivor lämpliga för avbildning. Screen genom olika skivor och välja de som bäst uppfyller de kriterier som beskrivs nedan i avsnittet "Representativa resultat".
  4. Låt skivorna inkubera vid RT i 10 min före överföringen av dem till en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  5. Efter 20 minuter, tillsätt 1,2 ml av skiva odlingsmedium i Glass Bottom Micro Dish. Lägg till 600 l av medium vid en tidpunkt och sprida den med en pipett.
  6. Fånga en låg förstoring bild av hjärnan skiva för att spela in den anatomiska nivå och integritet för den del.

9. Live avbildning av skivor (figur 1, steg 10, 11)

  1. Låt skivorna återhämta sig i inkubatorn i minst 1 timme och 30 minuter vid 37 ° C med 5% CO2 före live-avbildning.
  2. Bild skivorna med mikroskopet val, med tanke på att Syto11 är mycket benägna att fotoblekning. Här en Inverted spinning disk konfokalmikroskop används (Andor XD revolution snurrande skiva konfokalmikroskop). Alternativt kan en laserskanning konfokalmikroskop kan användas. Följande parametrar är för spinnskivan mikroskop set-up.
  3. Under hela levande avbildning session bibehålla skivorna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubationskammaren fäst vid mikroskopet.
  4. Bild celler med en 60X silikonolja målet med ett arbetsavstånd på 300 nm, och en numerisk bländare på 1,3 (för exempel se figur 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). En 100X oljeobjektiv med ett arbetsavstånd av 130 pm och en numerisk apertur på 1,4 (se till exempel Figur 4C) kan även användas. Upplösningen på kameran är 512 x 512.
  5. Denna bild är cellerna i en 30 ^ m z-stack, med centrum för den z-stack beläget omkring 40 | im under ytan av segmentet. Försöker bilden djupare in i vävnaden kan orsaka målet att läggamekaniskt tryck på skiva. Detta kan påverka integriteten av hjärnan skiva. Om planerar att göra 3D-rekonstruktioner av cellerna, använd en z-intervall på högst 2 nm.
  6. Justera lasereffekten och exponeringstider för att begränsa fotoblekning. Använd exponeringstider mellan 30 och 200 ms, beroende på intensiteten av Syto11 signalen.
  7. Med en motoriserad skede bild flera positioner över flera skivor monterade i 1 skål. Till exempel, bild upp till 20 positioner spridda över 4 olika skivor i 1 enda maträtt.
  8. För levande avbildning, använd en tidsupplösning på mindre än 5 minuter att göra det möjligt att identifiera de olika faserna i mitos. Använda Syto11 och / eller histon H2B-EGFP, 4-5 timmar av levande avbildning är tillräckligt att konstatera ett betydande antal mitotiska celler. Men, sedan en längre avbildning parameter (över natten) är lämpligt om bildbehandling glest märkt mitotiska celler (t.ex. de som uppnås genom i livmodern elektroporering) och arbetar vill.
    OBS: Genom att använda detta protokoll, vi vanligtvis observerar i genomsnitt 10 mitotiska celler per position. Såsom angivits ovan, monterade avbildnings flertal skivor ökar sannolikheten för att ha ett lyckat experiment. Med detta synsätt som vi identifierar vanligtvis mitotiska celler i så gott som alla experiment utförda med Syto11 eller histon H2B-EGFP.

10. Post-förvärv Analys av Mitos (figur 2)

Alla instruktionerna i det här avsnittet har optimerats i Fiji (ImageJ), vilket är fördelaktigt eftersom det är en fri programvara med öppen källkod. Andra mjukvarulösningar finns tillgängliga för att utföra samma uppgifter, såsom metamorfa, Imaris, och Amira.

  1. Identifiering av mitotiska former i Fiji
    1. Efter att ha öppnat dataset för en position som en "Hypers", välj ett z-planet (se figur 2A för placering i rullningslisten) där vävnader och celler ser friska (se kriterier i diskussionsavsnittet).Rulla över tidsdimensionen för att identifiera celler går igenom anafas, eftersom det är det enklaste mitotiska fasen att identifiera.
    2. Rulla tillbaka i tiden för att identifiera den tidpunkt då cellen går in mitosen (DNA kondens). Cellen kan förflytta sig över z-plan, men den temporala upplösningen och z-stack parametrar som beskrivits tidigare har optimerats för att möjliggöra denna process.
    3. I ett kalkylblad, spela in 4D-koordinaterna för cellen i Hypers (X, Y, Z och tid, se figur 2A att visualisera placeringen av dessa siffror i Fiji gränssnitt) när den går in mitos. Att veta dessa koordinater kommer att förhindra att räkna samma cell flera gånger.
    4. Rulla framåt i tiden och registrera den tid när cellen framskrider från en fas till en annan. Dokumentera hur länge varje mitotiska fas för en viss cell.
    5. Fortsätt med andra celler, över hela dataset (flera celler inom och mellan positionerna).
  2. 3D Reconstruction av cellerna och kvantifiering av rotation under Metaphase (Anpassad från Haydar et al, 2003) (Figur 2B).
    1. Efter att ha identifierat flera mitotiska celler, använder koordinaterna för en cell och bläddrar framåt i tiden till början av metafas.
    2. Rotera hela "Hypers" så att kammar gränsen är plan (med hjälp av "Image / Transform / Rotate ..."-kommando). Använd "vinkel" verktyg för att bestämma vinkeln för att ansöka om denna rotation.
    3. Identifiera z-planet där cellen av intresse är den mest synliga. I denna plan, använd "rektangel val" verktyg för att rita ett urval som omfattar hela cellen.
    4. Identifiera de z-plan som innefattar cellen av intresse. Använd "Bild / Duplicera" för att skapa en "sub-stack". I dialogrutan, lämna "Duplicera Hypers" kontrolleras. Den "Skivor (z)" parameter motsvarar z-plan inklusive hela cell, och de "Frames (t)" parameter motsvarar den aktuella tidpunkten.
    5. Om upplösningen är dålig, öka storleken på den "sub-stack" med hjälp av "Image / Adjust / storlek ..." kommandot.
    6. Skapa en 3D rekonstruktion av cellen vid aktuell tidpunkt med hjälp av "Image/Stacks/3D projektet ..." kommandot. De parametrar för detta kommando visas i figur 2B. Den "Segment avståndet" motsvarar intervallet mellan var och en av z-planet bilder (mikrometer). Viktigt: se till att den fysiska dimensionen (um) av sub-stacken har bevarats. Om inte, kommer interpolationen av pixlarna i z-dimensionen vara inkorrekt och 3D-rekonstruktion kommer att vara felaktig.
    7. Med hjälp av rullningslisten, rotera den resulterande 3D-rekonstruktion, så att kanten på metafas plattan är synlig. Antalet ramen motsvarar beta vinkeln som beskrivs i figur 3B, antecknar detta nummer. Användaden "vinkel" verktyget och "Analyze / Mät ..." kommandot, mäta vinkeln mellan horisontalplanet och en linje som skär metafas plattan vinkelrätt (Figur 2B). Detta är vinkeln alfa.
    8. Anteckna dessa vinklar för alla metafas tidpunkter hos cellen av intresse. Rotationsvinkeln mellan tidpunkter (t) och (t-1) är lika med absolutvärdet av skillnaden mellan en vinkel på (t), och denna vinkel (t-1).
  3. Att mäta Orientering av Cleavage Plane
    1. 3D rekonstruera en cell av intresse vid en tidpunkt under anafas följa anvisningarna för 3D-rekonstruktion av metafas plattor.
    2. Rotera uppbyggnaden tills kanterna på de två plattorna som bildas av de segregerande kromosomer är synliga.
    3. Använd vinkelverktyg för att mäta vinkeln mellan horisontalplanet (kammar kanten) och en linje parallell med de två plattorna som bildas av de segregerande kromosomer. Detta är vinkeln av klyvningsplanet (figur 2C).
  4. Generation av filmer
    1. Eftersom cellerna rör sig ofta mellan olika z-plan, identifiera z-plan upptas av cellen under live-avbildning session. Generera en "Maximal intensitet projektion" av dessa z-plan med hjälp av "Bild / Stacks / Z projekt ..." kommandot. Spara den resulterande stacken som en "TIF." Filen.
    2. Öppna filen i 1,45 versionen av ImageJ som Fiji inkluderar inte en stabil plugin för generering av ". Mov" eller ". Avi" filer.
    3. Använd "Arkiv / Spara som / ..." kommando i ImageJ för att skapa en film i ett format som är kompatibelt med din nedströms applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgången för denna analys och observation av flera mitotiska celler under en live-avbildning session beror till stor del på både integritet och anatomiska nivå för den del där förvärv görs. Såsom diskuteras nedan är det anatomiska nivån på en skiva en viktig faktor. Figur 3A visar rostro-kaudala och mediala-laterala platser där vi har varit mest framgångsrika. För ytterligare diskussion om detta ämne, se Noctor 26. Integriteten av den del kan variera i olika regioner av segmentet. Detta kan bestämmas före början av tidsförlopp (med användning av avbildning av hela segmentet som i steg 7,6). I ett bra område för en E13.5 hjärnan kan göras följande iakttagelser: många mitotiska celler kommer att hittas vid ventrikeln gränsen, interfaskärnorna kommer att formas elliptiska snarare än runda, och interfaskärnor visas kolumn relativt ventrikeln gränsen . I ett mindre önskvärt region av hjärnan, denkärnor kommer att se rundad och något oorganiserat (Jämför figurerna 3B och 3C, och se Figur 3D för en bild av en väl monterad skiva).

Vid ideala förhållanden uppnås, kommer denna analys möjliggöra kvalitativ identifiering av olika faser i mitos. Dessa kan detekteras genom analys av DNA-mönster (se figur 3E för exempel på apikalt delande celler i varje fas av mitos). Under profas, kommer DNA kondens ha utseendet av glest märkt DNA (DNA-rika och DNA-fattiga regioner i kärnan). Under metafas, kromosomerna bildar ett plan på ekvatorn av cellkroppen. Beroende på orienteringen av det plan som är DNA-mönstret antingen (i) en tjock linje (figur 3E, vy 1) eller (ii) en "rosett" med en DNA-fattig region i mitten (figur 3E, beskåda 2) . Under anafas när kromosomer separat, de ser ut som "händer"; som vandrar i motsatt riktning. Denna fas kan vara svårt att identifiera när klyvningsplanet i X - Y-planet för förvärvet. Under telofas, slappnar av DNA och förvärvar en ellipsoid form som kärnreformer kuvert. Individuell tidpunkter kan samlas för att visualisera mitos över tiden (se figur 3F).

Förutom avbildning mitos av apikalt delande stamceller, kan denna analys användas för att bilden basalt delande celler, såsom Orgs eller INPS, är den senare som med största sannolikhet visas i figur 3G. Sådana celler kan identifieras genom sin plats för delning i SVZ skiktet. Men för att verkligen markera dessa celler är det bäst att par analysen med expression av en fluorescerande markör som märker cellprocessen eller ödet (se figurerna 4B-D). INPS kommer varken att ha en apikal eller basala processen kommer Orgs har en basal process med deras cellkroppen som ligger i de yttre skikten, och RGC kommer att ha en basal process med sin cellkropp som ligger i VZ lagret.

Mitos av stamceller kan visualiseras med alternativa metoder. Figur 4A visar användning av histon H2B-EGFP transgen mus att märka kromosomer alla delande celler. Detta markerar celler i ett mönster som liknar Syto11. Figur 4B visar avbildning utfördes med hjärnor in utero electroporated med EGFP-α-tubulin och histon H2B-mCherry. Som framgår, möjliggör detta en att visualisera både mikrotubuli och kromosom, och dessutom cellkroppen och basala processen. Figur 4C avbildar avbilda utförs med hjärnor från en Centrin-EGFP mus, i livmodern elektro med mCherry-a-tubulin och histon H2B-EGFP . Som visat, gör detta till bild kromosomer och centrioler i den gröna kanalen och den mitotiska spindeln och cellkroppen / process i den röda kanalen. Figur 4D avbildar avbilda utförs med hjärnanar i livmodern elektroporerade med CMV-Cre glest och CALNL-EGFP 28. Denna teknik möjliggör en att glest etikett delande gångare, vilket gör analys av enskilda celler som delar sig lättare. Vid användning av elektroporation dock hålla i minnet att denna metod riktar en relativt synkroniserad kohort av cykelceller 2,12. Detta innebär att tidpunkten för live-avbildning relativt elektroporation behöver justeras, så att den kohort elektroporerade celler närmar mitos i början av avbildning session. Om inte, kan framgången för försöket att identifiera eventuella mitotiska celler äventyras på kort sikt avbildning session.

Vid ideala förhållanden uppnås, kan viktiga funktioner i mitos mätas kvantitativt inklusive övergripande mitos varaktighet, längd enskilda faserna, rotation av metaplanet och klyvning plan orientering. I de beskrivna förhållanden, har vi observerat en genomsnittlig total mitotiska varaktighet 1 timme30 min på embryonala dag (E) 13.5 och 14.5. Som beskrivits tidigare, kan rotationen av metafas DNA planet mätas vid en enskild tidpunkt eller kumulativt under den tid en hel metafas 2,6,9,10. Detta kan uppnås genom att använda 3D-rekonstruktion av metafas-planet av en cell vid varje tidpunkt och vinkelmätning av DNA i förhållande till ventrikeln. Vi har framgångsrikt tillämpat metoden i denna uppsats att följa celler i minst 3 timmar.

Figur 1
Figur 1. Schematisk bild av steg i protokollet. Tid som behövs för varje steg som anges under varje steg. Detaljer för vart och ett av dessa steg beskrivs i avsnittet "protokollet". Observera att steg 7 kan kringgås när avbildning skivor från histen H2B-EGFP embryon, eller skivor från hjärnor som elektroporerade med plasmider som uttrycker markörer för mitos.

Figur 2
Figur 2. Efter förvärvsanalys av tidsförlopp video mikroskopi dataset i Fiji (ImageJ). A) Placering av de olika verktyg som används för analysen i Fiji. B) Olika steg som ingår i 3D-rekonstruktion av en cell i metafas. Detaljer för vart och ett av dessa steg beskrivs i avsnittet "protokollet". C) Mätning av klyvning plan orientering i en 3D-rekonstruerade cell vid anafas. Observera att siffrorna i B Steg 6 och C visar den sekvens som följs för att mäta vinkeln. D) Representativa data som visar Fördeln av metafas varaktighet i en grupp av mitotiska celler observeras vid kammar gränsen i E13.5 hjärnan skivor (n = 35). E) Representativa data som visar den kumulativa rotation metafas plattor i E13.5 mitotiska celler vid gränsen av ventrikeln . Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Exempel på representativa uppgifter från levande avbildning analys. A) Längs den dorso-ventrala axeln, är mitos lättast avbildas i dorsala regioner i hjärnan skivor, eftersom den basala processen för RGC är kortare och därmed mindre sannolikt att skäras av vibratome. Längs rostro-caudal axeln, skivor i caudal regioner i rygg cortex germest konsekventa resultat i våra händer. B och C) Exempel visas av ett gott område (B) och en dålig området (C) för avbildning. I ett bra område, är kärnor elliptiskt formade (inringade områden) och många mitotiska celler observeras vid gränsen av ventrikeln innan time-lapse avbildning (pilar). I en dålig region, är mycket få mitotiska celler observeras vid gränsen av ventrikeln (enda pil) och kärnor är runda (inringade områden) D) Exempel på en bra bit observeras med en låg förstoring mikroskop före realtidsundersökningen.. E) Exempel på Syto11 märkta celler i olika faser av mitos, som nämnts F) Montage av ett område vid gränsen till ventrikeln där två neurala stamceller går igenom olika faser av mitos, markerade i olika färger (tid, hh:. mm). G) Montage av en region markerad i (B), där en neural progenitor delar in från kammar gränsen. I montage (D) och (E), cells var pseudo färgade med hjälp av Photoshop för att markera de olika mitotiska faser. (Skala barer: B, C, F: 10 | im och D: 1 mm, E, G: 5 ^ m).

Figur 4
Figur 4. Exempel på alternativa verktyg för att visualisera mitos av neurala stamceller. A) Montage av ett område vid gränsen till ventrikeln i en hjärna skiva från en histon H2B-EGFP transgena embryon vid E13.5. En stamfader observeras medan det går igenom de olika faserna av mitos. B) Montage av en VZ vid E14.5 i den del av en hjärna som var elektro vid E13.5 med vektorer som uttrycker EGFP-a-tubulin och H2B-mCherry. EGFP-a-tubulin möjliggör visualisering av mikrotubuli dynamik under mitos (B 1-B 2) C) Montage av en kammar region i enn E15.5 hjärnan från en Centrin-EGFP transgena embryot som elektro vid E14.5 med plasmider som uttrycker mCherry-a-tubulin och H2B-EGFP. Centrin-EGFP möjliggör visualisering av centrioler dynamik under mitos (C1 och C2). D) Montage av en region som visar IZ av en E14.5 hjärnan skiva där cellerna glest märkt av elektroporation vid E13.5 med en låg Koncentrationen av en plasmid som uttrycker Cre och en standardkoncentration av en plasmid som uttrycker EGFP efter Cre-rekombination 28. Den dividera cell i detta montage har morfologin hos en RGosvz med en lång basala process (rosa pilar) och ingen apikala processen 9. Målet som används för live-avbildning av (A) och (B) exempel är en 60X silikonolja mål, 100X olja mål till exempel (C), och 10X luft målet exempelvis D. tidsupplösning som används för att avbilda den (A) , (B), (C) och (D) exempel var 4 min, 4 min, 30 sek och 5 min, respektive. VZ: Ventricular Zen, IZ: mellanliggande zon, RGosvz: yttre subventrikulära zonen radiella glia-liknande celler. (Skala barer: A: 15 pm, B, C, D: 5 pm, C 1, C 2: 2,5 mikrometer) Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den stora fördelen med det protokoll som vi har beskrivit är att den tillhandahåller en dynamisk tidsupplösning av mitos av neurala stamceller. Normalt är analyser för att visualisera mitos i den växande hjärnan utförs med hjälp av immunofluorescens sektioner fast vävnad. Men denna metod ger endast en ögonblicksbild av mitos vid en tidpunkt.

Det finns flera steg som är mest kritiska för avbildning mitos i hjärnan skivor: 1) De hjärnan skivor bör sitta kvar i agaros, för att bevara integriteten i hjärnan sektioner under överföringen och montering. 2) För generering och avbildning av skivor, är viktig kontroll av rostro-caudal nivåer. Stjärthjärnskivor är vanligtvis bäst, eftersom det i dessa segment, kommer de basala processer i RGC hållas intakta, som är hälsosammare för cellerna. 3) För levande avbildning, är bäst för både hög upplösning användning av en konfokala spinning-disk mikroskop med en 60X mål och för att undvika fotoblekning av spel, som kan uppstå med Syto11 färgämne. 4) För levande avbildning, temporala parametrar för förvärvet är kritiska. Beroende på mikroskoputrustning som används kan tidsförlopp utföras i intervallet från varje min till varje 10 min. Större än 10 minuter är typiskt för lång för att uppnå hög upplösning dynamiken i mitos.

Detta protokoll har vissa begränsningar. Experimentet utförs med ex vivo vävnad. Det är tänkbart att observationer gjorda i hjärnan skivor skulle kunna vara annorlunda in vivo. Därför, när du gör jämförelser bland experiment som utförs på olika dagar eller med hjälp av olika prover, följande parametrar ska hållas konstant: användning av liknande rostro-stjärtfenan och dorso-laterala nivåer, innehållet i media, användning av mikroskop och förvärvsparametrar. Dessutom är det möjligt fototoxicitet med långvarig avbildning. Därför flera experiment bör utföras innan slutsatser. Dessutom Syto11 själv kunde potentially påverka mitotiska händelser, särskilt i en mutant bakgrund. Därför rekommenderas att när man gör slutsatser om mitos baserad på Syto11, de också bekräftar resultaten med hjälp av oberoende analyser, såsom markörer som beskrivs i Figur 4.

Som beskrivs i protokollet, kan mitos avbildas efter märkning kromosomer och cytoskelettet på olika sätt. Andra Syto färgämnen kan användas för att visualisera mitos i andra fluorescenskanaler. I stället för att använda Syto11 färgning för att visualisera DNA: t, kan segment genereras från fluorescerande transgena linjerna. Till exempel, såsom visat, histon H2B-EGFP transgena linjer kan användas 29. Användning av histon H2B-EGFP är särskilt användbart och rekommenderas för att bekräfta varje fenotyp observerats med Syto11 behandling. Dessutom kan det också vara bra för att övervinna utmaningar i samband med fotoblekning med Syto11. Användning av andra transgena linjer, till exempel centrin-EGFP 30, kananvändas för att visualisera centrioler, komponenterna i centrosomes. Även om dessa i sig inte skulle räcka för att visualisera mitos, de fungerar bra i kombination med andra markörer av kromosomer eller mikrotubuli. Sådana markörer kan införas genom i livmodern elektroporering 4,5,10,31,32. Såsom demonstreras, kan expression av fusionsproteiner en dag före dissektion vara användbart för detta tillvägagångssätt. I vår erfarenhet, uttrycker konstruktioner under CAG promotor kan ofta ge robust uttryck inom en dag. Till exempel införde vi α-tubulin och histon H2B-EGFP i embryonala hjärnor med hjälp av denna metod.

När denna teknik är behärskar det finns ytterligare modifieringar som kan göras för framtida experiment. In utero elektroporering kan även användas för att manipulera genuttrycket. Till exempel kan införandet av shRNA eller cDNA vara lämpligt att fastställa konsekvenserna av förlust-av-funktion eller överuttryck av en gen av intresse vid neural progenitor mitos 33. Dessutom kan skivor behandlas med kemiska droger eller små molekyler för att mäta effekten av att hämma signalvägar eller molekyler vid mitos 34,35.

I vår procedur beskriver vi imaging utförs med hjälp av en snurrande skiva konfokala. Den stora fördelen med en snurrande skiva konfokalmikroskop är hastigheten på förvärvet. Detta möjliggör avbildning av flera positioner från olika hjärnan skivor i en live-avbildning session med en hög tidsupplösning, och en rimlig bildkvalitet. Andra inställningar såsom en multi-foton laserskanning konfokalmikroskop ger dessa företag möjlighet att förvärva bilder av hög kvalitet djupt in i vävnaden, där de radiella gliaceller är mindre benägna att vara avskurna vid nivån för den basala processen. Detta kommer därför att öka sannolikheten att bilden friska neurala stamceller. Men detta är vanligtvis förknippas med en uppoffring av hastigheten på förvärvet. Detta i sin tur kommer att begränsa numBER på positioner som kan avbildas under en levande bildsession, samt den tidsmässiga upplösningen. Imaging av mitos kan också utföras på ett brett fält mikroskop. Men i detta fall är det bäst att bild glest märkta celler, till skillnad från Histon H2B-EGFP eller Syto11, som ljusstyrkan i dessa reagenser skulle göra bildbehandling mycket svårare. Också, det protokoll som beskrivs här använder ett inverterat mikroskop. De främsta fördelarna med ett inverterat mikroskop är möjligheten att använda mål högupplösta olja och den fria rörligheten när mikroskopet kopplas med en motoriserad scen. Som en slutsats, måste försöksledaren att hitta en balans mellan de fördelar och nackdelar med en viss uppsättning och syftet med ett experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering från NINDS / NIH, R00-NS064197 och NINDS / NIH, R01NS083897 (både till DLS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Tags

Neurovetenskap mitos radiella gliaceller utveckling av cortex neurala stamceller hjärna skiva Bildproduktion
Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live… More

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter