Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

Published: June 20, 2014 doi: 10.3791/51299
Automatic Translation
1, 1
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

Summary

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

Abstract

Peptidomimetics הם מקורות של ligands החלבון גדולים. טבע oligomeric של תרכובות אלו מאפשר לנו לגשת לספריות סינתטיות גדולות בשלב מוצק באמצעות כימיה קומבינטורית. אחד השיעורים הכי למדו היטב של peptidomimetics הוא peptoids. Peptoids קל לסנתז והוכח להיות proteolysis עמיד ותא חדיר. במהלך העשור האחרון, זוהה רבים ligands חלבון שימושי באמצעות הקרנה של ספריות peptoid. עם זאת, רוב ligands זיהה מספריות peptoid לא להציג זיקה גבוהה, עם יוצאים מן הכלל נדיר. זה עשוי להיות בשל, בין שאר, לחוסר מרכזי כיראליות ואילוצי קונפורמציה במולקולות peptoid. לאחרונה, תאר את המסלול סינטטי חדש לגישה אורגנית חיבור פפטיד שיישונים (PTAs). PTAs הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. עם שרשרות צד שני α-פחמן ואטומי חנקן השרשרת ראשיים,קונפורמציה של מולקולות אלה מוגבלים מאוד על ידי מכשלה sterical ומתח 1,3 allylic. (איור 1) המחקר שלנו מצביע על כך שמולקולות ועד ההורים אלה מובנים מאוד בפתרון וניתן להשתמש בם כדי לזהות ligands חלבון. אנו מאמינים כי מולקולות אלה יכולות להיות מקור עתיד של ligands חלבון גבוה זיקה. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את הכוח של שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז מדגם ספרייה אחת חרוז אחד מתחם (OBOC) של PTAs.

Introduction

Peptidomimetics הם תרכובות המחקות את המבנה של הפפטידים טבעיים. הם נועדו לשמר את הפעילות הביולוגית תוך התגברות על חלק מהבעיות הקשורות פפטידים טבעיים, כוללים חדירות תא ויציבות נגד proteolysis 1-3. בשל אופי oligomeric של תרכובות אלה, ניתן לגשת אל ספריות סינתטיות גדולות בקלות דרך מסלולים סינטטיים monomeric או תת monomeric 4-7. אחד השיעורים למדו רוב peptidomimetics הוא peptoids. Peptoids הוא oligomers של glycines N-alkylated שיכול להיות מסונתז בקלות באמצעות אסטרטגיה תת מונומר 8, 9. ligands חלבון שימושי רבים זוהה בהצלחה מהקרנת ספריות peptoid הסינתטי גדולות נגד מטרות חלבון 1, 10-14. יחד עם זאת, "להיטים" זיהו מספריות peptoid רק לעתים נדירות בארכיון זיקה גבוהה מאוד לעבר מטרות חלבון 1,10-14,22. ma אחדאימונים עם גור הבדל בין peptoids ופפטידים טבעיים הוא שרוב peptoids חוסר היכולת ליצור מבנה משני בשל חוסר מרכזי כיראליות ואילוצי קונפורמציה באופן כללי. על מנת לפתור בעיה זו, אסטרטגיות מרובות פותחו בעשור האחרון, תוך התמקדות במידה רבה בשינוי של רשתות בצד הכלולות באטומי חנקן השרשרת העיקריים 15-22. לאחרונה, פיתחנו מסלול סינטטי חדש להציג את הרשתות בצד חומצת אמינו טבעיות על גבי עמוד השדרה peptoid ליצור אורגני חיבור שלישוני פפטיד 23.

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא משפחת העל של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים (R 2 = H), peptoids (R 1 = H) ופפטידים מפוגלים-N (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . (ראה איור 1) המסלול הסינטטי מעסיק באופן טבעי חומצות אמינו כמקור של רשתות כירליות ולוואי על45; פחמן, ואמינים ראשוניים זמינים מסחרי כדי לספק N-החלפות. לכן, ניתן לחקור שטח כימי גדול יותר מזה של פפטידים פשוטים, peptoids או פפטידים מפוגלים-N. ספקטרום dichroism חוזר הראו כי מולקולות ועד ההורים הן מובנים מאוד בפתרון. אפיונו של אחד מהמתחמים ועד ההורים החלבון ניתן לראות בבירור כי האילוצים קונפורמציה של ועד ההורים נדרשים לכריכה. לאחרונה, יש לנו גם גילינו שחלק מהמולקולות ועד ההורים בעלי חדירות תא השתפרו מאשר עמיתי peptoid ופפטיד. אנו מאמינים כי הספריות ועד ההורים האלה יכולים להיות מקור טוב של ligands גבוה זיקה למטרות חלבון. במאמר זה, נדון בסינתזה של מדגם ספרייה עד הורים חד מתחם (OBOC) חד חרוז בפרטים יחד עם כמה תנאים משופרים לצימוד והמחשוף של תרכובות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יסודות של סינתזה הפיצול וברכה

על מנת ליצור מספר רב של תרכובות בשלב מוצק ביעילות, סינתזה מפוצלת וברכה היא מועסק לעתים קרובות כאסטרטגיה כללית. כפי שניתן לראות בתרשים 4, tentagel חרוזים הם פיצול ראשון לשלושה חלקים. כל חלק הגיב במגיב שונה, שהניבו את השאריות הראשונות בחרוזים. לאחר התגובה הראשונה, כל שלוש המנות הם אספו יחד, מעורבבים, ולפצל ואז שוב לשלושה חלקים. כל מנה שוב תגיב עם מגיב שונה, שהניבו את השאריות השניה בחרוזים. אחרי שני צעדים מפוצלים וברכה, תשע תרכובות נוצרות.

בסינתזה תת מונומר, חרוזים מתחלקים לכמה חלקים ראשון להגיב עם חומצות bromo שונות בנוכחות של מגיב צימוד. לאחר שטיפה עם ממס, כל חרוזים יהיו אספו יחד ומעורב, ולאחר מכן חילקו שוב לכמה חלקים כדי להגיב עם שונהאמינים ראשוניים. לאחר amination, כל חרוזים הם אספו יחד ושטפו ביסודיות, שסיימו את מונומר מלא על כל חרוז. ניתן לחזור על תהליך זה עד שהוא הגיע גיוון רצוי.

2. הכנת חומצה ברומיד מטבעית חומצות אמינו

בסינתזה תת מונומר, הסינתזה של כל מונומר מחולקת לשני שלבים נפרדים: 1. צימוד במתיל החומצה ו2 amination עם אמינים ראשוניים (איור 2).. כדי לסנתז אמיד שיישוני פפטיד, קלישאות חומצת כיראליות עם שרשרות צד על פחמן אלפא יהיו מוכנות מחומצות אמינו טבעיות. כאן אנו מתארים את השיטה של ​​הפיכת חומצת אמינו טבעית למתיל בחומצה להתכתב עם נאמנות הגבוהה סטריאו. אנו משתמשים אלנין כדוגמא; חומצות אמינו אחרות, כולל סרין, תראונין, חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית, asparagine, גלוטמין, גליצין, ולין, isoleucine, פנילאלנין יכול גם להפוך לחומצות bromo תחת conditio הדומהNS. שים לב שחלק מחומצות אמינו עם קבוצות פונקציונליות כמו פנול, guanidine ואמין צריך להיות מוגן לפני השינוי. הגדרת התגובה מוצגת באיור 3.

בטיחות זהירות: לתגובות הבאות מעורבים HBr, ננו 2 וכימיקלים קורוזיביים אחרים / רעילים, ציוד בטיחות נאות כמו משקפי בטיחות, מעבדה מעיל, כפפות כימיות עמידות יש צורך. יש לבצע את כל התגובות במנדף ידי כימאי מנוסה.

  1. הוספת 370 מיליליטר מים לתוך 630 מיליליטר 48% פתרון HBr כדי להכין 1 ליטר, פתרון HBr 30%. הוסף 500 גליקול מיליליטר אתילן לתוך מיכל אמבט 1 ליטר; להוסיף קרח יבש כדי לשמור על הטמפרטורה ב-10 ° C. זהירות: 48% פתרון HBr הוא מאוד חומצי ומאכל, להתמודד עם טיפול. קראו MSDS לפני השימוש.
  2. הוספת D-אלאנין (8.9 גרם, 0.1 mol) וKBR (ז 11.9, 0.1 mol) למיליליטר בקבוק 250 שלושה צוואר עגול תחתון עם בר מערבבים מגנטי. הוספת 100 מיליליטר, וHBr 30% ערוכים tשלב קודם לו. שים את הבקבוק באמבטיה אתילן גליקול מוכן בשלב 2.1 ולשמור על הטמפרטורה ב-10 ° C. ארגון בועה באמצעות מחט ארוכה מהחלק התחתון של הבקבוק עבור 10 דקות כפי שמוצגת באיור 3. מערבבים את הפתרון עם בר מערבבים המגנטי ב300 סל"ד.
  3. ממיסים Nano 2 (ז 8.28, 0.12 mol) בכוס 100 מיליליטר עם 20 מיליליטר מים. להוסיף את הפתרון ללחץ השוואת משפך יורד ולאטום את המשפך יורד עם מחצה. להפוך לאט לאט על השסתום של משפך ההטלה ולתת פתרון Nano 2 טיפה לתוך הבקבוק. לשלוט בשסתום להתאים את קצב הטפטוף של כ 2 טיפות לשנייה. שמור ערבוב ב300 סל"ד ולשמור על הארגון מבעבע מהחלק התחתון של הבקבוק. הבקבוק צריך להיות כל הזמן באמבטיה אתילן גליקול ב-10 ° C עד שכל ננו 2 הוא הוסיף. זהירות: בשלב זה יוצר חום וגז בתוספת של ננו 2 פתרון. שיעור נוטף צריך להיות בזהירות קוןמבוקר ואת המערכת כולה צריכה להיות פתוחה דרך שקע הארגון.
  4. שמור ערבוב במשך 3 שעות יותר ולתת לטמפרטורה להתחמם מ-10 ° C לטמפרטורת חדר. הפתרון שהתקבל צריך להיות ברור לצהוב בהיר; אם הצבע כהה מדי, להחיל ואקום כדי להסיר את תחמוצות חנקן העודפות וBr האפשרי 2 שנוצר במהלך התגובה.
  5. חלץ את המוצר מהפתרון עם 3x 35 מיליליטר אתר diethyl באמצעות משפך לחילוץ. מערבבים את השלב האורגני ולשטוף אותו עם מלח רווי. השלב האורגני גם ניתן לכבס עם כמות קטנה של NaHCO 3 לפני הכביסה עם מלח כדי להסיר את הצבע אם הוא כהה. ייבש את השלב האורגני על Na 2 SO 4 ל -6 שעות.
  6. לסנן את Na 2 SO 4 ולהתאדות הממס תחת ואקום, יש לקבל מוצר גולמי כברור לחיוורים שמן צהוב. מוצר גולמי יכול להיות מטוהר נוסף על ידי זיקוק ב115 ° C, 3 מ"מ כספית, או על ידיעמודת סיליקה עם 03:01 הקסאן: אתיל אצטט.
  7. מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, 6.6 g (להניב 74%), צפיפות = 1.69 גר '/ מיליליטר, [α] D20 = +24 ° (מתנול), 1 H NMR (400 MHz, CdCl 3) δ 4.41 (q, J = 7.0 הרץ, 1H), 1.86 (ד, י = 7.0 הרץ, 3H). במקרה של (S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4 (שהוכן מד 4-L-אלאנין), מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, תניב 78%, צפיפות = 1.72 גר '/ מיליליטר, [α] = D20 -19 ° (מתנול). 1 H NMR, אין אות H משמעותית הוא ציין. ESI-MS - [M-1] - = 155.1 (צפויים 154.97). ל( S)--4-2-bromo methylpentanoic חומצה (שהוכנה מL-לאוצין באותו האופן) מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, יניב 89%, [α] D20 = +37 ° (מתנול), 1 H תמ"ג (MHz 400, CdCl 3) δ 4.30 (t, J = 7.7 הרץ, 1H), 1.94 (dd, J = 10.8, 3.9 הרץ, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 הרץ, 1H), 0.96 (Dd, J = 18.2, 6.6 הרץ, 7H). במקרה של (S)-2-bromo-3-pheחומצת nylpropanoic (שהוכן מL-פנילאלנין באותו האופן) מוצר טהור מתקבל כשמן צהוב בהיר, תניב 72%, [α] D20 = +17 ° (מתנול), 1 H NMR (MHz 400, CdCl 3) δ 7.38 - 7.19 (מ ', 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 הרץ, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 הרץ, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 הרץ, 1H).

3. תיוג איזוטופי של אלאנין שימוש טרנסאמינזות

בסינתזת ספרייה קומבינטורית, במיוחד בסינתזה מפוצלת והברכה של אחד מתחם ספריות חד חרוז (OBOC), בסכום של מתחם שניתן להשיג מכל חרוז הוא יחסית קטן. (בדרך כלל 1 pmol ל10 nmol). בנוסף, ספקטרומטריית מסה נעשתה שימוש נרחב לזיהוי והאפיון של המתחם הסופי בשל הרגישות הגבוהה שלה. על מנת להשתמש בספקטרומטריית מסה כדי לקבוע סטריאוכימיה המוחלטת במרכזי כיראליות של מוצרים ועד ההורים הסופיים, האננטיומרים חומצת bromo צריכים להיות isotoכותרת pically לפני השימוש. כאן אנו מתארים את השיטה של שימוש טרנסאמינזות ו-D 2 O ל-L-אלאנין תווית.

  1. ממיסים (300 מ"ג, 3.36 מילימול) L-אלאנין עם 10 מיליליטר של D 2 O בצינור פוליאתילן 50 מיליליטר. הוספת α-ketoglutarate (10 מ"ג, 0.068 מילימול) כמו שיתוף מצע. לחמם את הצינור ל37 מעלות צלזיוס ולהתאים את פ"ד ל8.5-8.7 באמצעות soution 1 M NaOD. הערה: PD נקבע על ידי רצועות בדיקת ה-pH. מד pH אלקטרו מסורתי מצויד באלקטרודת זכוכית סלקטיבית לH + עשויה לתת שגוי הקריא ל+ D.
  2. הוספת טרנסאמינזות אלאנין (0.1 מ"ג, EC 2.6.1.2 מלב חזיר, אבחון רוש, אינדיאנפוליס, אינדיאנה) ל8.5 PD - 8.7, 37 פתרון C ° הוכן מהשלב קודם. שים את הצינור ב37 מעלות צלזיוס חממת דגירה אותו הלילה עם רעד קל, 10-30 סל"ד הוא מועדף.
  3. לאחר דגירה הלילה, לקחת 0.5 מיליליטר של הפתרון O D 2 ולבדוק את התקדמות התגובה על ידי 1 H-NMR. כל האותות של הפרוטוןlanine, δ 3.76 (Q, J = 7.2 הרץ, 1H), 1.46 (ד, י = 7.3 הרץ, 3H), 1 MHz H NMR 400, צריך להיות מדוכא מאוד עקב deuteration. יותר מ 98% מהפרוטון צריכים להיות מוחלפים לדאוטריום כפי שתוארו לעיל 23. הערה: D 2 O ניתן לשחזר באופן חלקי על ידי זיקוק אם התגובה מתבצעת בקנה מידה גדולה (> 200 מיליליטר D 2 O). בדרך כלל, 60% 80% D 2 O ניתן לזקק מהפתרון.
  4. להקפיא את הפתרון לעיל עם חנקן נוזלי וLyophilize באמצעות lyophilizer להשיג אבקת L-אלאנין deuterated לבן.

4. סינתזה של Peptoid לינקר אזור

אזור מקשר אינו נדרש לסינתזת ספרייה ועד הורים. עם זאת, על מנת להימנע מהרקע הגבוה בטווח הנמוך המשקל המולקולרי (100-600) של ספקטרוסקופית מסת MALDI ולשפר את היינון של התרכובות, משמש מקשר peptoid עם שאריות קוטב מרובות לעתים קרובות. זה peptoid ליןיכול להיות מסונתז משתכשך דרך הליך סינתזת peptoid סטנדרטי. כאן אנו לסנתז pentamer של גליצין N-methoxyethyl כמקשר (כפי שמוצג באיור 5).

  1. להתנפח 90 מיקרומטר חרוזים Tentagel עם מקשר זיכרון RAM (1 גרם, 0.27 מילימול / גר ') ב10 מיליליטר DMF לשעה 3 בכור מזרק מיליליטר 12 עם רעד קל.
  2. מסננים את DMF מהכור ולהוסיף 10 מיליליטר 20% פתרון DMF piperidine לdeprotect קבוצת Fmoc מהמקשר אמיד רינק. לנער את החרוזים עם 20% פתרון piperidine ל30 דקות. לשטוף עם DMF 5x כדי להסיר את כל piperidine.
  3. קח כמה חרוזים מ המזרק ולבדוק את זה עם מבחן chloranil. חרוזים צריכים לפנות בצבע חום כהה (מבחן chloranil חיובי עבור אמין ראשוני) אם Fmoc הוא deprotected בהצלחה.
  4. הכן את הפתרונות הבאים: 1. 20 מיליליטר, תמיסת החומצה / DMF bromoacetic 2 מ '; 2 20 מיליליטר, פתרון 2 M דסק"ש / DMF.; 3. 10 מיליליטר, 1 M methoxylethylamine / פתרון DMF.
  5. הוסף 5 מיליליטר של 2 פתרון M bromoacetic חומצה / DMF לחרוזים, ללחוץ בעדינות. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של 2 פתרון M דסק"ש / DMF לחרוזים; לאטום את המזרק עם הבוכנה ולשים אותו על שייקר. Shake 10 דקות.
  6. שטוף את החרוזים עם DMF ביסודיות. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת 1 M methoxyethylamine / DMF הוכן מצעד 4.4 לחרוזים. חותם את המזרק עם הבוכנה ולנער אותו על שייקר ל30 דקות.
  7. שטוף את החרוזים עם DMF 5x. בדוק כמה חרוזים עם מבחן chloranil, אם חיוביים (חרוזים להכחיל), ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. אחרת, חזור על שלב 4.6.
  8. חזור על שלבים 4.5-4.7, 4x כדי להשלים את pentamer.

. 5 סינתזה פיצול וברכה של ספרייה ועד הורים עם (R) - ו( S)-2-bromopropionic חומצות

כאן אנו מתארים את הסינתזה של ספרייה ועד הורים קטנים עם מגוון תיאורטי של 9261 תרכובות באמצעות 1 גרם של חרוזים מצעד 4.8. שים לב שחרוז tentagel 90 מיקרומטר מכיל כ 2.9 מיליון חרוזים לגרם; לכן היתירות שלהספרייה תהיה 2.9 x 10 6/9261 = 312 עותקים. אנו נשתמש בחומצת bromoacetic, (R)-2-bromopropanoic ואיזוטופי שכותרתו (S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4 כחומצות, ו7 אמינים שונים (A1 ~ A7, ראו איור 5 לפרטים נוספים) לamination. כורי מזרק וסעפת ואקום ישמשו כדי לבצע את הסינתזה.

  1. הוסף 10 מיליליטר של 1:1 DCM: DMF למזרק מצעד 4.8; להשתמש פיפטה 1,000 μl עם קצה פיפטה קטוע לפצל את כל חרוזים 1 גרם באופן שווה לשלושה כורי מזרק 5 מיליליטר. לתייג אותם כB (חומצת bromoacetic), R ((-2-bromopropanoic) R) ו-S ((S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4). לשטוף את כל 3 המזרקים עם 3x DCM, ולשטוף את המזרקים שכותרתו עם R ו-S עם THF 3x נטול מים, לשטוף את המזרק שכותרתו עם B עם 3x DMF.
  2. R מזרק ו-S. צימוד BTC של חומצת bromopropanoic.
    1. הכן פתרון BTC / THF טרי. הוספהpproximately 200 מ"ג של BTC לתוך הבקבוקון במנדף, לאטום אותו עם הכובע. לשקול את הכמות של BTC בבקבוקון. לחשב את כמות הממס הדרושה ולהוסיף THF נטול מים לתוך הבקבוקון לעשות 20 מ"ג / פתרון BTC / THF מיליליטר.
    2. הכן את / תערובת חומצות BTC bromo. הוספת חומצה (R)-2-bromopropanoic (89 μl, 0.95 מילימול) ו( S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4 (μl 89, 0.95 מילימול) בשני בקבוקונים קטנים בנפרד. לכל בקבוקון, מוסיף 5 מיליליטר של פתרון 20 מ"ג / מיליליטר BTC / THF לעיל. לאטום שני בקבוקונים ולשים אותם במקפיא -20 ° עבור 20 דקות.
    3. הוספת 1,125 μl, 2:1 THF / DIPEA (750 THF μl, 375 DIPEA μl, 2.2 mmol) למזרק R ו-S בנפרד. מערבבים את חרוזים עם קצה פיפטה. תן להם לשבת במשך 5 דקות.
    4. קח שני מקוררים חומצות bromo / תערובות BTC מהצעד 5.2.2, להוסיף 2,4,6-Trimethylpyridine (356 μl, 2.7 mmol) לכל מבחנות. משקעים לבנים יהוו באופן מיידי. החל את ההשעיה המקבילה ישירותלחרוזי basified (R מזרק ו-S בצעד 5.2.3) בהקדם האפשרי ולאחר מכן לשים אותם על שייקר לנער מתחת 120 סל"ד במשך שעה 2.
      הערה: הפתרון בכורי המזרק צריך להיות השעיה צהבהבה חיוורת במהלך הקורס כולו של התגובה. צבע כהה הוא סימן לחום גבוה שפורסם במהלך בנוסף הראשוני של פתרון כלוריד החומצה. זה יכול להיפתר על ידי הרגעות נוספות או לדלל את / תערובת חומצות BTC bromo.
  3. מזרק ב '. צימוד חומצת Bromoacetic עם דסק"ש
    1. הכן 20 מיליליטר טרי, תמיסת חומצת bromoacetic 2 M / DMF. הכן 20 מיליליטר, פתרון 2 M דסק"ש / DMF.
    2. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת החומצה 2 / DMF bromoacetic M למזרק B, לנער בעדינות. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת 2 M דסק"ש / DMF למזרק B, לנער בעדינות.
    3. שים את המזרק ב 'באותו שייקר כR מזרק ו-S
  4. לאחר 2 שעות, לקחת R מזרק, S ו-B שמייקר. שטוף את כל שלושת המזרקים ביסודיות עם DCM 5x. לאחר מכן לשטוף עם DMF 5x. שים לב שR המזרק ו-S לא ניתן לכבס עם DMF לפני שנשטף עם DCM או THF הראשון.
  5. בריכה את כל החרוזים ממזרקים R, S ו-B לכור מזרק מיליליטר 12 אחד. שטוף את כל החרוזים עם DMF 5x.
  6. הוסף 10 מיליליטר של 1:1 DCM: DMF למזרק; להשתמש פיפטה 1,000 μl עם קצה פיפטה קטוע לפצל את כל החרוזים באופן שווה ל7 2 מיליליטר מזרקים בודדים, לתייג אותם כA1-A7.
  7. Amination. הכן 10 מיליליטר, 2 פתרונות האמינים / DMF עיקריים M עבור כל אחד מ -7 האמינים מופיעים באיור 5. הוסף 5 מיליליטר של EACפתרון אמין שעות למזרק המתאים A1-A7. דגירה כל 7 המזרקים בחממה 60 ° C עם רעד הלילה.
  8. לאחר דגירה, לשטוף את כל חרוזים ביסודיות עם DMF. קח כמה חרוזים ממזרק ולבדוק עם מבחן chloranil. אם חרוזים הופכים לירוקים (חיובי) בתוך 3 דקות, המשך לשלב הבא. אם שלילי, חזור על שלב 5.7 למזרקים השליליים.
  9. חזור על שלבים 5.1-5.8 2x כדי להשלים את trimer. שלב אופציונאלי: לאחר כל מחזור, אנו ממליצים לבדוק את איכות הסינתזה ידי ספקטרוסקופית מסה כפי שיתואר להלן. כל 9261 תרכובות החברה מסונתזים בחרוזי tentagel כספריית OBOC.
  10. אישור ספקטרוסקופיות המוני של PTAs.
    PTAs הוא oligomers מובנה מאוד ויש הרבה תכונות משותפות של פפטידים מפוגלים-N. אחת הבעיות הנפוצות של סינתזת שלב מוצקה של פפטידים מפוגלים-N הוא השפלה החומצה במהלך מחשוף TFA. כדי לדכא השפלה חומצה, מחשוף של מולקולות כמו ציקלוספורין מתמיכה מוצקה מתבצעת לעתים קרובות מתחת לטמפרטורה נמוכה. אנחנו לעומת תנאי ביקוע שונים לביקוע מולקולות ועד הורים שונים מהתמיכה מוצקה. מצאנו כי, בדרך כלל, בטמפרטורה נמוכה וריכוז TFA מופחת יכולים יעילות לדכא השפלה חומצה ולספק תרכובות טהורים יותר.
    1. הכן 10 מיליליטר 1:01 פתרון TFA / DCM בצינור 15 מיליליטר. לאטום את הצינור ולשים אותו ב-20 ° C מקפיא למשך 20 דקות.
    2. שטוף את החרוזים שצריכים להיות ביקע עם DCM 5x. לנער את חרוזים בDCM במשך 15 דקות ולשטוף את החרוזים שוב עם DCM 5x.
    3. מסננים את DCM מהמזרק. השתמש במיקרוסקופ אור ופיפטה עם קצה קטום להעביר כל חרוז בודד לתוך צלחת 96 היטב, חרוז אחד בכל טוב.
    4. מכסה את צלחת 96 היטב עם להחליק את מכסה. שים את הצלחת ב-20 ° C במקפיא במשך 15 דקות.
    5. קח את פתרון TFA / DCM מקורר 1:01 מהצעד 5.10.1 ולהוסיף 20 μl לכל אחת מהבארות המכילה חרוז. שים להחליק את המכסה אחורי וpuלא צלחת 96 היטב על שייקר ב-20 ° C המקרר.
    6. Shake עבור 20 דקות. קח את צלחת 96 היטב החוצה ולהתקלף להחליק את המכסה. Blow-לייבש את TFA / DCM מכל טוב על ידי נשיפת אוויר או ארגון על זה. אם יותר מ10 חרוזים הם ביקע, speedvac יכול לשמש לייבוש TFA / DCM מהצלחת כולה. שים לב כי בשלב זה, לא כל התרכובות הם ביקע את חרוזים, אבל התרכובות ביקע צריכה להיות יותר ממספיק כדי לבצע את ניתוח ספקטרוסקופית מסה.
    7. הוסף 20 μl 6:04 ACN: H 2 O פתרון לפזר התרכובות ביקע מכל טוב. ספוט 0.6 μl של כל פתרון מתחם יחד עם 0.6 μl מטריצת CHCA MALDI על צלחת MALDI.
    8. השתמש בספקטרומטריית מסת MALDI כדי לקבוע את המשקל המולקולרי ורצף (MS / MS) של כל מתחם.

6. מבחן Chloranil

  1. הכן את ריאגנטים הבאים טריים עבור כל בדיקה. פתרון: Chloranil 2% (CAS: 118-75-2) בDMF. פתרוןB: אצטאלדהיד 2% (CAS: 75-07-0) בDMF.
  2. שילוב של פתרון עם הפתרון של B 100 μl 100 μl לפני הבדיקה בצינור 1.5 מיליליטר; שחרר את חרוזים ובעדינות לנער. אם חרוזים להכחיל תוך 5 דקות, זה מעיד על קיומו של אמין המשני על פני השטח של חרוזים. אמינים ראשוניים נותנים צבע חום כהה במקום להכחיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מראים שלושה ספקטרום MALDI נציג מtrimer עד הורים עם מקשר. כפי שניתן לראות באיור 6 א, כשבקע תחת טמפרטורת חדר באמצעות 50% פתרון TFA / DCM, השפלה משמעותית הוא ציין. באיור 6 א, שיא 593 ו484 מתאימות למקשר וtrimer עד הורי בהתאמה, מראים כי כל המולקולה הייתה מסונתזת בהצלחה על חרוז אבל מושפלת במחשוף. כשבקע בתנאי טמפרטורה נמוכים כפי שתואר לעיל, הסכום של השפלה מושרה TFA הוא מאוד מדוכא כפי שמוצג באיור 6. המנגנון של מחשוף כזה תואר בספרות קודמת 24, והוא האמין לעבור ביניים oxazolidine. יכולות להיות רצף מולקולות ועד הורים על ידי MS / MS ודפוס הפיצול דומה לזה של פפטידים וpeptoids, כפי שמוצג באיור 6 ג. מולקולות ועד הורים מסונתזים עם (S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4 בדרך כלל give שיא רחב יותר על MS ו-MS / MS ספקטרום בשל נוכחותם של מוצרי deuteration שלמים כגון (S)-2-bromopropanoic חומצת ד 3 (7 א דמויות ו7 ב). זה יכול לשמש כאינדיקציה לקיומו של מרכז כיראליות R (הפוך מS במהלך amination) במהלך הליך רצף. כמו כן מצאנו כי יש מולקולות ועד ההורים נטייה ליצירת adducts יותר sodiated מ פפטיד peptoid /, ולכן מים נמוכים נתרן (כגון מים dionized) ומכשירי פלסטיק עדיפים (איור 7C). נוסף על ידי מוצר שיכול להיבחן בסינתזה ועד הורים הוא acrylamide נוצר מהחיסול במתיל בamination (איור 7C). ברגע שacrylamide נוצר, הרצף הוא הופסק. זה ניתן לפתור על ידי הורדת הריכוז של האמין הראשוני לM 1 כדי להפחית את בסיסיות מהפתרון. אנו ממליצים לבצע את בדיקת chloranil לאחר כל שלב acylation ובאמצעות spectr ההמוני oscopy כדי לבדוק את המוצר לאחר כל צעד amination כדי להבטיח את האיכות של הספרייה.

איור 1
השוואת איור 1. מבני של פפטיד, peptoid, ועד הורים ופפטיד N-מפוגל. עד ההורים כוללים פפטיד (R 2 = H), peptoid (R 1 = H) ופפטיד N-מפוגל (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . ב ') ועד ההורים מעדיפים טראנס האג"ח אמיד קונפורמציה בשל הפרעה sterical בין שתי שרשרת α-צד. C) ועד הורים יש גם קונפורמציה מועדפת עקב 1,3 זן allylic בין N-תחליף ושרשרת α-צד. נא ללחוץ כאן להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

n-page = "תמיד"> איור 2
איור 2. סינתזה תת מונומר של peptoid (R ­ 1 = H) ועד הורים (R 1 ≠ H). הצעד הראשון הוא acylation החומצה של האמין. צעד שני הוא amination עם אמינים ראשוניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. התקנת תגובה. מיליליטר בקבוק תחתון 250 שלושה צוואר עגול היא לשים באמבט קרח גליקול / אתילן יבש. צוואר האמצע קשור ללחץ 150 מיליליטר השוואת משפך יורד. הצוואר שמאלה וימינה חתומים עם מתאם בקרת זרימה ומחץ w ה-i מחט ארוכה המאפשרת זרימת ארגון לעבור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. יסודות של סינתזה מפוצלת וברכה. חרוזים בלנק מפוצלים בשלוש מנות, שטופלו בנפרד עם מגיב A, B ו C. לאחר התגובה הראשונה, כל שלוש המנות של חרוזים הם אספו יחד ומעורבים. חרוזים ונקווה מפוצלים שוב בשלוש מנות ושוב טופלו באותה מגיב לכל מנה בודדת. לאחר התגובה השנייה, 9 בתרכובות שונות מסונתזים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

r.within-page = "תמיד"> איור 5
איור 5. סקירת מבנה ספרייה. שלושה PTAs מסונתז לאחר מקשר peptoid pentamer. גיוון תיאורטי, 3 3 X 7 3 = 9261. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. ספקטרום המוני MALDI אופייני של trimer עד הורים.) Trimer עד ההורים ביקע ידי 50% TFA / DCM מתחת לטמפרטורת חדר. מבנה ועד הורים כפי שמוצג, [ז +1] + = 1,077, [M + Na] + = 1,098.9, פיצול ועד הורים ממחשוף TFA ניתן לראות בספקטרום. B) trimer cleav ברורed על ידי 50% TFA / DCM בתנאים מותאמים, כמתואר בעיתון. השפלה חומצת TFA-לגרום מדוכאת מאוד. C) ספקטרום MS / MS של trimer ועד ההורים. Y7 החלש (916) אות הוא ציין, מדובר בפיצול התנהגות טיפוסית לPTAs. ספקטרה נותחה ונוצרה על ידי mMass 32. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. ספקטרום MALDI של סינתזה ועד הורים עם מונומר איזוטופי כותרת וטיפוסי לפי מוצרים. א) השוואת MS ספקטרום של מולקולות ועד הורים מסונתזים על ידי כחול: (bromopropanoic)-2-[M +1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 ואדום R: (S) - 2-bromopropanoic חומצת ד 4 [M +1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799. B) תבניות פיצול MS / MS של שתי מולקולות שמוצגים ב). שימו לב כי בשל נוכחותם של ד 1, ד 2 ו-D 3 תבלינים (deuteration שלם של אלנין), מולקולות מסונתזים על ידי (S)-2-bromopropanoic חומצת ד 4 בדרך כלל לתת פסגות רחבות יותר C) אדום:. ספקטרום של ועד הורים דימר מסונתז ובקע בתנאים אופטימליים. כחול:. דימר עד ההורים מסונתזים עם 2 פתרון M methoxyethylamine ובקע במים מסוננים רגילים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של oligomers peptidomimetic. חוץ מפפטידים למדו היטב, peptoids ופפטידים מפוגלים-N, חלק גדול מתרכובות בתוך משפחה זה נשאר understudied, majorly עקב חוסר השיטה סינתטית לגשת פפטידים N-alkylated כלליים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה לסנתז PTAs עם אבני בניין כיראליות נגזרים מחומצות אמינו. בעבר, יש לנו דיווח להשתמש תוואי תת מונומר חדש לספריות סינתזה של מולקולות ועד ההורים 23. הראנו שPTAs הוא oligomers המובנה מאוד אשר מחזיק מרסן קונפורמציה דרך עמוד השדרה. כאשר נבדקו in vivo, מולקולות ועד ההורים הראו חדירות תא משופרות ולכן פעילות משופרת 25. עם זאת, לצד עם כל היתרונות, PTAs גם לבוא עם כמה אתגרים סינטטיים, majorly מacylation של אמינים משניים בעמדות הפריעו. שרשרת α-הצד אשר מספקת קונפורמציההגבלה גם מביאה הפרעה סטרית לצעד הצימוד הבא. על מנת להתגבר על אתגרים אלה סינטטיים, ביצענו מחקר אופטימיזציה נרחב וקבענו BTC כמגיב הצימוד הטוב ביותר לתגובה זו 23.

צעד מפתח של המסלול הסינתטי הוא BTC הקל acylation של האמין המשני. במהלך תהליך זה, BTC מאפשר את הדור של כלוריד חומצה באתר 26,27. רוב חומרים כימיים צימוד אחרים, המהווים גם אסטרים פעילים או אלמימות חומצה כביניים לא הצליחו לספק acylation הנקי לסינתזה ועד הורים רציפים. קיומם של יחידות ועד הורים קודמים במידה רבה פוגע ביעילות הצימוד של היחידה ועד ההורים הבאים בשל הפרעה סטרית. לכן, לסינתזה של PTAs מרובה, מאוד פעיל ביניים עם קבוצת עזיבה קטנה מאוד מועדף. בין כל תנאי הצימוד שבדקנו, באתר שנוצר כלוריד חומצה על ידי BTC עובד BESלא ביד שלנו. עם זאת, אפילו עם כלור החומצה פעיל מאוד, אנו ממליצים להימנע מאמיני sterical מאוד הפריעו כגון אמינים ראשוניים-מסועף α בסינתזת ספרייה, אלא אם כן נבדקו מראש. אמינים ארומטיים כגון anile לעתים קרובות להוביל להחלפה שלמה וכך צריך להיות גם נמנעו. במהלך שלב צימוד BTC, הפתרון צריך להיות תמיד צהוב חיוור לצבע כתום; פתרון בצבע כהה הוא סימן להתחממות יתר ועלול לגרום לתשואה והיווצרות מוגברת של תוצרי לוואי נמוכים יותר. זה בדרך כלל ניתן לפתור על ידי קירור נוסף של פתרון BTC, להקטין את הגודל של התגובה והעברה מהירה יותר של הפתרון / BTC הופעל החומצה. חוץ מBTC, N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1 ,2-dihydroquinoline (EEDQ) הוא מגיב צימוד נוסף שעובד היטב בסינתזה ועד הורים. ביניים מפתח הוא אנהידריד פחמתית מעורב עם קבוצת עזיבה קטנה יחסית. במקרה של EEDQ, 3 מקבילה של EEDQ מומסת יחד עם החומצה בDCM ולאחר מכן apהעמיס את החרוזים בטמפרטורת חדר. התגובה נעשתה בדרך כלל בתוך שעה 2 עם רעד קל. תגובה זו משחררת CO 2 במהלך התגובה; לכן מערכת התגובה לא צריכה להיות סגורה.

עוד צעד מפתח הוא המחשוף והאפיון של מולקולות ועד הורים. דפוס פיצול MS / MS ייחודי כבר נצפה כאשר רצף מולקולות ועד הורים באמצעות MALDI-MS/MS (איור 6). זה מורכב עם עצימות נמוכות של יון האחרון y (שמוצג בסגול באיור 6C ועוצמה מוגברת של y6, y5, y4, B2, B3 יונים). דפוסים דומים נצפו מפיצול פפטיד המפוגל-N בדוח הקודם 28. בשל היציבות המוגברת של oxazolidine ביניים, פפטידים מפוגלים-N נוטים לתת יונים ב חזקים 28. יתר על כן, זה ידוע היטב כי פפטיד המפוגל-N הם יציב חומצה במהלך שני מחשוף TFA וספקטרוסקופית מסת MALDI 24,28, 29. מחקר מכניסטית הוכיח כי בשל הגבלת קונפורמציה בעמוד השדרה, אטום חמצן קרבוניל של השאריות הקודמים הוא לעתים קרובות בקרבה של קבוצת קרבוניל באתר המחשוף, ובכך לקדם את הקמתה של oxazolidine 29 ביניים. מהסיבות שהוזכרו לעיל, הן PTAs ופפטידים מפוגלים-N צריכים להיות ביקע מתמיכה מוצקה בטמפרטורה נמוכה באמצעות ריכוזים מבוקרים של 26 TFA, 30. מניסיוננו, שיטת המחשוף הנוחה ביותר עבור שאריות ועד הורים בודדים מתרחשת ב -20 מעלות צלזיוס עם, פתרון -20 ° C מקורר מראש של 50% TFA / DCM. הליך זה מאוד מדכא את היווצרותם של מוצרים מושפלים חומצה.

כאשר ישלוט בטכניקה זו, ספרייה עם מונומר עד ההורים נגזרים מחומצות אמינו טבעיות אחרות כגון לאוצין, פנילאלנין, גלוטמין, וכו 'יכולה להיות מסונתזת גם כן. ספרייה ועד הורים באיכות גבוהה יכולה להיות מוקרנת AGainst מטרות חלבון שונות תוך שימוש בפרוטוקולים שלנו שפורסמו בעבר ב-חרוז הקרנה ביום 31. הכה תרכובות שזוהו מההקרנה יכולה להיות מאופיין על ידי ספקטרוסקופית מסה וresynthesized לבדיקה נוספת באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר Jumpei מורימוטו וד"ר טוד דורן לסיוע רב ערך. עבודה זו נתמכה על ידי חוזה מNHLBI (NO1-HV-00,242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8 (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Tags

כימיה גיליון 88 סינתזת הפיצול וברכה אמיד שיישוני פפטיד ועד הורים peptoid תפוקה גבוהה הקרנה ספרייה קומבינטורית שלב מוצק triphosgene (BTC) אחד חרוז אחד מתחם OBOC
סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool… More

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter