Summary
ペプチドの第三級アミド（PTAは）が含まれるが、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチドミメティックのスーパーファミリーである。ここでのPTAの1ビーズ1化合物ライブラリーを合成するためにスプリット·アンド·プールとサブモノマー戦略の両方を組み合わせた合成法を記載している。
Abstract
ペプチド模倣物は、タンパク質リガンドの大源である。これらの化合物のオリゴマー性質は、コンビナトリアルケミストリーを使用して固相に大きな合成ライブラリにアクセスすることを可能にします。ペプチド模倣の中で最もよく研究されたクラスの一つは、ペプトイドです。ペプトイドは、合成が容易であり、タンパク質分解耐性及び細胞透過性であることが示されている。過去10年間、多くの有用なタンパク質リガンドは、ペプトイドライブラリーのスクリーニングによって同定されている。しかし、ペプトイドライブラリーから同定されたリガンドのほとんどは稀な例外を除いて、高い親和性を表示しません。これは、ペプトイド分子中のキラル中心およびコンホメーションの制約の欠如に一部起因し得る。最近では、ペプチドの第三級アミド（PTAは）にアクセスするための新しい合成経路を説明した。 PTAはとしては、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチド模倣体のスーパーファミリーである。 α-炭素主鎖窒素原子の両方の側鎖を有する、これらの分子の立体構造が大幅に立体障害及びアリル1,3歪みによって制約されます。 （ 図1）我々の研究は、これらのPTA分子が溶液中で高度に構造化されており、タンパク質リガンドを同定するために使用され得ることを示唆している。我々は、これらの分子は、高親和性タンパク質リガンドの将来の源となり得ると考えています。ここでは、サンプルのPTAの1ビーズ1化合物（OBOC）ライブラリを合成するスプリット·アンド·プールやサブモノマー戦略の両方のパワーを組み合わせた合成方法が記載されている。
Introduction
ペプチド模倣体は、天然ペプチドの構造を模倣する化合物である。それらは、タンパク質分解1-3に対する細胞透過性および安定性を含む天然ペプチドに関連する問題のいくつかを克服しながら生物活性を保持するように設計されている。により、これらの化合物のオリゴマー性質のために、大規模な合成ライブラリーは、容易に単量体またはサブ単量体の合成経路4-7を介してアクセスすることができます。ペプチド模倣の最も研究されたクラスの一つは、ペプトイドです。ペプトイドは、サブモノマー戦略8,9を用いて容易に合成することができるN-アルキルグリシンのオリゴマーである。多くの有用なタンパク質リガンドが正常タンパク質標的1、10月14日に対する大規模な合成ペプトイライブラリーをスクリーニングから同定されている。それにもかかわらず、トイドライブラリーから同定"ヒット"はめったにタンパク質標的1,10-14,22に対して非常に高い親和性をアーカイブしません。一ミリアンペアJORペプトイドおよび天然ペプチドとの差がペプトイドのほとんどは、一般的に起因キラル中心およびコンホメーションの制約の欠如のために二次構造を形成する能力を欠いていることである。この問題を解決するために、複数の戦略は、主に主鎖の窒素原子上に含まれる15-22側鎖の修飾に着目し、過去十年間にわたって開発された。最近、我々は、ペプチドの第三級アミド23を作成するためにペプトイド骨格に天然のアミノ酸側鎖を導入するための新規合成経路を開発した。
ペプチドの第三級アミド（PTAは）としては、ペプチド（R 2 = H）、ペプトイド（R 1 = H）とN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチドミメティックのスーパーファミリーである（R 1≠Hで、R 2 = Me で ） 。 （ 図1参照）我々の合成経路上のキラリティーおよび側鎖の供給源として天然に存在するアミノ酸を使用する45、炭素、およびN-置換を提供するために、市販の第一アミン。したがって、単純なペプチド、ペプトイドまたはN-メチル化ペプチドよりも大きな化学的空間を探求することができる。円二色性スペクトルは、PTA分子が高度に溶液中で構造化されて示されている。 PTA-タンパク質複合体の一つの特徴付けは、明らかにPTAのコンホメーションの制約は、結合に必要であることを示している。最近、我々はまた、PTA分子のいくつかは、それらのペプトイドおよびペプチド対応物よりも改善された細胞透過性を有することを発見した。我々は、これらのPTAライブラリはタンパク質標的に対する高親和性リガンドの良い情報源であることができると信じています。本論文では、これらの化合物の結合と切断のためのいくつかの改良の条件に沿って細部のサンプル1ビーズ1化合物（OBOC）PTAライブラリの合成を説明します。
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Protocol
1。スプリット·アンド·プール合成の基礎
効率的に固相上の多数の化合物を生成するために、スプリット·アンド·プール合成は、しばしば一般的な戦略として採用される。 図4に示すように、テンタゲルビーズは三つの部分への最初の分割である。各部分はビーズ上の最初の残基を生成する別の試薬と反応させる。最初の反応の後、3つのすべての部分が、一緒にプールし、混合し、再び3つの部分に分割される。各部分は、再度、ビーズ上の第2の残留物を生成し、別の試薬と反応する。 2分割し、プールの工程を経て、9化合物が生成されます。
サブモノマー合成において、ビーズは、第一のカップリング試薬の存在下で異なるブロモ酸と反応させるためにいくつかの部分に分割される。溶媒で洗浄した後、全てのビーズは再び異なると反応させるためにいくつかの部分に分け、一緒に混合されプールされる第一級アミン。アミノ化後、すべてのビーズは一緒にプールされ、各ビーズ上の完全な単量体を完成、十分に洗浄した。所望の多様性に到達するまで、このプロセスを繰り返すことができる。
天然アミノ酸から酸臭化物の2。準備
。酸臭化物および第一級アミンと2アミノ化（ 図2）の1カップリング：サブモノマー合成において、各モノマーの合成は、2つの別々のステップに分割される。ペプチドの第三級アミドを合成するために、α炭素の側鎖を有するキラル酸臭化物は、天然アミノ酸から調製される。ここでは、高忠実度のステレオ対応する酸臭化物に天然アミノ酸を変換する方法を記載している。ここでは、例としてアラニンを使用;セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンを含む他のアミノ酸も同様のconditio下でブロモ酸に変換することができるNS。フェノール、グアニジンおよびアミンのような官能基を有するアミノ酸のいくつかは、形質転換前に保護する必要があることに留意されたい。反応セットアップを図3に示す。
安全上の注意：HBrを、ナノ2やその他の腐食性/有毒化学物質、安全メガネ、白衣、および化学薬品耐性の手袋のような、適切な安全装置を含む以下の反応が必要とされるため。全ての反応は、経験豊富な化学者によってドラフト内で実施されるべきである。
- 1 Lの30％HBr溶液を調製し630ミリリットルの48％HBr溶液に370ミリリットルの水を加える。 1 Lの浴容器に500ミリリットルのエチレングリコールを追加; -10℃に温度を維持するためにドライアイスを加える注意：48％HBr溶液が強酸性、腐食性、取り扱いに注意して。使用前にMSDSをお読みください。
- 磁気攪拌棒を備えた250mlの三つ口丸底フラスコに、D-アラニン（8.9g、0.1モル）とKBr（11.9g、0.1モル）を添加する。 100ミリリットルを追加し、Tで作成30％のHBr彼、前のステップ。ステップ2.1で製造されたエチレングリコール浴にフラスコを入れ、-10℃の温度を保つ10分間、フラスコの底部からの長い針を通して気泡アルゴン、図3に示すように、300rpmで磁気攪拌棒を備えた溶液を撹拌した。
- 20mlの水で100mlビーカー中のNaNO 2（8.28グラム、0.12モル）を溶解する。滴下漏斗を均圧にソリューションを追加し、セプタムで滴下ロートを密封する。ゆっくりと滴下漏斗のバルブをオンにし、ナノ2液をフラスコ内にドロップしてみましょう。秒当たり約2滴を滴下速度を調整するための弁を制御します。 300 rpmで撹拌を維持し、フラスコの底からアルゴンバブリングを保つ。すべてのNaNO 2を添加するまで、フラスコを-10℃でエチレングリコール浴中に保持されるべきである。注意：この手順は、ナノ2溶液の添加時の熱やガスを発生させる。滴下速度はCON慎重にすべきである制御さとシステム全体がアルゴン出口を通って開いている必要があります。
- さらに3時間撹拌しておくと、温度が室温に-10℃からウォームアップしてみましょう。得られた溶液を淡黄色に明確にする必要があります。色が暗すぎる場合、超過窒素酸化物と反応中に発生可能性のBr 2を除去するために真空を適用します。
- 抽出漏斗を用いて3回35ミリリットルのジエチルエーテルで溶液から生成物を抽出。有機相を結合し、飽和食塩水で洗って。有機相はまた、それが前に暗い場合、色を除去するためのブラインで洗浄へのNaHCO 3を少量の水で洗浄することができる。 6時間4を Na 2 SO 4で有機相を乾燥させます。
- Na 2 SO 4で除外し、真空下で溶媒を蒸発させる、粗生成物を淡黄色の油への明確なように得られるべきである。粗生成物をさらに115℃、3mmHgで、又は重量での蒸留により精製することができる酢酸エチル3:1ヘキサンでシリカカラム。
- 純粋な生成物を、透明な油状物6.6グラム（収率74％）、密度= 1.69μg/ mlの、[α] D20 = +24°（メタノール）、4.41（qはδ1 H NMR（400 MHzでCDCl 3中）として得られるJ = 7.0ヘルツ、1H）、1.86の（d、J = 7.0 Hzの、3H）。の（d 4-L-アラニンから調製した）（S）-2 -ブロモプロパン酸-dの4の場合には、純粋な生成物を透明な油状物として得た、収率78％、密度= 1.72μg/ mlの、[α] D20 = -19°（メタノール）1 H NMR、有意のH信号が観察されない。 ESI-MS - [M-1] - = 155.1（154.97予定）。 （S）-2 -ブロモ-4 -メチルペンタン酸（同じ手順を用いてL-ロイシンから調製した）、純粋な生成物を透明な油状物として得た、収率89％、[α] D20 = +37°（メタノール）、1 H用NMR（400 MHzでのCDCl 3）4.30（T、J = 7.7 Hzで、1H）、1.94（DD、J = 10.8、3.9 Hzで、2H）、1.81（TT、J = 13.2、6.5 Hzで、1H）、0.96δ （DD、J = 18.2、6.6 Hzで、7H）。 （S）-2 - ブロモ-3 - フェニルの場合nylpropanoic酸（同じ手順を用いてL-フェニルアラニンから調製した）、純粋な生成物を淡黄色油状物として得た、収率72％、[α] D20 = +17°（メタノール）、1 H NMR（400 MHzでCDCl 3中）δ7.38 - 7.19（M、5H）、4.42（DD、J = 8.1、7.3 Hzで、1H）、3.47（DD、J = 14.2、8.2 Hzで、1H）、3.25（DD、J = 14.2、7.2 Hzで、1H）。
トランスアミナーゼを使用したアラニンの3。同位体標識
コンビナトリアルライブラリー合成において、特に1ビーズ1化合物（OBOC）ライブラリのスプリット·アンド·プール合成において、各ビーズから得ることができる化合物の量は比較的小さい。 （一般的に1 pmolのナノモル〜10）。さらに、質量分析法が広く、その高い感度に起因する最終化合物の同定および特徴付けのために使用される。最終のPTA生成物のキラル中心での絶対立体化学を決定するために質量分析を使用するために、臭素酸の鏡像異性体であるべきであるisotopically使用前にラベルされた。ここでは、ラベルL-アラニントランスアミナーゼおよびD 2 Oを使用する方法を記載している。
- 50ミリリットルのポリエチレンチューブでD 2 O 10mlのL-アラニン（300mgの、3.36ミリモル）を溶解する。補助基質としてα-ケトグルタル（10ミリグラム、0.068ミリモル）を追加します。 37℃までの管をウォームアップし、1M NaOD中のsoutionを使用して8.5から8.7へのPDは調整してください。注：のpDをpH試験紙により決定される。のH +のための選択ガラス電極を搭載した、伝統的なエレクトロ·pH計は、D +のために読み出さ間違って与えることができる。
- 8.7前のステップから調製された37℃の水溶液をPD - 8.5（豚の心臓、ロシュ·ダイアグノスティックス、インディアナ州インディアナポリスから0.1ミリグラム、EC 2.6.1.2）、アラニントランスアミナーゼを追加します。 37℃のインキュベーター内チューブを入れて、軽く振盪しながら一晩それをインキュベート、10から30回転が好ましい。
- 一晩インキュベートした後、D 2 O溶液0.5mlを取り、1 H-NMRにより反応の進行を確認してください。全てのプロトンシグナルアラニンは、3.76（Q、J = 7.2 Hzで、1H）、1.46（D、J = 7.3 Hzで、3H）、1 H NMR 400 MHzのδ、大幅に起因する重水素に抑える必要がある。以前に23記載されたプロトンの98％以上は、重水素に交換する必要があります。注：反応は大規模に行われた場合にD 2 Oを部分的に蒸留によって回収することができる（> 200ミリリットルD 2 O）。通常は、D 2 Oの80％〜60％が溶液から蒸留することができる。
- 液体窒素を用いて上記溶液を凍結し、白色の重水素化L-アラニン粉末を得た凍結乾燥機を使用して凍結乾燥する。
ペプトイドリンカー領域の4の合成
リンカー領域は、PTAライブラリー合成に必要とされない。しかしながら、MALDI質量分析法のより低い分子量範囲（100〜600）で高いバックグラウンドを回避し、化合物のイオン化を向上させるために、複数の極性残基を有するペプトイドリンカーが用いられることが多い。これは、LINのペプトイドケルは、標準的なペプトイド合成手順によって合成することができる。ここでは、（ 図5に示すように）リンカーとしてN-メトキシエチルグリシンの五量体を合成するであろう。
- 穏やかな振盪しながら12ミリリットル注射器反応器内で3時間、10ミリリットルのDMFにRAMリンカー（1グラム、0.27ミリモル/ g）で90ミクロンテンタゲルビーズを膨潤する。
- 反応器からDMFを排出したRinkアミドリンカーからのFmoc基を脱保護するために10ミリリットル20％ピペリジンDMF溶液を加える。 30分間の20％ピペリジン溶液でビーズを振る。すべてのピペリジンを除去するために、DMF 5倍で洗うこと。
- 注射器から数ビーズを取り出し、クロラニルテストでそれをテストします。のFmocが正常に脱保護されている場合ビーズはダークブラウン（一級アミンに陽性クロラニル試験）に変わります。
- 。次の溶液の準備：1 20ミリリットル、2Mのブロモ酢酸/ DMF溶液を、 2 20ミリリットル、2MのDIC / DMF溶液。 3。10ミリリットル、1 M methoxylethylamine / DMF溶液。
- 2 Mブロモ酢酸/ DMF溶液5mlを追加ビーズは、優しく振る。次いで5を追加ビーズに2 M DIC / DMF溶液1ml;プランジャーとシリンジを密封し、シェーカー上に置いた。 10分間振る。
- DMFで十分ビーズを洗浄。ビーズにステップ4.4から調製し、1Mメトキシエチルアミン/ DMF溶液2ミリリットルを追加します。プランジャーとシリンジを密封し、30分間シェーカー上でそれを振る。
- DMFを5倍でビーズを洗浄します。正（ビーズが青色に変わる）場合には、クロラニル試験により、いくつかのビーズを確認し、次のステップに進みます。それ以外の場合は、ステップ4.6を繰り返します。
- 繰り返して五量を完了するために、4倍、4.7に4.5を繰り返します。
図5スプリット·アンド·プール（R）とのPTAライブラリーの合成 - および（S）-2 - ブロモプロピオン酸
ここでは、ステップ4.8からビーズ1グラムを使用した9261化合物の理論的多様性を持つ小さなPTAライブラリの合成を記載している。 90ミクロンのTentaGelビーズはグラム当たり約290万ビーズが含まれていることに注意してください。そのための冗長性ライブラリは、2.9×10 6/9261 = 312のコピーになります。私たちは、アミノ化のため（詳細は図5を参照して、A1〜A7）酸、および7異なるアミンとして、（S）ラベルブロモ酢酸、（R）-2 -ブロモプロパンおよび同位-2 -ブロモプロパン酸-D 4を使用します。注射器及び真空マニホールドは、合成を実行するために使用される。
- ステップ4.8から注射器に、DMF、1:1のDCMの10ミリリットルを追加します。 3 5ミリリットルの注射器型原子炉に均等にすべての1グラムのビーズを分割する切り捨てピペットチップで千μlのピペットを使用しています。 （（S）-2 -ブロモプロパン酸-dの4）B（ブロモ酢酸）、R（（R）-2 -ブロモプロパン）及びSとしてラベルを付ける。 DCM 3Xを持つすべての3の注射器を洗浄し、そして無水THF 3XとRとSで標識された注射器を洗い、DMF 3XとBで標識された注射器を洗う。
- 注射器RとS。ブロモプロパン酸のBTCカップ。
- 新鮮BTC / THF溶液を準備します。加えるpproximately BTC 200mgのドラフト内バイアルに、ふたをしっかり閉めてください。バイアル中のBTCの量を秤量する。必要な溶媒の量を計算し、20 mg / mlのBTC / THF溶液を作るためにバイアル中に無水THFを加える。
- ブロモ酸/ BTC液を調製する。 （R）-2 -ブロモプロパン酸（89μL、0.95 mmol）および（S）-2 -ブロモプロパン酸-dの4（89μL、0.95 mmol）を二つの小さなバイアル中に別々に入れる。各バイアルに、上記の20 mg / mlのBTC / THF溶液5ミリリットルを追加。 2つのバイアルを密封し、20分間-20℃の冷凍庫に入れます。
- 別途シリンジRとSに1,125μL2:1のTHF / DIPEA（750μLのTHF中、375μLのDIPEA、2.2ミリモル）を追加します。ピペットチップでビーズをミックス。彼らは5分間放置します。
- 2各バイアルに2,4,6 - トリメチルピリジン（356μL、2.7 mmol）の追加、ブロモ酸/ステップ5.2.2から、BTCの混合物を冷却してください。白い沈殿物がすぐに形成することになる。直接対応するサスペンションを適用できる限り早く、その後2時間、120回転の下に振ってシェーカー上に置く塩基性化ビーズ（ステップ5.2.3での注射器のRとS）へ。
注：注射器の原子炉内の溶液を反応の全過程で淡黄色の懸濁液でなければなりません。暗い色は、酸塩化物溶液の初期の添加の間に放出される過剰な熱の指標である。これにより、冷却することによって解決またはブロモ酸/ BTC混合物を希釈することができる。
- シリンジB。 DICとのブロモ酢酸のカップリング
- 新鮮な20ミリリットル、2Mのブロモ酢酸/ DMF溶液を準備します。 20ミリリットル、2MのDIC / DMF溶液を準備します。
- シリンジBに2ミリリットル2のMブロモ酢酸/ DMF溶液を加え、静かに振る。シリンジBに2 M DIC / DMF溶液2 mlを加え、静かに振る。
- 注射器RとSと同じシェーカー上シリンジBを置く
- 2時間後、シェーカーから注射器R、SとBを取る。 DCMを5倍で十分にすべての3の注射器を洗浄します。その後、DMF 5Xで洗浄する。その注射器RとSが最初にDCMまたはTHFで洗浄される前に、DMFで洗浄することができません。
- プール注射器、R、S、およびBからの全てのビーズ1 12ミリリットルの注射器反応器に。 DMFを5倍にすべてのビーズを洗浄。
- 注射器に、DMF、1:1のDCMの10ミリリットルを追加、7個々の2ミリリットルの注射器に均等に全てのビーズを分割A1〜A7としてそれらにラベルを付ける切り捨てピペットチップで千μlのピペットを使用しています。
- アミノ化。 図5に記載されている7アミンのそれぞれについて、10ミリリットル、2Mの第一級アミン/ DMF溶液を調製する。EACの5ミリリットルを追加します。対応するシリンジA1〜A7にHアミン溶液。 60℃のインキュベーター内のすべての7の注射器は、一晩振とうしながらインキュベートする。
- インキュベーション後、DMFで十分にすべてのビーズを洗浄。各シリンジからのビーズの数を取り、クロラニル試験に確認してください。ビーズは3分以内に、緑（正）をオンにすると、次のステップに進みます。負の場合は、負の注射器のためのステップ5.7を繰り返します。
- 繰り返してトリマーを完了するために、5.1倍5.8を繰り返します。オプションのステップ：各サイクルの後、我々は以下に説明するように、質量分析法により合成の品質をチェックすることをお勧めします。すべての9261の化合物は、現在、OBOCライブラリとしてのTentaGelビーズ上で合成される。
- のPTAの質量分析の確認。
PTAは、高度に構造化されたオリゴマーであり、N-メチル化ペプチドの多くの共通の特徴を持っている。 N-メチル化ペプチドの固相合成の一般的な問題の一つは、TFA切断中に酸分解である。酸分解からのシクロスポリン様分子の切断を抑制するために固体支持体は、多くの場合、低温下で行われる。我々は、固体支持体から別のPTA分子を切断するための様々な切断条件を比較した。我々は一般的に、低温還元TFA濃度を効果的に酸分解を抑制し、純粋な化合物を提供することができることを見出した。- 10ミリリットル15ミリリットルチューブ1:1 TFA / DCM溶液を調製する。チューブを密封し、20分間-20℃の冷凍庫に入れて。
- DCMを5倍で切断する必要があるビーズを洗浄。 15分間のDCM中のビーズを振ると、DCMの5倍で再びビーズを洗浄。
- シリンジから、DCMを排出します。 、96ウェルプレートにウェル当たり1のビーズを個々のビーズを転送するために切り詰められたチップを用いて、光学顕微鏡やピペットを使用してください。
- カバースリップで96ウェルプレートを覆う。 15分間-20℃の冷凍庫にプレートを置く。
- ステップ5.10.1から冷却午前1時01分のTFA / DCM溶液を取り、ビーズが含まれている各ウェルに20μlを加える。背中とPUカバースリップを置くT -20℃〜冷蔵庫の中のシェーカー上で96ウェルプレート。
- 20分間振る。うち96ウェルプレートを取り、カバーガラスを剥がし。ブロードライその上の空気やアルゴンを吹き込んで各ウェルからのTFA / DCMが。 10以上のビーズが切断された場合、スピードバックは、全体のプレートからTFA / DCMを乾燥させるために使用することができる。この時点で、すべての化合物のビーズから切断されていますが、切断された化合物は、質量分析の分析を実行するために十分以上でなければならないことに注意してください。
- 各ウェルから切断する化合物を溶解するために、H 2 O溶液：20μlの午前6時04分のACNを追加します。 MALDIプレート上の0.6μLのCHCA MALDIマトリックスと一緒に、各化合物溶液0.6μLを発見。
- 各化合物の分子量および配列（MS / MS）を決定するためにMALDI質量分析法を使用する。
6。クロラニル試験
- 各テストのために新鮮な以下の試薬を準備します。 A液：2％クロラニル（CAS：118-75-2）のDMF。ソリューションB：2％アセトアルデヒド（CAS：75-07-0）のDMF。
- 1.5mlチューブ内の試験前に、B液100μlの溶液Aを100μlを混合する;ビーズを落とし、ゆっくりと振る。ビーズは5分以内に青色に変わる場合には、ビーズの表面上の第二級アミンの存在を示す。第一級アミンは、代わりに青を回すのダークブラウン色を与える。
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Representative Results
ここでは、リンカーとPTAトリマーから3つの代表的なMALDIスペクトルを示している。 図6Aに示すように、50％TFA / DCM溶液を用いて室温下で切断された場合に、有意な分解が観察される。 図6Aに、593ピークと484は、それぞれのリンカーとPTAトリマーに対応し、分子全体が正常にビーズ上で合成が、切断時に分解されたことを示している。上記のように低温条件下で開裂すると、図6（b）に示すように、TFA誘発分解の量が大幅に抑制される。そのような切断のメカニズムは、以前の文献24に記載されており、それはオキサゾリジン中間体を経ると考えられている。 PTA分子は、MS / MSによって配列決定することができ、 図6Cに示すように、断片化パターンは、ペプチド及びペプトイドと同様である。 （S）を用いて合成PTA分子-2 -ブロモプロパン、一般酸-D 4グラムによるこのような（S）-2 -ブロモプロパン酸3-dを（ 図7Aおよび7B）のような不完全な重水素化産物の存在をMS及びMS / MSスペクトルに広いピークをアイブ。これは、配列決定手順の間（アミノ化の際にS反転）Rのキラル中心の存在の指標として使用することができる。我々はまた、PTA分子は、従って低ナトリウム水（例えば脱イオン水など）、プラスチック装置は（ 図7C）が好ましく、ペプトイド/ペプチドよりもナトリウム化付加物を形成する傾向が見出さ。副産物PTA合成に観察することができた別のアミノ化（ 図7C）の間に臭化物の脱離から形成されたアクリルアミドである。アクリルアミドが形成されると、シーケンスは終了する。これは、溶液の塩基性を減少させるために、1 Mの第一級アミンの濃度を低下させることによって解決することができる。私たちは、それぞれのアシル化工程の後にクロラニル試験を実施し、質量SPECTRの使用をお勧めしますライブラリの品質を確保するために、各アミノ化工程後に製品をチェックするoscopy。
図1ペプチド、ペプトイド、PTAおよびN-メチル化ペプチドの構造比較。PTAペプチド（R 2 = H）、ペプトイド（R 1 = H）とN-メチル化ペプチド（R 1≠H、R 2 = Meである）を含む。B）PTAは、2つのα-側鎖間の立体障害にトランスアミド結合の立体構造を好む。C）PTAにも起因するN-置換したα-側鎖との間の1,3アリル株と優先コンホメーションを持っています。 するには、ここをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。
ペプトイドの図2。サブモノマー合成（R 1 = H）とPTA（R 1≠H）。最初のステップは、アミンの酸アシル化である。第二段階は、第一級アミンとアミノ化である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3反応セットアップ。250mlの三口丸底フラスコをドライアイス/エチレングリコール浴に入れる。中間首150mlの圧力が均等化滴下漏斗を用いて接続されている。左右のネックは、流量制御アダプタおよび隔壁付きで封止されているアルゴンの流れが通過することができます長い針番目。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4：スプリット·アンド·プール合成の基本。ブランクビーズを反応体Aと別々に処理された三つの部分に分割され、BおよびC.最初の反応後、ビーズを3つのすべての部分を一緒に混合しプールする。プールされたビーズを3回に分けて再分割して、再度、個々の部分に同じ反応で処理される。第二の反応の後、9種の異なる化合物が合成される。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。ライブラリの構造の概要。三のPTAは、五量のペプトイドリンカの後に合成される。理論的多様性、3 3、X 7 3 = 9261。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6。A）三量体PTAを室温下で50％TFA / DCMによって切断さPTA三量体の典型的なMALDI質量スペクトル 。示すように、PTAの構造、[M +1] + = 1077、[M +のNa] + = 1,098.9、TFA切断からPTA断片は、明らかにスペクトルB）三量体cleavで見ることができる論文で説明したように最適化された状態で50％TFA / DCMによって編TFA-誘導酸分解が大幅PTAトリマー。C）MS / MSスペクトルを抑制している。弱いY7（916）信号が観測され、これはPTAはの典型的な断片化の動作です。スペクトルを分析し、mMass 32で生成された。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図7の同位体標識された単量体および副生成物を有する典型的なPTA合成のMALDIスペクトルを示す。 A）ブルーにより合成PTA分子のMSスペクトルを比較：（R）-2 -ブロモプロパン[M +1] + = 760 [M +のNa] + = 787 [M + K] + = 803および赤色：（S） - 2 -ブロモプロパン酸-D 4 [M +1] + = 764 [M +のNa] + = 783 [M + K] + = 799。B）Aに示す2つの分子のMS / MSフラグメンテーションパターン）。 。PTAのスペクトラム：起因D 1、D 2及びD 3スパイス（アラニンの不完全な重水素化）により（S）-2 -ブロモプロパン酸-d 4は合成された分子の存在下に、一般C）赤広いピークを与えることに注意してくださいダイマーを合成し、最適化された条件の下で切断された。青：PTAダイマーが2mメトキシエチルアミン溶液を用いて合成され、通常のろ過水で切断され、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ペプチドの第三アミド（PTAは）ペプチド模倣オリゴマーのスーパーファミリーである。よく研究されたペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに加えて、このファミリー内の化合物の大部分がすぎなかったため、一般的なN-アルキル化ペプチドをアクセスするための合成法がないために、代役のまま。ここでは、アミノ酸由来のキラルビルディングブロックとのPTAを合成する効率的な方法を記載している。以前、我々は、PTA分子23の合成ライブラリーに新たなサブモノマールートを使用することが報告されている。私たちは、PTAは、バックボーンを通じてコンフォメーションの拘束具を持っている、高度に構造化されたオリゴマーであることが示されている。 生体内で試験した場合、PTA分子が改善された細胞透過性、したがって、改善された活性25を示した。しかし、すべての利点と並んで、PTAはまた、すぎなかっヒンダーの位置で第二級アミンのアシル化から、いくつかの合成の課題が付属しています。コンフォメーションの提供、α-側鎖制限は、次のカップリングステップのための立体障害をもたらします。これらの合成の課題を克服するために、我々は、大規模な最適化研究を行い、この反応物23のための最良のカップリング試薬としてBTCを決定した。
合成経路の重要なステップは、BTCは、第二級アミンのアシル化を促進される。このプロセスの間、BTCはその場 26,27 中の酸塩化物の生成を可能にする。中間体としての活性エステル又は酸無水物のいずれかを形成するほとんどの他のカップリング試薬は、連続的なPTA合成のためのクリーンなアシル化を提供することに失敗しました。以前PTA単位の存在が大きく、立体障害に起因する以下のPTAユニットの結合効率を損なう。したがって、複数のPTA、小さな脱離基で高活性中間体の合成のために強く推奨されている。 BTCは、BESの作品で我々は試験した全てのカップリング条件の中で、 その場で酸塩化物を生成した私たちの手の中のT。しかし、高活性の酸塩化物と、我々は事前にテストされていない限り、このようなライブラリー合成におけるα-分岐した第一級アミンのような高度に立体障害アミンを避けることをお勧めします。このような老婦人のような芳香族アミンは、しばしば不完全な置換を引き起こし、ひいては避けるべきである。 BTCカップリング工程中、溶液は常にオレンジ色が淡黄色であるべきである;暗い色の溶液は、過熱の指標であり、低収量及び副産物の形成が増加する可能性があります。これは、一般に、反応の大きさおよび活性化BTC /酸溶液のより速い伝達を低減、BTC溶液をさらに冷却することによって解決することができる。 BTCの他に、N-エトキシカルボニル-2 - エトキシ-1,2 - ジヒドロキノリン（EEDQ）はPTA合成にうまく機能する他のカップリング試薬である。重要な中間体は、比較的小さな脱離基と混合炭酸無水物である。 EEDQの場合、EEDQの3当量を、次いでDCM中の酸およびpと一緒に溶解させ室温でビーズにプライ。反応は、通常、軽度に振盪しながら2時間以内に行われます。この反応は、反応中にCO 2を放出する。したがって、反応系を閉じてはいけません。
もう一つの重要なステップは、切断およびPTA分子の特性である。 MALDI-MS/MS（ 図6）を介してPTA分子を配列決定する際に特徴的なMS / MSフラグメンテーションパターンが観察されている。それは、（ 図6Cに紫色で示されており、Y6、Y5、Y4、B2、B3、イオンの増加強度）最後のyイオンの低強度で構成されています。類似のパターンは、以前の報告28にN-メチル化ペプチド断片から観察されている。により中間オキサゾリジンの安定性の増加のために、N-メチル化ペプチドは、強力なBイオン28を与える傾向がある。さらに、そのウェルN-メチル化ペプチドは、TFA切断およびMALDI質量分析法24の両方の間に酸に不安定であることが知られている28、29。機構的研究は、主鎖コンホメーション上の制約から、先行残基のカルボニル酸素原子が、中間体29オキサゾリジンの形成を促進する、切断部位のカルボニル基の近傍にあることが多いことが示されている。上記の理由のために、両方のPTAおよびN-メチル化ペプチドはTFA 26,30の制御された濃度を用いて低温で固体支持体から切断される必要がある。我々の経験では、個々のPTA残基のための最も便利な切断法を50％TFA / DCMの予め冷却し、-20℃の溶液で-20℃で起こる。この手順は大幅に劣化した酸生成物の生成を抑制する。
この技術を習得した後、等ロイシン、フェニルアラニン、グルタミンのような他の天然アミノ酸から誘導PTAモノマーとライブラリも同様に合成することができる。高品質のPTAライブラリーは、Agをスクリーニングすることができる私たちの以前に発表され、オンビーズスクリーニングプロトコル31を使用して、様々なタンパク質標的ainst。ヒットのスクリーニングから同定された化合物は、質量分析法によって特徴付けられ、上記のプロトコルを使用して、更なるテストのために再合成することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、貴重な援助のために博士順平森本博士トッドドーランに感謝したいと思います。この作品は、NHLBI（NO1-HV-00242）からの契約によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6 trimethylpyridine | ACROS | 161950010 | CAS:108-75-8 |
| 2-morpholinoethanamine | Sigma-Aldrich | 06680 | CAS:2038-03-1 |
| 48% HBr water solution | ALFA AESAR | AA14036AT | CAS:10035-10-6 |
| Acetaldehyde | Sigma-Aldrich | 402788 | CAS:75-07-0 |
| Acetonitrile | Fisher | SR015AA-19PS | CAS:75-05-8 |
| Anhydrous tetrahydrofuran (THF) | EMD | EM-TX0277-6 | CAS:109-99-9 |
| Benzylamine | Sigma-Aldrich | 185701 | CAS:100-46-9 |
| bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) | ACROS | 258950050 | CAS:32315-10-9 |
| Bromoacetic acid | ACROS | 106570010 | CAS:79-08-3 |
| Chloranil | Sigma-Aldrich | 23290 | CAS:118-75-2 |
| Cyclohexanemethylamine | Sigma-Aldrich | 101842 | CAS:3218-02-8 |
| D2O | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8-1000 | CAS:7789-20-0 |
| D-Alanine | Anaspec | 61387-100 | CAS:338-69-2 |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher | BJ-NS300-20 | CAS:75-09-2 |
| Dimethylformamide (DMF) | Fisher | BJ-076-4 | CAS:68-12-2 |
| Ethylene glycol | Oakwood | 44710 | CAS:107-21-1 |
| Isopentylamine | Sigma-Aldrich | W321907 | CAS:107-85-7 |
| KBr | ACROS | 424070025 | CAS:7758-02-3 |
| L-Alanine | Anaspec | 61385-100 | CAS:56-41-7 |
| 3-Methoxypropylamine | Sigma-Aldrich | M25007 | CAS:5332-73-0 |
| 2-Methoxyethylamine | Sigma-Aldrich | 143693 | CAS:109-85-3 |
| N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone | Sigma-Aldrich | 136565 | CAS:7663-77-6 |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | ACROS | 115211000 | CAS:693-13-0 |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma-Aldrich | D125806 | CAS:7087-68-5 |
| NaNO2 | ACROS | 424340010 | CAS:7631-99-4 |
| NAOD 40% solution in water | ACROS | 200058-506 | CAS:7732-18-5 |
| Piperidine | ALFA AESAR | A12442-AE | CAS:110-89-4 |
| Piperonylamine | Sigma-Aldrich | P49503 | CAS:2620-50-0 |
| Propylamine | Sigma-Aldrich | 240958 | CAS:107-10-8 |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | CAS:76-05-1 |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 39468 | CAS:28166-41-8 |
| α-Ketoglutarate | ALFA AESAR | AAA10256-22 | CAS:328-50-7 |
| Tentagel Resin with RINK linker | Rapp-Polymere | S30023 | |
| Alanine transaminase | Roche | 10105589001 | AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT) |
| Incubator | New Brunswick Scientific | Innova44 | |
| NMR | Bruker | 400 MHz | |
| MALDI mass spectrometer | Applied Biosystems | 4800 MALDI-TOF/TOF | |
| Lyophilizer | SP Scientific | VirTis benchtop K | |
| Syringe reactor | INTAVIS | Reaction Column | 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 | Vac-Man |
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