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Chemistry

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Published: June 20, 2014 doi: 10.3791/51299
Automatic Translation
1, 1
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

Summary

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi, peptoids e peptidi N-metilato. Qui si descrive un metodo sintetico che combina split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un one-tallone biblioteca un composto di PTA.

Abstract

Peptidomimetici sono grandi fonti di leganti proteici. La natura oligomerica di questi composti in grado di accedere a grandi librerie sintetiche su fase solida utilizzando la chimica combinatoriale. Una delle classi più ben studiati di peptidomimetici è peptoids. Peptoids sono facili da sintetizzare e hanno dimostrato di essere resistente alla proteolisi e cellula-permeabile. Negli ultimi dieci anni, molte leganti proteici utili sono stati identificati attraverso lo screening di librerie peptoid. Tuttavia, la maggior parte dei ligandi identificati dalle biblioteche peptoid non vengono visualizzati alta affinità, con rare eccezioni. Ciò può essere dovuto, in parte, alla mancanza di centri chirali e vincoli conformazionali nelle molecole peptoid. Recentemente, abbiamo descritto una nuova via sintetica per accedere peptidi ammidi terziarie (PTA). PTA sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a, peptidi peptoids e peptidi N-metilati. Con catene laterali su entrambi α-carbonio e atomi di azoto catena principale,la conformazione di queste molecole sono notevolmente limitata dalla impedimento sterico e allilico 1,3 ceppo. (Figura 1) Il nostro studio suggerisce che queste molecole PTA sono altamente strutturate in soluzione e possono essere utilizzati per identificare ligandi proteici. Crediamo che queste molecole possono essere una futura fonte di ligandi ad alta affinità della proteina. Qui si descrive il metodo di sintesi che unisce la potenza di entrambi split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un campione unico tallone di un composto (OBOC) biblioteca di PTA.

Introduction

Peptidomimetici sono composti che imitano la struttura di peptidi naturali. Essi sono progettati per mantenere la bioattività mentre superare alcuni dei problemi associati con peptidi naturali, tra cui la permeabilità cellulare e stabilità contro proteolisi 1-3. A causa della natura oligomerica di questi composti, grandi librerie sintetiche possono essere facilmente accessibili attraverso vie sintetiche monomeriche o sub-monomerici 4-7. Una delle classi più studiati di peptidomimetici è peptoids. Peptoids sono oligomeri di glicine N-alchilati, che possono essere sintetizzati facilmente usando una strategia sub-monomero 8, 9. Molti ligandi di proteine ​​utili sono stati identificati con successo da screening di librerie di grandi dimensioni peptoid sintetico contro bersagli proteici 1, 10-14. Tuttavia, "hits" individuati dalle biblioteche peptoid raramente archivio un'elevata affinità verso gli obiettivi della proteina 1,10-14,22. One major differenza tra peptoids e peptidi naturali è che la maggior parte dei peptoids generalmente non hanno la capacità di formare strutture secondarie a causa della mancanza di centri chirali e vincoli conformazionali. Per risolvere questo problema, strategie multiple sono state sviluppate negli ultimi dieci anni, in gran parte incentrata sulla modifica delle catene laterali presenti sulle principali atomi di azoto catena 15-22. Recentemente, abbiamo sviluppato una nuova via sintetica per introdurre catene laterali di aminoacidi naturali su una dorsale peptoid per creare peptidi ammidi terziarie 23.

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una famiglia di super-peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi (R 2 = H), peptoids (R 1 = H) e peptidi N-metilato (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . (Vedi figura 1) La via sintetica impiega aminoacidi naturali come fonte di chiralità e catene laterali sul45;-carbonio, e ammine primarie disponibili in commercio per fornire N-sostituzioni. Pertanto, uno spazio chimico più grande di quello di peptidi semplici, peptoids o peptidi N-metilato può essere esplorato. Spettri di dicroismo circolare hanno dimostrato che le molecole del PTA sono altamente strutturati in soluzione. Caratterizzazione di uno dei complessi PTA-proteina mostra chiaramente che i vincoli conformazionali di PTA sono richiesti per il legame. Recentemente, abbiamo anche scoperto che alcune delle molecole PTA possiedono una migliore permeabilità cellulare rispetto ai loro omologhi peptoid e peptidi. Noi crediamo che queste librerie PTA possono essere una buona fonte di ligandi ad alta affinità per le proteine ​​target. In questo articolo, discuteremo la sintesi di un campione unico tallone di un composto (OBOC) biblioteca PTA in dettaglio insieme ad alcune condizioni migliori per l'accoppiamento e la scissione di questi composti.

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Protocol

1. Nozioni di base di Split-e-pool sintesi

Al fine di generare in modo efficiente un gran numero di composti in fase solida, sintesi split-e-pool è spesso impiegato come strategia generale. Come mostrato in Figura 4, tentagel perle sono prima divisa in tre porzioni. Ciascuna porzione viene fatto reagire con un reagente diverso, generando il primo residuo su perline. Dopo la prima reazione, tutte e tre le porzioni sono raggruppate, mescolati, e poi nuovamente suddivise in tre porzioni. Ciascuna porzione verrà nuovamente reagire con un reagente diverso, generando il secondo residuo su perline. Dopo due passi split-and-piscina, vengono generati nove composti.

In sintesi sub-monomero, perle vengono dapprima suddivise in diverse porzioni di reagire con differenti acidi bromo in presenza del reagente di accoppiamento. Dopo il lavaggio con il solvente, tutte le sfere verranno raggruppate e misti, poi di nuovo diviso in più porzioni di reagire con diversiammine primarie. Dopo amminazione, tutte le perle vengono raggruppate e lavate accuratamente, completando un monomero completo su ciascuna sfera. Questo processo può essere ripetuto fino al raggiungimento diversità desideri.

2. Preparazione di acido Bromuro da parte della Natural Aminoacidi

In sintesi sub-monomero, la sintesi di ogni monomero è diviso in due fasi distinte:. 1 accoppiamento di bromuro e acido 2 amminazione con ammine primarie (Figura 2).. Per sintetizzare un peptide ammide terziaria, bromuri acidi chirali con catene laterali sul carbonio alfa saranno preparate da amminoacidi naturali. Qui si descrive il metodo di trasformazione di un amminoacido naturale nel corrispondente acido bromuro con alta fedeltà stereo. Usiamo alanina come esempio; altri aminoacidi inclusi serina, treonina, acido aspartico, acido glutammico, asparagina, glutammina, glicina, valina, isoleucina, fenilalanina possono anche essere trasformati in acidi bromo sotto conditio similens. Si noti che alcuni degli amminoacidi con gruppi funzionali come fenolo, guanidina e ammina devono essere protetti prima della trasformazione. La configurazione di reazione è mostrato in Figura 3.

Precauzioni di sicurezza: Per occorrono le seguenti reazioni che coinvolgono HBr, NaNO 2 e di altri prodotti chimici corrosivi e / o tossici, adeguati dispositivi di sicurezza come occhiali protettivi, camice da laboratorio e guanti resistenti alle sostanze chimiche. Tutte le reazioni devono essere eseguite sotto cappa dal chimico esperto.

  1. Aggiungere 370 ml di acqua in 630 ml di soluzione di HBr 48% per preparare un 1 L, soluzione HBr 30%. Aggiungere 500 ml di glicole etilenico in un contenitore bagno 1 L; aggiungere ghiaccio secco per mantenere la temperatura a -10 ° C. Attenzione: soluzione di HBr 48% è fortemente acido e corrosivo, maneggiare con cura. Leggere la scheda di sicurezza prima dell'uso.
  2. Aggiungere D-alanina (8,9 g, 0,1 mol) e KBr (11,9 g, 0,1 mol) per un ml a tre colli pallone a fondo tondo 250 con un bastoncino magnetico. Aggiungere 100 ml, e il HBr 30% preparato in tegli passaggio precedente. Mettere il pallone nel bagno glicole etilenico preparato al punto 2.1 e mantenere la temperatura a -10 ° C. Bubble argon attraverso un lungo ago dal fondo del pallone per 10 minuti, come mostrato in Figura 3. Agitare la soluzione con l'ancoretta magnetica a 300 rpm.
  3. Sciogliere NaNO 2 (8,28 g, 0,12 mol) in un becher da 100 ml con 20 ml di acqua. Aggiungere la soluzione nel imbuto gocciolatore con compensatore di pressione e sigillare l'imbuto gocciolatore con un setto. Lentamente accendere la valvola l'imbuto a rubinetto e lasciare che la soluzione NaNO 2 goccia nel pallone. Controllare la valvola per regolare il tasso di gocciolamento per circa 2 gocce al sec. Mantenere l'agitazione a 300 rpm e mantenere il gorgogliare argon dal fondo del pallone. Il pallone deve essere tenuto in etilene glicole bagno a -10 ° C fino a quando viene aggiunto tutto NaNO 2. Attenzione: questo passaggio genera calore e gas durante l'aggiunta di nano 2 soluzione. Tasso di gocciolamento deve essere attentamente conlata e l'intero sistema dovrebbe essere aperto attraverso l'uscita argon.
  4. Continuate a mescolare per ulteriori 3 ore e lasciare che la temperatura scaldare da -10 ° C a temperatura ambiente. La soluzione risultante deve essere chiaro a giallo chiaro; se il colore è troppo scuro, applicare il vuoto per rimuovere gli ossidi di azoto in eccesso e possibile Br 2 generato durante la reazione.
  5. Estrarre il prodotto dalla soluzione con 3x 35 ml di etere etilico usando un imbuto estrazione. Unire la fase organica e lavarlo con salamoia satura. La fase organica può essere lavato con una piccola quantità di NaHCO3 prima del lavaggio con soluzione salina per rimuovere il colore se è buio. Essiccare la fase organica su Na 2 SO 4 per 6 ore.
  6. Filtrare il Na 2 SO 4 e si evapora il solvente sotto vuoto, prodotto grezzo deve ottenersi chiaro olio giallo pallido. Prodotto grezzo può essere ulteriormente purificato per distillazione a 115 ° C, 3 mm Hg, o dacolonna di silice con 3:1 esano: acetato di etile.
  7. Prodotto puro è ottenuto come olio limpido, 6,6 g (resa 74%), densità = 1,69 g / ml, [α] D20 = +24 ° (metanolo), 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H). Nel caso di (S)-2-bromopropanoic acido d-4 (d preparato da 4-L-alanina), prodotto puro è ottenuto come olio limpido, resa 78%, densità = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (metanolo). 1 H NMR, nessun segnale significativo H viene osservata. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (previsto 154,97). Per (S)-4-metilpentanoico-2-bromo acido (preparato da L-leucina utilizzando la stessa procedura) prodotto puro viene ottenuto come olio limpido, resa 89%, [α] D20 = +37 ° (metanolo), 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 4.30 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10.8, 3.9 Hz, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 0.96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). Nel caso di (S)-2-bromo-3-pheacido nylpropanoic (preparato da L-fenilalanina utilizzando la stessa procedura) prodotto puro viene ottenuto come olio giallo pallido, resa 72%, [α] D20 = +17 ° (metanolo), 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.38 - 7.19 (m, 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H).

3. Etichettatura isotopica di alanina transaminasi Utilizzo

In sintesi biblioteca combinatoria, in particolare nella sintesi split-e-pool di un composto biblioteche (OBOC) un tallone, la quantità di composto che può essere ottenuto da ciascun tallone è relativamente piccola. (In genere 1 pmol a 10 nmol). Inoltre, la spettrometria di massa è ampiamente usato per l'identificazione e la caratterizzazione del composto finale grazie alla sua elevata sensibilità. Per poter utilizzare spettrometria di massa per determinare la stereochimica assoluta presso i centri chirali dei prodotti finali PTA, enantiomeri acido bromo dovrebbero essere isotopically etichettati prima dell'uso. Qui si descrive il metodo di utilizzo di transaminasi e D 2 O all'etichetta L-alanina.

  1. Sciogliere L-alanina (300 mg, 3,36 mmol) con 10 ml di D 2 O in un tubo in polietilene 50 ml. Aggiungere α-chetoglutarato (10 mg, 0,068 mmol) come co-substrato. Riscaldare il tubo a 37 ° C e regolare la pD a 8,5-8,7 usando un soution 1 M INCD. Nota: PD è determinata dalla strisce reattive pH. Tradizionale electro pH-metro equipaggiato con elettrodo di vetro selettivo per H + può dare errata lettura per D +.
  2. Aggiungi alanina transaminasi (0,1 mg, EC 2.6.1.2 dal cuore di maiale, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) al PD 8,5-8,7, 37 ° C la soluzione preparata dal passo precedente. Mettere il tubo a 37 ° C incubatore e incubare durante la notte con lieve agitazione, da 10 a 30 rpm è preferito.
  3. Dopo incubazione durante la notte, prendere 0,5 ml di soluzione D 2 O e verificare lo stato di avanzamento di reazione da 1 H-NMR. Tutti i segnali di un protonelanine, δ 3.76 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 1.46 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 1 H NMR 400 MHz, dovrebbe essere notevolmente soppressa a causa di deuterazione. Più del 98% del protone deve essere invertita deuterio come descritto in precedenza 23. Nota: D 2 O può essere parzialmente recuperato per distillazione se la reazione viene eseguita su larga scala (> 200 ml D 2 O). Normalmente, il 60% al 80% di D 2 O può essere distillato dalla soluzione.
  4. Congelare la soluzione sopra con azoto liquido e liofilizzare usando un liofilizzatore avere polvere L-alanina deuterato bianco.

4. Sintesi di peptoid Linker Regione

La regione linker non è necessaria per la sintesi biblioteca PTA. Tuttavia, al fine di evitare l'alto sfondo nel rapporto inferiore peso molecolare (100-600) di spettroscopia di massa MALDI e per migliorare la ionizzazione dei composti, viene spesso usato un linker peptoid con più residui polari. Questo peptoid linker può essere sintetizzato attraverso la procedura di sintesi peptoid standard. Qui si sintetizzare un pentamero di N-metossietile glicina come linker (come mostrato in Figura 5).

  1. Swell 90 micron Tentagel perle con linker RAM (1 g, 0,27 mmol / g) in 10 ml di DMF per 3 ore in un reattore siringa da 12 ml con lieve agitazione.
  2. Scaricare l'DMF dal reattore e aggiungere 10 ml 20% di soluzione di piperidina DMF per deproteggere il gruppo Fmoc dal linker Rink amide. Agitare le perline con soluzione di piperidina 20% per 30 min. Lavare con DMF 5x per rimuovere tutti piperidina.
  3. Prendete un paio di perle fuori dalla siringa e testarlo con il test cloranile. Beads devono girare marrone scuro (test cloranile positivo per ammina primaria) se Fmoc viene deprotetto con successo.
  4. Preparare le seguenti soluzioni: 1., 20 ml di soluzione di acido 2 M / DMF bromoacetico; 2 20 ml, soluzione 2 M DIC / DMF.; 3. Da 10 ml, 1 M methoxylethylamine soluzione / DMF.
  5. Aggiungere 5 ml di soluzione 2 M di acido bromoacetico / DMF perle perline, agitare delicatamente. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione 2 M DIC / DMF ai talloni; sigillare la siringa con lo stantuffo e metterlo sul shaker. Agitare per 10 min.
  6. Lavare le perline con DMF accuratamente. Aggiungere 2 ml di soluzione 1 M methoxyethylamine / DMF preparati dal punto 4.4 ai talloni. Sigillare la siringa con lo stantuffo e agitare l'agitatore per 30 min.
  7. Lavare le perline con DMF 5x. Controlla un paio di perle con la prova cloranile, se positivi (perline diventano blu), quindi continuare con il passaggio successivo. In caso contrario, ripetere il punto 4.6.
  8. Ripetere i passaggi 4,5-4,7, 4x per completare la pentamero.

. 5 Split-e-pool Sintesi di PTA Biblioteca con (R) - e (S)-2-bromopropionico Acidi

Qui si descrive la sintesi di una piccola biblioteca PTA con una diversità teorica di 9.261 composti utilizzando la 1 g di perle dal punto 4.8. Si noti che un tentagel tallone 90 micron contiene circa 2,9 milioni di perline per grammo; quindi la ridondanza dila biblioteca sarà di 2,9 x 10 6/9261 = 312 copie. Useremo acido bromoacetico, (R)-2-bromopropanoic e isotopica etichettati (S)-2-bromopropanoic acid-d 4 come gli acidi, e 7 diverse ammine (A1 ~ A7, vedi Figura 5 per dettagli) per amminazione. Reattori siringa e un collettore a vuoto saranno utilizzati per eseguire la sintesi.

  1. Aggiungere 10 ml di 01:01 DCM: DMF alla siringa dal punto 4.8; usare una pipetta 1000 ml con un puntale troncato a dividere tutti i 1 g perline equamente in tre reattori siringa da 5 ml. Etichettarli come B (acido bromoacetico), R ((R)-2-bromopropanoic) e S ((S)-2-bromopropanoic acido d-4). Lavare tutte le 3 siringhe con DCM 3x, e lavare siringhe etichettati con R e S con THF anidro 3x, lavare la siringa marcato con B con DMF 3x.
  2. Siringa R e S. Accoppiamento BTC di acido bromopropanoic.
    1. Preparare una soluzione BTC / THF fresca. Aggiungere unpproximately 200 mg di BTC nel flaconcino in una cappa aspirante, sigillare con il tappo. Pesare la quantità di BTC nel flacone. Calcolare la quantità di solvente necessaria e aggiungere THF anidro nella fiala per fare un / ml soluzione BTC / THF 20 mg.
    2. Preparare la / miscela di BTC acidi bromo. Aggiungere (R)-2-acido bromopropanoic (89 ml, 0,95 mmoli) e (S)-2-bromopropanoic acido d-4 (89 microlitri, 0,95 mmol) in due piccole fiale separatamente. Per ogni flacone, aggiungere 5 ml di soluzione di 20 mg / ml BTC / THF sopra. Sigillare i due fiale e metterli in freezer a -20 ° C per 20 min.
    3. Aggiungere 1,125 ml, 02:01 THF / DIPEA (750 ml THF, 375 microlitri DIPEA, 2.2 mmol) per siringa R e S separatamente. Mescolare le perline con la punta della pipetta. Lasciate riposare per 5 minuti.
    4. Prendere i due raffreddata acidi bromo / miscele BTC dal punto 5.2.2, aggiungere 2,4,6-Trimethylpyridine (356 ml, 2.7 mmol) per ciascuna flaconcini. Precipitati bianchi formeranno immediatamente. Applicare direttamente la sospensione corrispondenteper le perline basificata (siringa R e S nel passaggio 5.2.3) il più presto possibile e poi metterli su un agitatore per scuotere sotto 120 rpm per 2 ore.
      Nota: La soluzione nei reattori siringa dovrebbe essere una sospensione giallastra pallida durante tutto il corso della reazione. Un colore più scuro è indice di eccessivo calore rilasciato durante l'aggiunta iniziale della soluzione di cloruro acido. Questo può essere risolto da un ulteriore raffreddamento o diluire l'/ miscela di BTC acidi bromo.
  3. Siringa B. Accoppiamento acido bromoacetico con DIC
    1. Preparare un fresco 20 ml, soluzione 2 M di acido bromoacetico / DMF. Preparare un 20 ml, soluzione 2 M DIC / DMF.
    2. Aggiungere 2 ml di soluzione di acido 2 M / DMF bromoacetico a siringa B, agitare delicatamente. Aggiungere 2 ml di soluzione 2 M DIC / DMF a siringa B, agitare delicatamente.
    3. Mettere la siringa B sullo stesso shaker come siringa R e S
  4. Dopo 2 ore, prendere la siringa R, S e B da shaker. Lavare accuratamente tutte le tre siringhe con DCM 5x. Lavare quindi con DMF 5x. Si noti che la siringa R e S non possono essere lavati con DMF prima di essere lavato con DCM o THF prima.
  5. Pool tutte le perline di siringhe R, S e B in un reattore siringa da 12 ml. Lavare tutte le perline con DMF 5x.
  6. Aggiungere 10 ml di 01:01 DCM: DMF alla siringa; usare una pipetta 1000 ml con un puntale troncato di dividere tutte le perline in modo uniforme in 7 singoli 2 ml siringhe, etichettarli come A1-A7.
  7. Amminazione. Preparare 10 ml, 2 M primari soluzioni ammina / DMF per ognuno dei 7 ammine elencate nella Figura 5. Aggiungere 5 ml di each ammina alla siringa corrispondente A1-A7. Incubare tutti i 7 siringhe in un incubatore a 60 ° C con agitazione durante la notte.
  8. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente tutte le perline con DMF. Prendete un paio di perle da ogni siringa e verificare con il test cloranile. Se i grani diventano di colore verde (positivo) entro 3 minuti, procedere con il passaggio successivo. In caso negativo, ripetere il punto 5.7 per le siringhe negativi.
  9. Ripetere i passaggi 5,1-5,8 2x per completare il trimero. Passaggio facoltativo: dopo ogni ciclo, si consiglia di controllare la qualità di sintesi mediante spettroscopia di massa come descritto di seguito. Tutti i 9.261 composti sono ora sintetizzati in perline tentagel come biblioteca OBOC.
  10. Massa spettroscopica conferma di PTA.
    PTA sono oligomeri altamente strutturati e possiedono molte caratteristiche comuni dei peptidi N-metilato. Uno dei problemi comuni di sintesi in fase solida dei peptidi N-metilato è la degradazione dell'acido durante TFA scissione. Per sopprimere degradazione dell'acido, scissione di molecole come ciclosporina dasupporto solido è spesso effettuato a bassa temperatura. Abbiamo confrontato diverse condizioni nell'incisione per scindere molecole diverse PTA dal supporto solido. Abbiamo scoperto che, in generale, a bassa temperatura e concentrazione TFA ridotta potrebbero effettivamente sopprimere la degradazione acida e fornire composti puri.
    1. Preparare 10 ml di soluzione 1:01 TFA / DCM in una provetta da 15 ml. Sigillare il tubo e metterlo in freezer a -20 ° C per 20 min.
    2. Lavare le perline che devono essere scisso con DCM 5x. Agitare le perline in DCM per 15 minuti e lavare le perline nuovo con DCM 5x.
    3. Scolare la DCM dalla siringa. Utilizzare un microscopio ottico e una pipetta con punta tronca per trasferire ogni singola perla in una piastra a 96 pozzetti, una perla per pozzetto.
    4. Coprire la piastra a 96 pozzetti con una scivolata di copertura. Inserire il piatto in un freezer a -20 ° C per 15 min.
    5. Prendere la soluzione raffreddata 01:01 TFA / DCM dal punto 5.10.1 e aggiungere 20 microlitri di ciascun pozzetto che contiene una perlina. Mettere il vetrino posteriore e put la piastra a 96 pozzetti in un agitatore a -20 ° C frigorifero.
    6. Agitare per 20 min. Prendere la piastra a 96 pozzetti fuori e staccare la polizza di copertura. Blow-asciugare il TFA / DCM da ogni pozzetto soffiando aria o argon su di esso. Se più di 10 perle sono spaccati, un speedvac può essere utilizzato per asciugare il TFA / DCM da tutta la piastra. Si noti che, a questo punto, non tutti i composti sono spaccati off le perline, ma i composti incisa dovrebbe essere più che sufficiente per eseguire l'analisi di spettrometria di massa.
    7. Aggiungere 20 microlitri 06:04 ACN: H 2 O soluzione per sciogliere i composti clivati ​​da ogni pozzetto. Spot 0,6 ml di ciascuna soluzione di composto con 0,6 microlitri matrice CHCA MALDI sulla piastra MALDI.
    8. Utilizzare spettrometria di massa MALDI per determinare il peso molecolare e la sequenza (MS / MS) di ciascun composto.

6. Cloranil test

  1. Preparare i seguenti reagenti freschi per ciascuna prova. Soluzione A: 2% cloranile (CAS: 118-75-2) in DMF. SoluzioneB: 2% acetaldeide (CAS: 75-07-0) in DMF.
  2. Miscelare 100 ml di soluzione A con 100 ml di soluzione B prima della prova in una provetta da 1,5 ml; cadere le perline e agitare delicatamente. Se i grani diventano blu entro 5 minuti, indica la presenza di ammina secondaria sulla superficie delle perle. Ammine primarie danno un colore marrone scuro invece di girare blu.

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Representative Results

Qui vi mostriamo tre spettri rappresentativi MALDI da un trimero PTA con linker. Come mostrato nella Figura 6A, quando spaccati a temperatura ambiente utilizzando il 50% di soluzione di TFA / DCM, degradazione significativa si osserva. In Figura 6A, picco 593 e 484 corrispondono al linker e il trimero PTA, rispettivamente, mostrano che l'intera molecola è stato sintetizzato con successo sul tallone ma degradato durante scissione. Quando spaccati in condizioni di bassa temperatura come descritto sopra, la quantità di degradazione TFA indotta è notevolmente soppressa come mostrato in Figura 6B. Il meccanismo di tale scissione è stata descritta in precedenti letterature 24, e si ritiene passare attraverso un intermedio ossazolidina. Molecole PTA possono essere sequenziati da MS / MS e il pattern di frammentazione è simile a quella di peptidi e peptoids, come illustrato nella Figura 6C. Molecole PTA sintetizzati con (S)-2-bromopropanoic acido d-4 generalmente give ampio picco sulla MS e MS / MS spettri per la presenza di prodotti deuterizzazione incomplete come (S)-2-bromopropanoic acido d-3 (Figure 7A e 7B). Questo potrebbe essere utilizzato come indicazione della presenza del centro chirale R (invertito da S durante amminazione) durante la procedura di sequenziamento. Abbiamo anche scoperto che le molecole di PTA hanno la tendenza a formare addotti più sodiated di peptoid / peptide, quindi l'acqua di sodio bassa (come l'acqua dionized) e apparecchi di plastica sono preferibili (Figura 7C). Un altro sottoprodotto che può essere osservata in sintesi PTA è l'acrilammide costituito dall'eliminazione di bromuro durante amminazione (Figura 7C). Una volta che l'acrilammide si forma, la sequenza viene terminata. Questo può essere risolto abbassando la concentrazione di ammina primaria di 1 M al fine di ridurre la basicità della soluzione. Si consiglia di eseguire il test cloranile dopo ogni passaggio di acilazione e con spectr massaoscopy per controllare il prodotto dopo ogni passo amminazione per garantire la qualità della biblioteca.

Figura 1
Figura 1. Strutturale confronto di peptide, peptoid, PTA e peptide N-metilato. PTA include peptide (R 2 = H), peptoid (R 1 = H) e peptide N-metilato (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . B) PTA preferisce trans legame ammidico conformazione a causa del impedimento sterico tra due catene α-side. C) PTA ha anche una conformazione preferita per 1,3 ceppo allilico tra N-sostituto e catena α-side. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 2. Sintesi Sub-monomero di peptoid (R ­ 1 = H) e PTA (R 1 ≠ H). Il primo passo è la acilazione acido dell'ammina. Secondo passo è amminazione con ammine primarie. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Installazione di reazione. A 250 ml a tre colli pallone a fondo rotondo viene messo in un gelato / etilene glicole bagno asciutto. Il collo centrale è collegata con una pressione di 150 ml imbuto gocciolatore con compensatore. I colli sinistro e destro sono sigillati con un adattatore di controllo del flusso e un setto wesima un lungo ago che permette il flusso di argon passare. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Fondamenti di sintesi split-e-pool. Perle vergini sono suddivise in tre porzioni, trattati separatamente con reagente A, B e C. Dopo la prima reazione, tutti e tre porzioni di perle vengono raggruppati insieme e mista. Perline aggregati sono divisi nuovamente in tre porzioni e nuovamente trattate con lo stesso reagente per ogni singola porzione. Dopo la seconda reazione, sono sintetizzati 9 composti diversi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Tre PTA sono sintetizzati dopo il linker pentamero peptoid Figura 5. Panoramica struttura Biblioteca.. Diversità teorica, 3 3 3 X 7 = 9261. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Tipica spettri di massa MALDI di un trimero PTA. A) Trimer PTA spaccati del 50% TFA / DCM a temperatura ambiente. Struttura PTA come mostrato, [M +1] + = 1.077, [M + Na] + = 1.098,9, PTA frammentazione di TFA clivaggio è chiaramente visibile sullo spettro. B) Trimer clivaggioEd. by 50% TFA / DCM in condizioni ottimizzate come descritto nel documento. TFA-indurre degradazione dell'acido è notevolmente soppressa. C) MS / MS spettro del trimero PTA. Y7 debole segnale (916) viene osservato, questo è un tipico comportamento frammentazione per PTA. Spectra analizzato e generato da mMass 32. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. MALDI spettri di sintesi PTA con isotopica etichettato monomero e tipica sottoprodotti. A) confronto MS spettri di molecole PTA sintetizzate da blu: (R)-2-bromopropanoic [M +1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 e rosso: (S) - 2-bromopropanoic acido d-4 [M +1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799. B) MS / MS modelli di frammentazione delle due molecole indicate in A). Si noti che a causa della presenza di d 1, d 2, d 3 spezie (deuterizzazione incompleto di alanina), molecole sintetizzate da (S)-2-bromopropanoic acido d-4 generalmente indica picchi più ampi C) Rosso:. Spettro di un PTA dimero sintetizzato e spaccati in condizioni ottimizzate. Blu:. PTA dimero sintetizzato con 2 soluzione M methoxyethylamine e scissa in normale acqua filtrata Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di oligomeri peptidomimetici. Oltre ai peptidi ben studiato, peptoids e peptidi N-metilati, una gran parte di composti all'interno di questa famiglia rimane understudied, majorly a causa della mancanza di metodo sintetico per accedere generali peptidi N-alchilati. Qui si descrive un metodo efficace per sintetizzare PTA con blocchi chirali derivati ​​da amminoacidi. In precedenza, abbiamo riportato di utilizzare un nuovo percorso sub-monomero di librerie di sintesi di molecole PTA 23. Abbiamo dimostrato che la PTA sono oligomeri altamente strutturati che possiedono trattiene conformazionale attraverso la spina dorsale. Quando la prova in vivo, molecole PTA hanno mostrato una migliore permeabilità delle cellule e quindi migliorata attività 25. Tuttavia, accanto a tutti i vantaggi, PTA anche venire con alcune sfide sintetici, majorly dal acilazione di ammine secondarie in posizioni ostacolato. La catena α-laterale che fornisce conformazionalerestrizione porta anche sterico consultato fase di accoppiamento. Per superare queste sfide sintetici, abbiamo effettuato un ampio studio di ottimizzazione e determinati BTC come il miglior reagente di accoppiamento per questa reazione 23.

Il passaggio chiave della via di sintesi è BTC facilitato acilazione della ammina secondaria. Durante questo processo, BTC consente la generazione di un cloruro acido in situ 26,27. La maggior parte degli altri reagenti di accoppiamento, che formano sia esteri attivi o anidridi acide come intermedi non sono riusciti a fornire acilazione pulita per sintesi continua PTA. L'esistenza di unità PTA precedenti compromette fortemente l'efficienza di accoppiamento delle seguenti unità PTA causa dell'impedimento sterico. Pertanto, per la sintesi di diversi PTA, un intermedio altamente attivo con un piccolo gruppo uscente è fortemente preferito. Tra tutte le condizioni di accoppiamento che abbiamo testato, in situ generato cloruro acido da BTC funziona il best in mano. Tuttavia, anche con i cloruri di acidi altamente attivi, si consiglia di evitare ammine impedite altamente sterici come α-ramificata ammine primarie in sintesi biblioteca a meno testato in anticipo. Ammine aromatiche come Anile spesso portano alla sostituzione incompleta e quindi dovrebbe anche essere evitata. Durante la fase di accoppiamento BTC, la soluzione deve essere sempre un giallo pallido al colore arancione; una soluzione di colore più scuro è indice di surriscaldamento e può deteriorare la resa e aumento della formazione di sottoprodotti. Questo può generalmente essere risolto ulteriore raffreddamento della soluzione BTC, ridurre le dimensioni della reazione e veloce trasferimento della soluzione BTC / acido attivato. Oltre BTC, N-etossicarbonil-2-etossi-1 ,2-diidrochinolina (EEDQ) è un altro reagente di accoppiamento che funziona bene in sintesi PTA. L'intermedio chiave è una anidride carbonica mescolato con un relativamente piccolo gruppo uscente. Nel caso di EEDQ, 3 equivalenti di EEDQ viene sciolto insieme con l'acido in DCM e poi apmoltiplicato per le perline a temperatura ambiente. La reazione avviene normalmente entro 2 ore con lieve agitazione. Questa reazione rilascia CO 2 durante la reazione; quindi il sistema di reazione non deve essere chiuso.

Un altro passo fondamentale è la scissione e la caratterizzazione di molecole PTA. Un distintivo MS / MS modello frammentazione è stata osservata durante la sequenziazione molecole PTA via MALDI-MS/MS (Figura 6). È costituita con una bassa intensità dell'ultimo ione y (viola in Figura 6C e maggiore intensità di Y6, Y5 Y4, b2, b3) ioni. Modelli analoghi sono stati osservati da N-metilato frammentazione peptide nella relazione precedente 28. A causa della maggiore stabilità del ossazolidina intermedio, peptidi N-metilati tendono a dare ioni forti B 28. Inoltre, è ben noto che il peptide N-metilato sono acido labile sia durante clivaggio TFA e spettroscopia di massa MALDI 24,28, 29. Studi meccanicistici ha dimostrato che a causa della restrizione conformazionale sul backbone, l'atomo di ossigeno carbonilico del residuo precedente è spesso in prossimità del gruppo carbossile nel sito di clivaggio, promuovendo così la formazione della ossazolidina intermedio 29. Per i motivi di cui sopra, sia PTA e peptidi N-metilato devono essere spaccati da supporti solidi a bassa temperatura con concentrazioni controllate di TFA 26, 30. Nella nostra esperienza, il metodo più conveniente per clivaggio singoli residui PTA si verifica a -20 ° C con una soluzione di -20 ° C pre-raffreddata di 50% TFA / DCM. Questa procedura sopprime notevolmente la formazione di prodotti degradati acidi.

Dopo aver imparato questa tecnica, biblioteca PTA monomero derivato da altri aminoacidi naturali come leucina, fenilalanina, glutammina, ecc può essere sintetizzato come bene. Una biblioteca PTA di alta qualità può essere schermato against vari bersagli proteici che utilizzano i nostri pubblicati in precedenza protocolli di screening sul tallone 31. Hit composti identificati dallo screening può essere caratterizzato mediante spettroscopia di massa e risintetizzato per ulteriore prova secondo il protocollo descritto sopra.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jumpei Morimoto e il Dr. Todd Doran per la preziosa assistenza. Questo lavoro è stato supportato da un contratto del NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

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References

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