Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التجميعي تقسيم وبركة وتوصيف الببتيد المكتبة أميد العالي

Published: June 20, 2014 doi: 10.3791/51299
Automatic Translation
1, 1
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

Summary

الببتيد الأميدات العالي (اتفاقيات التجارة التفضيلية) هي الفصيلة من peptidomimetics التي تشمل ولكن لا تقتصر على الببتيدات، peptoids والببتيدات ميثليته N-. نحن هنا تصف طريقة الاصطناعية الذي يجمع بين كل تقسيم وحمام سباحة واستراتيجيات مونومر فرعية لتجميع، حبة واحدة مكتبة المجمع واحدة من اتفاقيات التجارة التفضيلية.

Abstract

Peptidomimetics هي مصادر كبيرة من البروتين بروابط. طبيعة من oligomeric من هذه المركبات تمكننا من الوصول إلى المكتبات الاصطناعية كبير على المرحلة الصلبة باستخدام الكيمياء اندماجي. واحدة من الفئات الأكثر مدروسة من peptidomimetics هو peptoids. Peptoids سهلة لتجميع ولقد ثبت أن تكون مقاومة للتحلل البروتين وخلايا قابلة للاختراق. على مدى العقد الماضي، تم تحديد العديد من البروتين بروابط مفيدة من خلال الفحص المكتبات peptoid. ومع ذلك، فإن معظم بروابط حدد من المكتبات peptoid لا تعرض تقارب عالية، مع استثناءات نادرة. قد يكون هذا بسبب، في جزء منه، إلى عدم وجود مراكز مراوان والقيود بتكوين جزيئات في peptoid. في الآونة الأخيرة، وصفنا مسار الاصطناعية الجديدة للوصول الببتيد الأميدات العالي (اتفاقيات التجارة التفضيلية). اتفاقيات التجارة التفضيلية هي الفصيلة من peptidomimetics التي تشمل ولكن لا تقتصر على الببتيدات، peptoids والببتيدات ميثليته N-. مع السلاسل الجانبية على كلا α الكربون وذرات النيتروجين سلسلة الرئيسية،التشكل من هذه الجزيئات مقيدة إلى حد كبير من قبل عائق sterical وallylic 1،3 السلالة. (الشكل 1) دراستنا تشير إلى أن هذه الجزيئات منطقة التجارة التفضيلية ومنظم للغاية في حل، ويمكن استخدامها لتحديد بروابط البروتين. ونحن نعتقد أن هذه الجزيئات يمكن أن تكون مصدرا مستقبل عالية تقارب بروابط البروتين. نحن هنا وصف طريقة تركيبية تجمع بين قوة كل من الانقسام وحمام سباحة واستراتيجيات مونومر فرعية لتجميع عينة حبة واحدة في مركب واحد (OBOC) مكتبة اتفاقيات التجارة التفضيلية.

Introduction

Peptidomimetics هي مركبات التي تحاكي بنية الببتيدات الطبيعية. أنها مصممة على الإبقاء على النشاط الحيوي في حين التغلب على بعض المشاكل المرتبطة الببتيدات الطبيعية، بما في ذلك نفاذية الخلية والاستقرار ضد التحلل البروتيني 1-3. نظرا لطبيعة من oligomeric من هذه المركبات، والمكتبات الاصطناعية الكبيرة يمكن الوصول إليها بسهولة من خلال الطرق التركيبية أحادى أو دون أحادى 4-7. واحدة من الفئات الأكثر دراسة من peptidomimetics هو peptoids. Peptoids هي الأوليغومرات من GLYCINES N-الألكيلية التي يمكن توليفها بسهولة باستخدام استراتيجية مونومر الفرعي 8، 9. وقد تم تحديد العديد من البروتين بروابط مفيدة بنجاح من فحص المكتبات peptoid الاصطناعية كبيرة ضد أهداف البروتين 1، 10-14. ومع ذلك، "يضرب" حدد من المكتبات peptoid نادرا ما أرشفة تقارب عالية جدا نحو تحقيق الأهداف البروتين 1،10-14،22. واحد أماهJOR الفرق بين peptoids والببتيدات الطبيعي هو أن معظم peptoids عموما تفتقر إلى القدرة على تكوين هيكل الثانوي نظرا لعدم وجود مراكز مراوان والقيود متعلق بتكوين جزئي. من أجل حل هذه المشكلة، وضعت استراتيجيات متعددة على مدى العقد الماضي، مع التركيز بشكل كبير على تعديل السلاسل الجانبية الواردة على ذرات النتروجين سلسلة الرئيسية 15-22. في الآونة الأخيرة، وقد وضعنا طريقا الاصطناعية الجديدة إلى تقديم السلاسل الجانبية الأحماض الأمينية الطبيعية على العمود الفقري peptoid لإنشاء الببتيد الأميدات العالي 23.

الببتيد الأميدات العالي (اتفاقيات التجارة التفضيلية) هي عائلة السوبر من peptidomimetics التي تشمل ولكن لا تقتصر على الببتيدات (R 2 = H)، peptoids (R 1 = H) والببتيدات ميثليته N-(R 1 ≠ H، R 2 = عني) . (انظر الشكل 1) لدينا المسار الاصطناعية توظف طبيعيا الأحماض الأمينية كمصدر للشرليتي والجانب سلاسل على45؛ الكربون، والأمينات الأولية المتاحة تجاريا لتوفير N-بدائل. وبالتالي، مساحة الكيميائية أكبر من الببتيدات بسيطة، peptoids أو الببتيدات ميثليته N-يمكن استكشافها. وقد أظهرت أطياف ازدواج اللون التعميم ومنظم للغاية أن جزيئات منطقة التجارة التفضيلية في الحل. توصيف واحد من المجمعات منطقة التجارة التفضيلية البروتين يبين بوضوح أن القيود متعلق بتكوين جزئي من منطقة التجارة التفضيلية المطلوبة للربط. مؤخرا، اكتشفنا أيضا أن بعض الجزيئات تمتلك منطقة التجارة التفضيلية تحسين نفاذية الخلية من peptoid والببتيد نظرائهم. ونحن نعتقد أن هذه المكتبات منطقة التجارة التفضيلية يمكن أن يكون مصدرا جيدا للبروابط عالية تقارب لأهداف البروتين. في هذه الورقة، وسوف نناقش تجميع عينة حبة واحدة في مركب واحد (OBOC) مكتبة PTA في التفاصيل جنبا إلى جنب مع بعض الظروف المحسنة للاقتران والانقسام لهذه المركبات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. أساسيات سبليت وبركة التجميعي

من أجل توليد كفاءة عدد كبير من المركبات على المرحلة الصلبة، وغالبا ما يتم توظيف التوليف تقسيم وتجمع كاستراتيجية عامة. كما هو مبين في الشكل (4)، tentagel الخرز هي الانقسام الأول إلى ثلاثة أجزاء. وكان رد فعل كل جزء مع كاشف مختلفة، وتوليد بقايا الأولى على الخرز. بعد رد الفعل الأول، ويتم تجميع جميع أجزاء الثلاثة معا، ويخلط، ثم انقسمت إلى ثلاثة أجزاء مرة أخرى. سوف تتفاعل كل جزء مرة أخرى مع كاشف مختلفة، وتوليد بقايا الثانية على الخرز. بعد اثنين وانقسام وبركة الخطوات، يتم إنشاء تسع مركبات.

في التوليف مونومر الفرعية، وتنقسم إلى عدة حبات أول أجزاء لتتفاعل مع الأحماض برومو مختلفة في وجود اقتران كاشف. بعد غسل مع المذيبات، وسيتم تجميع كل حبات معا، والمختلطة، ثم تنقسم إلى عدة أجزاء مرة أخرى لتتفاعل مع مختلفالأمينات الأولية. بعد أمينة، يتم تجميع كل حبات معا، وغسلها جيدا، واستكمال مونومر الكامل على كل حبة. ويمكن تكرار هذه العملية حتى يتم التوصل إلى التنوع المطلوب.

2. إعداد حمض الميثيل من الأحماض الأمينية الطبيعية

في التوليف مونومر الفرعية، وينقسم تجميع كل مونومر في خطوتين منفصلتين: 1 اقتران بروميد حامض و 2 أمينة مع الأمينات الأولية (الشكل 2). من أجل تجميع الببتيد أميد التعليم العالي، وسيتم إعداد البروم حمض مراوان مع السلاسل الجانبية على الكربون ألفا من الأحماض الأمينية الطبيعية. نحن هنا وصف طريقة تحويل حمض أميني طبيعي في بروميد حمض المقابلة مع الدقة العالية ستيريو. نستخدم ألانين كمثال؛ الأحماض الأمينية الأخرى بما في ذلك سيرين، ثريونين، حمض الأسبارتيك، حمض الجلوتاميك، الأسباراجين، الجلوتامين، جليكاين، حمض أميني أساسي، آيسولوسين، ويمكن أيضا أن تتحول إلى أحماض برومو الفينيل ألانين تحت CONDITIO مماثلةنانوثانية. لاحظ أن بعض الأحماض الأمينية مع المجموعات الوظيفية مثل الفينول، جوانيداين وأمين في حاجة إلى الحماية قبل التحول. يظهر الإعداد رد فعل في الشكل 3.

احتياطات الأمان: هناك حاجة للحصول على ردود الفعل التالية التي تنطوي على دورية هارفارد، نانو 2 والمواد الكيميائية المسببة للتآكل / السامة الأخرى، ومعدات السلامة المناسبة مثل نظارات السلامة، ومعطف المختبر، والقفازات المقاومة للمواد الكيمائية. يجب أن يتم تنفيذ كل ردود الفعل في غطاء الدخان من قبل الصيدلي من ذوي الخبرة.

  1. إضافة 370 مل من الماء إلى 630 مل 48٪ محلول دورية هارفارد لإعداد 1 لتر، و 30٪ حل دورية هارفارد. إضافة 500 مل جلايكول الإثيلين في وعاء حمام 1 L؛ إضافة الثلج الجاف للحفاظ على درجة الحرارة عند -10 درجة مئوية. الحذر: 48٪ الحل دورية هارفارد حامضي بقوة وتآكل، والتعامل مع الرعاية. قراءة MSDS قبل الاستخدام.
  2. إضافة-D ألانين (8.9 غرام، 0.1 مول) وKBR (11.9 غرام، 0.1 مول) إلى 250 مل ثلاث رقبات قارورة أسفل مستديرة مع شريط مغناطيسي. إضافة 100 مل، ودورية هارفارد 30٪ أعد رانه الخطوة السابقة. وضع القارورة في حمام جلايكول الإثيلين أعدت في الخطوة 2.1 والحفاظ على درجة الحرارة عند -10 درجة مئوية. الأرجون فقاعة من خلال إبرة طويلة من الجزء السفلي من القارورة لمدة 10 دقيقة كما هو موضح في الشكل 3. تحريك الحل مع شريط مغناطيسي في 300 دورة في الدقيقة.
  3. حل نانو 2 (8.28 غرام، 0.12 مول) في كوب 100 مل مع 20 مل من الماء. إضافة الحل في الضغط معادلة اسقاط القمع وختم قمع اسقاط مع الحاجز. تتحول ببطء على صمام القمع والسماح إسقاط إسقاط حل نانو 2 في قارورة. السيطرة على صمام لضبط معدل يقطر إلى ما يقرب من 2 قطرات لكل ثانية. الحفاظ على التحريك في 300 دورة في الدقيقة والحفاظ على الأرجون محتدما من الجزء السفلي من القارورة. يجب أن تبقى في القارورة الاثيلين غليكول حمام في -10 درجة مئوية حتى يتم إضافة كافة نانو 2. تحذير: هذه الخطوة يولد حرارة والغاز خلال إضافة نانو 2 الحل. وينبغي أن يكون معدل يقطر بعناية يخدعجابت وينبغي أن يكون النظام كله مفتوح من خلال منفذ الأرجون.
  4. الحفاظ على التحريك لمدة 3 دقائق أكثر، والسماح للحرارة الاحماء من -10 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. يجب أن يكون الحل الناتج واضحة لضوء أصفر؛ إذا كان اللون داكنة جدا، وتطبيق فراغ لإزالة أكاسيد النيتروجين الزائد وممكن برازيلي 2 لدت خلال التفاعل.
  5. استخراج المنتج من الحل مع 3x 35 مل ايثر باستخدام قمع استخراج. الجمع بين المرحلة العضوية، وأغسلها مع محلول ملحي المشبعة. ويمكن أيضا أن تغسل المرحلة العضوية مع كمية صغيرة من NaHCO 3 قبل الغسيل مع الماء المالح لإزالة اللون إذا كانت مظلمة. تجفيف المرحلة العضوية على نا 2 SO 4 لمدة 6 ساعة.
  6. تصفية نا 2 SO 4 وتتبخر المذيب تحت فراغ، ينبغي الحصول على المنتج الخام واضحة إلى شاحب أصفر النفط. الناتج الخام يمكن تنقيته مزيد عن طريق التقطير في 115 درجة مئوية، 3 ملم زئبق، أو عن طريقالعمود السيليكا مع 3:01 الهكسان: خلات الإيثيل.
  7. يتم الحصول على منتج نقي مثل النفط واضحة، 6.6 غرام (العائد 74٪)، والكثافة = 1.69 جم / مل، [α] = D20 +24 ° (الميثانول)، 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، و اداه 3) δ 4.41 (ف، J = 7.0 هرتز، 1H)، 1.86 (د، J = 7.0 هرتز، 3H). في حالة (S) bromopropanoic-2 حمض د 4 (المحضرة من د 4-L-ألانين)، يتم الحصول على منتج نقي مثل النفط واضحة، تسفر عن 78٪، والكثافة = 1.72 جم / مل، [α] D20 = -19 ° (الميثانول). 1 H NMR، ويلاحظ أي إشارة H كبيرة. ESI-MS - [M-1] - = 155.1 (المتوقع 154.97). ل(S)-2-برومو-4-methylpentanoic حمض (المحضرة من L-يسين باستخدام نفس الإجراء) يتم الحصول على منتج نقي مثل النفط واضحة، تسفر عن 89٪، [α] = D20 +37 ° (الميثانول)، 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، و اداه 3) δ 4.30 (ر، J = 7.7 هرتز، 1H)، 1.94 (اليوم، J = 10.8، 3.9 هرتز، 2H)، 1.81 (ترينيداد وتوباغو، J = 13.2، 6.5 هرتز، 1H)، 0.96 (اليوم، J = 18.2، 6.6 هرتز، 7H). في حالة (S)-2-برومو-3-الظواهرحمض nylpropanoic (المحضرة من L-ألانين باستخدام نفس الإجراء) يتم الحصول على منتج نقي مثل زيت أصفر شاحب، تسفر عن 72٪، [α] = D20 +17 ° (الميثانول)، 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، و اداه 3) δ 7.38 - 7.19 (م، 5H)، 4.42 (اليوم، J = 8.1، 7.3 هرتز، 1H)، 3.47 (اليوم، J = 14.2، 8.2 هرتز، 1H)، 3.25 (اليوم، J = 14.2، 7.2 هرتز، 1H).

3. صفها النظائر من ألانين باستخدام ناقلة

في التوليف مكتبة اندماجي، وخاصة في تركيب تقسيم وبركة من حبة واحدة في مركب واحد (OBOC) المكتبات، وكمية من المركب الذي يمكن الحصول عليه من كل حبة صغيرة نسبيا. (عادة 1 إلى 10 نانومول بمول). بالإضافة إلى ذلك، يستخدم على نطاق واسع الطيف الكتلي لتحديد وتوصيف مركب النهائي نظرا لحساسيته العالية. من أجل استخدام مطياف الكتلة لتحديد الفراغية المطلقة في مراكز مراوان من المنتجات النهائية لمنطقة التجارة التفضيلية، وينبغي أن يكون متبلور مضاد حامض برومو isotoوصفت pically قبل الاستخدام. نحن هنا وصف طريقة استخدام ناقلة وD 2 O لتسمية L-ألانين.

  1. تذوب-L ألانين (300 ملغ، 3.36 ملمول) مع 10 مل من D 2 O في أنبوب 50 مل البولي اثيلين. إضافة α-كيتوغلوتارات (10 ملغ، 0.068 ملمول) كما شارك في الركيزة. الاحماء أنبوب إلى 37 ° C وضبط PD إلى 8،5-8،7 باستخدام SOUTION 1 M NaOD. ملاحظة: يتم تحديد PD بواسطة الرقم الهيدروجيني شرائط الاختبار. التقليدية الكهربائية درجة الحموضة متر مجهزة الزجاج الكهربائي الانتقائي للH + قد يعطي غير صحيحة تلا لD +.
  2. إضافة ناقلة ألانين (0.1 ملغ، EC 2.6.1.2 من قلب خنزير، روش تشخيص، انديانابوليس، IN) إلى PD 8،5-8،7، 37 ° C حل أعدت من الخطوة السابقة. وضع أنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز خفيف، ويفضل 10 إلى 30 دورة في الدقيقة.
  3. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، واتخاذ 0.5 مل من محلول O D 2 وتحقق التقدم رد فعل من قبل 1 H-NMR. كل إشارات بروتون منlanine، δ 3.76 (ف، J = 7.2 هرتز، 1H)، 1.46 (د، J = 7.3 هرتز، 3H)، 1 H NMR 400 ميغاهيرتز، ينبغي قمعها بشكل كبير بسبب معالجة بالديوتريوم. يجب أن يتم تبادل أكثر من 98٪ من البروتون لالديوتيريوم كما هو موضح سابقا 23. ملاحظة: D 2 O يمكن استردادها جزئيا عن طريق التقطير إذا أجري التفاعل على نطاق واسع (> 200 مل D 2 O). عادة، 60٪ إلى 80٪ من D 2 O ويمكن أن يستخلص من الحل.
  4. تجميد الحل أعلاه مع النيتروجين السائل ويجفد ذلك باستخدام مجفاد الحصول الأبيض بالديوتيريوم-L ألانين مسحوق.

4. توليف Peptoid رابط المنطقة

ليس مطلوبا المنطقة رابط لتخليق مكتبة منطقة التجارة التفضيلية. ومع ذلك، من أجل تجنب خلفية عالية في الجزء الأسفل من نطاق الوزن الجزيئي (100-600) من MALDI الطيفي الشامل وتحسين التأين من المركبات، وكثيرا ما يستخدم لرابط peptoid مع مخلفات متعددة القطبية. هذا peptoid لينيمكن توليفها كير من خلال معيار الإجراء التوليف peptoid. هنا سوف نقوم توليف مخموس من N-methoxyethyl الجلايسين كما رابط (كما هو موضح في الشكل 5).

  1. تنتفخ 90 ميكرومتر الخرز Tentagel مع RAM رابط (1 غرام، 0.27 مليمول / ز) في 10 مل لمدة 3 ساعة DMF في مفاعل حقنة 12 مل مع اهتزاز خفيف.
  2. استنزاف DMF من المفاعل وإضافة 10 مل 20٪ محلول تأكسد DMF لdeprotect المجموعة fmoc من أميد رابط تزلج. يهز الخرز مع 20٪ محلول تأكسد لمدة 30 دقيقة. تغسل مع DMF 5X لإزالة جميع تأكسد.
  3. يستغرق بضع حبات الخروج من الحقنة واختبار مع اختبار الكلورانيل. يجب أن تتحول حبات البني الداكن (الكلورانيل اختبار إيجابي لأمين الابتدائي) إذا تم deprotected fmoc بنجاح.
  4. إعداد الحلول التالية: 1 مل 20، 2 M bromoacetic محلول حمض / DMF؛ 2 مل 20، مدينة دبي للإنترنت الحل 2 M / DMF.؛ 3 10 مل، 1 M methoxylethylamine / DMF الحل.
  5. إضافة 5 مل من 2 M bromoacetic محلول حمض / DMF لالخرز، ويهز بلطف. ثم يضاف 5 مل من مدينة دبي للإنترنت 2 M / DMF حل لالخرز؛ ختم المحاقن مع المكبس ووضعها على شاكر. يهز لمدة 10 دقيقة.
  6. تغسل حبات مع DMF بدقة. إضافة 2 مل من محلول 1 M methoxyethylamine / DMF أعدت من الخطوة 4.4 إلى الخرز. ختم المحاقن مع المكبس والتخلص منه على شاكر لمدة 30 دقيقة.
  7. تغسل حبات مع DMF 5X. تحقق حبات قليلة مع اختبار الكلورانيل، إذا الإيجابية (حبات بدوره الزرقاء)، ثم تابع إلى الخطوة التالية. خلاف ذلك، كرر الخطوة 4.6.
  8. كرر الخطوات من 4،5-4،7، 4X لاستكمال مخموس.

5 التجميعي سبليت وبركة من منطقة التجارة التفضيلية مع مكتبة (R) - و (S)-2-bromopropionic الأحماض

نحن هنا وصف تركيب مكتبة صغيرة لمنطقة التجارة التفضيلية مع التنوع النظري من 9،261 مركبات باستخدام ز 1 من حبات من الخطوة 4.8. لاحظ أن 90 ميكرومتر tentagel حبة تحتوي على ما يقرب من 2.9 مليون حبات لكل غرام؛ وبالتالي فإن التكرار منوسوف تكون المكتبة 2.9 × 10 6 / 9،261 = 312 نسخة. سوف نستخدم حمض bromoacetic، (R)-2-bromopropanoic والنظائر (S) وصفت-2-bromopropanoic حمض د 4 كما الأحماض، و7 الأمينات مختلفة (A1 ~ A7، انظر الشكل (5) لمزيد من التفاصيل) لأمينة. وسوف تستخدم المفاعلات حقنة ومشعب فراغ لأداء التوليف.

  1. إضافة 10 مل 1:1 DCM: DMF إلى حقنة من الخطوة 4.8؛ استخدام ماصة ميكرولتر 1،000 مع طرف ماصة اقتطاع لتقسيم كل 1 غرام الخرز بالتساوي إلى ثلاث مفاعلات 5 مل حقنة. تسمية لهم كما B (حمض bromoacetic)، R ((R)-2-bromopropanoic) و S ((S)-2-bromopropanoic حمض د 4). يغسل كل 3 محاقن مع DCM 3X، ويغسل المحاقن المسمى مع R و S مع اللامائية THF 3X، وغسل حقنة المسمى مع B مع DMF 3X.
  2. حقنة R و S. BTC اقتران حمض bromopropanoic.
    1. يعد حل BTC / THF الطازجة. إضافةpproximately 200 ملغ من BTC في قارورة في غطاء الدخان، وختم ذلك مع الغطاء. تزن كمية BTC في القارورة. حساب كمية المذيبات المطلوبة وإضافة THF اللامائية في قارورة لجعل 20 ملغ / مل حل BTC / THF.
    2. إعداد الأحماض برومو / خليط BTC. إضافة (R)-2-bromopropanoic حمض (89 ميكرولتر، 0.95 ملمول) و (S)-2-bromopropanoic حمض د 4 (89 ميكرولتر، 0.95 ملمول) في اثنين من قارورة صغيرة بشكل منفصل. إلى كل قارورة، إضافة 5 مل من محلول 20 ملغ / مل BTC / THF أعلاه. ختم قارورة اثنين ووضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. إضافة 1،125 ميكرولتر، 02:01 THF / DIPEA (750 ميكرولتر THF، 375 ميكرولتر DIPEA، 2.2 ملمول) لمحقنة R و S بشكل منفصل. مزج الخرز مع طرف ماصة. السماح لهم الجلوس لمدة 5 دقائق.
    4. تأخذ اثنين من الأحماض تبريد برومو / مخاليط BTC من الخطوة 5.2.2، إضافة 2،4،6-Trimethylpyridine (356 ميكرولتر، 2.7 ملمول) إلى كل قارورة. سوف رواسب بيضاء تشكل على الفور. تطبيق تعليق المقابلة مباشرةلحبات basified (حقنة R و S في الخطوة 5.2.3) في أقرب وقت ممكن ومن ثم وضعها على شاكر لزعزعة تحت 120 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحل في المفاعلات حقنة تعليق مصفر شاحب خلال دورة كاملة من رد الفعل. A لون أغمق هو مؤشر للحرارة المفرطة صدر خلال إضافة الأولي من محلول كلوريد حامض. هذا يمكن حلها عن طريق مزيد من تهدئة أو تخفيف الأحماض برومو / خليط BTC.
  3. حقنة B. اقتران حمض Bromoacetic مع مدينة دبي للإنترنت
    1. إعداد الطازجة 20 مل، والحل 2 M حمض bromoacetic / DMF. إعداد 20 مل، والحل 2 M مدينة دبي للإنترنت / DMF.
    2. إضافة 2 مل من 2 M bromoacetic محلول حمض / DMF لمحقنة B، يهز بلطف. إضافة 2 مل من محلول 2 M مدينة دبي للإنترنت / DMF لمحقنة B، يهز بلطف.
    3. وضع حقنة B على نفس شاكر كما حقنة R و S
  4. بعد 2 ساعة، واتخاذ حقنة R، S و B من شاكر. يغسل كل ثلاثة محاقن تماما مع DCM 5X. ثم تغسل مع DMF 5X. نلاحظ أن حقنة R و S لا يمكن غسلها مع DMF قبل أن يتم غسلها مع DCM أو THF الأولى.
  5. تجمع جميع حبات من المحاقن R، S و B في واحد 12 مل حقنة المفاعل. يغسل كل الخرز مع DMF 5X.
  6. إضافة 10 مل 1:1 DCM: DMF إلى حقنة؛ استخدام ماصة ميكرولتر 1،000 مع طرف ماصة اقتطاع لتقسيم كل الخرز بالتساوي في 7 فرد 2 مل المحاقن، وتسمية لهم كما A1-A7.
  7. أمينة. تحضير 10 مل، 2 M حلول أمين / DMF الأولية لكل من 7 الأمينات المدرجة في الشكل 5. إضافة 5 مل من مجموعة شرق افريقياح حل الأمينات إلى حقنة المقابلة A1-A7. احتضان جميع المحاقن 7 في حاضنة 60 درجة مئوية مع الهز بين عشية وضحاها.
  8. بعد الحضانة، وغسل كل الخرز تماما مع DMF. يستغرق بضع حبات من كل حقنة وتحقق مع اختبار الكلورانيل. إذا كانت حبات يتحول إلى اللون الأخضر (إيجابية) في غضون 3 دقائق، والمضي قدما مع الخطوة التالية. إذا كان سلبيا، كرر الخطوة 5.7 لمحاقن سلبية.
  9. كرر الخطوات من 5،1-5،8 2X لاستكمال مثلوث. خطوة اختيارية: بعد كل دورة، ونحن نوصي للتحقق من جودة تجميعي من التحليل الطيفي الشامل كما هو موضح أدناه. وقد تم تجميع جميع المركبات 9،261 الآن على حبات tentagel كما مكتبة OBOC.
  10. كتلة تأكيد الطيفية من اتفاقيات التجارة التفضيلية.
    اتفاقيات التجارة التفضيلية هي الأوليغومرات منظم للغاية وتمتلك العديد من القواسم المشتركة من الببتيدات ميثليته N-. واحدة من المشاكل المشتركة للتوليف المرحلة الصلبة من الببتيدات ميثليته N-هو تدهور حمض خلال TFA الانقسام. لقمع تدهور حامض، والانقسام من الجزيئات مثل السيكلوسبورين منوعادة ما تجرى دعم قوي من تحت درجة حرارة منخفضة. قارنا مختلف الظروف الشق الشق لمنطقة التجارة التفضيلية جزيئات مختلفة من الدعم الصلبة. وجدنا أن، عموما، وانخفاض درجة الحرارة وانخفاض تركيز TFA يمكن قمع فعال تدهور حمض وتوفير مركبات أنقى.
    1. تحضير 10 مل 01:01 TFA / DCM الحل في أنبوب 15 مل. ختم الأنبوب ووضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. تغسل حبات التي تحتاج إلى المشقوق مع DCM 5X. يهز حبات في DCM لمدة 15 دقيقة وتغسل حبات مرة أخرى مع DCM 5X.
    3. استنزاف DCM من الحقنة. استخدام المجهر الضوئي وماصة مع طرف اقتطاع لنقل كل حبة الفردية في لوحة 96 جيدا، وحبة واحدة لكل بئر.
    4. تغطية لوحة 96 جيدا مع انزلاق الغطاء. وضع لوحة في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. اتخاذ تبريد 01:01 TFA / DCM حل من خطوة 5.10.1 وإضافة 20 ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على حبة. وضع زلة الغطاء الخلفي وبور 96 لوحة جيدا على شاكر في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    6. يهز لمدة 20 دقيقة. تأخذ لوحة 96 جيدا وتقشر انزلاق الغطاء. ضربة الجافة وTFA / DCM من كل بئر بنفخ الهواء الأرجون أو أكثر من ذلك. إذا المشقوق أكثر من 10 حبات، وspeedvac يمكن استخدامها لتجفيف TFA / DCM من لوحة كاملة. لاحظ أنه عند هذه النقطة، وليس كل من المركبات والمشقوق من الخرز، ولكن ينبغي أن تكون مركبات المشقوق أكثر من كاف لإجراء التحليل الطيفي الشامل.
    7. إضافة 20 ميكرولتر 6:4 ACN: H 2 O الحل بحل المركبات المشقوق من كل بئر. بقعة 0.6 ميكرولتر من كل محلول مركب مع 0.6 ميكرولتر CHCA MALDI مصفوفة على لوحة MALDI.
    8. استخدام مطياف الكتلة MALDI لتحديد الوزن الجزيئي وتسلسل (MS / MS) من كل مجمع.

6. الكلورانيل اختبار

  1. إعداد الكواشف التالية الطازجة لكل اختبار. الحل ج: 2٪ الكلورانيل (CAS: 118-75-2) في DMF. حلB: 2٪ الأسيتالديهيد (CAS: 75-07-0) في DMF.
  2. مزيج 100 ميكرولتر من محلول A مع 100 ميكرولتر من محلول B قبل الاختبار في أنبوب 1.5 مل؛ إسقاط الخرز في ويهز بلطف. إذا كانت حبات بدوره الزرقاء خلال 5 دقائق، فإنه يشير إلى وجود الأمينات الثانوية على السطح من الخرز. الأمينات الأولية تعطي اللون البني الداكن بدلا من تحول اللون الأزرق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا تظهر ثلاثة أطياف MALDI ممثل من مثلوث منطقة التجارة التفضيلية مع رابط. كما هو مبين في الشكل 6A، عندما المشقوق تحت درجة حرارة الغرفة باستخدام 50٪ TFA / DCM الحل، لوحظ تدهور كبير. في الشكل 6A، ذروتها 593 و 484 تتوافق مع رابط ومثلوث منطقة التجارة التفضيلية على التوالي، وتبين أن جزيء كله تم تصنيعه بنجاح على حبة ولكن تدهورت خلال الانقسام. عندما المشقوق في ظل انخفاض درجة الحرارة شرط كما هو موضح أعلاه، يتم قمع كمية من التدهور الناجم عن TFA إلى حد كبير كما هو مبين في الشكل 6B. وقد وصفت هذه الآلية الانقسام في الآداب السابق 24، ويعتقد أن تذهب من خلال oxazolidine المتوسطة. جزيئات منطقة التجارة التفضيلية يمكن أن تكون متسلسلة حسب MS / MS ونمط تجزئة مماثلة لتلك التي من الببتيدات وpeptoids، كما هو مبين في الشكل 6C. جزيئات منطقة التجارة التفضيلية توليفها مع (S)-2-bromopropanoic حمض د 4 عموما زإيف الذروة أوسع على MS و MS / MS الأطياف بسبب وجود منتجات معالجة بالديوتريوم ناقصة مثل (S) bromopropanoic-2 حمض د 3 (أرقام 7A و7B). ويمكن استخدام هذا كمؤشر على وجود مركز R مراوان (المقلوب من خلال أمينة S) أثناء إجراء التسلسل. كما وجدنا أن جزيئات منطقة التجارة التفضيلية لديهم ميل لتشكيل adducts أكثر من sodiated peptoid / الببتيد، وبالتالي المياه الصوديوم منخفضة (مثل المياه dionized) وأجهزة البلاستيك ويفضل (الشكل 7C). آخر من قبل المنتج التي يمكن ملاحظتها في التوليف منطقة التجارة التفضيلية هي مادة الأكريلاميد تتكون من القضاء على بروميد خلال أمينة (الشكل 7C). مرة واحدة يتم تشكيل الأكريلاميد، يتم إنهاء تسلسل. وهذا يمكن أن تحل عن طريق خفض تركيز الأمينات الأولية إلى 1 M من أجل تقليل قاعدية من الحل. نوصي إجراء اختبار الكلورانيل بعد كل خطوة أسيلة واستخدام SPECTR الشامل oscopy للتأكد من المنتج بعد كل خطوة أمينة لضمان جودة المكتبة.

الشكل 1
الشكل 1. الهيكلي مقارنة الببتيد، peptoid، منطقة التجارة التفضيلية والببتيد N-ميثليته. تشمل منطقة التجارة التفضيلية الببتيد (R 2 = H)، peptoid (R 1 = H) والببتيد N-ميثليته (R 1 ≠ H، R 2 = عني) باء) منطقة التجارة التفضيلية تفضل عبر التشكل السندات أميد بسبب عائق sterical بين اثنين من سلسلة α الجانب. لديه C) منطقة التجارة التفضيلية أيضا التشكل المفضل نظرا ل1،3 allylic سلالة بين N-بديلا وسلسلة α الجانب. يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ن = صفحة "دائما"> الرقم 2
الشكل 2. التوليف مونومر الفرعية من peptoid (R ­ 1 = H) ومنطقة التجارة التفضيلية (R 1 ≠ H). الخطوة الأولى هي حمض أسيلة من الأمينات. الخطوة الثانية هي أمينة مع الأمينات الأولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الإعداد رد الفعل. يتم وضع 250 مل ثلاث رقبات الجولة أسفل القارورة في منطقة جافة الجليد / الاثيلين غليكول حمام. يتم توصيل الرقبة الوسط مع الضغط 150 مل معادلة اسقاط القمع. وختم رقاب اليسار واليمين مع محول التحكم في التدفق والحاجز ث إيث إبرة طويلة أن يسمح تدفق الأرجون بالمرور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. يتم تقسيم أساسيات التوليف تقسيم وبركة. حبات فارغة في ثلاثة أجزاء، وتعامل بشكل منفصل مع المتفاعلة A، B و C. وبعد رد الفعل الأول، ويتم تجميع جميع أجزاء ثلاثة من الخرز معا والمختلط. وينقسم الخرز تجميع مرة أخرى في ثلاثة أجزاء، ومرة ​​أخرى تعامل مع نفس المتفاعلة لكل جزء على حدة. بعد رد الفعل الثاني، وقد تم تجميع 9 مركبات مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

r.within صفحة = "دائما"> الرقم 5
الرقم 5. مكتبة عامة الهيكل. يتم توليفها ثلاث اتفاقيات التجارة التفضيلية بعد رابط مخموس peptoid. التنوع النظري، 3 3 X 3 = 7 9،261. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. النموذجية أطياف الكتلة MALDI من مثلوث منطقة التجارة التفضيلية. A) أرتب منطقة التجارة التفضيلية المشقوق بنسبة 50٪ TFA / DCM تحت درجة حرارة الغرفة. هيكل التجارة التفضيلية كما هو مبين، [M +1] + = 1،077 [+ M نا] + = 1،098.9، تجزئة منطقة التجارة التفضيلية من TFA الانقسام يمكن رؤيتها بوضوح على الطيف. B) أرتب cleavإد بنسبة 50٪ TFA / DCM تحت شرط الأمثل كما هو موضح في ورقة. TFA-لحث تدهور حمض يتم قمعها بشكل كبير. C) MS / MS الطيف من مثلوث منطقة التجارة التفضيلية. Y7 ضعيفة لوحظ (916) إشارة، وهذا هو السلوك النموذجي للتجزئة اتفاقيات التجارة التفضيلية. أطياف تحليلها والتي تم إنشاؤها بواسطة mMass 32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. أطياف MALDI التوليف منطقة التجارة التفضيلية مع النظائر المسمى مونومر ونموذجية من المنتجات. A) مقارنة MS أطياف الجزيئات منطقة التجارة التفضيلية توليفها من قبل الأزرق: (R)-2-bromopropanoic [M +1] + = 760 [+ M نا] + = 787 [M + K] + = 803 والحمراء: (S) - 2-bromopropanoic حمض د 4 [M +1] + = 764 [+ M نا] + = 783 [M + K] + = 799 باء) MS / MS أنماط تجزئة اثنين من الجزيئات هو مبين في A). لاحظ أنه نظرا لوجود د 1، د 2 و د 3 التوابل (بالديوتيريوم غير مكتملة من ألانين)، والجزيئات توليفها من قبل (S)-2-bromopropanoic حمض د 4 تعطي عموما قمم أوسع C) الأحمر: الطيف من منطقة التجارة التفضيلية ديمر توليفها والمشقوق تحت شرط الأمثل. الأزرق: منطقة التجارة التفضيلية ديمر توليفها مع 2 الحل M methoxyethylamine والمشقوق في الماء المصفى العادي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الببتيد الأميدات العالي (اتفاقيات التجارة التفضيلية) هي الفصيلة من الأوليغومرات peptidomimetic. إلى جانب الببتيدات مدروسة، peptoids والببتيدات ميثليته N-، وجزء كبير من المركبات داخل هذه العائلة لا تزال سلوكه، مجورلي بسبب عدم وجود طريقة للوصول الاصطناعية العام الببتيدات N-الألكيلية. نحن هنا تصف وسيلة فعالة لتجميع اتفاقيات التجارة التفضيلية مع اللبنات مراوان المستمدة من الأحماض الأمينية. سابقا، لقد ذكرت لاستخدام الطريق مونومر فرعية جديدة إلى المكتبات تجميع جزيئات منطقة التجارة التفضيلية 23. لقد أظهرنا أن هذه الجمعيات الأوليغومرات منظم للغاية التي تمتلك يقيد متعلق بتكوين عن طريق العمود الفقري. عند اختبارها في الجسم الحي، وأظهرت جزيئات منطقة التجارة التفضيلية تحسين نفاذية الخلية وبالتالي تحسين النشاط 25. ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع مع كل المزايا، اتفاقيات التجارة التفضيلية تأتي أيضا مع بعض التحديات الاصطناعية، مجورلي من أسيلة الأمينات الثانوية في مناصب معرقلا. سلسلة من جانب α الذي يوفر بتكوينتقييد يجلب أيضا عائق الفراغية للخطوة التالية اقتران. من أجل التغلب على هذه التحديات الاصطناعية، أجرينا دراسة مستفيضة وتحديد الأمثل BTC كأفضل كاشف اقتران لهذا التفاعل 23.

الخطوة الرئيسية لمسار الاصطناعية هو BTC سهلت أسيلة من الأمينات الثانوية. أثناء هذه العملية، BTC تمكن الجيل من كلوريد حمض في الموقع 26،27. معظم الكواشف اقتران الأخرى، والتي تشكل استرات إما نشطة أو انهيدريدات حامض كوسائط فشلت في توفير أسيلة نظيفة لتخليق منطقة التجارة التفضيلية المستمر. وجود وحدة منطقة التجارة التفضيلية السابقة يضعف كثيرا من كفاءة اقتران وحدة منطقة التجارة التفضيلية التالية بسبب عائق الفراغية. لذلك، لتركيب اتفاقيات التجارة التفضيلية متعددة، وسيطة نشطة للغاية مع مجموعة صغيرة مغادرة يفضل بشدة. بين جميع الظروف اقتران التي اختبرناها، ولدت في الموقع كلوريد حمض كتبها BTC يعمل بيزر في يدنا. ومع ذلك، حتى مع الكلوريدات حمض نشطة للغاية، ونحن نوصي لتجنب الأمينات sterical غاية أعاقت مثل الأمينات الأولية تشعبت α التوليف في مكتبة ما لم اختبارها مسبقا. الأمينات العطرية مثل عجائزي غالبا ما تؤدي إلى إحلال غير مكتملة، وبالتالي كما ينبغي تجنبها. خلال الخطوة اقتران BTC، ينبغي أن يكون الحل دائما الأصفر الشاحب إلى اللون البرتقالي؛ حل الملونة الداكنة وهذا مؤشر على ارتفاع درجة الحرارة وربما يؤدي إلى انخفاض المحصول وتشكيل زيادة من المنتجات. هذا عموما يمكن حلها عن طريق مزيد من التبريد من الحل BTC، والحد من حجم رد الفعل ونقل أسرع للBTC / محلول حمض تفعيلها. إلى جانب BTC، N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1 ،2-dihydroquinoline (EEDQ) هو آخر كاشف اقتران التي تعمل بشكل جيد في التوليف منطقة التجارة التفضيلية. وسيطة المفتاح هو أنهيدريد الكربونيك مختلطة مع مجموعة مغادرة صغيرة نسبيا. في حالة EEDQ، يذوب 3 يعادل EEDQ معا مع الحامض في DCM ثم أبإجتهد لحبات في درجة حرارة الغرفة. ويتم التفاعل عادة في غضون 2 ساعة مع الهز الخفيف. يطلق هذا التفاعل CO 2 خلال رد فعل؛ ولذلك لا ينبغي أن تكون مغلقة نظام التفاعل.

خطوة رئيسية أخرى هي الانقسام وتوصيف جزيئات منطقة التجارة التفضيلية. وقد لوحظ نمط مميز تجزئة MS / MS عندما تسلسل جزيئات منطقة التجارة التفضيلية عبر MALDI-MS/MS (الشكل 6). وتتكون مع كثافة منخفضة من أيون ذ الماضي (كما هو موضح باللون الأرجواني في الشكل 6C وزيادة كثافة Y6، Y5، Y4، B2، B3 الأيونات). وقد لوحظت أنماط مماثلة من N-ميثليته تجزئة الببتيد في التقرير السابق 28. ويرجع ذلك إلى زيادة الاستقرار من oxazolidine وسيطة، الببتيد N-ميثليته تميل إلى إعطاء أيونات قوية ب 28. وعلاوة على ذلك، ومن المعروف جيدا أن الببتيد N-ميثليته هي عطوب حمض خلال كل من الانقسام TFA وMALDI مطياف الكتلة 24،28، 29. وقد أظهرت دراسة الآلية أنه نظرا لتقييد متعلق بتكوين على العمود الفقري، وذرة الأكسجين الكربونيل من بقايا السابقة في كثير من الأحيان على مقربة من مجموعة الكربونيل في موقع الانقسام، وبالتالي تشجيع تشكيل oxazolidine المتوسطة 29. للأسباب المذكورة أعلاه، سواء اتفاقيات التجارة التفضيلية والببتيدات ميثليته N-بحاجة إلى أن المشقوق من دعامات صلبة في درجة حرارة منخفضة باستخدام تركيزات رقابة من TFA 26، 30. في تجربتنا، وطريقة الانقسام الأكثر ملاءمة لمنطقة التجارة التفضيلية بقايا الفردية يحدث في -20 درجة مئوية مع حل -20 ° C تبريد مسبقا من 50٪ TFA / DCM. هذا الإجراء يمنع إلى حد كبير في تشكيل المنتجات حمض المتدهورة.

بعد اتقان هذه التقنية، ومكتبة مع مونومر منطقة التجارة التفضيلية الأخرى المشتقة من الأحماض الأمينية الطبيعية مثل يسين، الفنيل الأنين، الجلوتامين، الخ يمكن توليفها كذلك. مكتبة منطقة التجارة التفضيلية ذات جودة عالية يمكن فحص AGainst مختلف الأهداف البروتين باستخدام بروتوكولات لدينا المنشورة سابقا على حبة الفحص 31. ضرب المركبات التي تم تحديدها من الفحص يمكن يتميز التحليل الطيفي الشامل وresynthesized لمزيد من الاختبار باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Jumpei موريموتو والدكتور تود دوران للمساعدة قيمة. وأيد هذا العمل عن طريق عقد من NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8 (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Tags

الكيمياء، العدد 88، والتوليف سبليت وبركة، الببتيد أميد العالي، منطقة التجارة التفضيلية، peptoid، وفحص عالية الإنتاجية، ومكتبة اندماجي، المرحلة الصلبة، triphosgene (BTC)، حبة واحدة في مركب واحد، OBOC
التجميعي تقسيم وبركة وتوصيف الببتيد المكتبة أميد العالي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool… More

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter