此协议的评论电器细胞 – 基底阻抗传感方法来记录和分析的贴壁细胞的阻抗谱细胞附着,增殖,运动,和细胞反应的药理学和毒性刺激的量化。检测血管内皮细胞通透性和细胞 – 细胞和细胞 – 基质接触的评估被强调。
电动细胞基质阻抗传感(ECIS)是一种体外阻抗测量系统来量化贴壁细胞层中的细胞的行为。为此,细胞生长在上置,圆形的金电极的顶端特殊培养室。一个常数小的交变电流在被测量的电极和电势之间。细胞膜的绝缘性创建朝向电流流动导致在电极之间的增加的电势的电阻。以这种方式测量细胞阻抗允许细胞附着,生长,形态学,功能和活力的自动学习。虽然ECIS测量本身很简单,简单易学,基础理论是复杂的,选择正确的设置和正确的分析和解释数据是不言自明。然而,一个明确的协议,描述从实验的各个步骤设计,准备,实现和实验分析不可用。在本文的基本测量原理以及可能的应用,实验的考虑,优点和ECIS系统的局限性进行了讨论。提供了一种用于细胞附着的研究的导向,扩散和扩散;中汇合层,对于屏障功能,细胞运动,细胞 – 细胞和细胞 – 基底粘连质量细胞行为进行定量;和伤口愈合的量化和细胞对血管活性刺激物。代表性的结果是基于人微血管(MVEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)所讨论的,但同样适用于所有粘附生长的细胞。
ΩΩΩHere我们提出电动细胞基质阻抗传感,被称为ECIS,测量和分析贴壁细胞在培养1的阻抗谱的具体方法。此协议的目的是提供这种特定类型的基于阻抗细胞分析的使用一个普遍适用的指导,对于一些从不断越来越多的应用程序的关键功能提供了协议。重点将是对细胞增殖,屏障功能,细胞连接和细胞运动的研究。
由于ECIS及其相关模型转换阻抗谱数据的生物学相关的参数是在其目前的形式介绍给科学界通过Giaever和基斯在1991年2,它经常被简称为TEER的测量(反系统上皮电阻),这是不准确的。差异似乎缘在第一,但是对数据的解释很重要。对于经典TEER测量,细胞生长在可渗透的过滤器来表征细胞旁转运的机制,这是由上皮细胞紧密连接或内皮粘着连接3为主。常见的是,位于上方和下方的过滤器的两个电极用于施加一个直流(DC)流过电池层和另外两个电极来测量所产生的电压降4。的电阻是使用欧姆定律,它允许细胞屏障的质量的数值描述计算。
ECIS遵循这一基本原则,并扩展它。在ECIS系统,细胞生长在嵌入在特殊细胞培养皿的底部相对的,圆形的金电极。每培养电极的数量以及是可变的,依赖于应用程序和电极有250μm的标准直径,在某些情况下,较大的反电极用来完成电路。 ECIS使用1μA与一个给定的频率,而不是直流电流的恒定交变电流(AC)。的阻抗是由电极之间的电压的相应变化(以mV为单位)计算。 ECIS提供测量在一个频率范围,研究频率依赖性细胞的性质,这有一些优点TEER和本文中详细地进行说明的阻抗的可能性。首先,测量复阻抗允许分离的整体阻抗为细胞屏障电阻和电池电容。此外,通过采取数据在多个频率和施加的数学模型,可以交界阻抗(的细胞 – 细胞接触紧密度)和阻抗引起的细胞 – 基底相互作用(距离基底细胞膜到底层矩阵的),以及区分细胞膜电容的贡献。第二,细胞增殖和活力进行评估,由于细胞s为与电极直接接触。第三,基体和电极是足够薄,以允许对明场和相衬显微镜。
阻抗测量基准:复阻抗
依据生物对象( 例如细胞)的电阻抗的测量是欧姆定律,一个基本的电子技术原理,它描述了电阻(R)的关系,电流(I)和电压(U)中的电路在给定的时间(t)。
适用于直流电路:R(T)= U(T)/ I(T)
在AC系统中工作时,电流和电压,不仅在它们的振幅,而且在它们的相位(φ)。现在,阻力不再足以说明这些关系。取而代之的是,复杂的阻抗(Z)或阻抗在大多数情况下的幅度(| Z |)时,含有先前所描述的欧姆电阻加电抗(X),从而重新sults从交流电流经电容器和电感器的驱动电压和电流5之间的相移。
适用于交流电路:| Z(F)| =√(R 2 + X(F)2)
φ=反正切(X / R)
当对完整细胞中,由于它们的膜的特性阻抗的测量,细胞作为电阻器和电容器的并联连接。这里,电阻表示反对电流流动,而电容(C)描述的电载流子在绝缘双层细胞膜,导致极化的细胞的分离。从而X由细胞膜的电容性能的支配。
X(F)≈(2 * PI * F * C 电池 )-1
因为X是依赖于频率,测量频率的变化使之细胞的不同功能和结构性质的研究。 ECIS的设备测量R和X,使计算的| Z |,C和φ。
量化整个细胞层与阻抗谱:电气等效电路。
如前面所解释的,当一个细胞被带入一个电场,它示出了无源电子元件的性能。如果现在,而不是一个单一的细胞,生长在电极顶部和补充细胞培养基的整个细胞层进行了研究,需要电阻器和电容器的简单模型被扩展到整个电网。在此所谓的等效电路中,培养基(R 医务 )以及电容(C ELECTR)和电阻(R ELECTR)特征的电极/电解质相互作用的电阻需要考虑3,6。
这样的等效电路,用于贴壁生长的细胞层的简化,一般的例子可以在图1中找到。这样的一个数学的优势pproach来描述一个生物系统是那些电路可以细化自由采食和调整到特定的实验问题, 例如 ,通过考虑阻抗引起的胞内细胞器或区分的细胞-细胞的影响(R JUNC)和细胞-基底粘连(R 分 )对整体阻抗7,8。尽管如此,目的为造型应该总是使用最小的数字描述了测量阻抗频谱的所有功能,让有意义的相关性元素。
图1。示意图ECIS的系统和有代表性的等效电路附着生长的细胞层的ECIS的文化以及A)的横截面。将细胞生长于传感和反电极和一个顶重新盖上培养基。该电极被连接到一个锁定放大器和一个AC信号经由1兆欧电阻器施加以创建一个恒流源。刺激可以直接加入到培养基中在时刻B)ECIS措施的阻抗所有个体贡献的总和的任意一点。培养基(R 医务 )以及阻抗所引起的电极/电解质界面,这是为了简单起见,作为一个电阻(R ELECTR)和一个电容(C ELECTR),并且还电性能的并联组合的电阻细胞膜,通过电阻的并联连接(R 单元 )和电容(C MEM)中描述的,所有需要被考虑。 Ř 细胞是可变的,因为它是依赖于对当前的细胞渗透性。的等效电路可以扩展和细化自由采食 。作为一个例子交界(R JUNC)为以及内皮下(R 分 )电阻被添加到电路。 请点击此处查看该图的放大版本。
阻抗参数及其生物学意义
从阻抗测量得出的两个最直接的参数是电阻和电池的容量。电阻代表质量和小区屏障的功能,因此,考虑到对对 – 和反式蜂窝电流流动的电阻。电容可提供电极覆盖的整体措施。 ECIS的的显着特点是,与等效电路的帮助和建模的全局参数提供更多的细胞特性,包括细胞 – 细胞和细胞 – 基底粘连,这将在本文后面讨论的见解。
实验conside:在开始之前口粮
测量设置 -该设置由几个独立的部分组成:ECIS的设备与测量仪表,PC机进行数据采集;为8阵列持有人-或96孔系统,ECIS阵列和选择的细胞培养。阵列夹持器必须放置在温箱中,并连接到所述培养箱外ECIS的设备。电脑需要配备ECIS的软件(1.2.123.0 2013年2月14日),并连接到ECIS的设备。
阵列的选择 -有一个不断增长的各种ECIS阵列,专为多种应用。标准阵列是8W1E和8W10E阵列,这是由8个培养孔(用W表示)分别包括1个或10个测量电极(用E表示)。一个大的反电极就完成了电路,但它的阻抗是在实际测量6基本上可以忽略不计。标准的8孔阵列架可以承载两个rrays,导致16个培养孔的总数量。金电极是50nm厚,划定有绝缘膜和安装在任何光学透明的Lexan聚碳酸酯基片或印刷电路板(PCB)。在PCB阵列更强大和成本效益。透明的幻灯片允许光线和免疫荧光显微镜。什么是必须考虑的是,1E阵列增强所造成的细胞运动的阻力信号不稳定,而且是需要伤口愈合的研究。此外,单个电极允许电信号和光信号的相关性。在多电极阵列,该信号被平均超过几个电极,它由于提高了测量区域包括多个小区在测量中,由不平坦的接种和细胞生长的限制数据的偏差,并减少了信号的晃动,由于细胞运动。因此,多电极阵列来研究细胞的增殖和势垒形成是有用的。下一步,标准阵列有可用于剪切应力9应用特殊的阵列,研究趋化10,细胞迁移和增殖,以及96孔板高通量筛查。最后,将用于在阵列强烈地依赖于科学问题和细胞类型和应选择和仔细测试。
测量频率 – Rb和阿尔法的造型(见数据分析)需要多频率测量(MFT)。否则阻抗可以在一种细胞类型的特定频率(SFT)来测量随着时间的推移,与该数据可以被收集具有较高的时间分辨率的优点。最灵敏的测量频率为特定的细胞类型可以通过频率扫描中找到。当在一个数 – 对数图中的频率分别绘制阻抗的电阻对频率的特性,其中间无细胞和细胞覆盖的电极是最大的区别是,其中所述细胞块T的频率他目前最有效的。若血管内皮细胞(EC)的这个频率是在大约4千赫。
接种密度 -由于在每一个定期的基于细胞的实验的接种密度依赖于科学问题。当研究的粘附和铺展或屏障形成细胞,内皮细胞应与40,000-60,000个细胞/ cm 2的高密度被接种,以保证汇合,48小时后是稳定的屏障。如果该实验的重点是在增殖,内皮细胞应接种大约2000-10000个细胞/ cm 2的密度低。
ECIS是一个极好的工具,用于细胞的属性和行为的审查以及对已知和未知物质的影响进行量化。从而将细胞的标准培养条件下保持,阻抗可以连续地以高时间分辨率的监视和相关的光学信号。该方法用于细胞操作的最佳时间点,可以选择的形态和功能的细胞状态的基础上。不幸的是,这种高测量分辨率自带的价格,在温度,pH值或单元格的机械刺激(中等城市)的微小变化会立即影响到阻抗信号。
在细胞上的小测量电流的应用使得ECIS测量无创,无损和无标记的,但作为结果只有被动生物电特性可以被测量(无动作电位)。一个重要特点是,一些参数可以是DER从一个单一的测量IVED,从几个经典实验,如渗透率或伤口愈合实验相结合的信息。这里特别感兴趣的方面是,从数学建模的数据可以用来探索变化的电阻和电容,并将它们指的是不同的细胞结构( 例如细胞接触或细胞膜)。重要的是要注意的是,阻抗谱总是在感测电极,其不容许在单细胞研究,也对数学模型是唯一有效的在汇合的细胞层提供来自所有小区的平均信号。因此,内皮细胞应在合流状态保持之前用于建模,以确保成熟的细胞粘连和静止期细胞至少一天。同样,电气伤口应只适用使用多伤人短脉冲高频率汇合的细胞层,以达到最佳的伤人效率和防止电极损坏。
jove_content“>为了从ECIS测量得到的信息的最大数量,如在每一个试验中,几个参数,如阵列基板,涂料,接种密度为个别细胞类型的组合,需要进行测试和优化实验之前。ECIS的一个主要限制是测量不提供分子水平上的直接信息。因此,ECIS的测量通常是最翔实的实验系列,以帮助联想一个科学问题与细胞结构或特性,并提供一个可检验的假说的产生显著输入的开头。因此,ECIS的模块化设计提供了广泛的应用与可能性量身定做的数组。最新的阵列预示未来专注于高吞吐量的阻抗筛检细胞增殖和电气伤人及特殊流动阵列在体内模拟的前进</eM>剪切应力与不同的流量分布。
此外文献
请同时参阅应用生物物理学的网页(www.biophysics.com)的应用笔记,网络研讨会和出版物涵盖整个ECIS谱的详细清单。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢查尔斯·基斯博士,基督教伦肯博士,基督教Dehnert(应用生物物理学Inc。)和乌尔夫拉德勒尔博士(ibidi有限公司)为他们出谋划策,帮助和这份手稿的准备过程中的富有成果的讨论。再者,我们要感谢扬·贝祖·他出色的技术支持。