Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования для количественной оценки эндотелиальной пролиферации, барьерную функцию, и Подвижность

Summary

Этот протокол Отзывы Электрический клетки с субстратом импеданс зондирование, метод для записи и анализа импеданса спектр прикрепленных клеток для количественной оценки прикрепления клеток, пролиферации, подвижности и клеточном ответе на фармакологических и токсических раздражителей. Обнаружение проницаемости эндотелия и оценки межклеточных и клетка-подложки контактов подчеркнул.

Abstract

Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования (ЕСНГ) является в пробирке измерения импеданса система для количественного поведение клеток в прикрепленных слоев клеток. С этой целью клетки выращивают в специальных культуральных камер на верхней части противоположных круговых, золотыми электродами. Константа небольшой переменный ток прикладывается между электродами и потенциал через измеряется. Изолирующие свойства клеточной мембраны создать сопротивление в направлении электрического тока приводит к увеличению электрического потенциала между электродами. Измерение сотовой сопротивление таким образом позволяет автоматизированную изучение прикрепления клеток, роста, морфологии, функции и подвижности. Хотя само измерение ЕСНГ проста и легка в освоении, основная теория сложна и выбор правильных настроек и правильного анализа и интерпретации данных не является само собой разумеющимся. Тем не менее, ясно, протокол описания отдельных шагов из экспериментальныхдизайн с подготовкой, реализацией и анализе эксперимента не доступен. В этой статье Основной принцип измерения, а также возможных применений, обсуждаются экспериментальные соображения, преимущества и недостатки системы ЕСНГ. Направляющая предназначен для изучения прикрепления клеток, распространение и распространение; количественное определение поведения клеток в сливной слой, в отношении барьерной функции, клеточной подвижности, качество клетка-клетка и клетка-субстрат спаек; и количественное определение заживлении ран и клеточные ответы на вазоактивных раздражители. Представитель результаты обсуждаются на основе микрососудов человека (MVEC) и человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC), но применимы ко всем прикрепленных растущих клеток.

Introduction

ΩΩΩHere мы представляем Электрический клетки с субстратом импеданс зондирования, известный как ЕСНГ, определенного метода для измерения и анализа импеданса спектр прилипшие клетки в культуре ^1. Цель этого протокола заключается в предоставлении общеприменимый руководство для использования этого конкретного типа импеданса на основе клеточных анализов и предоставить протоколы для некоторых ключевых функций из постоянно растущего числа приложений. Упор будет сделан на изучении пролиферации клеток, барьерной функции, соединений элементов и подвижности клеток.

Так был введен ЕСНГ и связанный с ним модель для преобразования данных импедансной спектроскопии в биологически соответствующих параметров в его нынешнем виде для научного сообщества по Гиавер и Keese в 1991 году ^2, он часто упоминается как системы для измерения TEER (транс -эпителиальных электрическое сопротивление), который не является точной. Различия кажутся предельная сначала, ноимеют важное значение для интерпретации данных. Для классических измерений Тир, клетки выращивают на проницаемых фильтров охарактеризовать парацеллюлярная транспортные механизмы, которые доминируют эпителиальных плотных контактов или эндотелиальных слипчивых соединений ^3. Как правило, два электрода, расположенные выше и ниже фильтра используются для применения постоянный ток (DC) течь поверх слоя клеток и двух других электродов для измерения падения напряжения в результате ^4. Электрическое сопротивление рассчитывается с помощью закона Ома, который позволяет численное описание качества клеточный барьер.

ЕСНГ следует этот основной принцип и расширяет его. В системе ЕСНГ клетки выращивают на противоположных круговых, золотых электродов, внедренных в нижней части специальных культур клеток блюд. Количество электродов в культуре хорошо является переменной величиной, зависит от приложения и электроды имеют стандартный диаметр 250 мкм, а в некоторых случаях больше, Противоэлектродиспользуется для замыкания цепи. ЕСНГ использует постоянный переменный ток (AC) от 1 мкА с заданной частотой вместо постоянного тока. Сопротивление рассчитывается из соответствующих изменений напряжения (в мВ) между электродами. ЕСНГ предлагает возможность измерить сопротивление по всему диапазону частот для изучения частотных зависимые клеточные свойства, которые имеет ряд преимуществ перед TEER и будет детально описаны в этой статье. Во-первых, измерения комплексного сопротивления позволяет отделить общий импеданс в устойчивости клеток барьера и емкостью ячейки. Кроме того, принимая данные на нескольких частотах и ​​применение математической модели, можно различать соединительного импеданса (герметичность из межклеточных контактов) и импеданса, вызванное клетка-субстрат взаимодействий (расстояние от базальной мембраны клетки к базовой матрицы), а также вклад клеточной мембраны емкости. Во-вторых, клеточной пролиферации и подвижности может быть оценена, так как клеткис находятся в непосредственном контакте с электродами. В-третьих, подложка и электроды достаточно тонким, чтобы обеспечить светлом поле и фазово-контрастной микроскопии.

Основа измерения импеданса: комплексное сопротивление

Основой для измерения электрического импеданса биологических объектов (например, клетки) является закон Ома, основной электро-технический принцип, который описывает отношение между сопротивлением (R), ток (I) и напряжения (U) в электрической цепи в данный момент времени (т).
Применяется в цепи постоянного тока: R (T) = U (т) / I (т)

При работе в системе переменного тока, ток и напряжение не только различаются по своей амплитуде, но и в их фазы (φ). Теперь, сопротивление больше не достаточно, чтобы описать эти отношения. Вместо этого, комплекс импеданс (Z) или в большинстве случаев величина импеданса (| Z |) используются, содержащий описанный выше омическое сопротивление плюс реактивное сопротивление (х), который повторнотаты от сети переменного тока течь через конденсаторы и катушки индуктивности вождения фазовый сдвиг между напряжением и током ^5.
Применяется в сети переменного тока: | Z (F) | = √ (R ² + X (F) ²⁾
φ = агс (X / R)

При выполнении измерения импеданса на неповрежденных клеток, в связи с особенностями их мембраны, клетки действуют как параллельного соединения резисторов и конденсаторов. Здесь сопротивление представляет собой противодействие тока, тогда как емкость (C) описывает разделение электрических носителей на изолирующей двойной слой клеточной мембраны, что вызывает поляризацию клетки. Таким образом X преобладают емкостных свойств клеточной мембраны.
X (F) ≈ (2 * Pi * е * С _{сотового)} ^-1

Так как X является частота зависит, изменение частоты измерений позволяет изучение различных функциональных и структурных свойств клетки. В ЕСНГ Прибор измеряет и R и X, что позволяет расчетиз | Z |, С и φ.

Количественная целые клеточные слои с импедансной спектроскопии: Электрическая эквивалентная схема.

Как объяснялось ранее, когда клетка приводится в электрическом поле, она показывает свойства пассивных электронных компонентов. Если теперь вместо одной ячейки, весь слой клеток, выращенных на верхней части электродов и дополнены среду для культивирования клеток исследуется, простая модель резистора и конденсатора должна быть расширена до целой электрической сети. В этой так называемой эквивалентной схемы, сопротивление культуральной среде (R _Med), а также емкости (C _Electr) и сопротивления (R _Electr), характеризующей взаимодействие электрод / электролит должны быть рассмотрены ^3,6.

Упрощенная, общий пример такого эквивалентной схемы для адгезивного слоя клеток растет, можно найти на рисунке 1. Преимущество такого математического ахо д описать биологическую систему в том, что эти схемы могут быть уточнены по желанию и доводили до конкретных экспериментальных вопросов, например, рассматривая сопротивление вызвано внутриклеточных органелл или различать влияние клетка-клетка (R _{переходами)} и клетки с субстратом спаек (R _Sub) на общую ^7,8 импеданса. Тем не менее цель для моделирования должны быть всегда использовать наименьшее количество элементов, описывающих все особенности измеренного спектра импеданса, чтобы позволить значимые корреляции.

Рисунок 1. Схема системы ЕСНГ и представительного схемы замещения для приверженцем растущих клеток слоя.) Поперечное сечение ЕСНГ культуры хорошо. Клетки растут в верхней части чувствительного и противоэлектрод иповторно покрыты культуральной среде. Электроды подключены к усилителю блокировки в и сигнал переменного тока поступает через резистор 1 МОм, чтобы создать источник постоянного тока. Стимулы могут быть добавлены непосредственно в культуральную среду в любой момент времени. B) ЕСНГ меры сумма всех отдельных вкладов в сопротивление. Сопротивление культуральной среды (R _Med), а также импеданса, вызванное границе раздела электрод / электролит, который для простоты представлен как параллельно соединенных резистора (R _Electr) и конденсатор (C _Electr), а также электрических свойств клеточной мембраны, описанной параллельного соединения сопротивления (R _Cell) и емкости (С _MEM), все должны быть рассмотрены. R _Cell является переменной, так как она зависит от проницаемости клеток по отношению к току. Схема замещения может быть расширен и уточнены по желанию. В качестве примера Junctional (R _{переходами)} кака также субэндотелиальные (R _Sub) сопротивление были добавлены в цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Параметры импеданса и их биологический смысл

Два наиболее прямых параметры, полученные из измерений импеданса являются сопротивление и емкость клеток. Сопротивление представляет качество и функцию клеточный барьер и, следовательно, принимает во внимание устойчивость к пара-и транс-клеточной тока. Емкость обеспечивает общую меру покрытия электрода. Отличительной особенностью ЕСНГ является то, что с помощью эквивалентных схем и моделирования эти глобальные параметры дают представление о многих более свойств клеток, в том числе межклеточных и клетка-субстрат спаек, которые будут обсуждаться позже в этой статье.

Перед началом: Экспериментальная Рассмотритепродовольствие

Установка измерения - Установка состоит из нескольких отдельных компонентов: ЕСНГ устройств с электроникой измерений; ПК для сбора данных; держателя массива для 8 - или системы 96-а; массивов ЕСНГ и клеточной культуре выбора. Держатель Массив должен быть помещен в инкубатор и подключен к ЕСНГ устройства за пределами инкубатора. ПК должен быть оборудован с программным обеспечением ЕСНГ (1.2.123.0 14 февраля 2013) и подключен к ЕСНГ устройства.

Выбор Array - Существует постоянно растет разнообразие ЕСНГ массивов, предназначенных для нескольких приложений. Стандартные массивы 8W1E и массивы 8W10E, которые состоят из 8 культуры скважин (обозначенных W), содержащий 1 или 10 измерительных электродов (обозначается E) соответственно. Большая противоположный электрод замыкает цепь, но ее сопротивление пренебрежимо мало по существу в реальном измерении ^6. Стандартный держатель массив 8-а можно разместить дваrrays, в результате чего общее количество 16 культуральных лунок. Золотые электроды 50 нм, очерчены с изолирующей пленкой и установлен на любой оптически прозрачного поликарбоната Lexan субстрат или печатную плату (PCB). Массивы PCB являются более надежными и экономически выгодными. Прозрачные слайды позволяют света и иммунофлюоресценции микроскопии. Что необходимо учитывать, что массив 1E усиливает колебания сигнала сопротивления, вызванного клеточных движений и необходим для заживления ран исследований. Кроме того, одиночные электроды позволяют корреляцию электрических и оптических сигналов. В нескольких электродных массивов, сигнал усредняется по нескольким электродов, которые в связи с увеличением зоны измерений включает в себя несколько ячеек в измерении, ограничивает смещение данных неравномерным прививки и роста клеток и уменьшает размытость сигнала из-за клетке движения. Таким образом, мульти матрицы электродов могут быть использованы для изучения клеточную пролиферацию и образование барьера. Рядом сстандартные массивы существуют специальные массивы, доступные для применения напряжения сдвига ^9, для изучения хемотаксиса ^10, миграции клеток и распространение, а также 96-луночные планшеты для высокой пропускной фильмов. В заключение, массив, который будет использоваться сильно зависит от вопроса и научной типа клеток и должны быть выбраны и испытаны тщательно.

Частота измерения - моделирование Rb и альфа (см. анализ данных) требует измерения многочастотный (MFT). В противном случае сопротивление может быть измерена с течением времени в одном типе клетки определенной частоте (SFT), с тем преимуществом, что данные могут быть собраны с более высоким временным разрешением. Наиболее чувствительным частота измерения для конкретного типа клеток можно найти частоты сканирования. При построении сопротивление соответственно сопротивление в зависимости от частоты в логарифмическом графике частоты, где разница между бесклеточный и сотовый покрытых электродов является крупнейшим частота, где клетки блокируют тон тока наиболее эффективно. В случае эндотелиальных клетках (ЭК) эта частота около 4 кГц.

Посев плотность - Как и в любой обычной плотности на основе клеток эксперимент посева зависит от научной проблемы. При изучении адгезии и распространения или формирование барьера, эндотелиальные клетки должны быть высевают с высокой плотностью 40,000-60,000 клеток / см ^2, чтобы гарантировать сливающийся, стабильный барьер после 48 часов. Если фокус из эксперимента на пролиферацию, эндотелиальные клетки должны быть высевают с низкой плотностью около 2,000-10,000 клеток / см ^2.

Protocol

1. Подготовка системы измерения

1. Prewarm держатель массива в инкубаторе до 37 ° С перед началом эксперимента, чтобы предотвратить конденсацию.
2. Заполните воды шкатулку инкубаторе с дистиллированной водой, чтобы избежать высыхания лунок.
3. Выполните все манипуляции на клетки и массивов в шкафу с ламинарным потоком в стерильных условиях.

2. Подготовка массивов и модифицирования клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы ЕСНГ должны быть очищены и стабилизируется до эксперимента, чтобы предотвратить электрода дрейф, чтобы улучшить воспроизводимость хорошо к скважине и отношение сигнал-шум. Поэтому возможны два варианта: А) предварительная обработка электродов с L-цистеина и б) функция стабилизации в ЕСНГ.

Вариант А: L-цистеин рекомендуется как наиболее последовательной предварительной обработки, но, возможно, в некоторых особых случаях взаимодействовать с белком coatinGS на электродах. Объемы представленные используются для стандартных массивов 8-а.

1. Добавить 200 мкл / лунку 10 мм L-цистеин. Цистеин очищает и модифицирует поверхность электрода, обеспечивающий высокую и воспроизводимую емкостного электрода.
2. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре (RT).
3. Мыть два раза 500 мкл / лунку с ультра-чистой воды (тип 1). Не следует использовать фосфатные буферы, которые могут помешать адсорбции некоторых белков. Также не содержащей сыворотку решения перед нанесением покрытия, так как золото поверхность адсорбирует первые макромолекулы в контакте.
4. Пальто с 200 мкл / лунку теплой 1% желатина.
5. Выдержите 30 минут при 37 ° С
6. Удалить желатин, но не позволяйте поверхность насухо. Это может повредить электроды.
7. Вымойте раз с ультра-чистой воды (тип 1).
8. Добавить 400 мкл / лунку полное клеток культуральной среды (содержащий сыворотку, антибиотики и все факторы роста).
9. Презентация массив в массив держателя апг убедиться, что массив расположен таким образом, что девять золотых квадратных колодки правильно связаться по подпружиненных штифтов пого и регулировка винта и рука туго. Будьте осторожны с прозрачными массивов, слой золота легко могут быть повреждены.
10. Откройте программное обеспечение измерения и нажмите Setup затем Выезд в разделе «Сбор данных", чтобы выполнить быстрое измерения полного сопротивления каждого отдельного скважины. Полученные значения являются измерение базовой линии и автоматически сохраняется в разделе "Комментарии".
11. Проверка также будет автоматически определять тип массивов ЕСНГ используется. Проверьте выбранные массивы в разделе "Ну Конфигурация".
12. Диаграмма массив горит зеленым должным образом связанных скважин и красный для пустых или неправильных подключенных скважин. Тем не менее, всегда убедитесь, что массивы были неправильно вставлен в держатель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если чистка и покрытие были успешными массивы 8W1E ЕСНГ имеют переменного токаapacitance около 5 нФ и 8W10E массивов 50 нФ, что приводит к базовым сопротивлением около 2000 и 200 Ω, соответственно.
13. Удалить массив из держателя.
14. Семенной клеток, как суспензии отдельных клеток в 400 мкл / лунку полной среды культуры клеток.

Вариант B: Функция стабилизация ЕСНГ могут быть использованы в качестве альтернативы или в сочетании с L-цистеин лечения и если проблемы с дрейфом электрода или больших различий в хорошо-к-хорошо сопротивления и емкости происходит.

1. Выполните цистеина лечение (поставляется отдельно) и намывных электроды с белком (по желанию).
2. Добавить 200 мкл / лунку полной среды в каждую лунку и поместите массив в держатель массива.
3. Программное обеспечение с открытым измерения и нажмите Настройка последующим Отметьте установить массив правильно подключен и измерить начальное Z, R и C.
4. Стабилизировать электроды, нажав (ок. 3 мА), высокой частоты (64 кГц) импульса для очистки электродов.
5. Проверьте электроды снова. Емкость должна быть увеличена и значения сопротивления должны быть в сопоставимой диапазоне.
6. Если емкость и сопротивление значения все еще не является удовлетворительным, повторите стабилизации.
7. Удалить массив из держателя и привить клетки.

3. Настройка Программное обеспечение Система измерения и сбора данных

1. Поместите массив в держателе массива, как описано выше.
2. Программное обеспечение с открытым измерения и нажмите кнопку Настройка в разделе «Сбор данных» для подключения программного обеспечения ЕСНГ к инструменту ЕСНГ и запустить другой хорошо Проверьте.
3. Проверьте выбранные массивы в разделе "Ну Конфигурация".
4. Выберите скважин быть измерены в "Well CONFIGURATраздел ионный ".
5. Выберите режим измерения от "Сбор данных" вариантов:
   1. Для временного ряда на фиксированной частоте, выберите Один Freq. / Время (SFT) и выбрать частоту измерения из выпадающего меню.
   2. Для измерения покрытия электрода и моделирования Rb и Alpha, выбрать несколько Freq. / Время (MFT). Устройство ЕСНГ будет измерять автоматически на всех доступных частот.
   3. Для микродвижения (см. анализ данных) выберите Быстрое Время собирать (RTC) и отрегулируйте частоту измерения и частоты дискретизации. Здесь стандартное временное разрешение один образец в секунду (1 Гц), но частота дискретизации может быть также увеличена, чтобы отслеживать быстрые изменения импеданса до 25 Гц (для Z-Theta). Важное примечание: в режиме RTC только один хорошо измеряется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроподвижность должны быть измерены в нескольких скважинах впоследствии, выберите Справка> пункты Панель инструментов Показать эксперт / меню> Acquire> Multi-Ну РТК. Укажите Ограничение по времени (HR) в Collect разделе Data; ЕСНГ теперь будет измерять выбранные скважин в порядке. После начала измерения программное обеспечение попросит указать номера циклов. Введите значение для того, как часто нужно измерение необходимо повторить.
6. Для SFT и MFT, выберите интервал времени (сек) между измерениями или если нужно данные должны быть приобретены как можно быстрее покинуть этот флажок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения данных ЕСНГ устройство использует мультиплексор для переключения из одной ямы в другую с минимальным скорости сбора SFT 0,25 сек и 7,5 сек для MFT. Значение интервала зависит от количества выбранных скважин и частот. Для измерений на медленных размножающихся клеток или простой записи сопротивления в зависимости от времени, используют интервалы по 600 сек или более.
7. Нажмите кнопку Пуск, введите имя файла и выберите папку для хранения данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер файла не должно быть пр.oblem, так как данные ЕСНГ сохраняются в своего рода текстовом формате под названием *. ABP, которая никогда не превышает несколько сотен мегабайт даже со всеми частотами измерений и количества скважин выбранных.
8. Остановить запустить, нажав Готово.

4. Средний Изменение и сотовый Манипуляция

1. Нажмите Пауза, это остановит сбор данных, но продолжают работать экспериментальный часы.
2. Снимите массив из держателя и манипулировать его под лавку ламинарного потока (т.е. изменение среды).
3. Наведите массив обратно в держатель и либо нажмите кнопку Проверить подключение или Возобновить эксперимент продолжить сбор данных. Программное обеспечение измерения разместит временную метку в наборе данных.

5. Острая Стимуляция во время сбора данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Второй вариант заключается в манипулировании клетки во время сбора данных для подражания немедленные изменения. Это возможно только вА когда образцы не должна быть стерильной в дальнейшем ходе эксперимента.

1. Добавить стимул непосредственно к колодцу и убедитесь, что смешивать осторожны с 200 мкл пипетки.
2. Марк момент времени вручную, нажимая Отметить и добавить комментарий.

6. Электрические Ранение

ПРИМЕЧАНИЕ: Поиск правильные настройки для используемого типа клеток является ключевым для электрической ранения. Если ранив слишком коротка, это может привести к недостаточному удаления клеток, в то время как, если ранение слишком длинный и / или грубая это может повредить электроды (особенно на прозрачных массивов). Таким образом, несколько импульсы короткие ранение рекомендуется. Для HUVEC культурах две 10-20 сек долго ранение импульсы 5 В при 60 кГц каждый были найдены оптимальная помощью ЕСНГ 1600R. В общем, рекомендуется использовать высокие частоты> 20 кГц для поддержания единых высокие поля через клетки и избежать повреждения электродов.

1. Выполните ранив дурьING активное измерение ЕСНГ.
2. Включить Wound / электропорации Setup, затем нажмите рана и заполнить время (сек), раневой напряжение (В течение 1600 R) или ток (мкА для Z и Z-Theta) и частота (Гц). Отображаемые значения по умолчанию на основе типа массива и ЕСНГ устройства.
3. Выберите скважин ранить в разделе "Ну Конфигурация". Только проверенные скважины будут ранены.
4. не Enable Задержка до часа и заполнить времени задержки для активации функции задержки раны. Эта функция может быть остановлена ​​в любой момент, нажав Стоп или применения рану вручную. Только одна команда задержки могут быть активны одновременно.
5. Нажмите Активировать и нажмите кнопку ОК в появившемся окне, чтобы начать ранив.
6. Убедитесь в том, что сигнал сопротивление падает до смещения сопротивлением после ранения, в противном случае повторить ранения.

7. Анализ данных

Представление данных и экспорт.

1. Измерение Готово или загрузки данных устанавливается с помощью File -> Open.
2. Выберите скважин, которые будут отображаться в окне "Ну Конфигурация". Группа отдельные скважины в настоящее время средняя.
3. Выбрал параметр, который будет отображаться от верхней панели инструментов (Z, R или C).
4. Выберите тип граф из верхней панели инструментов (Т = время, F = частот, 3D = водопад блот).
5. Определить график смещения и диапазона с приведенными ниже окне графика ползунков или заполнить точных значений в соседних управления.
6. Выбрал из основных "Options Время-Series" в разделе "Анализ", чтобы выполнить стандартное отклонение, скользящее среднее или нормализации данных.
7. Активируйте экспертов Toolbar в меню справки для более продвинутых операций, таких как Nyuist участка и преобразования Фурье.
8. Используйте "Параметры отображения" в разделе "Анализ", чтобы определить раНге из х-и у-осей и экспорта графике.
9. Экспорт выбранных данных в файл Excel с помощью Файл -> Экспорт данных -> Для Excel (Selected) и использовать программное обеспечение сторонних выбора для глубокого анализа, статистики и представления по мере необходимости.

Моделирование Rb и Alpha.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для моделирования рекомендуется использовать бесклеточный, средний заполненный также ссылки.

1. Измерение Отделка MFT или нагрузка MFT набор данных.
2. Если ссылка хорошо бесклеточный доступен нажмите любую Найти для автоматического выбора опорного значения или указан выбрать сотовый точку свободное время вручную из "Freq. Scan моделирование" в разделе "Анализируя".
3. Если нет ссылки бесклеточной, импортировать опорное значение из другого набора данных. Откройте набор данных ссылка (убедитесь, что был использован тот же массив и среднего) и использовать Найти или указан для выбора опорного значения.Затем перейдите к измеренных данных и нажмите Get.
4. Если нет комплект использовать заводские настройки по умолчанию данные ссылки бесклеточные.
5. Пресс Модель начать расчеты. Моделирование может занять несколько минут в зависимости от размера набора данных.

Расчет микродвижения.
Примечание: Этот расчет не является частью измерительного программного обеспечения, но могут быть выполнены с любым программным обеспечением обработки сигналов.

1. Закончить измерение RTC или загрузить набор данных RTC.
2. Нормализация установленные усредненного сопротивления всего периода данных.
3. Перерыв, установленные на сегменты с длиной пунктов 256-данных данные и очистить каждый сегмент у окна Хеннинга.
4. Запуск 256-балльной преобразование Фурье и частотные спектры среднюю результате к односторонней 129-балльной спектра мощности, чтобы минимизировать случайные шумы и повысить биологическую сигнал.
5. Частота земля против амплитуды в логарифмическом графике и применятьнаименьших квадратов линейной форме.
6. Наклон линейной аппроксимации является мерой общего шума в сигнале, и тем самым микродвижения клеток.

Representative Results

Настройка эксперимент является довольно простым и само измерение является полностью автоматическим, но, как это часто бывает, правильный анализ и интерпретация данных имеют решающее значение. В разделе представительного данных руководство предназначен для интерпретации наиболее важных параметров, предусмотренных импедансной спектроскопии с ЕСНГ. Это будет полезно, чтобы решить, для какой вид научной проблемы измерения ЕСНГ могут быть полезны и какие параметры должны быть записаны.

Типичная экспериментальная чтения из в целом можно разделить на рост фазы после введения клеток и плато-фазы, когда клетки достигают слияния. Каждый из этих этапов дает информацию о различных клеточных свойств. Представитель измерение показано на рисунке 2 и разделить на четыре подфаз проанализировать A) клеточную адгезию, распространение и распространение; Б) формирование созревания ЕС барьера; C) миграция клеток после генерации электрическойдр. раны, и D) клеточный ответ на стимуляцию с вазоактивного агента тромбина. Фазового контраста и иммунофлюоресценции изображения были получены непосредственно от измерительного электрода в разные подфаз чтобы проиллюстрировать связь между охватом электрода, состояние клеток и записанного сигнала импеданса.

Адгезия, распространение и распространение

Каждый тип клеток имеет свой характерный адгезии и роста кривую, можно манипулировать посредством изменения плотности посева, покрытие с белками внеклеточного матрикса или других стимулов. Одна из основных трудностей для изучения этих процессов для дифференциации адгезии, распространения и распространение. Вегенер и др. ^11. Дал подробное описание для использования комбинации сопротивления и емкости, чтобы различать этих параметров и на рисунке 3 становится очевидно, насколько сопротивление и емкость могут дополнять друг друга. Важно, чтобыизучение адгезии и распространение понимать влияние частоты измерения, потому что здесь электрическое поле вызывает поляризацию клеточной мембране клеток в суспензии ^8, что заставляет ток протекать исключительно вокруг клеток. Когда клетки приложить они начинают ограничивать ток, распространяя над электродом и емкости уменьшается по линейному закону с процент открытой площади на электроде (дробный область). Таким образом, адгезия, распространение и распространение может быть количественно лучшем случае, когда емкость записи на частоте, превышающей 40 кГц (рис. 3В), где уменьшение емкости является прямой пропорциональна покрытия электрода. В качестве альтернативы сопротивление на его самой чувствительной частоте измерения является прямой мерой для дифференциации и созревания клеток в сливной барьер (рис. 3А). В дополнение к дробной области, Вегенера и соавт. Введены два другихПараметры для количественной оценки адгезии и покрытие электрода: T _1/2 (половина максимальной емкости), который является время до 50% от электрода не покроется клетками (фиг. 3B, вставка), и наклон кривой емкость (с, не показаны), как скорость распространения клеток и пролиферации.

Сопротивление в качестве меры качества барьера

Сопротивление является частью импеданса, который описывает качество барьера и функцию лучший, потому что она не учитывает емкостные компоненты из мембраны, электродом и среды. Здесь качество термин барьер, а не проницаемость используется, так как проницаемость по определению зависит только от межклеточных контактов. Сопротивление однако определяется способностью клеток и их межклеточных и клетка-матрикс взаимодействий блокировать ток. Соответственно разные типы клеток (клоны и проходы) имеют свои специфические значения сопротивления (рис. 4а). Хотя сопротивление дает гораздо КлиоRER идея о клеточный барьер, сигнал сопротивление всегда должны быть приняты во внимание.

Моделирование Rb и Альфа

Программное обеспечение ЕСНГ таит в себе определенную функцию, способность моделировать два параметра, которые отличают между межклеточных и клетка-матрикс спаек (Цифры 4В и 4 C). Rb (в см ² х Ом), является сопротивление межклеточных контактов в текущем потоке и тем самым обратной меры классической проницаемости. Высокое Rb означает низкую проницаемость по отношению к тока. Альфа (в см х Ом ^0.5), является мерой вкладов импеданса, вытекающих из клеток-электродные переходы. Модель для количественной клетка-клетка и клетка-матрикс контактов был введен 1991 по Гиавер и Keese и основан на предположении, что клетки являются круглыми, в форме дисков, объекты, которые имеют изолирующую мембрану, курсор над электродом и заполнены электролитом проведение ² .изолирующие свойства клеточной мембраны остается только три пути для тока: а) между вентральной поверхности клеток и электродом, б) между межклеточных контактов и С) через клетки (вероятно только когда используется высокая частота измерения ). Более подробный вывод и объяснение можно найти в работах Ло и др. ^3,12.

Micromotion

Было показано, что небольшие колебания в сигнале сопротивления (фиг.4А) обусловлены тонкими, случайных движений клеток в слоях сливающихся клеток, а также клеток, движущихся на и от электрода в разреженных культур ^2. Этот аспект данных временного курса ЕСНГ описываемых Ло и Opp др.. ^13,14 часто упускается из виду и лучше всего видно при измерении с 1E массивов и в самой чувствительной частоты для учета пара-и внутриклеточных текущих-путей. Расчет этой ячейки вызвало шум (микроподвижность) не является частью гое стандартное программное обеспечение измерения, хотя в последней версии быстрое преобразование Фурье (БПФ) интегрируется. Запись данных RTC с частотой дискретизации 1 Гц в течение 1 часа при 4 кГц обеспечивает достаточное разрешение для расчета ЕС микродвижения. Этот расчет дает один единственный значение и могут быть непосредственно использованы для статистического анализа. Продлен обсуждение на использовании частотного анализа для микродвижения можно найти в другом месте ^15. В качестве альтернативы БПФ другие стратегии анализа могут быть использованы, например, дисперсии приращений. Разница более чувствителен к небольшим изменениям в микродвижения, но из-за этой чувствительности сравнение отдельных экспериментов становится трудно. Склоны спектра мощности являются более надежными измерение микродвижения (рис. 4D). Здесь площадь под кривой можно рассматривать как сумму микродвижения или шума клетки создают. Следовательно, тем круче наклон спектра мощности, чем меньше площадь под кривойи чем меньше Micromotion.

Электрический заживления ран анализ

Для изучения миграцию клеток, как правило, механические раны наносятся царапины клетки от планшета для культуры с наконечниками, сотовые скребками или конкретных марок и следовать их реэмиграции микроскопически ^16. Этот метод имеет очевидный недостаток, что размер нуля изменяется и, как правило, слишком большой, чтобы пренебречь влиянием пролиферации клеток на процесс заживления ран. Ранив функция ЕСНГ использует высокое напряжение, высокая частота импульсов, чтобы получить бесплатный электрод клеток и впоследствии следует реэмиграции из соседних клеток для замены смерти клетки (рис. 5, а). Преимущество этого способа автоматизированного сравнению со стандартными, трудоемких скретч анализов является то, что ЕСНГ производит хорошо воспроизводимый рану точным диаметром 250 мкм, который закрывает в течение нескольких часов, чтобы изучить чистый миграции. Кроме того, электрический импульс сделатьэс не удалить покрытие белка и секретируется внеклеточный матрикс. В предположении, что клетки remigrate на электроде со всех сторон, скорость миграции легко может быть вычислена делением радиуса раны на время, необходимое для закрытия раны ^17. В качестве альтернативы электрической ранения, недавно так называемый метод электрический забор был введен (не показан). Импульсы Здесь высокие текущие предотвратить прикрепление и миграцию клеток на электродах после прививки. Клетки будут расти вокруг измерительного электрода и начинают мигрировать внутрь, как только электрические импульсы выключены. Преимущество электрическим забором над электрического ранения в том, что поверхность электрода не было изменено на рост клеток или удаления клеток, что является важным для измерения влияния различных покрытий на клеточной миграции.

Стимуляция Сотовый

В дополнение к изучению миграции клеток, импедансной спектроскопии идеально подходит дляоценки последствий лекарств и токсинов на клетки. 5В представляет классическую стимуляция / ингибирования эксперимент, где тромбина был использован, чтобы вызвать гипер-проницаемость в сливной ЕС барьера сжатия и зазора формирования клеток, что проявляется в виде транзиторной падению сопротивления . По предварительной инкубации с ингибитором киназы Rho Y-27632 большую часть ответа тромбина уменьшается за счет снижения базального натяжения клеток ¹⁸ и блокируя образование стресс волокна ^19. Затем киназы Rho блокатор был использован в различные моменты времени после того тромбина, что приводит к немедленному и полного восстановления барьера ЕС. Здесь преимущество непрерывной системы измерения импеданса для изучения острых клеточные ответы становится очевидным. В регулярных конечных анализов (например, окрашивания иммунофлюоресценции или макромолекулы прохода), это острая реакция на используемой блокатора было бы очень трудно, если не невозможно обнаружить и количественно. Важно отметить, что с яИзмерения mpedance проницаемость по отношению к ионам описано и не к макромолекул. Пожалуйста, обратитесь к Аман и др.. ^20, где отличный сравнение между измерениями ЕСНГ и макромолекулы прохода экспериментов предусмотрено.

Рисунок 2. Представитель измерения. MVEC были выращены на желатиновой покрытием 8W1E массивов с низкой плотностью посева 5000 клеток / см ² и записи MFT был выполнен в течение 10 дней. Измерение иллюстрирует различные чтения выходы эксперимента ЕСНГ: A) адгезии, распространения и нераспространения; Б) формирование и созревание сливной клеточный барьер, С) заживление ран после применения электрической раны; D) стимуляция с вазоактивных агент тромбина. Две стрелки указывают среду прохладительные напитки, которые были проведены с интервалом в 4 дня и дают представление о чувствительности измерений к механическим раздражителям и изменениям температуры и рН. Изображения в верхней панели соответствуют измерению и были приобретены непосредственно из измерительного электрода. Фазового контраста изображение слева показывает эндотелиальные клетки 24 часов после инокуляции, начиная покрыть электрод. В иммунофлюоресценции фотографий в центре и на правом настоящему F-актина окрашивания конфлюэнтного эндотелия слоя до и после стимуляции тромбина (1 ед / мл). Тромбин вызывает сокращение эндотелиальных клеток образованием так называемых стрессовых волокон и переходного отверстия между эндотелиальными зазоров (стрелки и изображение вставки), распознаваемых в сигнале ЕСНГ падением устойчивости к базовой линии. Здесь чувствительность измерений становится очевидным, и как изменения в клеточном слое коррелирует с сигналом импеданса.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Прикрепление клеток и рост. MVEC от того же донора высевали с тремя различными плотностями на желатиновых покрытием 8W10E массивов и рост клеток был записан в нескольких частот для 60 часов.) Значения сопротивления для трех условий при их оптимальной частоте 4 кГц для измерения формирование барьера. Все три плотности посева установлено сливающийся барьер ок. 1200 Ω в конце измерения;. Ставки распространения однако (наклон кривых) заметно отличаются Б) Измерение емкости при 64 кГц дает представление о адгезии и распространения. Адгезия является вitial фаза плато на кривой емкости (между 2-8 ч). Распространение, который находится в линейной зависимости от покрытия электрода, представлена ​​наклона кривой и завершается после 10-30 ч в зависимости от плотности посева. Момент времени т _1/2 (половина максимальная охват) могут быть использованы для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Характеристика сливной барьера. Два MVEC доноров с различным числом проходов (проход 3 и 6) высевали на покрытые желатином массивов 8W1E и измерение MFT проводили в течение 30 ч, чтобы характеризовать барьер EC.) Сопротивление Измерения показывают, что чем моложе донор 1 имеет более высокое сопротивление ок. 11000 Ω в сравнении с ок. 7500 Ω старшего донора 2. Н.э.) возможности моделирования ЕСНГ были использованы, чтобы найти причину для снижения сопротивления. Моделирование показало, сравнимую Rb взаимодействие клетка-клетка и указанный ослабленный взаимодействие клетка-матрица альфа качестве возможной причины. D) RTC была выполнена количественно Micromotion в сливной клеток слоя преобразования Фурье, где площадь под кривой пропорциональна микродвижения . Анализ спектров показывает меньшую Micromotion старшего донора 2 и тем самым поддержать то, что уже можно считать из сигнала сопротивления (меньше дисперсия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5 "FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Миграция клеток после ранения и электрического воздействия тромбина стимуляции. Импеданс записи проводили при 4 кГц с максимальным временным разрешением.) MVEC донор 1 был использован в канале 3 и донором 2 в канал 6 на желатиновых покрытием массивов 8W1E и выращивали до слияния. Затем электрический рана была создана путем применения двух импульсов 5 В при 60 кГц с длительностью 20 сек каждый. Младший донор 1 показал лучшее заживление ран возможности, основанные на быстрее закрытия раны (миграция, наклона кривых) и более высокое сопротивление после ранения в сравнении с более старой донора 2. B) HUVEC выращивали на желатиновых покрытием массивов 8W10E. При слиянии клеток были сыворотка голодали в течение 1,5 часа при замене полной культуральной среде с базальной среде плюс 1% сывороточного альбумина человека (HSA). Намвозраст простой среде с HSA является важным шагом, так как компоненты сыворотки блокировать реакцию тромбина. Как только стабильное сопротивление плато было обнаружено, тромбин был добавлен непосредственно в лунки и тщательно перемешивают с 200 мкл пипетки. Максимальный эффект тромбина видна через 30 мин, отличающийся тем, переходного падение устойчивости к базовой линии и ок. На 30-50% ниже сопротивление после восстановления. Клетки либо преинкубировали с Rho-киназы блокатора Y-27632 в течение 30 мин или блокатора был добавлен 20, 30, или 40 мин после тромбина того, что сразу уменьшилась тромбина эффект. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры .

Discussion

ЕСНГ является отличным инструментом для скрининга свойства и поведение клеток, а также для количественной оценки последствий известных и неизвестных веществ. Таким образом клетки проведено в стандартных условиях культивирования, сопротивление можно отслеживать непрерывно с высоким временным разрешением и коррелирует с оптических сигналов. Таким образом, оптимальный момент времени для клеточных манипуляций могут быть выбраны на основе статуса морфологической и функциональной клеток. К сожалению, это высокое разрешение измерения идет с ценой, что небольшие изменения в температуре, рН или механической стимуляции клеток (средняя изменить) немедленно повлиять на сигнал импеданса.

Применение небольшого измерительного тока к клеткам делает измерение ЕСНГ неинвазивный, неразрушающий и этикетка-бесплатно, но в результате только пассивные биоэлектрические свойства не могут быть измерены (без потенциалов действия). Ключевой особенностью является то, что ряд параметров может быть дер ченная из одного измерения, сочетая информацию из нескольких классических анализов, как проницаемость или заживление ран анализов. Здесь частности интересный аспект в том, что математически смоделированные данные могут быть использованы для изучения изменений в сопротивления и емкости и направлять их в различных клеточных структур (например, сотовые контакты или клеточных мембран). Важно отметить, что импедансной спектроскопии всегда обеспечивает усредненную сигнал от всех клеток на чувствительного электрода, который не позволяет исследований на одиночных клеток, а также математическая модель действует только в слоях сливающихся клеток. Поэтому эндотелиальные клетки должны быть, по крайней мере за день до, используемого для моделирования для обеспечения зрелых клеток-спайки и покоящиеся клетки проводится в состоянии конфлюэнтного. Равным образом, электрические раны должны быть применены только к сливающийся слоев клеток с помощью нескольких коротких ранив импульсы с высоких частотах, для достижения оптимальной эффективности ранения и предотвратить повреждение электродов.

jove_content "> Чтобы получить максимальное количество информации из измерения ЕСНГ, как и в любой анализе нескольких параметров, таких как комбинации подложки матрицы, покрытия и плотности посева для индивидуального типа клеток должны быть проверены и оптимизированы до эксперимента.

Главное ограничение ЕСНГ в том, что измерения не обеспечивает прямую информацию о молекулярном уровне. Таким образом измерения ЕСНГ, как правило, наиболее информативным в начале экспериментальной серии, чтобы помочь связать научную проблему с клеточными структурами или свойств и обеспечить значительный вклад для генерации проверяемую гипотезу. Поэтому модульная конструкция ЕСНГ предоставляет широкий спектр приложений с возможностью для ВАШЕМУ массивов. Последние события массива указывают на будущие направления на высокой пропускной импеданса показы для клеточной пролиферации и электрической ранения и продвижение специальных массивов потока для моделирования в естественных условиях

Дополнительная литература
См. также веб-страницу прикладной биофизики (www.biophysics.com) для применения примечания, вебинары и подробный перечень публикаций, охватывающих весь спектр ЕСНГ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E