Denne protokollen vurderinger Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing, en metode for å registrere og analysere impedans spekteret av adherente celler for kvantifisering av cellefesting, spredning, motilitet, og cellulære responser til farmakologiske og toksiske stimuli. Påvisning av endothelial permeabilitet og vurdering av celle-celle og celle-substrat kontakter er vektlagt.
Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing (ECIS) er en in vitro-impedans-målesystemet for å kvantifisere oppførselen til cellene i løpet av adherente cellelagene. For dette formål blir cellene dyrket i spesielle kulturen kamre på toppen av motstående, sirkulære gullelektroder. En konstant liten vekselstrøm tilføres mellom elektrodene og den potensielle faren måles. De isolerende egenskapene til cellemembranen opprette en motstand mot den elektriske strøm som resulterer i en økt elektrisk potensial mellom elektrodene. Måling av cellulær impedans på denne måte tillater automatisert undersøkelse av cellefesting, vekst, morfologi, funksjon og motilitet. Selv om ECIS målingen i seg selv er grei og lett å lære, er den underliggende teorien kompleks og valg av riktige innstillinger og riktig analyse og tolkning av data er ikke selvinnlysende. Likevel, en klar protokoll som beskriver de enkelte skritt fra den eksperimentelledesign til forberedelse, realisering, og analyse av eksperimentet er ikke tilgjengelig. I denne artikkelen grunnmåleprinsipp, samt mulige bruksområder, er eksperimentelle vurderinger, fordeler og begrensninger av ECIS system diskutert. A guide er anordnet for studiet av celleadhesjon, spre og proliferasjon; kvantifisering av celle oppførsel i et sammenflytende lag, med hensyn til barrierefunksjon, celle motilitet, kvaliteten på celle-celle-og celle-substrat-adhesjon, og kvantifisering av sårheling og cellulære responser til vasoaktive stimuli. Representative resultatene er omtalt basert på menneskelig microvascular (MVEC) og humane navlestrengsvenen endotelceller (HUVEC), men gjelder for alle heft voksende celler.
ΩΩΩHere presenterer vi Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing, kjent som ECIS, en spesifikk metode for å måle og analysere impedans spektrum av adherente celler i kultur 1.. Målet med denne protokollen er å tilby en generelt anvendbar guide for bruk av denne typen impedans basert cellulære analyser og gi protokoller for noen av de viktigste funksjonene fra den stadig økende antall søknader. Det vil være fokus på studiet av celleproliferasjon, barrierefunksjon, celle veikryss, og cellemotilitet.
Siden ECIS og tilhørende modell for å transformere impedansspektroskopi data i biologisk relevante parametere ble innført i sin nåværende form til det vitenskapelige miljøet ved Giæver og Keese i 1991 2, har det ofte blitt referert til som et system for måling av Teer (trans -epitelial elektrisk motstand), noe som ikke er nøyaktige. Forskjellene synes marginale i første, mener viktig for tolking. For klassiske Teer målinger, er celler dyrket på permeable filtrene til å karakterisere paracellular transportmekanismer, som er dominert av epitel trange veikryss eller endothelial adherens veikryss tre. Vanligvis er to elektroder som er plassert over og under filteret som brukes til å søke en likestrøm (DC) flyte over cellelaget og to andre elektroder for å måle den resulterende spenningsfall 4.. Den elektriske motstand er beregnet ved hjelp av Ohms lov, noe som gir en numerisk beskrivelse av kvaliteten av cellebarrieren.
ECIS følger dette grunnleggende prinsippet, og utvider den. I ECIS system, blir cellene dyrket på motstående, sirkulære gull-elektroder som er innleiret i bunnen av spesielle celledyrkingsskåler. Antallet elektroder per kultur er også variable, avhengig av anvendelsen, og elektrodene har en standarddiameter på 250 um, i noen tilfeller en større motelektrodenbrukes til å fullføre kretsen. ECIS bruker en konstant vekselstrøm (AC) med en μA med en gitt frekvens i stedet for en likestrøm. Impedansen blir beregnet fra de tilsvarende endringer i spenning (i mV) mellom elektrodene. ECIS gir mulighet til å måle den impedans over et område av frekvenser for å studere frekvensavhengige cellulære egenskaper, noe som har flere fordeler i forhold til teer og vil bli forklart i detalj i denne artikkelen. Først måle kompleks impedans kan skille den totale impedansen i celle barriere motstand og celle kapasitans. I tillegg, ved å ta data på flere frekvenser, og å anvende en matematisk modell, kan man skille mellom junctional impedans (tetthet i celle-celle-kontakter), og impedansen forårsaket av celle-substrat-vekselvirkninger (avstand av basalcellemembran til underliggende matrise) samt bidraget fra cellemembranen kapasitans. For det andre kan celleproliferasjon og motilitet vurderes, siden cellens er i direkte kontakt med elektrodene. For det tredje substrat, og elektroder er tilstrekkelig tynn til å tillate lyse felt og fasekontrastmikroskopi.
Grunnlag for impedansmålinger: Den komplekse impedansen
Til grunn for måling av den elektriske impedans av biologiske gjenstander (f.eks celler) er Ohms lov, en grunnleggende elektroteknisk prinsipp, som beskriver forholdet mellom motstanden (R), strøm (I) og spenningen (U) i en elektrisk krets på et gitt tidspunkt (t).
Gjelder i DC kretsen: R (t) = U (t) / I (t)
Når du arbeider i AC system, strøm og spenning ikke bare ulik amplitude, men også i sin fase (φ). Nå er motstanden ikke lenger tilstrekkelig å beskrive disse relasjonene. I stedet, den komplekse impedans (Z), eller i de fleste tilfeller av størrelsen av impedansen (| Z |) benyttes, inneholdende den tidligere beskrevne ohmsk motstand plus reaktans (X), noe som retater fra AC strømme gjennom kondensatorer og induktorer kjørefaseforskyvning mellom spenning og strøm 5.
Gjelder i AC krets: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2)
φ = arctan (X / R)
Ved utførelse av impedansmålinger for intakte celler, på grunn av karakteristikkene av deres membran, cellene fungerer som en parallellkobling av motstand og kondensator. Her representerer motstanden til motstand mot strømgjennomgang, mens kapasitansen (C) beskriver separering av elektriske bærere på det isolerende bi-sjikt av cellemembranen som fører til polarisering av cellen. Derved X er dominert av de kapasitive egenskaper av cellemembranen.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C Cell) -1
Siden X er frekvensavhengig, variasjon av målefrekvens muliggjør studium av forskjellige funksjonelle og strukturelle egenskaper av cellen. ECIS Enheten måler både R og X, slik at beregningav | Z |, C og φ.
Kvantifisering hele cellelag med impedansspektroskopi: Den elektriske tilsvarende krets.
Som tidligere forklart, når en celle er brakt inn i et elektrisk felt, det viser egenskaper for passive elektroniske komponenter. Hvis nå, i stedet for en enkelt celle, en hel cellelaget dyrket på toppen av elektrodene og supplert med cellekulturmedium blir undersøkt, må den enkle modell av motstand og kondensator som skal utvides til en hel elektriske nettet. I denne såkalte ekvivalent krets, motstanden i kulturmediet (R Med) så vel som kondensatoren (C Electr) og motstanden (R Electr) som karakteriserer den elektrode / elektrolytt-interaksjon må vurderes 3,6.
En forenklet, generelt eksempel på en slik ekvivalent krets for en fastsittende voksende celle laget kan finnes i figur 1. Fordelen med en slik matematisk enpproach å beskrive et biologisk system er at disse kretser kan være raffinert ad libitum og tilpasset de spesifikke eksperimentelle spørsmål, blant annet ved å vurdere impedans forårsaket av intracellulære organeller eller å skille påvirkninger av celle-celle (R Junc) og celle-substrat voksninger (R Sub) på total impedans 7,8. Likevel sikte for modellering bør alltid være å bruke den minste antall elementer som beskriver alle funksjonene i målt impedans spektrum for å tillate meningsfulle sammenhenger.
Figur 1. Skjematisk av ECIS systemet og representative ekvivalent krets for en adherente celler i vekst lag. A) tverrsnitt av et ECIS kulturen godt. Cellene vokser på toppen av sense-og motelektroden, og enre dekket med kulturmedium. Elektrodene er forbundet med en lock-in-forsterker, og en AC-signal tilføres via en 1 MΩ resistor for å skape en konstant strøm-kilde. Stimuli kan legges direkte til kultur medium til enhver tid. B) ECIS måler summen av alle individuelle bidrag til impedans. Resistens av kulturmediet (R Med) samt impedans forårsaket av elektrode / elektrolytt-grensesnittet, som er for enkelhets skyld presentert som en parallellkombinasjon av en motstand (R Electr) og en kondensator (C Electr), og også de elektriske egenskaper av cellemembranen, som beskrives av en parallellkobling av motstand (R celle) og kapasitans (C Mem), som alle må tas i betraktning. R Cell er variabel, da den er avhengig av celle permeabilitet mot strømmen. Den tilsvarende krets kan bli utvidet og raffinert ad libitum. Som et eksempel junctional (R Junc) somsamt subendotel (R Sub) resistens ble lagt til kretsen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Impedans parametere og deres biologiske betydning
De to mest direkte parametre avledet fra impedansmålinger er motstand og kapasitans av celler. Motstand representerer kvaliteten og funksjon av cellebarrieren og således tar hensyn til motstand mot para-og trans-cellulær strøm. Kapasitans gir en samlet mål på elektrode dekning. Den karakteristiske trekk ved ECIS er at med hjelp av tilsvarende kretser og modellering de globale parametere gi innsikt på mange flere cellulære egenskaper, inkludert celle-celle og celle-substrat voksninger, som vil bli diskutert senere i denne artikkelen.
Før du begynner: Eksperimentell betyderasjoner
Setup måling – Oppsettet består av flere separate komponenter: ECIS enhets med måle elektronikk, PC for datainnsamling, utvalg holder for 8 – eller 96-godt system; ECIS arrays og cellekultur av valget. Matrisen holderen må plasseres i en inkubator og koblet til ECIS enheten utenfor inkubatoren. Den PC-en må være utstyrt med ECIS programvare (1.2.123.0 14 februar 2013) og koblet til ECIS enheten.
Array utvalg – Det er et stadig voksende utvalg av ECIS arrays, designet for flere bruksområder. Standard-matriser er de 8W1E og 8W10E matriser, som er sammensatt av åtte kulturbrønner (angitt med W) som består av en eller 10 måleelektroder (angitt med E), henholdsvis. Et stort motelektroden en lukket krets, men dens impedans er i det vesentlige neglisjerbar i selve målingen 6.. Standarden 8-godt utvalg holderen kan være vert for to enrrays, noe som resulterer i et totalt antall på 16 kulturbrønnene. Gullelektroder er 50 nm tykt, avgrenset med en isolerende film, og som er montert på enten en optisk klar Lexan substrat eller et kretskort (PCB). PCB arrays er mer robust og kostnadseffektiv. Det transparente lysbilder tillate lys og immunfluorescens mikroskopi. Det må tas i betraktning er at 1E matrisen forbedrer svingninger i motstanden signalet forårsaket av cellebevegelser og som er nødvendig for sårheling studier. Videre enkeltelektroder tillate korrelasjon av elektriske og optiske signaler. I flerelektrode matriser, er signalet i gjennomsnitt over flere elektroder, som på grunn av den økte måleområdet omfatter flere celler i målingen, begrenser skjevhet av dataene ved ujevn inokulering og vekst av cellene og reduserer uskarphet av signalet på grunn av celle bevegelser. Derfor er de flerelektrode arrays er nyttige for å studere celleproliferasjon og barrieredannelse. Ved siden avvanlige matriser er det spesielle matriser som er tilgjengelige for anvendelse av skjærspenning 9, for å studere chemotaxis 10, cellemigrasjon, og spredning, så vel som 96-brønners plater for høy gjennomstrømning screeninger. For å konkludere, er matrisen som skal brukes sterkt avhengig av vitenskapelig spørsmålet og celletype, og bør velges og testes grundig.
Målefrekvens – Modellering av Rb og alfa (se dataanalyse) krever multi frekvensmålinger (MFT). Ellers impedans kan måles over tid ved en celletype spesifikk frekvens (SFT), med den fordel at data kan samles inn med en høyere tidsmessig oppløsning. Den mest følsomme målefrekvens for en spesifikk celletype kan finnes ved å frekvens-skanninger. Ved plotting impedans henholdsvis motstand vs frekvens i et log-log diagram frekvens hvor forskjellen mellom cellefri og celledekket elektrode er størst er frekvensen hvor cellene blokkere than dagens mest effektivt. I tilfelle av endotelceller (EC) denne frekvensen er på omtrent 4 kHz.
Såing Tetthet – Som i enhver vanlig cellebasert forsøk seeding tetthet avhenger av den vitenskapelige problem. Når man studerer adhesjon og spredning eller hindring formasjon, bør endotelceller blir podet med en høy tetthet av 40.000-60.000 celler / cm 2 for å sikre en sammenflytende, stabil barriere etter 48 timer. Ved fokus for forsøket er den spredning, bør endotelceller blir podet med en lav tetthet på ca 2,000-10,000 celler / cm 2.
ECIS er et utmerket verktøy for screening av celle egenskaper og oppførsel, så vel som for kvantifisering av virkningene av kjente og ukjente stoffer. Derved blir cellene holdt under standard dyrkningsbetingelser, kan impedansen kontinuerlig overvåkes med en høy tidsmessig oppløsning, og korrelert til optiske signaler. På den måten det optimale tidspunkt for celle manipulasjoner kan velges på grunnlag av de morfologiske og funksjonelle celletilstand. Uheldigvis kommer denne høye oppløsning måling med prisen for at små forandringer i temperatur, pH eller mekanisk stimulering av celler (medium forandring) vil påvirke den impedans-signalet umiddelbart.
Anvendelsen av den lille målestrømmen til cellene gjør ECIS måling invasiv, ikke-destruktiv, og label-fri, men som et resultat bare passive bioelektriske egenskaper kan måles (ingen aksjonspotensialer). Et viktig trekk er at en rekke parametere kan være der ived fra en enkelt måling, ved å kombinere informasjon fra flere klassiske analyser, som permeabilitet eller sårtilheling analyser. Her bestemt interessant aspekt er at matematisk modellerte data kan brukes til å utforske endringer i motstand og kapasitans og henvise dem til forskjellige cellulære strukturer (f.eks celle-kontakter eller cellemembran). Viktig å merke seg er at impedansspektroskopi gir alltid et gjennomsnitt signal fra alle cellene på sensing elektrode, som ikke tillater for studier av enkeltceller og også den matematiske modellen er kun gyldig i konfluente cellelag. Derfor endotelceller bør bli holdt i sammenflytende tilstand i minst en dag før brukt for modellering for å sikre modne celle-adhesjoner og hvilende celler. Likeledes bør elektriske sårene bare anvendes for sammenflytende cellelag ved hjelp av flere korte såret pulser med høye frekvenser, for å oppnå optimal effektivitet såret og forhindre skader på elektrodene.
jove_content "> For å få den maksimale mengde av informasjon fra en ECIS måling, som i hver analyse ble flere parametere som for eksempel kombinasjonen av matrisen substratet, belegging og såing densitet for den enkelte celletype må testes og optimaliseres før et eksperiment.En større begrensning av ECIS er at måling ikke gir direkte informasjon på det molekylære nivå. Dermed ECIS målinger er vanligvis mest informative i begynnelsen av en eksperimentell serie å hjelpe knytte et vitenskapelig problem med mobilnettet strukturer eller egenskaper og gi betydelig innspill for generering av en testbar hypotese. Derfor den modulære utformingen av ECIS tilbyr et bredt spekter av applikasjoner med mulighet for skreddersydde arrays. De siste array-utvikling tilsier en fremtidig fokus på høy gjennomstrømning impedans screenings for celleproliferasjon og elektrisk såret og den forkant av spesielle strømnings arrays for simulering av in vivo </em> skjærspenning med forskjellige strømningsprofiler.
Ytterligere litteratur
Det vises for øvrig til websiden of Applied biofysikk (www.biophysics.com) for søknad notater, webinarer og en detaljert liste over publikasjoner som dekker hele ECIS spekteret.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Charles Keese, Dr. Christian Renken, Christian Dehnert (Applied biofysikk Inc.) og Dr. Ulf Radler (ibidi GmbH) for deres råd, hjelp og fruktbare diskusjoner under utarbeidelsen av dette manuskriptet. Videre ønsker vi å takke Jan van Bezu for hans utmerkede teknisk support.