Detta protokoll omdömen elektrisk cell-substrat Impedans Sensing, en metod för att spela in och analysera impedansspektrumet vidhäftande celler för kvantifiering av cellvidhäftning, proliferation, motilitet och cellulära svaren på farmakologiska och toxiska stimuli. Detektion av endotelial genomtränglighet och bedömning av cell-cell-och cell-substratkontakter betonas.
Elektrisk cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) är ett in vitro impedans mätsystem att kvantifiera cellers beteende inom vidhäftande cellskikt. För detta ändamål odlas celler i speciella odlingskammare ovanpå motstående, cirkulära guldelektroder. En konstant liten växelspänning appliceras mellan elektroderna och potentialen över mäts. De isolerande egenskaperna hos cellmembranet skapar ett motstånd mot elektriskt strömflöde som resulterar i en ökad elektrisk potential mellan elektroderna. Mätning cellulär impedans på detta sätt medger den automatiserade studien av cellvidhäftning, tillväxt, morfologi, funktion och motilitet. Trots att ECIS mätningen i sig är enkel och lätt att lära sig, är den bakomliggande teorin komplexa och val av rätt inställningar och korrekt analys och tolkning av data är inte självklart. Men en tydlig protokoll som beskriver de olika stegen från den experimentelladesign till förberedelse, genomförande och analys av experimentet inte är tillgänglig. I den här artikeln princip den grundläggande mätningen samt möjliga tillämpningar, är experimentella överväganden, fördelar och begränsningar ECIS systemet diskuteras. En styrning är anordnad för studier av cellvidhäftning, spridning och proliferation; kvantifiering av cellbeteende i ett sammanflytande skikt med avseende på barriärfunktionen, cellmotilitet, kvalitet på cell-cell-och cell-substrat adhesioner, och kvantifiering av sårläkning och cellulära svaren på vasoaktiva stimuli. Representativa resultat diskuteras utifrån mänskliga mikrovaskulära (MVEC) och mänskliga umbilikalvensendotelceller (HUVEC), utan gäller för all vidhäftande växande celler.
ΩΩΩHere presenterar vi Electric Cell-substrat Impedans Sensing, känd som ECIS, en särskild metod för att mäta och analysera impedansspektrumet av vidhäftande celler i kultur 1. Syftet med detta protokoll är att erbjuda en allmängiltig vägledning för användningen av denna typ av impedans baserade cellulära analyser och tillhandahålla protokoll för några av de viktigaste funktionerna från det ständigt växande antalet ansökningar. Man kommer att fokusera på studiet av celldelning, barriärfunktion, cell korsningar, och cellrörlighet.
Eftersom ECIS och dess tillhörande modell för att omvandla impedans spektroskopi data i biologiskt relevanta parametrar infördes i sin nuvarande form till den vetenskapliga världen genom Giaever och Keese 1991 2, har det ofta kallas ett system för mätning av TEER (trans -epitelial elektriskt motstånd), vilket inte är korrekt. Skillnaderna verkar marginella i början, menär viktiga för tolkning av data. För klassiska Teer mätningar, celler odlas på genomsläppliga filter för att karakterisera paracellulär transportmekanismer, som domineras av epitelceller tight junctions eller endotelceller adherensgränssnitten junctions 3. Vanligen är två elektroder placerade ovanför och under filtret används för att applicera en likström (DC) strömma över cellskiktet och två andra elektroderna för att mäta det resulterande spänningsfallet 4. Det elektriska motståndet beräknas med Ohms lag, som tillåter en numerisk beskrivning av kvaliteten av cellbarriären.
ECIS följer denna grundläggande princip och förlänger den. I ECIS systemet odlas celler på motstående, cirkulära guldelektroder som är inbäddade i botten av speciella cellodlingsskålar. Antalet elektroder per odlingsbrunn är variabel, beroende på tillämpningen och elektroderna har en standarddiameter av 250 | im, i vissa fall en större motelektrodanvänds för att fullborda kretsen. ECIS använder en konstant växelström (AC) av 1 iA med en given frekvens i stället för en likström. Impedansen räknas från motsvarande förändringar i spänning (i mV) mellan elektroderna. ECIS erbjuder möjligheten att mäta impedansen över ett frekvensområde för att studera frekvensberoende cellulära egenskaper, som har flera fördelar jämfört TEER och kommer att förklaras i detalj i denna artikel. Först mäta komplexa impedans gör att separera den totala impedansen i cellbarriär motstånd och cell kapacitans. Dessutom, genom att ta data vid flera frekvenser och tillämpa en matematisk modell, kan man skilja mellan Junktional impedans (täthet av cell-cellkontakter) och impedans orsakas av cell-substrat interaktioner (avstånd av basalcellmembranet till underliggande matris) samt bidraget av cellmembranets kapacitans. För det andra, kan bedömas cellproliferation och motilitet, eftersom cellens är i direkt kontakt med elektroderna. För det tredje substratet och elektroderna är tillräckligt tunna för att möjliggöra ljusa fältet och faskontrastmikroskopi.
Grund för impedansmätningar: Den komplexa impedansen
Till grund för mätningen av den elektriska impedansen hos biologiska objekt (t.ex. celler) är Ohms lag, en grundläggande elektroteknisk princip, som beskriver förhållandet mellan resistansen (R), ström (I) och spänning (U) i en elektrisk krets vid en viss tidpunkt (t).
Användbar i likströmskretsen: R (t) = U (t) / I (t)
När du arbetar i AC-systemet, ström och spänning inte bara skiljer sig åt i sin amplitud, men också i sin fas (φ). Nu är motståndet inte längre tillräckligt för att beskriva dessa förbindelser. Istället den komplexa impedansen (Z) eller i de flesta fall magnituden av impedans (| Z |) används, som innehåller den tidigare beskrivna resistiva motståndet plus reaktansen (X), som återsultat från AC strömma genom kondensatorer och induktorer driv fasförskjutningen mellan spänning och ström 5.
Användbar i AC-krets: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2)
φ = arctan (X / R)
Vid utförande av impedansmätningar på intakta celler, på grund av egenskaperna hos deras membran, celler fungerar som en parallellkoppling av motstånd och en kondensator. Här motstånd representerar motstånd mot strömflöde, medan kapacitansen (C) beskriver separation av elektriska bärare vid den isolerande dubbelskikt av cellmembranet som orsakar polarisationen av cellen. Därmed X domineras av de kapacitiva egenskaper hos cellmembranet.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C Cell) -1
Eftersom X är frekvensberoende variationen av mätfrekvensen möjliggör studie av olika funktionella och strukturella egenskaper hos cellen. Åtgärderna ECIS enhet både R och X, möjliggör en beräkningav | Z |, C och φ.
Kvantifiera hela cellager med impedansspektroskopi: Den elektriska ekvivalenta kretsen.
Såsom tidigare förklarats, när en cell bringas i ett elektriskt fält, det visar egenskaperna för passiva elektroniska komponenter. Om nu, i stället för en enda cell, en hel cellskiktet odlades på toppen av elektroderna och kompletterat med cellodlingsmedium undersöks behöver enkel modell av motstånd och en kondensator för att utsträckas till ett helt elektriskt nätverk. I denna så kallade ekvivalenta kretsen, motstånd av odlingsmediet (R Med) samt kapacitans (C Elektr) och resistans (R Elektr) karakterisera elektrod / elektrolyt interaktion måste beaktas 3,6.
En förenklad, allmänt exempel på en sådan ekvivalent krets för en vidhäftande växande cellskikt kan hittas i figur 1. Fördelen med en sådan matematisk aILLVÄGAGÅNGSSÄTT att beskriva ett biologiskt system är att dessa kretsar kan förfinas efter behag och anpassas till de specifika experimentella frågor, t.ex. genom att överväga impedans orsakas av intracellulära organeller eller för att särskilja påverkan av cell-cell (R Junc) och cell-substrat sammanväxningar (R Sub) på den totala impedansen 7,8. Trots målet för modellering bör alltid vara att använda det minsta antalet element som beskriver alla funktioner i den uppmätta impedansspektrum att göra meningsfulla samband.
Figur 1. Schematisk av ECIS systemet och representativ ekvivalent krets för en fastsittande växande celler lager. A) Tvärsnitt av en ECIS kulturen väl. Cellerna växer på toppen av avkänning och motelektrod och enåter täckt med odlingsmedium. Elektroderna är anslutna till en lock-in-förstärkare och en AC-signal matas via en 1 Mohm motstånd för att skapa en konstant strömkälla. Stimuli kan tillsättas direkt till odlingsmediet vid någon tidpunkt. B) ECIS mäter summan av alla enskilda bidrag till impedansen. Resistans i odlingsmedium (R Med) samt impedans orsakad av elektrod / elektrolyt-gränsytan, som är för enkelhetens skull presenteras som en parallellkombination av ett motstånd (R Elektr) och en kondensator (C Elektr), och även de elektriska egenskaperna av cellmembranet, som beskrivs av en parallellkoppling av motstånd (R Cell) och kapacitans (C Mem), alla måste beaktas. R Cell är variabel, eftersom den är beroende av cellens permeabilitet mot strömmen. Den ekvivalenta kretsen kan utökas och förfinas efter behag. Som ett exempel Junktional (R Junc) såsomliksom subendoteliala (R Sub) motstånd sattes till kretsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Impedans parametrar och deras biologiska betydelsen
De två mest direkta parametrar härledda från impedansmätningar är resistans och kapacitans av celler. Resistance står för kvalitet och funktion av cellbarriären och tar hänsyn till motståndet mot para-och trans-cellulär strömflöde därför. Kapacitans ger ett övergripande mått på elektrodtäckning. Det utmärkande för ECIS är att med hjälp av motsvarande kretsar och modellering de globala parametrar ger insikter om många fler cellulära egenskaper, inklusive cell-cell och cell-substrat sammanväxningar, som kommer att diskuteras senare i denna artikel.
Innan du börjar: Experimentell consideransoner
Mätning inställning – Installationen består av flera separata komponenter: ECIS enhet med mätningselektronik, PC för datainsamling, array hållare för 8 – eller 96-bra-system, ECIS arrayer och cellkultur val. Matrisen Innehavaren måste placeras i en inkubator och anslutna till ECIS enhet utanför inkubatorn. Datorn måste vara utrustad med ECIS programvara (1.2.123.0 14 februari 2013) och ansluts till ECIS enhet.
Array val – Det finns ett ständigt växande utbud av ECIS matriser, avsedda för flera program. De schablon arrayer är den 8W1E och 8W10E arrayer, som består av åtta odlingsbrunnar (indikeras med W) innefattande ett eller 10 mätelektroder (anges med E), respektive. En stor motelektrod sluter kretsen, men dess impedans är i huvudsak försumbar i själva mätningen 6. Standarden 8 brunnar array innehavaren kan vara värd två enrrays, vilket resulterar i ett totalt antal av 16 odlingsbrunnar. De guldelektroderna är 50 nm tjockt, avgränsas med en isolerande film och monteras på antingen en optiskt klar Lexan polykarbonatsubstrat eller ett tryckt kretskort (PCB). PCB-arrayer är mer robust och kostnadseffektiv. De genomskinliga diabilder tillåter ljus och immunofluorescensmikroskopi. Vad måste beaktas är att 1E array förbättrar fluktuationer i motståndssignalen orsakade av cellrörelser och krävs för sårläkning studier. Dessutom enstaka elektroder tillåter korrelation av elektriska och optiska signaler. I multielektrodanordningar, är signalen som medelvärde över flera elektroder, vilket beror på den ökade mätområdet innehåller flera celler i mätningen, begränsar förspänningen av data genom ojämn inokuleringen och tillväxten av cellerna och minskar suddigheten av signalen på grund av cell rörelser. Därför är de multielektrodanordningar är användbara för att studera cellproliferation och barriärbildningen. Bredvidvanliga arrayer finns särskilda matriser tillgängliga för tillämpningen av skjuvspänningen 9, för att studera chemotaxis 10, cell migration och spridning samt 96-brunnar för hög genomströmning filmvisningar. Avslutningsvis, är starkt beroende av vetenskapliga frågor och celltyp matrisen som ska användas och bör väljas och testas noggrant.
Frekvensmätning – Modelleringen av Rb och alfa (se dataanalys) kräver multifrekvensmätningar (MFT). Annars impedansen kan mätas över tid på en celltyp specifik frekvens (SFT), med den fördelen att data kan samlas in med en högre tidsupplösning. Den känsligaste frekvensmätning för en specifik celltyp kan hittas genom frekvensläsningar. Vid plottning impedans respektive motstånd mot frekvensen i ett log-log diagram frekvensen där skillnaden mellan cellfria och cell täckta elektroden är störst är den frekvens där cellerna blockerar than aktuell mest effektivt. I händelse av endotelceller (EC) denna frekvens är vid ca 4 kHz.
Sådd densitet – Som i varje ordinarie cellbaserade experiment seedning densitet är beroende av vetenskapliga problem. Vid studie av vidhäftning och spridning eller barriärbildningen bör endotelcellerna ympas med en hög densitet av 40,000-60,000 celler / cm 2 för att garantera en sammanflytande, stabil barriär efter 48 timmar. Om fokuseringen av experimentet är på proliferationen bör endotelcellerna ympas med en låg densitet av ca 2,000-10,000 celler / cm 2.
ECIS är ett utmärkt verktyg för screening av cellegenskaper och beteende samt för kvantifiering av effekterna av kända och okända ämnen. Därigenom cellerna hålls under standardodlingsbetingelser kan impedans kontinuerligt övervakas med en hög tidsupplösning och korreleras till optiska signaler. På så sätt den optimala tidpunkten för cell manipulationer kan väljas på basis av den morfologiska och funktionella cellstatus. Tyvärr kommer denna hög mätupplösning med priset att små förändringar i temperatur, pH eller mekanisk stimulering av celler (mediumbyte) kommer att påverka impedanssignalen omedelbart.
Tillämpningen av den lilla mätningsström till cellerna gör att ECIS mätning icke-invasiv, icke-förstörande, och etikett-fri, men som ett resultat endast passiva bioelektriska egenskaper kan mätas (inga aktionspotentialer). En viktig egenskap är att ett antal parametrar kan vara der ived från en enda mätning, som kombinerar information från flera klassiska analyser, såsom permeabilitet eller sårläkningsanalyser. Här den särskilda intressant aspekt är att matematiskt modellerade data kan användas för att undersöka förändringar i motstånd och kapacitans och hänvisa dem till olika cellstrukturer (t.ex. cell-kontakter eller cellmembran). Viktigt att notera är att impedansspektroskopi ger alltid ett genomsnitt signal från alla celler på avkännande elektroden, som inte tillåter för studier av enskilda celler och även den matematiska modellen är endast giltig i sammanflytande cellager. Därför endotelceller bör hållas i sammanflytande tillstånd under minst en dag innan används för modellering för att se till mogna cell sammanväxningar och vilande celler. Likaså bör elektriska sår endast tillämpas på sammanflytande cellskikt med användning av multipla korta sårskada pulser med höga frekvenser, för att uppnå optimal sårskada effektivitet och förhindra skada på elektroderna.
jove_content "> För att få maximal mängd information från ett ECIS mätning, som i varje analys, flera parametrar såsom kombinationen av array substrat, beläggning och seedning densitet för den enskilde celltyp måste testas och optimeras innan ett experiment.En viktig begränsning av ECIS är att mätningen inte ger direkt information om den molekylära nivån. Således ECIS mätningar är oftast mest informativa i början av en experimentell serie för att associera ett vetenskapligt problem med cellulära strukturer eller egenskaper och ger betydande bidrag till skapandet av en testbar hypotes. Därför den modulära designen av ECIS erbjuder ett brett spektrum av applikationer med möjlighet för skräddarsydda arrayer. De senaste array utveckling tyder på en framtida satsning på hög genomströmning impedans filmvisningar för celltillväxt och elektrisk såra och förskottet för speciella flödes matriser för simulering av in vivo </em> skjuvspänning med olika strömningsprofiler.
Ytterligare litteratur
Se även webbsidan för Applied biofysik (www.biophysics.com) för ansökan anteckningar, webbseminarier och en detaljerad lista över publikationer som täcker hela ECIS spektrumet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Charles Keese, Dr Christian Renken, Christian Dehnert (Applied biofysik Inc.) och Dr Ulf Radler (ibidi GmbH) för deras råd, hjälp och givande diskussioner under utarbetandet av detta manuskript. Vidare vill vi tacka Jan van Bezu för hans utmärkta tekniska support.