Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

تقييم الأداء الوظيفي في Published: March 27, 2014 doi: 10.3791/51303
Automatic Translation
1, 1
1Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center

Summary

قياس النتيجة الأولية في التجارب السريرية لاضطرابات العصبية والعضلية وتحسين وظيفة العضلات عموما. وبالتالي، وتقييم تأثير المركبات العلاجية المحتملة على أداء العضلات سريريا قبل في نماذج الماوس هو من أهمية كبيرة. نحن هنا تصف عدة اختبارات وظيفية لمعالجة هذا الأمر.

Abstract

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو شديد في العضلات والهزال التدريجي اضطراب والتي لا يوجد علاج متاح. ومع ذلك، قد تقدمت العديد من المركبات الدوائية المحتملة والنهج العلاج الجيني في التجارب السريرية. مع تحسن في وظيفة العضلات كونها نقطة النهاية الأكثر أهمية في هذه التجارب، تم وضع الكثير من التركيز على إنشاء موثوق بها، قابلة للتكرار، وسهلة لأداء الاختبارات الوظيفية إلى ما قبل سريريا تقييم وظيفة عضلة، والقوة، والشرط، والتنسيق في MDX نموذج الفأر لDMD. تتوفر كل من اختبارات الغازية وغير الغازية. الاختبارات التي لا تؤدي إلى تفاقم المرض يمكن أن تستخدم لتحديد التاريخ الطبيعي للمرض وآثار التدخلات العلاجية (على سبيل المثال. اختبار قوة قبضة forelimb، اختبارين شنقا مختلفة سواء باستخدام الأسلاك أو شبكة وrotarod تشغيل). بدلا من ذلك، اضطر تشغيل مفرغه يمكن استخدامها لتعزيز تطور المرض و / أو تقييمآثار وقائية من التدخلات العلاجية في أمراض الأمراض. نحن هنا تصف كيفية أداء هذه الاختبارات الوظيفية الأكثر استخداما بطريقة موثوق بها وقابلة للتكرار. باستخدام هذه البروتوكولات على أساس إجراءات التشغيل القياسية تمكن مقارنة البيانات بين المختبرات المختلفة.

Introduction

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو اضطراب عصبي عضلي الأكثر شيوعا التي تؤثر 1:5،000 الأولاد حديثي الولادة. ويتسبب هذا المرض الشديد والهزال العضلات التدريجي عن طريق الطفرات في الجين DMD التي تعطل الإطار القراءة المفتوحة ومنع تخليق البروتين الدستروفين الوظيفية. ألياف العضلات التي تفتقر إلى الدستروفين عرضة لممارسة الأضرار التي يسببها. عند استنفاد قدرة العضلات على التجدد، ويرجع ذلك إلى التهاب مزمن في العضلات التالفة، يتم استبدال الألياف عن طريق النسيج الضام والدهون، مما يؤدي لاحقا إلى فقدان وظيفة. عموما، والمرضى DMD تفقد التمشي في الأطراف السفلية في وقت مبكر من العقد الثاني. في وقت لاحق، وكذلك عضلات الذراعين والكتف حزام هي المتضررة والمرضى وغالبا ما تضع صدري قطني جنف بسبب ضعف في عضلات غير المتماثلة دعم الحبل الشوكي. التهوية المساعدة هو مطلوب عموما في أواخر سن المراهقة أو في أوائل العشرينات. الجهاز التنفسي وفشل القلب الرصاصحتى الموت في العقد الثالث أو الرابع 1.

على الرغم من أن الجين المسبب للمرض تم اكتشافه منذ أكثر من 25 عاما 2، لا يوجد علاج متاح لDMD. ومع ذلك، وتحسين الرعاية الصحية واستخدام الكورتيزون وزيادة متوسط ​​العمر المتوقع في العالم الغربي 3. مع استخدام نماذج حيوانية مثل الماوس MDX، إلى الأمام خطوات كبيرة في اكتشاف استراتيجيات العلاجية المحتملة بذلت. الماوس MDX هو نموذج الفأر DMD الأكثر استخداما. لديها طفرة نقطة في اكسون 23 من الجينات DMD الفئران وبالتالي يفتقر الدستروفين 4. على مدى العامين الماضيين، قد حققت تقدما العديد من الاستراتيجيات المقترحة في التجارب السريرية 5-9. في هذه التجارب، وتحسين وظيفة العضلات هو نقطة النهاية الأولية، التي يقوم عليها أهمية اختبار فائدة من المركبات على وظيفة العضلات في الفئران خلال مرحلة ما قبل السريرية لاختبار.

مثل DMDالمرضى، وأيضا الألياف العضلية السلبية الدستروفين من الفئران MDX عرضة للضرر الناجم عن ممارسة واختلال وظائف العضلات مقارنة C57BL/10ScSnJ الفئران نوع البرية. ويمكن تقييم هذا الانخفاض مع مجموعة متنوعة من الاختبارات الوظيفية. بعض هذه الاختبارات موسع ولا تتداخل مع أمراض العضلات (مثل forelimb قوة قبضة، واختبارات شنقا وrotarod تشغيل). وبالتالي يمكن أن تستخدم لرصد التاريخ الطبيعي للمرض أو تحديد آثار المركبات على تطور المرض. للحصول على الصورة في عمق تأثير المركبات على وظيفة العضلات في الفئران MDX، نظام اختبار وظيفي أن لا تتداخل مع تطور المرض تتكون من كل هذه التجارب يمكن استخدامها 10.

بدلا من ذلك، اضطر تشغيل مفرغه يمكن استخدامها لتفاقم عمدا تطور المرض واختبار القدرات الوقائية للمركبات 11. ويمكن أيضا أن تكون حلقة مفرغةتستخدم قياس النتيجة التي تشغل الوقت حتى استنفاد يقاس 12، أو كأداة لالتعب الفئران MDX بحيث أداء أقل بشكل جيد في اختبار وظيفي لاحقة ضمان أكبر الاختلافات في الأداء بين مجموعات العلاج 13. عند اختيار الاختبارات الوظيفية، يجب أن تبقى تأثيرها على تطور المرض في الاعتبار خاصة عند اختبار الفئران التصنع مثل الماوس MDX 14.

نحن هنا تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ الاختبارات الوظيفية الأكثر استخداما بطريقة موثوق بها وقابلة للتكرار على أساس إجراءات التشغيل القياسية المتوفرة من شبكة TREAT NMD. اضغط هنا لزيارة TREAT-NMD .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب وصفها هنا من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية (DEC) من المركز الطبي لجامعة لايدن (LUMC). كانت ولدت الفئران عن طريق منشأة الحيوان من LUMC وضعهم في أقفاص التهوية بشكل فردي مع 12 ساعة ضوء دورات الظلام. كان عليهم بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية الحصول على المياه وتشاو القياسية.

عند تنفيذ أي من الاختبارات الوظيفية المبينة أدناه، الظروف التجريبية يجب أن تكون خاضعة لرقابة صارمة للحد من التباين. ويفضل، ينبغي استخدام العمر والجنس الفئران المتطابقة، كما يختلف الأداء بين العمر وبين الجنسين. وينبغي العشوائية الفئران التي تنتمي إلى نفس القمامة على المجموعات التجريبية. وينبغي اختبار الحيوانات من قبل نفس المشغل، الذي هو أعمى إلى المجموعات التجريبية. يجب أن يتم تنفيذ الاختبارات على نفس الوقت من اليوم وأيام الأسبوع، نفس الغرفة لمعادلة الروائح، والضوضاء، الخ ويمكن ملاحظة تباين كبير بين 14 الفئران الفردية والنقاط الزمنية للجميعاختبارات وظيفية، وبالتالي 6-8 الفئران / المجموعة التجريبية التي ينبغي استخدامها. يمكن أداء اختبار وظيفي أيضا تختلف إلى حد كبير بين مختلف السلالات البرية من نوع الفطرية. وبالتالي، الفئران البرية من نوع التجريبية والضابطة ينبغي دائما أن الخلفيات المقابلة (في حالة الفئران MDX استخدام C57BL/10ScSnJ نوع السلالة البرية). وقد تم الحصول على جميع البيانات الموضحة هنا مع C57BL/10ScSnJ نوع السلالة البرية، وهو ما يشير إلى نوع البرية اعتبارا من الآن فصاعدا. الاختبارات الموصوفة هنا يمكن استخدام طوليا من 1-19 أشهر على الأقل من العمر في الفئران نوع MDX والبرية. يجب أن لا تتكرر التجارب أكثر من مرة واحدة أسبوعيا لمنع الفئران من فقدان الاهتمام والاستعداد لتنفيذ المهمة.

1. Forelimb قبضة قوة اختبار

استخدام اختبار forelimb قوة قبضة لقياس قوة الأمامية. ويستند الاختبار على الميل على فأرة الحاسوب لفهم غريزي شبكة عندما علقت من ذيله 15، وadapteد من DMD_M2.2.001.pdf .

  1. تعيين الجهاز الأعلى: إرفاق الشبكة لمحول القوة، والذي يقيس أقصى القوة التي تطبقها الماوس على الشبكة أثناء السحب. تأكد من أن الإعداد هو على الذروة وضع التوتر (T-PK) لسحب. ويمكن تعديل وحدات من القوة في أي أوقية من قوة، غرام من قوة، جنيه من قوة، كجم من القوة، أو نيوتن.
    ملاحظة: نحن نفضل العمل مع غرام كوحدة من القيم. هي متر متعددة متاحة تجاريا، ولكن فقط محولات المحوري تعطي نتائج موثوق بها وتتأثر قوة محولات رافعة نوع سلبا من القوانين الفيزيائية من تأثير رافعة. إما شبكة nonflexible أو مثلث يمكن استخدامها مع الحانات التي هي 1-2 ملم في القطر.
  2. قبل إجراء الاختبار، وتقييم وزن الجسم من الفأرة، للسماح للتطبيع وزن الجسم.
  3. استخدام غرام كوحدة من القيم. إعادة تعيين العداد في بداية كل ريكوrding.
  4. إزالة الماوس من قفصه عن طريق الاستيلاء على الذيل وتحريكه أفقيا نحو الشبكة.
  5. تأكد من أن الماوس القبضات الشبكة بشكل وثيق مع كل من الأرجل الأمامية.
  6. سحب الماوس بعيدا عن الشبكة بحيث يتم كسر سيطرتها؛ سيظهر أعلى القوة المطبقة على الشبكة على شاشة محول، والتي يمكن أن تكون إما يدويا أو تلقائيا المسجلة.
  7. تأخذ فقط في الاعتبار تسحب فيها الماوس يظهر مقاومة المجرب. رفض التدابير التي forepaw واحد فقط، أو hindlimbs استخدمت والتي تحولت الماوس أثناء السحب.
  8. السماح للماوس سحب الشبكة ثلاث مرات على التوالي ومن ثم إعادته في القفص لفترة يستريح من دقيقة واحدة على الأقل ملاحظة: بين سلسلة من تسحب فترة الراحة ضروري لالماوس لاستعادة وتجنب تشكيل العادة.
  9. ثم ترك الماوس إجراء سلسلة من أربعة تسحب كل تليها فترة راحة قصيرة. بهذه الطريقة مذكرات التفاهموقد سحبت ه ما مجموعه 15X (3 × 5 مرات تسحب = 15 تسحب).
  10. تحديد الحد الأقصى لقوة قبضة وتطبيع لوزن الجسم عن طريق أخذ متوسط ​​القيم الثلاث أعلى من القيم التي تم جمعها 15.
  11. اختياري: تحديد التعب عن طريق حساب إنقاص بين متوسط ​​من الأولين والأخيرين من سلسلة تسحب 1 +2 +3 = A، 4 +5 +6 = B، 10 +11 +12 = C و 13 +14 + 15 = D. الصيغة: (C + D) / (A + B) يعطي قيمة 1 بالنسبة للفئران التي لا مرهق. هذا يمكن التعبير عنها في النسب المئوية بحيث ماوس دون تعب يحتوي على قيمة 0٪ والفأر الأمامية التي مرهق تماما يحتوي على قيمة 100٪.

2. معلقة الاختبارات

مع الاختبارات شنقا، والتوازن والتنسيق وحالة العضلات يمكن تقييمها. وتستند هذه الاختبارات على الفئران أن المعرفة هي حريصة أن تبقى معلقة على سلك الشبكة أو حتى استنفاد 16. هناك نوعان من اختبارات شنقا المميزة التي في بداية الاختبار إماوتستخدم فقط الأمامية اثنين أو جميع أطرافه الأربعة، وذلك باستخدام سلك الشبكة أو على التوالي. اختبار شنقا باستخدام الأسلاك والشبكة هي أطول وقت طريقة التعليق مقتبس من DMD_M.2.1.004.pdf و DMD_M.2.1.005.pdf على التوالي. ويستخدم الحد شنقا ثابتة من 600 ثانية. غالبية الفئران البرية من نوع يمكن أن يتعطل عن 600 ثانية، بينما الفئران التصنع لا يمكن. للحد من قضاء بعض الوقت أداء هذا الاختبار، تم تعيين الحد الأقصى الوقت شنقا في المكان. يتم إعطاء الفئران التي تسقط السلك أو الشبكة قبل ثم يصل إلى اثنين من أكثر محاولات. يتم ذلك لإعادة التأمين أن الفئران غير قادر حقا أن يتعطل وحتى لا يسقط بسبب الحماقات.

  1. اختبار شنقا مع اثنين من أطرافه
    1. تعيين جهاز الأعلي: تأمين بإحكام 2 مم معدنية سميكة من القماش شماعات لرف مع الشريط والحفاظ على شماعات حول 370؛ سم فوق طبقة من الفراش. ملاحظة: بدلا من ذلك، 55 سم 2 مم سلك معدني سميك الذي هو المضمون بإحكام بين 2 المدرجات الرأسي يمكن استخدامها. على مسافة 37 سم يكفي لتشجيع الفئران أن تظل معلقة، ولكن أيضا منخفضة بما فيه الكفاية لمنع الفئران من الإصابات عند سقوطها. يجب أن السلك لم يهتز أو تهجير أثناء الاختبار لأن هذا يمكن أن تتداخل مع أداء الماوس.
    2. التعامل مع الماوس عبر الذيل وجعله بالقرب من السلك.
    3. السماح للماوس فهم السلك مع الأرجل الأمامية اثنين فقط، وخفض hindlimbs في مثل هذه الطريقة أن توقف الماوس فقط مع اثنين من الأرجل الأمامية على السلك (الشكل 2B).
    4. البدء مباشرة في توقيت عند تحرير الماوس. بعد الإفراج عنهم، الفئران قوية في محاولة للقبض على الأسلاك مع جميع أطرافه الأربعة والذيل، والذي يسمح (الشكل 2C).
    5. عندما يظهر الماوس السلوك غير اللائق (مثل موازنة أو عمدا القفز من الأسلاك على النحو SHتملك في أرقام 2D و 2E)، معالجة مباشرة هذا عن طريق استبدال الماوس على السلك من دون التوقف الموقت.
    6. عندما يسقط ماوس قبالة الأسلاك، وإيقاف الموقت وتسجيل الوقت شنقا.
    7. عندما تكون قادرا على شنق ل600 ثانية الفئران، وتأخذهم بعيدا عن الأسلاك وإعادتها إلى القفص. يتم إعطاء الفئران التي تقع قبل هذا الحد بحد أقصى اثنين من أكثر محاولات.
    8. تسجيل الحد الأقصى للوقت شنقا (أي أطول من تجارب) واستخدام هذا لمزيد من التحليل.
  2. معلقة اختبار مع أطرافه الأربعة
    1. تعيين الجهاز حتى: استخدام إما اليد التي قدمت مربع أو غطاء قفص كبير للفأر أو أرنب لهذا الاختبار. وضع الشبكة 25 سم فوق الفراش لينة لمنع الفئران من إيذاء أنفسهم على السقوط، ولكن أيضا للحد من الفئران على القفز عمدا خارج الشبكة. تأمين بإحكام الشبكة بحيث لا يكون المجرب لعقد الشبكة يدويا أثناء التجربة حيث أن هذه الحركات قد طnterfere مع أداء الفأر.
    2. ضع الماوس على الشبكة بحيث القبضات مع الكفوف الأربعة.
    3. عكس الشبكة بحيث الماوس هو معلق والبدء مباشرة في جهاز ضبط الوقت.
    4. تنتهي جلسة اختبار للفئران التي تكون قادرة على شنق لمدة 600 ثانية. إعطاء الفئران التي تقع خارج الشبكة في وقت سابق بحد أقصى اثنين من أكثر محاولات.
    5. استخدام الحد الأقصى للوقت شنقا (أي. أطول من تجارب) لمزيد من التحليل.

3. الجري Rotarod

مع اختبار قوة العضلات rotarod، والتنسيق، والتوازن، وحالة يمكن تحديد 17.

  1. تعيين الجهاز الأعلى: لهذا الاختبار، والفئران لديك لتشغيل على أنبوب الدورية. ضمان أن يتم ضبط سرعة ثابتة عند 5 التناوب لكل دقيقة (دورة في الدقيقة)، وأن يزيد من سرعة 5-45 دورة في الدقيقة في 15 ثانية الأولى عندما بدأت. بعد هذا لديه للحفاظ على سرعته.
  2. وضع الفئران على أنبوب من rotarodعندما يدور بسرعة ثابتة بطيئة من 5 دورة في الدقيقة. يمكن اختبار خمسة الفئران في وقت واحد.
  3. بدء التشغيل مرة واحدة يتم وضع جميع الفئران. ضمن 15 ثانية الأولى من سرعة أنبوب تسارع 5-45 دورة في الدقيقة وبعد ذلك يؤكد أن السرعة.
  4. مراقبة التشغيل. إدارة الوقت وتسجل باستمرار من قبل البرنامج. إدارة الوقت يتوقف تلقائيا عندما يسقط ماوس خارج الأنبوب حيث أن هذا ينشط شريط الوقت ضعه تحت الأنبوب. إعادة الفئران التي يستدير التي تواجه الاتجاه المعاكس على أنبوب أثناء تشغيل دون توقف أنبوب للتدوير.
  5. إنهاء جلسة اختبار للفئران التي هي قادرة على تشغيل لمدة 500 ثانية. إعطاء الفئران بحد أقصى اثنين محاولات أكثر مما يسمح لهم لتحسين وقتهم على التوالي، عندما يقعون في وقت سابق.
  6. استخدام الحد الأقصى للوقت تشغيل (أي أطول من تجارب) لمزيد من التحليل.

4. التمرين مفرغه

المفرغه يمكن استخدامها في ثلاث طرق كأداة في مرحلة ما قبل البحوث السريرية. أولا، مطحنة اضطر تشغيل يمكن استخدامها لتفاقم الأمراض المرض كما هو موضح في هذا البروتوكول (انظر أيضا: DMD_M2.1.001.pdf ). ثانيا، القدرة على التوالي القصوى من الفئران وآثار العلاجات على هذا يمكن تقييمها (انظر لطريقة للسماح الفئران تشغيل حتى استنفاد DMD_M.2.1.003.pdf ). أخيرا، مطحنة تشغيل يمكن استخدامه قبل اختبار وظيفي آخر لاستنفاد الماوس بحيث ينفذ أقل بشكل جيد في الاختبار الثاني 13. يتم ذلك من خلال ممارسة الفئران مرتين أو ثلاث مرات أسبوعيا كما هو موضح أدناه، تليها مباشرة من قبل أي واحد من اختبارات وظيفية وصفها في بروتوكول 1-3.

  1. تعيين جهاز حسابه: هناك العديد من المطاحن المتاحة تجاريا التي يمكن العديد من الفئران رون في وقت واحد والتي الارتفاع ومدته وسرعة يمكن تعديلها. وقد تم تجهيز بعض المطاحن مع شبكة لتقديم الصدمات كثافة منخفضة لتشجيع الفئران لتشغيل. ومع ذلك، الفئران MDX حساسة للإجهاد، ويمكن بسهولة أن يكون الدافع بطريقة ودية من خلال دفعة لطيف مع اليد في الاتجاه قيد التشغيل. وبالتالي، فإنها مدعوة بقوة إلى عدم استخدام الشبكة الصدمة. عموما، هناك حاجة إلى التحفيز مع اليد فقط خلال الدورة الأولى على التوالي.
  2. وضع الفئران في حلقة مفرغة الأفقي.
  3. بدء حلقة مفرغة في سرعة تشغيل 12 م / دقيقة. بسرعة أقل (8 م / دقيقة) لديها لاستخدامها في الفئران القديمة (> 15 شهرا)، حيث السرعات العالية يؤدي بسهولة إلى الإرهاق.
  4. خلال الدورة الأولى، وتشجيع الفئران لتشغيل عن طريق دفع لهم بلطف عندما يكونون قرب نهاية الحزام.
  5. عندما قمت بتشغيل الفئران لمدة 30 دقيقة، ووضعها مرة أخرى في قفص.
  6. كرر ذلك مرتين أسبوعيا لمدة 12 أسبوعا على سبيل المثال. تسمح فترات الراحة عند الحاجة. على سبيل المثال، بعض الفئران MDX ديك لإيقاف تشغيل وينبغي أن يسمح للراحة لبضع دقائق. إذا حدث هذا، بدوره قبالة الحزام، وإعطاء كل الفئران فترة الراحة اثنين من دقيقة، يتحول الحزام على لمدة دقيقة على 4 م / دقيقة. بعد هذا، وزيادة السرعة إلى 12 م / دقيقة والسماح للفئران لإنهاء البروتوكول. من المهم أن جميع الفئران استكمال بروتوكول تشغيل كامل.

    ملاحظة: في حالة الفئران MDX تحتاج فترات الراحة، والنظر في الاحماء قبل ممارسة بروتوكول 30 دقيقة. يتكون هذا الاحماء دورة: فترة التأقلم 2 دقيقة بسرعة 4 م / دقيقة، تليها مباشرة والودية 8 دقائق في 8 متر / دقيقة.


    في أيدينا الفئران MDX الإناث 4-16 أسبوع من العمر قادرون على استكمال بروتوكول ممارسة 30 دقيقة من دون يستريح. وذكر آخرون أن في سن المتطابقة الفئران MDX الذكور 45٪ من الفئران لا تحتاج إلى فترات الراحة لإنهاء العملية. بروتوكول الاحماء تقللو كمية من توقف 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قوة قبضة forelimb من نوع البرية والفئران MDX يزيد تتراوح أعمارهم ما بين 4-12 أسابيع، ويقلل من جديد في الفئران الأكبر سنا. يمكن بالفعل لوحظ ضعف في القوة في الفئران MDX الشباب. وتظهر بيانات تمثيلية من الفئران الإناث 9 الاسبوع القديمة في أرقام 1A و 1 ب. على الرغم من التعب لا تختلف بين سلالات حتى الآن في هذا العصر، الفئران MDX أضعف من الفئران نوع البرية. ليس لدينا بيانات حتى الآن على فتور في MDX السن والنوع البري الفئران.

للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار، وتحتاج إلى تقييم متعددة ينبغي القيام به من قبل نفس المجرب. نحن هنا وصف لسحب 15 مرة / الفردية، ولكن أقل من أرقام تسحب (منخفضة تصل إلى 5 تسحب) أيضا توفير بيانات موثوقة. ينبغي لفت الانتباه الدقيق لتحديد المواقع من الكفوف على الشبكة وهذا يمكن أن تؤثر إلى حد كبير النتائج. أثناء الانسحاب، فقط كل من الأرجل الأمامية وينبغي أن تستخدم لديهم لبه وضعت بشكل جيد بجانب بعضها البعض (الشكل 1C). عندما الماوس لا يظهر مقاومة لسحب، لا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار القيمة.

لأطرافه الأربعة وأطرافهم شنقا اثنين من الاختبارات والفئران البرية من نوع الشباب خصوصا (4-16 أسابيع من العمر) ويمكن الوصول بسهولة إلى الساعة المعلقة الحد الأقصى من 600 ثانية. متضارب، هو ضعف أداء الفئران MDX الشباب (وهم نادرا تحقيق أقصى قدر من الوقت شنقا)، وكذلك تدهور مع التقدم في السن، رغم أن كلا سلالات وضع كل جهد في أداء هذه الاختبارات في شنق أفضل قدراتهم (أرقام 2A و 3A). ويتم الحصول على أكبر الاختلافات في شنقا مرات بين نوع MDX والبرية الفئران مع السلك. وبالتالي، يمكن أن يتم الكشف عن أثر حتى أحجام صغيرة من المركبات على وظيفة العضلات باستخدام هذا الاختبار. الأداء معلق (أو أي نوع آخر من الأداء) يختلف بين الأفراد داخل وبمرور الوقت مما يؤدي في الحانات عالية الانحراف المعياري. Nonethelوفاق سطيف، الفئران MDX باستمرار أداء أسوأ من سن المتطابقة الفئران البرية من نوع (الشكل 2A). يمكن إجراء تقييمات متعددة تقدم نظرة أكثر تفصيلا في التحسينات الفنية على العلاج من القياسات نقطة النهاية فقط. ينبغي أن يوضع في الاعتبار أنه في الدورة الأولى الحيوانات تتعلم كيفية إجراء اختبار وظيفي. هذا المنحنى التعلم، والتي هي موجودة في جميع الاختبارات، ومرئيا بين 4-6 أسابيع من العمر بشكل واضح. ومع ذلك، لأن الفئران أيضا تنمو بسرعة في هذه الفترة العمرية، وهو تمييز بين التحسن يرجع إلى التعلم و / أو النمو لا يمكن أن يتم. كما تم العثور على الفروق بين الجنسين في الأداء شنقا لاثنين من أطرافه شنق الاختبار. أداء الفئران MDX الإناث يفوق عدد الذكور التي كتبها ~ 100 ثانية، وأداء مفرغه تحدى الفئران الإناث MDX مشابه تقريبا لتلك التي للذكور دون منازع (قارن مع الأرقام 2A 4A). وتؤكد هذه النتيجة أهمية استخدام سن لالثانية بين الجنسين المتطابقة الفئران لتجنب التحيز. لدينا بيانات أولية تشير إلى أن الاختلافات في الأداء في كل الاختبارات معلقة بين نوع زيادات MDX والبرية في الفئران قديمة جدا (18 شهرا) الفئران.

عرض بعض الفئران السلوك غير اللائق لتجنب معلقة على الأسلاك مثل؛ التوازن على السلك، القفز من السلك عمدا الخ (أرقام 2D و 2E)، على الرغم من أن الغالبية العظمى من الفئران الامتثال لاختبار وشنق مع اثنين أو أربعة أطراف ( أرقام 2B و 2C). في بعض الأحيان، الفئران قوية القفز من السلك عمدا. انهم شنق قبل القفز فقط مع اثنين hindlimbs والذيل على السلك وننظر إلى أسفل لتقدير المسافة إلى الأرض. السلوك غير اللائق التي ينظر اليها في بعض الأحيان على الشبكة أثناء الاختبار أربعة أطرافه معلقة تتكون من القفز عمدا خارج الشبكة أو التسلق على الشبكة. جميع أشكال السلوك غير الملائم ليمكن أن يكون بسهولة. dذ المتميزة وينبغي ألا يسمح. الفئران التي تجنب شنقا في واحدة من هذه الطرق يجب أن توضع مباشرة مرة أخرى على السلك أو الشبكة دون التوقف الموقت.

على rotarod، الفئران MDX تشغيل بالكاد من أي وقت مضى للمرة تشغيل الحد الأقصى من 500 ثانية، في حين أن نسبة أكبر من الفئران البرية من نوع القيام به (الشكل 3B). مع التقدم في السن، يعمل أداء كل سلالات النقصان. بعض الفئران قادرة على كبح بإحكام إلى أنبوب الدورية وتجنب تشغيل بواسطة 'cartwheeling' حولها. هذا لا يمكن تصحيحه عن وجود قيود شديدة هو الاختبار عند الفئران متعددة تبدأ في فعل هذا لفترات طويلة، وبالتالي زيادة التباين داخل المجموعات التجريبية. خاصة بالنسبة لبعض الفئران التي تعمل جزئيا وجزئيا عجلة العربة، وخلال فترة الانتقال من cartwheeling في تشغيل الخريف. بعض الفئران يستدير على أنبوب الدورية أثناء التشغيل. وينبغي معالجة هذا السلوك من قبل لاعادة تموضع مباشرة الفئران على الأنابيب، معمن وقف ذلك. أيضا هذا النوع من السلوك يحد من فائدة هذا الاختبار.

مطحنة اضطر تشغيل هو ممارسة سهلة وفعالة لتفاقم أمراض المرض في الفئران MDX nontreated، بينما النوع البري الفئران التي تمر نفس البروتوكول لا تتأثر. عموما، الفئران تصبح مألوفة مع حلقة مفرغة بعد جلسة التدريب الأولي، ونحن مستعدون لتشغيل، وخصوصا عندما تقوم بتشغيل الفئران متعددة في نفس الوقت. الفئران MDX القديمة (أكثر من 15 شهرا من العمر) تواجه صعوبات في تشغيل وغير قادرة على التعامل مع نفس سرعة تشغيل من 12 م / دقيقة لمدة 30 دقيقة تستخدم لصغار الفئران. لذلك، ينصح أبطأ سرعة تشغيل من 8 متر / دقيقة لمدة 30 دقيقة تمكين جميع الفئران لإنهاء بروتوكول بأكمله. الفئران MDX هم عرضة بوجه خاص لانكماش غريب الأطوار، وبالتالي تشغيل انحدار يمكن أن تستخدم إلا لمدة قصيرة.

بدلا من ذلك، والاختبارات الفنية الأخرى مثل الأسلاك ر اثنين من أطرافه شنقابتوقيت شرق الولايات المتحدة يمكن القيام بها مباشرة بعد تشغيل (الشكل 4A). استخدام هذا تصميم الدراسة، والاختلافات بين سلالات أو الأسلحة العلاج ومن المرجح أن تزداد كما تحدى مفرغه الفئران غير المعالجة هي أقل MDX قادرة على أداء هذه الاختبارات من الفئران MDX المستقرة 13.

كما ذكر آنفا، عند دراسة وظيفة العضلات في الفئران MDX، يحتاج C57BL/10ScSnJ نوع السلالة البرية لاستخدامها والتي هي الخلفية الوراثية المقابلة. فإننا ننصح هذا حتى بين السلالات البرية من نوع الفطرية مفرغه تشغيل الأداء يختلف 18،19. ولكن أيضا في اختبارات وظيفية موسع، يتأثر الأداء الوظيفي عن طريق خلفيات وراثية. الشكل 5 يوضح هذا في ثلاثة رسوم بيانية ممثل حيث أداء الفئران MDX على خلفية BL/10 وعلى خلفية مختلطة تتألف من BL/10، BL/6J، DBA2 وتتم مقارنة 129OLA. كما يمكن أن يكون موضع تقدير الفئران خلفية مختلطةأداء أفضل في اختبارات الأسلاك المعلقة وأسوأ على rotarod.

الشكل 1
الشكل 1. قوة قبضة Forelimb، ممثل النتائج وتحديد المواقع الصحيحة من الكفوف. قوة قبضة A. Forelimb تطبيع لوزن الجسم من MDX الإناث 9 أسابيع من العمر (ن = 5) والنوع البري (ن = 4) الفئران. هو ضعف قوة قبضة بالفعل في الفئران MDX الشباب. تشير العلامات النجمية ع <0.05 ويتم عرض البيانات كما يعني ± st.dev باء التعب من نفس الأفراد كما هو مبين في A، وكان في المتوسط ​​أقل من 10٪ ولم تختلف بين السلالات. C. للحصول على بيانات موثوقة، والاهتمام ينبغي أن تدفع إلى المواقع من خلال الكفوف forelimb تحليل قوة قبضة. الموضع الصحيح من الفأرة، واثنتان الأرجل الأمامية هي بجانب بعضها البعض، hindlimbs عه عدم لمس الشبكة والماوس هو سحب في خط مستقيم D. المواقع غير الصحيحة من الأرجل الأمامية؛ الماوس لا سحب في خط مستقيم. عندما يحدث هذا، أو عند استخدام forepaw واحد فقط أو أيضا hindlimbs، يتحول الماوس حولها خلال سحب أو يفتقر لإظهار المقاومة، يجب التخلص من البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. اختبارين أطرافهم شنقا، نتائج ممثل والسلوك المناسب وغير المناسب شنقا. A. مثال ممثل اختبار اثنين من أطرافه شنقا يؤديها مرة واحدة أسبوعيا في MDX الذكور (ن = 18، 4-10 أسابيع، ن = 13، 11 و 12 أسبوعا، ن = 10، 13 أسبوعا) وعمر ويقابل بين الجنسين الفئران البرية من نوع (ن = 6). منحنى التعلم هو لكلا السلالات في الأسابيع القليلة الأولى من الاختبار واضحة. كان أداء الفئران MDX سوءا مقارنة بما كان عليه من الفئران نوع البرية. البيانات المقدمة كما يعني ± st.dev. يشار إلى الحد الأقصى للوقت المسموح به من قبل شنقا خط منقط. باء نقطة الانطلاق الصحيح من هذا الاختبار هو مع اثنين من الأرجل الأمامية. C. اعتمادا على قدرة وظيفية من الفأرة فإنه يمكن أيضا استخدام hindlimbs والذيل دال وهاء مجموعة فرعية صغيرة من الفئران، والفئران قوية وخاصة النوع البري، ويمكن تجنب بعض الأحيان شنقا عن طريق تسلق على أشرطة جانبية أو التوازن على السلك. بعض الفئران تقفز عمدا خارج السلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 3. أربعة أطرافه شنقا وrotarod تشغيل الاختبار. A. أربعة أداء أطرافهم شنقا تقييم مرة واحدة أسبوعيا في MDX الذكور (ن = 18، 4-10 أسابيع، ن = 13، 11 و 12 أسبوعا، ن = 8 و 13 أسابيع)، والنوع البري ( ن = 6) الفئران. مع مرور الوقت، الفئران MDX شنق أقل طويلة من النوع البري الفئران. B. Rotarod تشغيل مرات لم تختلف بين الذكور الشباب MDX (ن = 18، 4-10 أسابيع، ن = 13، 11 و 12 أسبوعا، ن = 10، 13 أسبوعا ) والفئران البرية من نوع (ن = 6). يتم تمثيل البيانات كما يعني ± st.dev.

الرقم 4
الشكل 4. وكانت أمراض العضلات تأثير مفرغه اضطر تشغيل بروتوكول ممارسة على الأداء الوظيفي وعلم الأمراض العضلات والهيكل العظمي في الفئران الإناث عمداتفاقمت من خلال السماح الفئران تشغيل في حلقة مفرغة الأفقي ثلاث مرات في الأسبوع في 12 م / دقيقة لمدة 30 دقيقة لمدة 12 أسبوعا. مباشرة بعد تشغيل، وكان الفئران للمشاركة في اثنين من اختبار أطرافهم شنقا. في حين أن جميع الفئران البرية من نوع (ن = 5) لا تزال معلقة حتى الحد الأقصى المسموح به، وجميع الفئران MDX (ن = 6) تسقط السلك في وقت سابق (ع <0.001، البيانات المقدمة كما يعني ± st.dev). B. وجود الضرر غشاء تقرر من خلال تقييم البلازما الكرياتين كيناز (CK) المستويات التي يتسرب من ألياف العضلات من خلال الدموع في الغشاء. كانت مرتفعة مستويات CK في الفئران MDX مقابل نوع الفئران البرية قبل ممارسة الرياضة. ممارسة مفرغه زيادة مستويات الفور (ع <0.01 يتبين من النجمة، البيانات المقدمة كما يعني ± st.dev.) في الفئران MDX، في حين أنها لا تزال منخفضة في البرية من نوع الفئران. CD عضلات الفئران MDX. معرضون جدا لممارسة مفرغه، وتدهور علم الأمراض المرض على نطاق واسع لأي fter بضعة أسابيع من التشغيل. هذه Haematoxylin ويوزين stainings من عضلات الفخذ من 16 أسبوع من العمر nonexercised (C) وتمارس مفرغة (D) MDX المعرض الماوس التي يتم تطويرها التليف واسعة والنخر. لا تتأثر E. عضلات الفئران البرية من نوع تمر البروتوكول نفسه التوالي. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تأثير مختلط على خلفية الأداء الوظيفي في الفئران MDX. الاختلافات في تأثير الخلفية الوراثية الأداء الوظيفي. لتوضيح هذا، أداء MDX الذكور (BL/10 الخلفية، ن = 18، 4-10 أسابيع، ن = 13، 11 و 12 الاولىكانساس، ن = 10، 13 أسبوعا) وMDX (BL/10 المختلطة، BL/6J، DBA2 و129OLA الخلفية، ن = 5) تمت مقارنة الفئران مع مرور الوقت. أطرافهم معلقة الأداء A. اثنين الاختبار يختلف اختلافا كبيرا بين سلالتين. وكانت نتائج الاختبار B. أربعة أطرافه معلقة على ارتفاع طفيف في خلفية مختلطة الفئران MDX. C. Rotarod مرات أيضا تشغيل اختلفت قليلا بين السلالات. البيانات المقدمة كما يعني ± st.dev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاختبارات الفنية المعروضة هنا هي استنساخه، وسهلة لأداء وتنطبق على نوع البرية والفئران التصنع مستقلة عن سنهم. الاختبارات توفير أدوات مفيدة لتقييم ما قبل السريرية وظيفة العضلات، والقوة، والشرط، والتنسيق. عند اختبار آثار مركب على التاريخ الطبيعي للمرض، ووصف الاختبارات موسع هنا (قوة قبضة forelimb، سواء شنقا الاختبارات واختبار rotarod) ويمكن الجمع بين طيف في نظام اختبار وظيفي حيث يتم تنفيذ هذه الاختبارات في أيام متتالية . هذه البروتوكولات ليست ضارة على الفئران MDX، ويمكن استخدامها بطريقة طولية 10. وينبغي ألا يغرب عن البال أن يتم إنشاء نتائج كل من هذه التجارب التي قامت بها مجموعات مختلفة من العضلات أو متداخلة جزئيا بدلا من العضلات الفردية. لذا، وذلك باستخدام مزيج من اختبارات متعددة ينصح للحصول على صورة أكثر اكتمالا والبصيرة وبالتالي أفضل في وظائف التجاربمجموعات العقلية. بدلا من ذلك، إدخال تحسينات وظيفية من العضلات وحيد يمكن تقييمها باستخدام قياسات فسيولوجيا العضلات 20.

مثل الاختبارات السلوكية، كما يمكن أن تظهر اختبارات وظيفية واسعة الاختلاف بين الفئران مختلفة، أو داخل الماوس بين التقييمات المختلفة. للحد من التباين، يجب أن يتم تنفيذ جميع الاختبارات من قبل نفس المجرب المطلع على الفئران. المتغيرات الخارجية مثل الروائح والأصوات في الغرفة، ويجب أن تبقى وقت من اليوم ويوم من أيام الأسبوع التي يتم تنفيذ الاختبار بثبات ممكن. وينبغي أن تكون الفئران الجنس والعمر المتطابقة. عند استخدام جهاز المشي إلى تفاقم تشغيل تطور المرض، فمن الضروري لاستخدام بروتوكول موحد التي يتم الاحتفاظ كافة المعلمات تشغيل (إدارة الوقت والسرعة والمنحدر) ثابتة على مر الزمن لجميع المجموعات التجريبية، بحيث يتم التعامل مع جميع الفئران على حد سواء. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الفئران حريصون على المشاركة في الاختبارات الوظيفية وتظهر معظم الحيوانات عاليةمستويات الاستعداد، وبعض الفئران (قوي في المقام الأول النوع البري الفئران) تجنب أحيانا أداء اختبار السلوك وتظهر الإبطال. عندما لا يتم تصحيح هذا السلوك ل، يمكن استخلاص استنتاجات خاطئة 21. لحسن الحظ، هذه الأنواع من السلوك ويلاحظ أحيانا فقط ويمكن تصحيحها عن طريق وضع الماوس مرة أخرى على السلك، شبكة أو rotarod، أو سحب وقت آخر على قوة قبضة متر.

تحسينات في اختبار وظيفي واحد (على سبيل المثال معلقة اختبار وظيفة العضلة تقييم) ليس بالضرورة أن تشارك تحدث مع تحسينات في اختبار آخر (forelimb قوة قبضة تقييم قوة العضلات وحيد). في الفئران MDX، وإدخال تحسينات في وظيفة العضلات يمكن تمييزها في وقت سابق من قوة العضلات. ويعتبر هذا أيضا في المرضى DMD المشاركة في التجارب السريرية حيث تحسينات ذات مغزى سريريا في اختبار المشي 6 دقائق لا cooccur مع تحسينات في قوة العضلات 6،7. ومع ذلك، قدفي جزء تعتمد على آلية العمل في مجمع اختبارها وأنه من الممكن أن المركبات الأخرى تحسين قوة وليس وظيفة. وبالتالي، ينبغي تفسير نتائج الاختبارات مع آلية عمل المجمع في الاعتبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نود أن نشكر مارغريت Hulsker لمساعدتها التصوير الفوتوغرافي والمساعدة في الحصول على الصور من الفئران والمراجعين على تعليقاتها البناءة جدا. وأيد هذا العمل من قبل ZonMw، وعلاج، NMD (العقد رقم LSHM-CT-2006-036825) ومشروع الرئيسي دوشين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse grip strength meter Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) # 80529
Hanging wire 2 limbs device Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device Lid of rat cage or custom made device
Rotarod Ugo Basil # 47600
Treadmill for mice Exer 3/6 Columbus Instruments # 1055SRM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
  2. Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
  3. Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
  4. Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
  5. Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
  6. Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
  7. Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
  8. Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
  9. Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
  10. van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
  11. De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
  12. Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
  13. van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
  14. Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
  15. Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
  16. Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
  17. Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
  18. Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
  19. Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
  20. Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
  21. Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).

Tags

السلوك، rotarod العدد 85، ضمور العضلات دوشين، الاضطرابات العصبية والعضلية، وتدابير النتيجة، اختبار وظيفي، نموذج الفأر، قوة قبضة، والشنق الأسلاك الاختبار، اختبار شنقا الشبكة، تشغيل، مطحنة تشغيل
تقييم الأداء الوظيفي في<em&gt; MDX</em&gt; نموذج الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aartsma-Rus, A., van Putten, M.… More

Aartsma-Rus, A., van Putten, M. Assessing Functional Performance in the Mdx Mouse Model. J. Vis. Exp. (85), e51303, doi:10.3791/51303 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter