Summary
De primaire uitkomstmaat in klinische trials voor neuromusculaire aandoeningen is over het algemeen verbeterd spierfunctie. Daarom beoordeling van het effect van mogelijke therapeutische verbindingen op spierprestaties klinisch vooraf in muismodellen van groot belang. We beschrijven hier een aantal functionele tests om dit aan te pakken.
Abstract
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige en progressieve spieratrofie aandoening waarvoor geen behandeling beschikbaar is. Toch verscheidene potentiële farmaceutische verbindingen en gentherapiebenaderingen zijn gevorderd in klinische proeven. Met verbetering van de spierfunctie het belangrijkste eindpunt in deze onderzoeken, is veel nadruk gelegd op het opzetten van betrouwbare, reproduceerbare, en makkelijk om functionele testen uit te voeren om klinisch pre spierfunctie, kracht, conditie en coördinatie bij de beoordeling geplaatst mdx muismodel voor DMD. Zowel invasieve en niet-invasieve testen beschikbaar. Tests die nog niet over de ziekte verergeren kan worden gebruikt om te bepalen de natuurlijke geschiedenis van de ziekte en de effecten van therapeutische interventies (bv. Voorpoot grijpkracht test, twee verschillende hangende testen met behulp van een draad of een rooster en rotarod hardlopen). Als alternatief kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om progressie van de ziekte te verbeteren en / of te beoordelenbeschermende effecten van therapeutische interventies op ziekte pathologie. We beschrijven hier hoe deze meest gebruikte functionele tests op betrouwbare en reproduceerbare wijze. Met behulp van deze protocollen op basis van standaard operationele procedures maakt de vergelijking van gegevens tussen verschillende laboratoria.
Introduction
Duchenne spierdystrofie (DMD) is de meest voorkomende neuromusculaire aandoening die 1:5000 pasgeboren jongens. Deze ernstige en progressieve spieratrofie ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het DMD gen dat het open leesraam verstoren en voorkomen de synthese van functionele dystrofine proteïne. Spiervezels ontbreekt dystrofine zijn kwetsbaar voor geïnduceerde schade te oefenen. Na uitputting van regeneratieve capaciteit van de spier, en door chronische ontsteking van beschadigde spieren, worden vezels vervangen door bindweefsel en vet, vervolgens leidt tot een verlies van functie. In het algemeen, DMD patiënten verliezen ambulantie van de onderste ledematen in het begin van het tweede decennium. Later, ook de spieren van de armen en schoudergordel zijn getroffen en patiënten vaak thoracolumbar scoliose door asymmetrische verzwakking van de spieren ondersteunen het ruggenmerg. Geassisteerde ventilatie is over het algemeen nodig is in de late tienerjaren of begin twintig. Ademhalings-en hartfalen looddood in de derde of vierde decennium 1.
Hoewel het veroorzakende gen is ontdekt meer dan 25 jaar geleden 2, is er geen behandeling beschikbaar voor DMD. Echter, een betere gezondheidszorg en het gebruik van corticosteroïden hebben de levensverwachting toegenomen in de westerse wereld 3. Met het gebruik van dierlijke modellen zoals de mdx muis, belangrijke stappen in de ontdekking van potentiële therapeutische strategieën zijn gemaakt. De mdx muis is de meest gebruikte DMD muismodel. Het heeft een puntmutatie in exon 23 van het muizen Dmd gen en dus ontbreekt dystrofine 4. In de afgelopen paar jaren hebben vele voorgestelde strategieën ontwikkeld tot klinische studies 5-9. In deze studies, verbetering van de spierfunctie is het primaire eindpunt, wat het belang van het testen van het voordeel van de verbindingen op de spierfunctie bij muizen tijdens de preklinische fase van het testen.
Net als DMDpatiënten, ook het dystrofine negatieve spiervezels van mdx muizen zijn kwetsbaar voor veroorzaakte schade te oefenen en hun spierfunctie is verminderd ten opzichte van C57BL/10ScSnJ wild-type muizen. Deze bijzondere waardevermindering kan worden beoordeeld met een verscheidenheid aan functionele tests. Sommige van deze tests zijn niet-invasieve en niet interfereren met spier-pathologie (bv. voorpoot grijpkracht, opknoping testen en rotarod hardlopen). Daarom kunnen ze worden gebruikt om het natuurlijke beloop van de ziekte of het effect van een verbindingen van ziekteprogressie. Om een grondige beeld van de invloed van verbindingen op de spierfunctie in mdx muizen, een functionele test regime dat niet interfereert met ziekteprogressie bestaande uit al deze tests kunnen worden gebruikt 10.
Als alternatief kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om opzettelijk verergeren progressie van de ziekte en test de beschermende capaciteiten van verbindingen 11. De loopband kan ookals resultaat mate waarin looptijd tot uitputting gemeten 12, of als een middel om vermoeidheid mdx muizen, zodat ze minder goed presteren in een volgende functionele beproeving die groter verschil in prestaties tussen behandelingsgroepen 13. Bij het kiezen van functionele tests, moeten hun effect op de progressie van de ziekte in gedachten worden gehouden vooral bij het testen dystrophic muizen als de mdx muis 14.
Wij hier in detail beschrijven hoe aan de meest gebruikte functionele testen op een betrouwbare en reproduceerbare wijze op basis van beschikbare standaard operationele procedures van de TREAT-NMD netwerk uit te voeren. Klik hier om naar TREAT-NMD .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven experimenten werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee (DEC) van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC). Muizen werden gefokt door het dier faciliteit van het LUMC en bewaard in individueel geventileerde kooien met 12 uur licht donker cycli. Ze hadden ad libitum toegang tot water en standaard chow.
Bij het uitvoeren van een van de functionele tests hieronder beschreven experimentele condities moeten streng gecontroleerd worden om de variatie te verminderen. Bij voorkeur dient leeftijd en geslacht overeen muizen worden gebruikt als prestaties verschillen tussen leeftijd en geslachten. Muizen die tot hetzelfde nest worden gerandomiseerd in de experimentele groepen. De dieren moeten worden getest door dezelfde exploitant, die is blind voor de experimentele groepen. Tests moeten worden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip van de dag en dag van de week, dezelfde kamer geuren, geluiden, etc. egaliseren 14 Grote variatie tussen individuele muizen en tijdstippen kan worden waargenomen voor allefunctionele tests, dus 6-8 muizen / experimentele groep worden gebruikt. Functionele test kan ook grotendeels verschillen tussen verschillende inteelt wild-type stammen. Daarom moeten experimentele en controle wild-type muizen altijd overeenkomstige achtergronden hebben (in geval van mdx muizen gebruiken het C57BL/10ScSnJ wild-type stam). Alle gegevens die hier worden beschreven zijn verkregen met het C57BL/10ScSnJ wild type stam, die wij aanduiden als wild type van hier op. De hier beschreven tests kunnen in lengterichting worden uit ten minste 1-19 maanden in mdx en wildtype muizen. Tests moeten niet worden herhaald meer dan eenmaal per week aan muizen voorkomen verliezen interesse en bereidheid om de taak uit te voeren.
1. Voorpoot Grip Strength Test
Gebruik de voorpoot grijpkracht test om de sterkte van de voorpoten te meten. De test is gebaseerd op de neiging van een muis instinctief grijpen een rooster bij suspensie door de staart 15 en van ADAPTEd van DMD_M2.2.001.pdf .
- Apparatuur opzetten: Bevestig een grid naar een krachtopnemer, die de maximale kracht van de muis toegepast op de grid tijdens de pull meet. Zorg ervoor dat de instelling over Peak spanning modus (T-PK) voor het trekken. De eenheden van kracht kan worden aangepast in zowel gram-kracht, g-kracht, kilo-van kracht, kilogram-kracht, of Newton.
Opmerking: Wij geven de voorkeur om te werken met grammen als eenheid van waarden. Meerdere meters zijn in de handel verkrijgbaar, maar alleen axiale transducers geven betrouwbare uitkomsten als type hefboom krachtopnemers negatief worden beïnvloed door de fysische wetten van het hefboomeffect. Ofwel een nonflexible raster of driehoek kan met staven die 1-2 mm in diameter. - Vóór de test beoordeelt het lichaamsgewicht van de muis, om normalisatie voor het lichaamsgewicht mogelijk.
- Gebruik gram als eenheid van waarden. Reset de meter aan het begin van elk recording.
- Verwijder de muis uit zijn kooi door grijpen de staart en het horizontaal verplaatsen naar het rooster.
- Controleer of de muis grijpt het rooster stevig met beide voorpoten.
- Trek de muis weg van het net zodat de greep wordt gebroken, de grootste kracht uitgeoefend op de grid op de transducer display, die handmatig of automatisch opgenomen kunnen worden weergegeven.
- Alleen rekening rukken in de rekening waarop de muis toont weerstand tegen de experimentator. Maatregelen die op een voorpoot of de achterste ledematen werden gebruikt en waarbij de muis bleek tijdens de trek verwerpen.
- Laat de muis trekt het net drie keer achter elkaar en dan terug in de kooi voor een rustperiode van ten minste een minuut. Opmerking: tussen serie trekt een rustperiode is noodzakelijk voor de muis om te herstellen en te voorkomen dat gewoontevorming.
- Laat dan de muis uit te voeren vier series van trekt, elk gevolgd door een korte rustperiode. Op deze manier de mouse heeft een totaal van 15x (3 trekt x 5 keer = 15 maal trekken) getrokken.
- Bepaal de maximale grijpkracht en normaliseren van het lichaamsgewicht door het gemiddelde van de drie hoogste waarden van de 15 waarden verzameld.
- Optioneel: Bepaal vermoeidheid door berekening van het verlagen van het gemiddelde van de eerste twee en de laatste twee reeksen trekt 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C en 13 +14 + 15 = D. De formule: (C + D) / (A + B) geeft een waarde van 1 voor muizen die niet vermoeid. Dit kan worden uitgedrukt in procenten, zodat een muis zonder vermoeiing heeft een waarde van 0% en een muis die voorpoten volledig vermoeid heeft een waarde van 100%.
2. Opknoping Tests
Met hangende testen, balans, coördinatie en spieren voorwaarde kan worden beoordeeld. Deze tests zijn gebaseerd op de wetenschap dat muizen staan te popelen om te blijven opknoping op een draad of rooster tot uitputting 16. Er zijn twee verschillende hangende testen waarbij bij aanvang van de proef hetzijalleen de twee voorpoten of alle vier de ledematen worden gebruikt, met een draad of raster respectievelijk. De hangende test met de draad en het rooster zijn de langste schorsing tijd methode aangepast van DMD_M.2.1.004.pdf en DMD_M.2.1.005.pdf respectievelijk. Een vaste opknoping limiet wordt gebruikt van 600 sec. De meerderheid van de wild-type muizen kunnen hangen voor 600 sec, terwijl dystrophic muizen niet kunnen. Om tijd te besteden uitvoeren van deze test te verminderen, werd een maximale hangende tijd opgezet. Muizen die de draad of raster vallen voor die tijd krijgen maximaal twee pogingen. Dit wordt gedaan om te herverzekeren dat muizen zijn echt niet in staat om op te hangen en niet vallen als gevolg van onhandigheid.
- Opknoping proef met twee onderdelen
- Apparatuur opgezet: Nauw zorgen voor een 2 mm dikke metalen doek hanger aan een plank met tape en de hanger ongeveer 37 behouden0; cm boven een laagje strooisel. Opmerking: Als alternatief zou een 55 cm breed, 2 mm dikke metalen draad die strak wordt bevestigd tussen 2 verticale stands worden gebruikt. De afstand van 37 cm is voldoende om muizen aan te moedigen om te blijven hangen, maar ook laag genoeg om muizen te voorkomen van blessures bij het vallen. De draad moet niet trillen of verdringen tijdens de test, omdat dit kan interfereren met de prestaties van de muis.
- Omgaan met de muis via de staart en breng het in de buurt van de draad.
- Laat de muis grijpen de draad met alleen de twee voorpoten en de achterpoten zakken zodanig dat de muis hangt alleen de twee voorpoten op de draad (figuur 2B).
- Direct de timer te starten wanneer de muis loslaat. Na de release, sterke muizen proberen de draad halen met alle vier ledematen en de staart, die is toegestaan (figuur 2C).
- Wanneer een muis toont ongepast gedrag (zoals balanceren op of opzettelijk springen uit de draad als shbezit in figuren 2D en 2E), dit rechtstreeks tot de muis vervangen op de draad zonder stoppen van de timer.
- Wanneer een muis valt de draad, stop de timer en noteer de hangende tijd.
- Bij muizen zijn in staat om op te hangen voor 600 sec, neem ze uit de draad en breng ze terug naar de kooi. Muizen die vóór deze grens vallen, krijgen maximaal twee meer probeert.
- Noteer de maximale hangende tijd (dwz de langste van de proeven) en gebruik deze voor verdere analyse.
- Opknoping proef met vier ledematen
- Apparatuur opgezet: Gebruik een van beide een hand plein of op de deksel van een grote kooi voor een rat of een konijn voor deze test gemaakt. Plaats het rooster 25 cm boven zacht beddengoed om muizen te voorkomen dat zelfbeschadiging op vallen, maar ook om muizen te ontmoedigen om opzettelijk te springen uit het rooster. Stevig vast het rooster, zodat de experimentator niet hoeft aan het net tijdens het experiment als deze bewegingen met de hand te houden zou iknterfere met de prestaties van de muis.
- Plaats de muis op het rooster zodat het grijpt met zijn vier poten.
- Keer het rooster, zodat de muis is opknoping en de timer direct starten.
- De test sessie eindigt voor muizen die in staat zijn om op te hangen voor een duur van 600 sec zijn. Geef muizen die uit het rooster vallen eerder een maximum van twee meer probeert.
- Gebruik de maximale hangende tijd (dwz. De langste van de proeven) voor verdere analyse.
3. Rotarod Running
Met de rotarod proef spierkracht, kan coördinatie, balans en conditie worden vastgesteld 17.
- Apparatuur opgezet: Voor deze test, muizen moeten draaien op een roterende buis. Controleer of de constante snelheid wordt ingesteld op 5 omwentelingen per minuut (rpm), en dat de snelheid toeneemt 5-45 rpm in de eerste 15 seconden bij het starten. Daarna moet het de snelheid behouden.
- Plaats de muizen op de buis van de rotarodals het draait met een langzame constante snelheid van 5 rpm. Vijf muizen kunnen gelijktijdig worden getest.
- Start de run zodra alle muizen zijn geplaatst. Binnen de eerste 15 seconden van de snelheid van de buis versnelt 5-45 min, waarna zij dat snelheid.
- Bewaken van de run. De looptijd wordt continu geregistreerd door de software. Looptijd stopt automatisch wanneer een muis valt de buis als deze activeert de tijdbalk onder de buis geplaatst. Verplaatsen muizen die draaien rond geconfronteerd met de tegenovergestelde richting op de buis tijdens het hardlopen zonder te stoppen de buis te draaien.
- Het einde van de testsessie voor muizen die kunnen draaien voor een duur van 500 sec zijn. Geef muizen maximaal twee pogingen zodat ze verbeteren van hun looptijd, wanneer zij eerder vallen.
- Gebruik de maximale looptijd (de langste van de proeven) voor verdere analyse.
4. Tredmolenoefening
Deloopband kan op drie manieren gebruikt als een instrument in de pre klinisch onderzoek. Ten eerste kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om de ziekte pathologie verergeren zoals beschreven in dit protocol (zie ook: DMD_M2.1.001.pdf ). Ten tweede kan de maximale lopende vermogen van muizen en het effect van de behandelingen op deze worden beoordeeld (Zie voor de methode te laten muizen lopen tot uitputting DMD_M.2.1.003.pdf ). Ten slotte kan loopband lopen worden gebruikt voorafgaand aan een andere functionele test om de muis te putten, zodat het minder goed presteert in de tweede proef 13. Dit gebeurt door het uitoefenen muizen tweemaal of driemaal per week zoals hieronder beschreven, onmiddellijk gevolgd door een van de functionele tests protocol 1-3 beschreven.
- Apparatuur opgezet: Er zijn verschillende loopbanden commercieel verkrijgbaar waarop meerdere muizen kan run gelijktijdig en waarvoor hoogte, duur en snelheid kan worden aangepast. Sommige loopbanden zijn voorzien van een rooster lage intensiteit schokken toe te dienen aan muizen stimuleren draaien. Echter, mdx muizen zijn gevoelig voor stress en kan gemakkelijk in een vriendelijker manier worden gemotiveerd door een lichte druk met de hand in de looprichting. Daarom is het sterk aangemoedigd om NIET de schok net. Over het algemeen wordt de stimulering van de kant alleen nodig tijdens de eerste lopende sessie.
- Plaats de muizen op de horizontale loopband.
- Start de loopband bij een loopsnelheid van 12 m / min. Lagere snelheden (8 m / min) moet in oude muizen (> 15 maanden), waar hogere snelheden gemakkelijk leiden tot uitputting.
- Gedurende de eerste sessie stimuleren muizen lopen door ze zachtjes als ze aan het einde van de band.
- Wanneer de muizen lopen voor een duur van 30 minuten, plaats ze terug in hun kooi.
- Herhaal dit twee keer per week voor oa 12 weken. Laat rustpauzes wanneer nodig. Bijvoorbeeld, sommige mdx muizen te stoppen en moet worden toegestaan om te rusten voor een paar minuten. Als dit gebeurt, zet de riem af, geven alle muizen een rustperiode van twee minuten, draai de riem op twee minuten bij 4 m / min. Hierna verhogen snelheid 12 m / min en laat de muizen om het protocol te beëindigen. Het is belangrijk dat alle muizen voltooien de gehele lopende protocol.
Opmerking: In het geval mdx muizen nodig rusttijden, overweeg dan een warming-up voor de 30 min. oefening protocol. Dit opwarmen sessie bestaat uit: 2 min acclimatisatie periode bij een snelheid van 4 m / min, onmiddellijk gevolgd door een 8 minuten opwarmen bij 8 m / min.
In onze handen 4-16 weken oude vrouwelijke mdx muizen zijn in staat om de 30 min oefening protocol te voltooien zonder te rusten. Anderen hebben gemeld dat in dezelfde leeftijd mannelijke mdx muizen 45% of de muizen hoeft rustperioden om de oefening te voltooien. De warming-up protocol verminderens de hoeveelheid stops 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorpoot grijpkracht van wild-type en mdx muizen verhoogt tussen de leeftijd van 4-12 weken en vermindert weer in oudere muizen. Stoornissen in kracht kan reeds op jonge mdx muizen. Representatieve gegevens van 9 weken oude vrouwelijke muizen worden getoond in Figuren 1A en 1 B. Hoewel vermoeidheid verschilt niet tussen de stammen nog op deze leeftijd, mdx muizen zijn zwakker dan wild-type muizen. We hebben nog geen gegevens hebben over vermoeidheid bij oudere mdx en wild-type muizen.
Om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, moeten meerdere evaluaties worden gedaan door dezelfde experimentator. We beschrijven hier tot 15 keer / individuele trekken, maar kleinere aantallen trekt (zo laag als 5 maal trekken) ook betrouwbare gegevens. Dient zorgvuldige aandacht te worden besteed aan de plaatsing van de poten op de grid, want dit kan grotendeels beïnvloeden uitkomsten. Tijdens het trekken, dient alleen beide voorpoten worden gebruikt en ze moeten be keurig naast elkaar (figuur 1C) geplaatst. Wanneer de muis niet wordt weergegeven weerstand tegen de trekkracht, de waarde niet worden meegenomen.
Voor de twee ledematen en vier ledematen hangende testen, vooral jonge (4-16 weken oud) wild-type muizen kunnen gemakkelijk de maximale hangende tijd van 600 sec bereiken. Daartegenover worden de prestaties van jonge mdx muizen verminderde (ze nauwelijks maximale hangende tijd te bereiken) en ook verslechtert met de leeftijd, hoewel beide stammen zet alle inspanning in het uitvoeren van deze hangen testen op hun best vermogen (figuren 2A en 3A). Grotere verschillen in opknoping tijden tussen mdx en wild-type muizen worden verkregen met de draad. Daarom kan zelfs een klein effect maten van verbindingen op de spierfunctie worden gedetecteerd met behulp van deze test. Opknoping prestatie (of andere prestatie) verschilt binnen en tussen individuen in de tijd leidt tot hoge standaarddeviatie bars. Nonetheless, mdx muizen consequent slechter presteren dan vergelijkbare leeftijd wild-type muizen (Figuur 2A). Het uitvoeren van meerdere evaluaties kunnen meer gedetailleerd inzicht in functionele verbeteringen na behandeling dan alleen eindpunt metingen geven. Het moet in gedachten worden gehouden dat in de eerste sessie dieren leren hoe je een functionele test uit te voeren. Dit leercurve, die in alle tests, duidelijk zichtbaar tussen 4-6 weken oud. Echter, omdat muizen ook snel groeien in deze leeftijdsperiode, een onderscheid tussen verbetering als gevolg van leer-en / of groei kan niet worden gemaakt. Sekseverschillen in opknoping prestaties voor de twee onderdelen hangen proef zijn ook gevonden. Prestaties van vrouwelijke mdx muizen dat van mannen door ~ 100 sec en prestaties loopband uitgedaagd vrouwelijke mdx muizen bijna vergelijkbaar met die van de onbetwiste mannetjes (vergelijk Figuren 2A 4A). Deze bevinding onderstreept het belang van het gebruik van leeftijd eennd geslacht afgestemd muizen om vertekening te voorkomen. We hebben voorlopige gegevens suggereren dat de verschillen in prestaties in zowel hangende tests tussen mdx en wild-type muizen verhogingen van zeer oud (18 maanden) muizen.
Sommige muizen tonen ongepast gedrag voorkomen opknoping op de draadvormige, balancerend op de draad, springen de draad opzettelijk enz. (figuren 2D en 2E), hoewel de meeste muizen aan de test en hangen met twee of vier ledematen ( Figuren 2B en 2C). Af en toe, sterke muizen sprong opzettelijk uit de draad. Ze hangen voorafgaand aan springen met alleen de twee achterpoten en de staart op de draad en kijk naar beneden in te schatten van de afstand tot de grond. Ongepast gedrag dat af en toe wordt gezien op de grid tijdens de vier ledematen hangende test bestaat uit bewust te springen uit het rooster of klimmen op de grid. Elke vorm van inadequate gedrag kan easil wordeny onderscheiden en mag niet worden toegestaan. Muizen die voorkomen opknoping in een van deze manieren moeten direct worden terug geplaatst op de draad of raster zonder stoppen van de timer.
Op de rotarod, mdx muizen nauwelijks lopen voor de duur van max. 500 sec, terwijl een groter deel van de wild-type muizen doen (Figuur 3B). Met de leeftijd, lopende prestaties van beide stammen af. Sommige muizen zijn in staat om strak klem op de draaiende buis en vermijden dat door 'cartwheeling' rond. Dit kan niet worden gecorrigeerd voor en is een ernstige beperking van de test wanneer meerdere muizen beginnen dit te doen gedurende langere tijd, waardoor de variatie binnen de experimentele groepen. Speciaal voor enkele muizen die gedeeltelijk draaien en gedeeltelijk cartwheel, en tijdens de overgang van cartwheeling een lopende vallen. Sommige muizen omdraaien op de draaiende buis tijdens het hardlopen. Dit gedrag moet door rechtstreeks de herpositionering van de muizen op de buis, met worden aangepaktout te stoppen. Ook dit gedrag beperkt de bruikbaarheid van deze test.
Gedwongen loopband lopen is een eenvoudige en effectieve oefening om de ziekte pathologie verergeren in niet behandelde mdx muizen, terwijl wild-type muizen ondergaan hetzelfde protocol niet worden beïnvloed. In het algemeen, muizen vertrouwd te raken met de loopband na een eerste training en bereid zijn te lopen, vooral als er meerdere muizen tegelijk draaien. Oude mdx muizen (meer dan 15 maanden oud) hebben moeite in het lopen en kan niet omgaan met de zelfde loopsnelheid van 12 m / min gedurende 30 min gebruikt voor jonge muizen. Daarom wordt een langzamere loopsnelheid van 8 m / min gedurende 30 min. aanbevolen die alle muizen de volledige protocol af. MDX muizen zijn bijzonder kwetsbaar voor excentrische contracties dus bergafwaarts kan alleen worden gebruikt voor een korte duur.
Als alternatief, andere functionele tests zoals de twee ledematen hangende draad test kunnen direct na het uitvoeren van (Figuur 4A) worden uitgevoerd. Met behulp van deze studie ontwerp, verschillen tussen stammen of behandeling armen waarschijnlijk toenemen als loopband uitgedaagd onbehandelde mdx muizen zijn minder goed in staat het uitvoeren van deze tests dan sedentaire mdx muizen 13.
Zoals eerder vermeld, bij het bestuderen spierfunctie in mdx muizen, het C57BL/10ScSnJ wildtype stam moet worden dat de overeenkomstige genetische achtergrond. Wij adviseren dit als zelfs tussen inteelt wild-type stammen loopband lopen prestaties verschilt 18,19. Maar ook in niet-invasieve functionele tests, functionele prestaties beïnvloed door genetische achtergronden. Figuur 5 illustreert dit in drie representatieve grafieken waar de prestaties van mdx muizen op een BL/10 achtergrond en op een gemengde achtergrond bestaande uit BL/10, BL/6J, DBA2 en 129OLA worden vergeleken. Zoals duidelijk zal de gemengde achtergrond muizenbeter presteren in de opknoping draad tests en erger aan de rotarod.
Figuur 1. Voorpoot grijpkracht, representatieve resultaten en correcte plaatsing van de poten. A. voorpoot grijpkracht genormaliseerd voor lichaamsgewicht van 9 weken oude vrouwelijke mdx (n = 5) en wild type (n = 4) muizen. Grip is al verstoord bij jonge mdx muizen. Sterretjes geven p <0,05 en gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± ST.DEV. B. vermoeidheid van dezelfde individuen als getoond in A was gemiddeld minder dan 10% en geen verschillen tussen stammen. C. betrouwbare gegevens te verkrijgen, aandacht moet worden besteed aan de positionering van de poten tijdens voorpoot grijpkracht analyse. Een correcte positionering van de muis, twee voorpoten zijn naast elkaar achterpoten are niet aanraken van het net en de muis trekt in een rechte lijn D. onjuiste positionering van de voorpoten;. de muis is niet te trekken in een rechte lijn. Wanneer dit gebeurt, of wanneer slechts een voorpoot of ook de achterpoten worden gebruikt, de muis draait rond tijdens het trekken of tekort komt om weerstand te tonen, gegevens moeten worden weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Twee ledematen hangende tests representatieve resultaten en gepast en ongepast gedrag hangen. A. Een representatief voorbeeld van de twee ledematen hangende proef eenmaal per week uitgevoerd in mannelijke mdx (n = 18, 4-10 weken, n = 13, 11 en 12 weken, n = 10, 13 weken) en leeftijd en geslacht gematched wild-type muizen (n = 6). Een leercurve is toegankelijk voor beide stammen in de eerste paar weken van het testen. Prestaties van mdx muizen was slechter vergeleken met die van wildtype muizen. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± ST.DEV. Maximale hangende toegestane tijd wordt aangegeven door de stippellijn. B. De juiste uitgangspositie van deze test is met de twee voorpoten. C. Afhankelijk van de functionele mogelijkheden van de muis kan ook gebruik maken van de achterpoten en de staart. D en E. Een kleine subset van muizen, vooral sterk wild-type muizen, kan af en toe voorkomen dat opknoping door klimmen op de zijbalken of balanceren op de draad. Sommige muizen opzettelijk springen uit de draad. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Vier ledematen hangende en rotarod looptest. A. vier ledematen hangende uitvoering eenmaal per week beoordeeld mannelijke mdx (n = 18, 4-10 weken, n = 13, 11 en 12 weken, n = 8, 13 weken) en wildtype ( n = 6) muizen. Na verloop van tijd, mdx muizen hangen minder lang dan wild-type muizen. B. Rotarod looptijden verschilde niet tussen jonge mannelijke mdx (n = 18, 4-10 weken, n = 13, 11 en 12 weken, n = 10, 13 weken ) en wild type muizen (n = 6). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± ST.DEV.
Figuur 4. Het effect van gedwongen lopende oefening protocol betreffende functionele prestaties en skeletspieren pathologie bij vrouwelijke muizen. Muscle pathologie was opzettelijkverergerd doordat muizen uitgevoerd op een horizontale loopband drie keer per week bij 12 m / min gedurende 30 min voor een duur van 12 weken. Direct na het lopen, muizen hadden om aan de twee ledematen hangende test. Terwijl alle wildtype muizen (n = 5) blijven opknoping tot het maximum, alle mdx muizen (n = 6) eerder vallen de draad (p <0,001, gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± ST.DEV.). B. De aanwezigheid membraan schade werd bepaald door het bepalen van plasma creatine kinase (CK) niveaus die van spiervezels lekken door scheuren in het membraan. CK-waarden waren verhoogd in mdx muizen in vergelijking met wild-type muizen voor de training. Tredmolenoefening onmiddellijk een toename (p <0.01 aangegeven met asterisk, gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± ST.DEV.) In mdx muizen, terwijl ze bleef laag in wild-type muizen. Cd. Spieren van mdx muizen zijn erg kwetsbaar voor oefening loopband, verergering ziektepathologie schaal eenN a een paar weken van hardlopen. Deze Hematoxyline en eosine kleuringen van de quadriceps van een 16 weken oude nonexercised (C) en loopband uitgeoefend (D) mdx muizen tonen aan dat uitgebreide fibrose en necrose worden ontwikkeld. E. Spieren van wild-type muizen ondergaan van dezelfde lopende protocol worden niet beïnvloed. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Effect van een gemengde achtergrond op functionele prestaties in mdx muizen. Verschillen in genetische achtergrond invloed functionele prestaties. Ter illustratie van mannelijke mdx (BL/10 achtergrond, n = 18, 4-10 weken, n = 13, 11 en 12 weeks, n = 10, 13 weken) en MDX (gemengde BL/10, BL/6J, DBA2 en 129OLA achtergrond, n = 5) muizen werd vergeleken in de tijd. A. Twee ledematen hangende testprestaties significant tussen de twee stammen. B. Vier ledematen hangende testresultaten waren iets hoger in de gemengde achtergrond mdx muizen. C. Rotarod looptijden eveneens licht verschilde tussen de stammen. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± ST.DEV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De functionele tests hier gepresenteerde reproduceerbaar, gemakkelijk uit te voeren en van toepassing op wild-type en dystrophic muizen onafhankelijk van hun leeftijd. De tests geven nuttige instrumenten voor een pre klinisch spierfunctie, kracht, conditie en coördinatie te beoordelen. Bij het testen van de effecten van een verbinding over de natuurlijke geschiedenis van de ziekte, de niet-invasieve test hier beschreven (voorpoot grijpkracht, zowel opknoping tests en de rotarod test) kan mooi worden gecombineerd in een functionele regime proef waar de proeven worden uitgevoerd op opeenvolgende dagen . Deze protocollen zijn niet schadelijk mdx muizen en kunnen worden gebruikt in een longitudinale wijze 10. Het moet in gedachten worden gehouden dat de resultaten van elk van deze tests worden gegenereerd door verschillende of gedeeltelijk overlappende spiergroepen in plaats van een individuele spier. Daarom, met behulp van een combinatie van meerdere tests wordt aanbevolen om een completer beeld te krijgen en daardoor beter inzicht in de functionaliteit van de ervaringmentale groepen. Als alternatief kan functionele verbeteringen van een enkele spier worden beoordeeld met behulp spierfysiologie metingen 20.
Net als gedragstesten, ook functionele tests kunnen grote verschillen tussen de verschillende muizen, of binnen een muis tussen de verschillende beoordelingen te tonen. Variatie te verminderen, moeten alle tests worden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker die bekend is met de muizen. Externe variabelen zoals geuren en geluiden in de kamer, moet de tijd van de dag en de dag van de week waarop de test wordt uitgevoerd zo constant mogelijk worden gehouden. Muizen moeten geslacht en dezelfde leeftijd zijn. Bij gebruik tredmolen loopt tot ziekteprogressie verergeren, is het essentieel om een gestandaardiseerd protocol waarbij alle actieve parameters (looptijd, snelheid en helling) constant in de tijd voor alle experimentele groepen worden gehouden, zodat alle muizen gelijke behandeling gebruiken. Hoewel de meeste muizen graag deelnemen aan de functionele tests en de meeste dieren vertonen een hogemate van bereidheid, sommige muizen (vooral sterk wild-type muizen) af en toe voorkomen dat het uitvoeren van de test-en show vermijdingsgedrag. Wanneer dit gedrag niet wordt gecorrigeerd voor, kon verkeerde conclusies worden getrokken 21. Gelukkig zijn die handelwijzen slechts zelden waargenomen en kan worden gecorrigeerd door de muis weer op de draad, net of rotarod, of trekken een keer op de grijpkracht meter.
Verbeteringen in een functionele test (bijvoorbeeld opknoping proef evaluatie spierwerking) hoeft niet noodzakelijkerwijs samen voorkomen met verbeteringen in andere test (voorpoot grijpkracht beoordeling enige spierkracht). In mdx muizen, kunnen verbeteringen in de spierfunctie vroeger dan in spierkracht worden onderscheiden. Dit wordt ook gezien in DMD patiënten die deelnamen aan klinische onderzoeken waarbij klinisch relevante verbetering van de 6 min looptest niet cooccur met verbeteringen in spierkracht 6,7. Dit kan echterdeels af van het werkingsmechanisme van de geteste verbinding en het is mogelijk dat andere verbindingen verbeteren van kracht en niet. Daarom moeten de resultaten van de tests worden geïnterpreteerd met het werkingsmechanisme van de stof in het achterhoofd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Margriet Hulsker bedanken voor haar fotografische bijstand en helpen om beelden te verkrijgen van muizen en de beoordelaars voor hun constructieve commentaar. Dit werk werd ondersteund door ZonMw, TREAT-NMD (contractnummer LSHM-CT-2006-036825) en het Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
