Summary
Le critère de jugement principal dans les essais cliniques pour les maladies neuromusculaires est généralement amélioré la fonction musculaire. Par conséquent, l'évaluation de l'effet des composés thérapeutiques potentiels sur la performance musculaire pré clinique dans des modèles de souris est d'une grande importance. Nous décrivons ici plusieurs tests fonctionnels pour y remédier.
Abstract
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une musculaire sévère et progressive perdre trouble pour lequel aucun traitement n'est disponible. Néanmoins, plusieurs composés pharmaceutiques potentiels et des approches de thérapie génique ont progressé dans des essais cliniques. Avec l'amélioration de la fonction musculaire soit le point final le plus important dans ces essais, beaucoup d'accent a été mis sur la mise en place fiable, reproductible et facile à effectuer des tests fonctionnels de pré clinique évaluer la fonction musculaire, la force, l'état et la coordination dans le modèle de souris mdx de DMD. Les deux tests invasifs et non invasifs sont disponibles. Tests qui ne aggravent la maladie peuvent être utilisés pour déterminer l'histoire naturelle de la maladie et les effets des interventions thérapeutiques (p. ex. Des tests de résistance préhension des membres antérieurs, deux essais de suspension différents en utilisant soit un fil ou une grille et rotarod fonctionnement). Sinon, course sur tapis roulant forcé peut être utilisé pour améliorer la progression de la maladie et / ou évaluereffets protecteurs des interventions thérapeutiques sur la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici comment effectuer ces tests fonctionnels les plus couramment utilisés d'une manière fiable et reproductible. L'utilisation de ces protocoles basés sur des procédures d'exploitation standard permet de comparer les données entre les différents laboratoires.
Introduction
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente chez les garçons nouveau-nés 1:5000. Cette maladie du dépérissement musculaire sévère et progressive est causée par des mutations dans le gène DMD qui perturbent le cadre de lecture ouvert et empêchent la synthèse de la protéine dystrophine fonctionnelle. Les fibres musculaires qui n'ont pas la dystrophine sont vulnérables à exercer dommages induits. Lors de l'épuisement de la capacité de régénération du muscle, et en raison de l'inflammation chronique des muscles endommagés, les fibres sont remplacées par du tissu conjonctif et de la graisse, ce qui conduit par la suite à une perte de fonction. Généralement, les patients DMD perdent la marche des membres inférieurs au début de la deuxième décennie. Plus tard, aussi les muscles des bras et de la ceinture scapulaire sont touchés et les patients développent souvent une scoliose dorso-lombaire raison de l'affaiblissement asymétrique des muscles de soutien de la moelle épinière. La ventilation assistée est généralement nécessaire à la fin de l'adolescence ou au début de la vingtaine. Respiratoire et l'insuffisance cardiaque plombà la mort dans le troisième ou quatrième décennie 1.
Bien que le gène responsable a été découvert il ya plus de 25 ans 2, il n'existe aucun remède disponible pour la DMD. Cependant, l'amélioration des soins de santé et l'utilisation de corticostéroïdes ont augmenté l'espérance de vie dans le monde occidental 3. Avec l'utilisation de modèles animaux comme la souris mdx, de grandes avancées dans la découverte de stratégies thérapeutiques potentielles ont été faites. La souris mdx est le modèle de la souris DMD le plus couramment utilisé. Il a un point de mutation dans l'exon 23 du gène de la DMD murine et manque par conséquent, la dystrophine 4. Au cours des deux dernières années, de nombreuses stratégies proposées ont progressé dans les essais cliniques 5-9. Dans ces essais, l'amélioration de la fonction musculaire est le principal critère d'évaluation, soulignant l'importance de tester l'intérêt des composés sur la fonction musculaire chez la souris lors de la phase préclinique d'essais.
Comme DMDpatients, aussi les dystrophine négatifs fibres musculaires de souris mdx sont vulnérables à exercer dommages induits et leur fonction musculaire est diminuée par rapport à des souris de type sauvage C57BL/10ScSnJ. Cette déficience peut être évaluée avec une variété de tests fonctionnels. Certains de ces tests sont non invasive et n'interfèrent pas avec la pathologie musculaire (par exemple, des membres antérieurs de la force de préhension, les tests suspendus et rotarod fonctionnement). Par conséquent, ils peuvent être utilisés pour surveiller l'évolution naturelle de la maladie ou de déterminer les effets de composés sur la progression de la maladie. Pour obtenir une image en profondeur l'influence des composés sur la fonction musculaire chez la souris mdx, un régime de test fonctionnel qui n'interfère pas avec la progression de la maladie composé de tous ces tests peut être utilisé 10.
En variante, tapis roulant en marche forcée peut être utilisé pour exacerber intentionnellement progression de la maladie et de tester les capacités de protection des composés 11. Le tapis de course peut aussi êtreutilisé comme mesure de résultat dans lequel durée jusqu'à l'épuisement est mesurée 12, ou comme un outil de souris mdx de fatigue afin qu'ils réussissent moins bien dans un test fonctionnel ultérieur assurer de plus grandes différences de performance entre les groupes de traitement 13. Lors du choix des tests fonctionnels, leur effet sur la progression de la maladie doit être gardé à l'esprit en particulier lors de l'essai souris dystrophique comme la souris mdx 14.
Nous décrivons ici en détail comment effectuer des tests les plus couramment utilisés fonctionnels d'une manière fiable et reproductible sur la base de procédures normalisées d'exploitation disponibles sur le réseau TREAT-NMD. Cliquez ici pour visiter TREAT-NMD .
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Protocol
Les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité d'éthique animale (DEC) de la Leiden University Medical Center (LUMC). Les souris ont été élevés par l'animalerie du LUMC et gardés dans des cages individuellement ventilées avec 12 h de lumière de cycles sombres. Ils ont eu accès à volonté à l'eau et une nourriture standard.
Lors de l'un des tests fonctionnels décrits ci-dessous, les conditions expérimentales doivent être strictement contrôlée pour réduire la variation. De préférence, les souris appariés par âge et sexe devraient être utilisés, comme la performance diffère entre l'âge et les sexes. Les souris appartenant à la même portée doivent être répartis de façon aléatoire dans les groupes expérimentaux. Les animaux doivent être testés par le même opérateur, qui est aveugle aux groupes expérimentaux. Les tests doivent être effectués sur la même heure de la journée et de la semaine, même salle pour égaliser les odeurs, les bruits, etc 14 Grande variation entre les souris individuelles et les points de temps peut être observée pour tousles tests fonctionnels, donc 6-8 souris / groupe expérimental doivent être utilisés. Les performances du test fonctionnel peut aussi largement différer entre les différentes souches de type sauvage consanguines. Par conséquent, les souris de type sauvage et témoins auraient toujours dû milieux correspondant (dans le cas des souris mdx utiliser la souche de type sauvage C57BL/10ScSnJ). Toutes les données décrites ici ont été obtenus avec la souche de type sauvage C57BL/10ScSnJ, que nous appelons de type sauvage comme à partir d'ici. Les essais décrits ici peuvent être utilisés longitudinalement d'au moins 1-19 mois chez les souris de type sauvage et MDX. Tests ne devraient pas être répétées plus d'une fois par semaine pour éviter de perdre des souris intérêt et la volonté d'accomplir la tâche.
Une. Préhension des membres antérieurs test de résistance
Utilisez le test préhension des membres antérieurs de force pour mesurer la force des membres antérieurs. Le test est basé sur la tendance d'une souris pour saisir instinctivement une grille lorsqu'il est suspendu par la queue 15, et adapted à partir DMD_M2.2.001.pdf .
- Appareil mis en place: Fixez une grille à un capteur de force, qui mesure la force maximale appliquée par la souris sur la grille lors de la traction. Assurez-vous que le réglage est sur le pic mode de tension (T-PK) pour tirer. Les unités de force peuvent être ajustés en soit onces à la force, en grammes de la force, de livres à la force, en kilogrammes de la force, ou Newton.
Note: Nous préférons travailler avec des grammes comme unité de valeurs. Mètres multiples sont disponibles dans le commerce, mais seulement transducteurs axiaux donnent des résultats fiables que des transducteurs de type levier de force sont influencés négativement par les lois de la physique de l'effet de levier. Soit d'une grille ou d'un triangle non flexible peuvent être utilisés avec des barres qui sont de 1 à 2 mm de diamètre. - Avant l'essai, l'évaluation du poids corporel de la souris, pour permettre la normalisation de poids corporel.
- Utilisation grammes comme unité de valeurs. Réinitialiser le compteur au début de chaque recording.
- Débranchez la souris de sa cage en saisissant la queue et se déplaçant horizontalement vers la grille.
- Vérifiez que la souris saisit la grille fermement avec les deux pattes de devant.
- Tirez la souris de la grille de sorte que sa portée est cassé, la plus grande force appliquée à la grille sera affiché sur l'écran de la sonde, qui peut être soit manuellement ou automatiquement enregistrée.
- Ne prendre que des tractions en compte dans laquelle la souris présente une résistance à l'expérimentateur. Rejeter mesures dont un seul patte, ou les membres postérieurs ont été utilisés et dans lequel la souris transformées au cours de la traction.
- Laissez la souris tirer sur la grille trois fois de suite, puis revenir dans la cage pour une période de repos d'au moins une minute. Remarque: entre les séries de tire une période de repos est nécessaire pour la souris pour récupérer et éviter la formation de l'habitude.
- Alors laissez la souris effectuer quatre séries de tractions, chacune suivie d'une période de repos de courte. De cette façon, la mouse a tiré un total de 15x (3 essais x 5 = 15 fois PULLS).
- Déterminer la force de préhension maximale et de normaliser le poids corporel en prenant la moyenne des trois valeurs les plus élevées des 15 valeurs recueillies.
- Facultatif: déterminer la fatigue par le calcul de la décrémentation de la moyenne entre les deux premières et les deux dernières séries de tractions 1 2 3 = A, 4 5 6 = B, 10 11 12 13 et C = 14 + 15 = D. La formule: (C + D) / (A + B) donne une valeur de 1 pour les souris qui ne sont pas fatigués. Cela peut être exprimée en pourcentage de sorte que la souris sans fatigue a une valeur de 0% et une souris qui pattes avant sont complètement fatigué a une valeur de 100%.
2. Suspendre Tests
Avec les tests de suspension, l'équilibre, la coordination et l'état musculaire peut être évaluée. Ces tests sont basés sur la connaissance que les souris sont désireux de rester suspendu à un fil ou une grille jusqu'à épuisement 16. Il existe deux tests d'accrochage distinctifs dans lequel au début de l'essai, soitseuls les deux membres antérieurs ou les quatre membres sont utilisés, à l'aide d'un fil ou d'une grille respectivement. Le test d'accrochage à l'aide du fil et le réseau sont les plus longues méthode du temps de suspension adapté de DMD_M.2.1.004.pdf et DMD_M.2.1.005.pdf respectivement. Une limite pendaison fixe est utilisée de 600 sec. La majorité des souris de type sauvage peut accrocher pour 600 secondes, alors que les souris dystrophiques ne peux pas. Pour réduire les dépenses de temps à effectuer ce test, un temps de suspension maximale a été mis en place. Les souris qui tombent du fil ou de la grille avant sont ensuite donnés à deux autres essais. Ceci est fait pour réassurer que les souris sont vraiment pas à accrocher et ne tombent pas en raison de la maladresse.
- Suspendre test avec deux branches
- Appareil mis en place: Étroitement obtenir un 2 mm suspension de toile métallique d'épaisseur à un plateau avec du ruban adhésif et de maintenir la suspension environ 370; cm au-dessus d'une couche de litière. Remarque: alternativement, à 55 cm de large mm de fil métallique épaisse 2 qui est étroitement solidaires entre 2 montants verticaux peuvent être utilisés. La distance de 37 cm est suffisant pour encourager les souris à rester suspendu, mais aussi suffisamment bas pour empêcher les souris de blessures en cas de chute vers le bas. Le fil ne doit pas vibrer ou déplacer pendant le test, car cela pourrait interférer avec le fonctionnement de la souris.
- Manipuler la souris par la queue et l'amener près du fil.
- Laissez la souris saisir le fil avec les deux pattes avant seulement, et abaisser les membres postérieurs de façon à ce que la souris se bloque uniquement avec les deux pattes de devant sur le fil (figure 2B).
- Commencer directement la minuterie lorsque la souris est relâché. Après la libération, les souris fortes essayer d'attraper le fil avec tous les quatre membres et la queue, qui est permis (figure 2C).
- Quand une souris montre un comportement inapproprié (comme en équilibre sur ou délibérément sauter le fil comme shposséder les figures 2D et 2E), s'adresser directement ce par le remplacement de la souris sur le fil sans arrêter le chronomètre.
- Quand une souris tombe le fil, arrêter le chronomètre et noter le temps de suspension.
- Lorsque les souris sont capables de bloquer pendant 600 secondes, les retirer du fil et de les retourner à la cage. Les souris qui tombent avant cette limite sont donnés un maximum de deux autres essais.
- Noter le temps de suspension maximale (la plus longue des essais) et l'utiliser pour une analyse ultérieure.
- Suspendre test avec quatre membres
- Appareil mis en place: Utilisez soit une main faite carré ou le couvercle d'une grande cage pour un rat ou le lapin pour ce test. Placez la grille de 25 cm au-dessus de la literie doux pour éviter les souris de se nuire en tombant, mais aussi pour décourager les souris pour sauter volontairement hors de la grille. Fixer solidement la grille de sorte que l'expérimentateur n'a pas à tenir manuellement le réseau au cours de l'expérience que ces mouvements pourraient interfere de la performance de la souris.
- Placez la souris sur la grille de sorte qu'il saisit avec ses quatre pattes.
- Inversez la grille de sorte que la souris est suspendu et commencer directement la minuterie.
- La séance de test se termine pour les souris qui sont capables de bloquer pendant une durée de 600 secondes. Donnez souris qui tombent de la grille plus tôt, un maximum de deux autres essais.
- Utiliser le temps maximal de suspension (ie. La plus longue des essais) pour une analyse ultérieure.
3. Course à pied rotarod
Avec la force musculaire de test de la tige tournante, la coordination, l'équilibre, et l'état peuvent être déterminées 17.
- Appareil mis en place: Pour ce test, les souris doivent fonctionner sur un tube tournant. Assurez-vous que la vitesse constante est fixé à 5 rotations par minute (rpm), et que la vitesse augmente de 5 à 45 tours par minute dans les 15 premières secondes quand ont commencé. Après cela, il doit maintenir sa vitesse.
- Placer la souris sur le tube de la tige tournantequand il tourne à une vitesse lente et régulière de 5 tours. Cinq souris peuvent être testés simultanément.
- Démarrez la course une fois toutes les souris sont placées. Dans les 15 premières secondes de la vitesse du tube accélère 5-45 min après quoi il maintient cette vitesse.
- Surveillance de la course. Le temps d'exécution est enregistré en continu par le logiciel. Durée s'arrête automatiquement lorsque la souris tombe le tube car cela active la barre de temps positionné en dessous du tube. Repositionner les souris qui tournent autour de la direction opposée sur le tube lors de l'exécution sans arrêt le tube de tourner.
- Fin de la session de test pour les souris qui sont capables de fonctionner pendant une durée de 500 secondes. Donnez souris un maximum de deux autres essais leur permettant d'améliorer leur temps de course, quand ils tombent plus tôt.
- Utilisez la durée maximale (c'est à dire la plus longue des essais) pour une analyse plus approfondie.
4. Exercice tapis roulant
Latapis roulant peut être utilisé de trois manières comme un outil dans la recherche préclinique. Tout d'abord, course sur tapis roulant forcé peut être utilisé pour exacerber la pathologie de la maladie, comme décrit dans ce protocole (voir aussi: DMD_M2.1.001.pdf ). Deuxièmement, la capacité de fonctionnement maximale de la souris et les effets des traitements sur ce qui peut être évalué (voir la méthode de laisser les souris courir jusqu'à épuisement DMD_M.2.1.003.pdf ). Enfin, course sur tapis roulant peut être utilisé avant un autre test fonctionnel d'épuiser la souris de sorte qu'il est moins performant dans le deuxième test 13. Cela se fait en exerçant des souris deux fois ou trois fois par semaine comme décrit ci-dessous, directement suivi par l'un quelconque des essais fonctionnels décrits dans le protocole 3.1.
- Appareil mis en place: Il ya plusieurs tapis roulants disponibles dans le commerce sur lequel plusieurs souris peuvent run en même temps et pour lequel l'altitude, la vitesse et la durée peuvent être ajustées. Certains tapis roulants sont équipés d'une grille de livrer des chocs de faible intensité pour encourager les souris à courir. Cependant, les souris mdx sont sensibles au stress et peuvent facilement être motivés de façon conviviale par une légère poussée avec la main dans le sens de la marche. Par conséquent, il est vivement recommandé de ne PAS utiliser la grille de choc. En général, la stimulation de la main est nécessaire uniquement lors de la première séance de cours.
- Placez la souris sur le tapis roulant horizontal.
- Démarrer le tapis roulant à une vitesse de défilement de 12 m / min. Des vitesses plus faibles (8 m / min) doivent être utilisés chez les souris âgées (> 15 mois), où des vitesses plus élevées facilement conduire à l'épuisement.
- Au cours de la première session, encourager souris pour exécuter en les poussant doucement quand ils sont près de l'extrémité de la ceinture.
- Lorsque les souris ont couru pour une durée de 30 min, remettez-les dans leur cage.
- Répétez cette opération deux fois par semaine pendant 12 semaines par exemple. Autoriser les périodes de repos en cas de besoin. Par exemple, certaines souris mdx ont arrêter de courir et devrait être autorisé à se reposer pendant quelques minutes. Si cela se produit, tourner la courroie, donner toutes les souris une période de repos de deux minutes, mettez la ceinture pendant deux minutes à 4 m / min. Après cela, augmenter la vitesse de 12 m / min et de permettre aux souris pour terminer le protocole. Il est important que toutes les souris terminent le protocole de roulement entière.
Remarque: Dans le cas des souris mdx ont besoin de périodes de repos, envisager un échauffement avant le protocole d'exercice de 30 min. Cette session réchauffer se compose de: une période d'acclimatation de 2 min à une vitesse de 4 m / min, suivi immédiatement par un échauffement de 8 min à 8 m / min.
Dans nos vieilles mains 4-16 semaines souris mdx femelles sont capables de compléter le protocole d'exercice de 30 minutes sans repos. D'autres ont signalé que dans appariés pour l'âge des souris mdx mâle 45% des souris n'ont pas besoin des périodes de repos pour terminer l'exercice. Le protocole d'échauffement réduires le montant des butées 12.
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Representative Results
La force de préhension des membres antérieurs de type sauvage et des souris mdx augmente entre l'âge de 4-12 semaines et réduit de nouveau chez les souris âgées. Déficiences en vigueur peuvent déjà être observés chez les jeunes souris mdx. Des données représentatives de 9 semaines les souris femelles sont présentés dans les figures 1A et 1B. Bien que la fatigue ne diffère pas entre les souches encore à cet âge, les souris mdx sont plus faibles que les souris de type sauvage. Nous n'avons pas encore de données sur la fatigabilité dans mdx âgées et les souris de type sauvage.
Pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, de multiples évaluations doivent être faites par le même expérimentateur. Nous décrivons ici de tirer 15 fois / individu, mais plus petit nombre de tractions (aussi bas que 5 tractions) également fournir des données fiables. Une attention particulière doit être attirée sur le positionnement des pattes sur la grille, car cela peut largement influencer les résultats. Au cours de la traction, seulement deux pattes de devant doivent être utilisés et ils ont à be bien placé à côté de l'autre (Figure 1C). Lorsque la souris ne montre pas de résistance à la traction, la valeur ne doit pas être prise en compte.
Pour les deux tests des membres et quatre membres suspendus, en particulier les jeunes (4-16 semaines) souris de type sauvage peuvent facilement atteindre le temps de suspension maximum de 600 secondes. Par contraste, la performance des jeunes souris mdx est altérée (ils presque jamais à atteindre le temps de suspension au maximum) et également se détériore avec l'âge, même si les deux souches mis tous les efforts dans l'exécution de ces essais pendent à leurs meilleures capacités (Figures 2A et 3A). Les grandes différences de temps suspendu entre les souris de type sauvage et MDX sont obtenus avec le fil. Par conséquent, même les petites tailles d'effet des composés sur la fonction musculaire peuvent être détectés par ce test. Performances pendaison (ou tout autre type de performance) diffère à l'intérieur et entre les personnes de plus de temps résultant en barres d'écart-type élevé. Nonetheless, souris mdx effectuent toujours pire que appariés pour l'âge des souris de type sauvage (figure 2A). Effectuer des évaluations multiples peut donner un aperçu plus détaillé des améliorations fonctionnelles lors du traitement de seules mesures de point de terminaison. Il faut garder à l'esprit que dans la première session animaux apprennent à effectuer un test fonctionnel. Cette courbe d'apprentissage, qui est présent dans tous les essais, est clairement visible entre 6.4 semaines d'âge. Cependant, parce que les souris développent également rapidement en cette période de l'âge, une distinction entre l'amélioration due à l'apprentissage et / ou de croissance ne peut pas être fait. différences entre les sexes dans la performance suspendu pour les deux membres accrocher essai ont également été trouvés. Performance des souris mdx femmes dépasse celui des hommes de ~ 100 sec, et les performances des souris mdx femelle tapis roulant contestée est presque comparable à celle des hommes non contestées (comparer les figures 2A 4A). Ce constat souligne l'importance d'utiliser un âgee genre correspond souris pour éviter les biais. Nous avons des données préliminaires suggérant que les différences de performances dans les deux essais de suspension entre les augmentations mdx et sauvages de type souris, en très vieux (18 mois). Souris
Certaines souris ont un comportement inapproprié pour éviter la pendaison sur le fil comme, en équilibre sur le fil, sauter le fil délibérément etc (figures 2D et 2E), bien que la majorité de la souris se conformer à l'essai et accrocher avec deux ou quatre membres ( les figures 2B et 2C). De temps en temps, les souris forts sautent le fil intentionnellement. Ils pendent avant de sauter avec seulement les deux membres postérieurs et la queue sur le fil et regarder vers le bas pour estimer la distance au sol. Comportement inapproprié qui est parfois observée sur la grille lors de l'essai des quatre membres de la pendaison se compose de délibérément sauter hors de la grille ou de grimper sur la grille. Toutes les formes de comportement inapproprié peut être easily distingue et ne devrait pas être permis. Souris qui évitent suspendu dans l'un de ces moyens devraient être directement remis sur le fil ou réseau sans arrêter la minuterie.
Sur la tige tournante, souris mdx presque jamais courir pour la durée maximale de 500 secondes, tandis qu'une plus grande proportion de souris de type sauvage faire (figure 3B). Avec l'âge, la course la performance des deux souches diminue. Certaines souris sont capables de serrer étroitement sur le tube rotatif et éviter de courir par 'cartwheeling »autour. Cela ne peut pas être corrigée pour et une limitation sévère de l'épreuve lorsque plusieurs souris commencent à faire ce pour des périodes prolongées, augmentant ainsi la variation dans les groupes expérimentaux. Surtout pour des souris qui fonctionnent en partie et en partie roue, et au cours de la transition de se renversant dans la chute en cours d'exécution. Certaines souris tournent autour du tube tournant pendant la course. Ce problème doit être adressée directement par le repositionnement de la souris sur le tube, avecà l'arrêter. Aussi ce genre de comportement limite l'utilité de ce test.
Tapis de course marche forcée est un exercice simple et efficace pour exacerber la pathologie de la maladie chez la souris mdx non traitées, alors que les souris de type sauvage qui subissent le même protocole ne sont pas affectés. En général, les souris se familiariser avec le tapis de course après une session de formation initiale et sont prêts à fonctionner, surtout quand plusieurs souris fonctionnent simultanément. Souris mdx âgées (de plus de 15 mois d'âge) ont des difficultés à la course et ne peuvent pas faire face à la même vitesse de défilement de 12 m / min pour 30 min utilisé pour les jeunes souris. Par conséquent, une vitesse de déplacement plus lent de 8 m / min pendant 30 minutes est recommandé permettant toutes les souris pour terminer l'ensemble du protocole. Souris mdx sont particulièrement vulnérables aux contractions excentriques, donc en descente ne peut être utilisé pour une courte durée.
Alternativement, d'autres tests fonctionnels comme les deux fils membre suspendu tintérêt peut être effectuée directement après l'exécution (Figure 4A). En utilisant ce type d'étude, les différences entre les souches ou les bras de traitement sont susceptibles d'augmenter à mesure que la souris mdx non traitées tapis roulant contestées sont moins capables d'effectuer ces tests que les souris mdx sédentaire 13.
Comme mentionné précédemment, lors de l'étude de la fonction musculaire chez des souris mdx, la souche de type sauvage C57BL/10ScSnJ doit être utilisé, qui est de l'arrière-plan génétique correspondante. Nous conseillons ce que même entre les souches consanguines de type sauvage fonctionnant tapis roulant performances diffère 18,19. Mais aussi dans les tests fonctionnels non invasifs, la performance fonctionnelle est influencée par des fonds génétiques. Figure 5 illustre ce dans trois graphiques représentatifs où la performance de la souris mdx sur un fond de BL/10 et sur un fond mixte constitué de BL/10, BL/6J, DBA2 et 129OLA sont comparées. Comme on peut l'apprécier, les souris de fond mélangéesde meilleurs résultats dans les tests de câbles suspendus et pire sur la tige tournante.
Figure 1. La force de préhension des membres antérieurs, des résultats représentatifs et le positionnement correct des pattes. A. Forelimb force de préhension normalisé pour un poids corporel de 9 semaines mdx femmes (n = 5) et de type sauvage (n = 4) chez la souris. La force de préhension est déjà altérée chez les jeunes souris mdx. Les astérisques indiquent p <0,05 et données sont présentées en moyenne ± st.dev. B. Fatigue des mêmes personnes, comme indiqué en A, était en moyenne moins de 10% et ne varie pas entre les souches. C. Pour obtenir des données fiables, attention devrait être accordée à la mise en place des pattes pendant membres antérieurs analyse de la force de préhension. Le positionnement correct de la souris, deux pattes de devant sont à côté de l'autre, les membres postérieurs are pas toucher la grille et la souris en tirant en ligne droite D. mauvais positionnement des pattes de devant;. la souris n'est pas en tirant en ligne droite. Lorsque cela se produit, ou si un seul pattes avant ou encore les membres postérieurs sont utilisés, la souris se retourne pendant la traction ou manque de montrer la résistance, les données doivent être jetés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Deux tests membre suspendus, des résultats représentatifs et le comportement de suspension approprié et inapproprié. A. Un exemple représentatif de l'essai de deux pendaison de branche effectué une fois par semaine dans mdx hommes (n = 18, 4-10 semaines, n = 13, 11 et 12 semaines, n = 10, 13 semaines) et l'âge et le sexe correspond souris de type sauvage (n = 6). Une courbe d'apprentissage est visible pour les deux souches dans les premières semaines de tests. Performance des souris mdx était pire par rapport à celui des souris de type sauvage. Les données présentées sous forme de moyenne ± st.dev. Durée maximale d'accrochage permis est indiqué par la ligne pointillée. B. La position de départ correcte de ce test est avec les deux pattes de devant. C. Selon la capacité fonctionnelle de la souris, il peut également utiliser les membres postérieurs et la queue. D et E. Un petit sous-ensemble des souris, des souris de type sauvage particulièrement fortes, peut parfois éviter la pendaison en grimpant sur les barres latérales ou en équilibre sur le fil. Certaines souris sautent volontairement hors du fil. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Quatre membres suspendus et rotarod essai de fonctionnement. A. Quatre performances membre suspendu évalués une fois par semaine dans mdx hommes (n = 18, 4-10 semaines, n = 13, 11 et 12 semaines, n = 8, 13 semaines) et de type sauvage ( n = 6) chez la souris. Au fil du temps, les souris mdx accrochent moins longue que les souris de type sauvage. B. Rotarod fois de suite ne diffère pas entre les jeunes mdx masculin (n = 18, 4-10 semaines, n = 13, 11 et 12 semaines, n = 10, 13 semaines ) et les souris de type sauvage (n = 6). Les données sont représentées en moyenne ± st.dev.
Figure 4. L'effet de tapis roulant marche forcée protocole d'exercice sur la performance fonctionnelle et squelettique pathologie musculaire chez les souris femelles. Muscle pathologie a été délibérémentexacerbé en laissant les souris exécutés sur un tapis roulant horizontal, trois fois par semaine à 12 m / min pendant 30 min pour une durée de 12 semaines. Immédiatement après la course, les souris ont dû participer à l'épreuve membre suspendu deux. Alors que toutes les souris de type sauvage (n = 5) demeurent suspendus jusqu'à ce que le maximum autorisé, toutes les souris mdx (n = 6) tombent le fil précédent (p <0,001, les données présentées en moyenne ± st.dev.). B. La présence des dommages à la membrane a été déterminée en évaluant plasma créatine kinase (CK) des niveaux qui s'échappent de fibres musculaires à travers des larmes dans la membrane. le taux de CPK ont été élevés dans des souris mdx par rapport à des souris de type sauvage avant l'exercice. Exercice sur tapis roulant immédiatement des niveaux accrus (p <0,01 indiqué par l'astérisque, les données présentées en moyenne ± st.dev.) Chez la souris mdx, alors qu'ils sont restés faibles chez les souris de type sauvage. CD. Muscles de souris mdx sont très vulnérables à exercice sur tapis roulant, l'aggravation pathologie de la maladie largement uneprès avoir quelques semaines de fonctionnement. Ces colorations hématoxyline-éosine des quadriceps d'un vieux 16 semaines témoin au repos (C) et tapis roulant exercé (D) mdx de souris montrent que fibrose extensive et nécrose sont développés. E. Les muscles de souris de type sauvage qui subissent le même protocole de fonctionnement ne sont pas affectés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effet d'un fond mixte sur la performance fonctionnelle dans mdx souris. Différences de performances fonctionnelles fond génétique influence. Pour illustrer cela, le rendement de mdx mâle (BL/10 arrière-plan, n = 18, 4 à 10 semaines, n = 13, 11 et 12 weeks, n = 10, 13 semaines) et MDX (BL/10 mixte, BL/6J, DBA2 et 129OLA fond, n = 5) des souris a été comparée au fil du temps. A. Deux performances du test membre suspendu diffèrent significativement entre les deux souches. B. Quatre résultats des tests membre suspendus étaient légèrement plus élevés chez les souris mdx de fond mixtes. C. rotarod fois de suite également légèrement diffèrent entre les souches. Les données présentées sous forme de moyenne ± st.dev.
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Discussion
Les tests fonctionnels présentés ici sont reproductibles, faciles à réaliser et applicable au type sauvage et une souris dystrophique indépendamment de leur âge. Les tests fournissent des outils utiles pour pré clinique évaluer la fonction musculaire, la force, l'état et la coordination. Quand tester les effets d'un composé sur l'histoire naturelle de la maladie, les tests non invasifs décrits ici (force préhension des membres antérieurs, les deux tests suspendus et le test de la tige tournante) peut être bien combiné dans un régime de test fonctionnel où ces tests sont effectués sur plusieurs jours consécutifs . Ces protocoles ne sont pas préjudiciables à la souris mdx et peuvent être utilisés de façon longitudinale 10. Il convient de garder à l'esprit que les résultats de chacun de ces tests sont générés par différents groupes qui se chevauchent en partie ou à la place d'un muscle du muscle individuel. Par conséquent, en utilisant une combinaison de plusieurs tests est recommandé d'obtenir une image plus complète et ainsi un meilleur aperçu de la fonctionnalité de l'expériencegroupes mentale. Alternativement, des améliorations fonctionnelles d'un seul muscle peuvent être évalués en utilisant des mesures de physiologie musculaire 20.
Comme les tests de comportement, aussi les tests fonctionnels peuvent montrer une vaste variation entre différentes souris, ou dans une souris entre les différentes évaluations. Pour réduire les variations, tous les essais doivent être effectués par le même expérimentateur qui est familier avec les souris. Les variables externes comme les odeurs et les sons dans la pièce, le temps de la journée et le jour de la semaine où le test est effectué doivent être maintenues aussi constantes que possible. Souris doivent être sexe et l'âge correspondant. Lors de l'utilisation du tapis roulant à exacerber la progression de la maladie, il est essentiel d'utiliser un protocole standardisé dans lequel tous les paramètres de fonctionnement (temps de fonctionnement, la vitesse et de la pente) sont maintenues constantes au fil du temps pour tous les groupes expérimentaux, de sorte que toutes les souris sont également traités. Bien que la majorité des souris sont désireux de participer aux tests fonctionnels et de la plupart des animaux présentent une grandeniveaux de volonté, certaines souris (principalement forte de souris de type sauvage) à l'occasion d'éviter d'effectuer le comportement de test et spectacle évitement. Lorsque ce problème n'est pas corrigé pour, fausses conclusions pouvaient être tirées 21. Heureusement, ces types de comportement ne sont observées occasionnellement et peuvent être corrigées pour en plaçant la souris en arrière sur le fil, grille ou rotarod, ou en tirant une autre fois sur le compteur de la force de préhension.
Des améliorations dans un test fonctionnel (par exemple suspendus essai évaluation de la fonction musculaire) ne doivent pas nécessairement se produire conjointement avec des améliorations dans un autre test (préhension des membres antérieurs force évaluer seul la force musculaire). Dans les souris mdx, l'amélioration de la fonction musculaire peuvent être distinguées plus tôt que la force musculaire. Ceci est également observée chez les patients DMD participant à des essais cliniques où des améliorations cliniquement significatives dans le test de marche de 6 minutes ne cooccur avec des améliorations de la force musculaire 6,7. Cependant, cela peuten partie dépendre du mécanisme de travail du composé testé et il est possible que d'autres composés améliorent la résistance et ne pas fonctionner. Par conséquent, les résultats des tests doivent être interprétés avec le mécanisme d'action du composé à l'esprit.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Margriet Hulsker pour son aide photographique et d'aider à obtenir des images de la souris et les examinateurs pour leurs commentaires très constructifs. Ce travail a été soutenu par ZonMw, TREAT-NMD (numéro de contrat LSHM-CT-2006-036825) et la Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
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