Summary
מדד התוצאה העיקרי בניסויים קליניים לטיפול בהפרעות התוקפת משתפר בדרך כלל תפקוד שרירים. לכן, הערכת ההשפעה של תרכובות טיפוליות אפשריות על ביצועי שרירים מראש קליני במודלים של עכבר היא בעל חשיבות רבה. אנחנו כאן לתאר כמה בדיקות פונקציונליות לכתובת זו.
Abstract
ניוון שרירים דושן (DMD) הוא שרירים חמורים ומתקדמים מבזבזים את ההפרעה שלאין תרופה זמינה. עם זאת, כמה תרכובות תרופות פוטנציאליות וגישות ריפוי גנטי התקדמו לניסויים קליניים. עם שיפור בלהיות נקודת הסיום החשובה ביותר בניסויים אלה תפקוד שרירים, דגש רב הושם על ההקמה אמינה, לשחזור, וקל לביצוע בדיקות פונקציונליות מראש קליני להעריך את תפקוד שריר, כוח, מצב, ותיאום ב מודל עכבר MDX עבור DMD. שני בדיקות פולשניות ולא פולשנית זמינות. בדיקות שלא להחמיר את המחלה ניתן להשתמש בם כדי לקבוע את המהלך הטבעי של המחלה ואת ההשפעות של התערבויות טיפוליות (למשל. מבחן אחיזת forelimb כוח, שתי בדיקות תלייה שונות או באמצעות חוט או רשת וריצה rotarod). לחלופין, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי לשפר את התקדמות מחלה ו / או להעריךהשפעות מגנות של התערבויות טיפוליות בפתולוגיה מחלה. אנחנו כאן מתארים כיצד לבצע בדיקות תפקודיות הנפוצות ביותר אלה באופן אמין לשחזור. תוך שימוש בפרוטוקולים אלה מבוססים על נהלי הפעלה סטנדרטיים מאפשר השוואת נתונים בין מעבדות שונות.
Introduction
ניוון שרירים דושן (DMD) הוא הפרעת neuromuscular הנפוצה ביותר המשפיעה על 1:5,000 נערים שזה עתה נולד. מחלה ממארת זו חמורה ומתקדמת שרירים נגרמת על ידי מוטציות בגן DMD, המשבשות את מסגרת הקריאה הפתוחה ולמנוע את סינתזת חלבון דיסטרופין התפקודי של. סיבי שריר חסרי דיסטרופין פגיעים לממש נזק מושרה. על מיצוי יכולת ההתחדשות של השריר, ועקב דלקת כרונית של שריר פגוע, סיבים מוחלפים על ידי רקמת שומן וחיבור, לאחר מכן מובילים לאובדן התפקוד. באופן כללי, חולי DMD לאבד ניידות של הגפיים התחתונים בתחילת העשור השני. מאוחר יותר, גם על שרירי הידיים וחגורת כתפיים הם מושפעים וחולים לעתים קרובות לפתח עקמת thoracolumbar בשל היחלשות סימטרית של השרירים התומכים בעמוד השדרה. אוורור בסיוע נדרש בדרך כלל בסוף שנות העשרה או בשנתי העשרים המוקדמות. להוביל כשל נשימתי ואת הלבלמוות בעשור השלישי או רביעי 1.
למרות שהגן סיבתי כבר גילה לפני 25 שנה 2, אין תרופה זמינה עבור DMD. עם זאת, שיפור בריאות והשימוש בסטרואידים הגדילו את תוחלת חיים בעולם המערבי 3. עם השימוש במודלים של בעלי חיים כמו עכבר MDX, צעדים גדולים קדימה לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות אפשריות נעשה. עכבר MDX הוא המודל של עכברי DMD הנפוץ ביותר. יש לו מוטציה נקודתית באקסון 23 של גן Dmd העכברי וכתוצאה מכך חסר דיסטרופין 4. במהלך השנים האחרונות, אסטרטגיות המוצעות רבות התקדמו לתוך ניסויים קליניים 5-9. בניסויים אלה, שיפור בתפקוד שרירים הוא נקודת הסיום הראשונית, העומד בבסיס החשיבות של בדיקות היתרון של תרכובות בתפקוד שרירים בעכברים בשלב הקליני מראש של בדיקות.
כמו DMDחולים, גם את סיבי השריר השליליים דיסטרופין של עכברי mdx פגיעים לממש את הנזק נגרם ותפקוד השרירים שלהם נפגעים בהשוואה לעכברי סוג בר C57BL/10ScSnJ. ירידת ערך זו ניתן להעריך עם מגוון רחב של בדיקות פונקציונליות. חלק מהבדיקות האלה הן לא פולשנית ולא להפריע לפתולוגיה שריר (כוח אחיזה למשל forelimb, בדיקות תלויות וריצה rotarod). לכן הם יכולים לשמש כדי לפקח על המהלך הטבעי של המחלה או לקבוע את ההשפעות של תרכובות בהתקדמות מחלה. כדי לקבל תמונה בעומק של ההשפעה של תרכובות בתפקוד שרירים בעכברי MDX, משטר מבחן פונקציונלי שאינו מפריעים להתקדמות מחלה המורכבת מכל מבחנים אלה יכול לשמש 10.
לחלופין, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי להחריף בכוונה את התקדמות מחלה ולבדוק את היכולות המגנה של תרכובות 11. הליכון יכול להיות גםמשמש כמדד תוצאה שבה פועל זמן עד התשישות נמדדה 12, או ככלי לעכברי MDX עייפות, כך שהם מבצעים פחות טובים במבחן תפקודי הבא להבטיח הבדלים גדולים בביצועים בין קבוצות טיפול 13. בעת בחירת בדיקות פונקציונליות, ההשפעה שלהם על התקדמות מחלה צריכה לזכור במיוחד כאשר בדיקות עכברי dystrophic כמו עכבר MDX 14.
אנחנו כאן לתאר בפירוט כיצד לבצע את הבדיקות תפקודיות הנפוצות ביותר באופן אמין לשחזור המבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים זמינים מרשת TREAT-NMD. לחצו כאן כדי לבקר TREAT-NMD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי החיים (DEC) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC). עכברים גידלו במתקן בעלי החיים של LUMC ובכלובים מאווררים בנפרד עם 12 מחזורים חשוכים שעות אור. היה להם גישה כרצונך מודעת מים ואוכל רגיל.
בעת ביצוע כל הבדיקות פונקציונליות המפורטות להלן, תנאי ניסוי צריכים להיות מבוקרים בקפידה כדי להפחית וריאציה. רצוי, יש להשתמש בעכברים מותאמים גיל ומין, כפי שביצועים משתנים בין גיל ומינים. עכברים שייכים לאותו המלטה צריכים להיות באופן אקראי על פני קבוצות ניסוי. בעלי חיים צריכים להיבדק על ידי אותו מפעיל, שהתעוור לקבוצות ניסוי. בדיקות יש לבצע באותו זמן, בחדר באותו יום בשבוע ולהשוות ריחות, רעשים, וכו '14 וריאציה גדולה בין עכברים הבודדים ונקודות זמן ניתן לצפות לכלבדיקות פונקציונליות, ולכן 6-8 עכברים / צריכה לשמש קבוצת ניסוי. ביצועים במבחן פונקציונליים יכולים גם נבדלים בעיקר בין זני סוג בר מולדים השונים. לכן, עכברי סוג בר ניסיוניים ולשלוט צריכים תמיד מתאימים רקע (במקרה של עכברי mdx להשתמש בזן פראי סוג C57BL/10ScSnJ). כל הנתונים שתוארו כאן התקבלו עם הזן פראי סוג C57BL/10ScSnJ, שבו אנו מתייחסים לסוג בר כמכאן והלאה. הבדיקות שתוארו כאן יכולות לשמש ציר אורך של לפחות 1-19 חודשים של גיל בעכברי MDX ופראיים סוג. בדיקות לא צריכים להיות חזרו יותר מפעם בשבוע כדי למנוע מעכברים לאבד עניין ונכונות לבצע את המשימה.
1. מבחן כוח אחיזת forelimb
השתמש בבדיקת כוח אחיזת forelimb כדי למדוד את עוצמתו של forelimbs. הבדיקה מבוססת על הנטייה של עכבר כדי לתפוס באופן אינסטינקטיבי רשת כאשר הושעה על ידי הזנב 15, וadapteד מDMD_M2.2.001.pdf.
- מנגנון שהוקם: צרף רשת למתמר כוח, המודד את הכוח המרבי המיושם על ידי העכבר על הרשת במשיכה. ודא שההגדרה היא על מצב מתח שיא (T-PK) למשיכה. היחידות של כוח יכולות להיות מותאמות בכל אחד,,,, או ניוטון גרם-of-כוח קילוגרמים של כוח אונקיות של כוח קילו של כוח.
הערה: אנחנו מעדיפים לעבוד עם גרם כיחידה של ערכים. מטרים מרובים זמינים באופן מסחרי, אך רק מתמרים צירי נותנים תוצאות אמינות כמו מתמרים כוח סוג המנוף מושפעים לרעה על ידי חוקי הפיזיקה של אפקט המנוף. כך או רשת או משולש nonflexible ניתן להשתמש עם ברים, כי הם 1-2 מ"מ בקוטר. - לפני הבדיקה, להעריך את משקל הגוף של העכבר, כדי לאפשר נורמליזציה למשקל גוף.
- השתמש גרם כיחידה של ערכים. אפס את המונה בתחילת כל recording.
- הסר את העכבר מהכלוב שלה על ידי גרירת הזנב ולהעביר אותו בצורה אופקית לכיוון הרשת.
- בדוק שהעכבר תופס את הרשת באופן הדוק עם שני כפות רגליו קדמיות.
- משוך את העכבר הרחק מהרשת, כך שאחיזתו נשברה; הכוח הגבוה ביותר מיושם על הרשת יוצג בתצוגה של המתמר, אשר יכול להיות באופן ידני או באופן אוטומטי נרשם.
- לקחת רק מושך בחשבון שבעכבר מראה התנגדות לנסיין. לדחות את הצעדים שבהם רק אחד בכפו, או hindlimbs שימשו ושבו העכבר פנה במהלך המשיכה.
- בואו העכבר למשוך את הרשת שלוש פעמים ברציפות ולאחר מכן להחזיר אותו בכלוב לתקופת מנוחה של דקה אחת לפחות הערה:. בין הסדרה מושכת תקופת מנוחה הכרחית לעכבר כדי להתאושש ולמנוע היווצרות הרגל.
- אז בואו העכבר ארבע סדרות של מושך, כל אחד ואחרי תקופת מנוחה קצרה לבצע. בדרך זו mousדואר משך כולל של 15x (3 מושך x = 5 פעמים 15 מושך).
- קבע את כוח האחיזה המקסימאלי ולנרמל למשקל גוף על ידי לקיחת הממוצע של שלושה הערכים הגבוהים ביותר מערכי 15 שנאספו.
- אופציונאלי: קבע עייפות על ידי חישוב המפחית בין הממוצע של שני הראשונים ושתי הסדרות האחרונות של מושך 1 +2 +3 = 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C ו13 +14 + 15 = ד הנוסחה: / (+ B) (C + D) נותנת ערך של 1 לעכברים שאינם עייפים. זה יכול לבוא לידי ביטוי באחוזים, כך שעכבר ללא עייפות יש לו ערך של 0% ועכבר שforelimbs עייפים לחלוטין יש ערך של 100%.
2. תליית בדיקות
עם בדיקות תלייה, שיווי משקל, קואורדינציה ומצב שרירים ניתן להעריך. בדיקות אלה מבוססות על הידע שהעכברים להוטים להישאר תלוי על חוט או רשת עד תשישות 16. ישנן גם שתי בדיקות תלייה ייחודיות שבו בתחילת המבחןרק שני forelimbs או כל ארבעת הגפיים משמשים, באמצעות חוט או רשת בהתאמה. הבדיקה התלויה באמצעות החוט והרשת הן שיטת זמן השעיה הארוכה ביותר המותאמת מDMD_M.2.1.004.pdf וDMD_M.2.1.005.pdf בהתאמה. גבול תלוי קבוע משמש 600 שניות. רוב עכברי סוג בר יכול לתלות ל600 שניות, ואילו עכברי dystrophic לא יכולים. כדי להפחית את הוצאת זמן ביצוע בדיקה זו, זמן תלייה מרבי נקבע במקום. עכברים שנופלים לו החוט או רשת לפני אז הם ויתרו על שני ניסיונות נוספים. הדבר נעשה כדי ביטוח משנה שהעכברים הם באמת לא מסוגלים להסתובב ואינו נופלים בשל סרבול.
- תליית מבחן עם שני איברים
- מנגנון שהוקם: בחוזקה לאבטח קולב בד עבה מתכת 2 מ"מ למדף עם קלטת ולשמור על הקולב סביב 370; ס"מ מעל שכבת המצעים. הערה: לחלופין, יכול לשמש 55 סנטימטר חוט רחב 2 מ"מ עובי מתכתי המובטחת בחוזקה בין 2 יציעים אנכיים. המרחק של 37 סנטימטר מספיק כדי לעודד עכברים להישאר תלוי, אלא גם נמוך מספיק כדי למנוע עכברים מפציעות כאשר נופלים למטה. התיל לא צריך לרטוט או לעקור במהלך הבדיקה כמו זה יכול להפריע לביצועים של העכבר.
- להתמודד עם העכבר באמצעות הזנב ולהביא אותו ליד התיל.
- תן את העכבר לתפוס את החוט עם שתי רגליים הקדמיות בלבד, ולהפחית את hindlimbs באופן כזה שהעכבר נתקע רק עם שתי רגליו הקדמיות על החוט (איור 2).
- ישירות להפעיל את הטיימר כאשר העכבר הוא שוחרר. לאחר שחרורו, עכברים חזקים מנסים לתפוס את החוט עם כל הגפיים ארבעה והזנב, שהוא מותר (איור 2 ג).
- כאשר עכבר מציג התנהגות לא נאותה (כמו איזון או במכוון קופצים מהחוט כshבעלות ב2D דמויות ו2E), ישירות כתובת זו על ידי החלפה את העכבר על החוט בלי לעצור את שעון העצר.
- כאשר עכבר נופל תיל, לעצור את השעון ולרשום את זמן התלייה.
- כאשר עכברים מסוגלים לתלות ל600 שניות, לקחת אותם את החוט ולהחזיר אותם לכלוב. עכברים שנופלים לפני שהמגבלה זו ניתנים למקסימום של שני ניסיונות נוספים.
- רשום את זמן תלייה המרבי (כלומר הארוך ביותר של הניסויים) ולהשתמש בזה לניתוח נוסף.
- תליית בדיקה עם ארבעה גפיים
- מנגנון שהוקם: השתמש באחת יד מרובעת או המכסה של כלוב גדול לחולדה או ארנבת לבדיקה זו. מקם את הרשת 25 ס"מ מעל מצעים רכים כדי למנוע עכברים מלפגוע בעצמם על ירידה, אלא גם כדי להרתיע עכברים לקפוץ במכוון הרשת. חוזקה לאבטח את הרשת, כך שהניסוי לא צריך להחזיק באופן ידני את הרשת במהלך הניסוי כתנועות אלה יורשו ליnterfere עם הביצועים של העכבר.
- מניחים את העכבר על הרשת, כך שהוא תופס אותו עם ארבע כפות הרגליים שלה.
- הפוך את הרשת, כך שהעכבר הוא תלוי וישירות להתחיל את הטיימר.
- פגישת המבחן מסתיימת לעכברים כי הם מסוגלים לתלות למשך תקופה של 600 שניות. תן עכברים שנופלים מחוץ לרשת מוקדם יותר מקסימום של שני ניסיונות נוספים.
- לנצל את הזמן המרבי התלוי (כלומר. הארוך ביותר של הניסויים) לניתוח נוסף.
3. ריצה Rotarod
עם כוח השרירים מבחן rotarod, ניתן לקבוע קואורדינציה, שיווי משקל, ומצב 17.
- מנגנון שהוקם: לבדיקה זו, עכברים צריכים לרוץ בצינור מסתובב. ודא שהמהירות הקבועה מוגדרת ב 5 סיבובים לדקה (סל"ד), וכי עליות מהירות 5-45 סל"ד בשניות 15 הראשונות כאשר התחילו. אחרי זה יש לו כדי לשמור על המהירות שלו.
- מקם את העכברים בצינור של rotarodכשהוא מסתובב במהירות קבועה איטית של 5 סל"ד. ניתן לבדוק חמישה עכברים בו זמנית.
- התחל לרוץ פעם אחת את כל העכברים בעמדה. בתוך שניות 15 הראשונות את המהירות של הצינור מאיצה 5-45 סל"ד אחרי שהיא שומרת על מהירות זו.
- לפקח על הריצה. זמן הריצה נרשם ברציפות על ידי התוכנה. זמן הריצה מפסיקה באופן אוטומטי כאשר עכבר נופל צינור כמו זה מפעיל את סרגל הזמן המוצב מתחת לצינור. מיקום מחדש של עכברים שמסתובבים פונה לכיוון ההפוך בצינור תוך כדי ריצה מבלי לעצור את הצינור כדי לסובב.
- בסוף יום המבחן לעכברים כי הם מסוגלים להתמודד על משך 500 שניות. תן עכברים מרביים של שני מנסה יותר ומאפשר להם לשפר את זמן הריצה שלהם, כאשר הם נופלים מוקדם יותר.
- השתמש בזמן הריצה לכל היותר (כלומר הארוך ביותר של הניסויים) לניתוח נוסף.
4. תרגיל הליכון
הליכון ניתן להשתמש בשלוש דרכים ככלי במחקר קליני מראש. ראשית, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי להחמיר הפתולוגיה מחלה כפי שתוארה בפרוטוקול זה (ראה גם: DMD_M2.1.001.pdf). שנית, את יכולת הריצה המקסימלי של עכברים ואת ההשפעות של טיפולים על זה ניתן להעריך (ראה לשיטה לתת לעכברים לרוץ עד אפיסת כוחות DMD_M.2.1.003.pdf). לבסוף, ריצה על הליכון יכולה לשמש לפני עוד מבחן תפקודי כדי למצות את העכבר, כך שהוא מבצע פחות טוב במבחן השני 13. הדבר נעשה על ידי פעילות גופנית עכברים פעמיים או שלוש פעמים בשבוע כפי שיתואר להלן, באופן ישיר ואחריו האחד משתי הבדיקות פונקציונליות שתוארו בפרוטוקול 1-3.
- מנגנון שהוקם: יש כמה הליכונים זמינים המסחרית שבו כמה עכברים יכולים run בו זמנית, ואשר יכולים להיות מותאמת גובה, משך ומהירות. הליכונים חלקם מצוידים ברשת כדי לספק זעזועים בעצימות נמוכים כדי לעודד עכברים לרוץ. עם זאת, עכברי MDX רגישים ללחץ והוא יכול בקלות להיות מונעים באופן ידידותי יותר על ידי דחיפה עדינה עם היד בכיוון הריצה. לכן, הוא עודד מאוד לא להשתמש ברשת ההלם. באופן כללי, גירוי עם היד יש צורך רק במהלך פגישת הריצה הראשונה.
- מניחים את העכברים על ההליכון האופקי.
- הפעל את ההליכון במהירות ריצה של 12 מ '/ דקה. מהירויות נמוכות (8 מ '/ דקה) צריכים להיות בשימוש בעכברים ישנים (> 15 חודשים), שבו במהירויות גבוהות יותר בקלות להוביל לתשישות.
- במהלך הפגישה הראשונה, לעודד עכברים לרוץ בעדינות על ידי דוחף אותם כאשר הם קרובים לסוף של החגורה.
- כאשר העכברים לרוץ לתקופת 30 דקות, הנח אותם בחזרה לכלוב שלהם.
- חזור על פעולה זו פעמיים בשבוע לדוגמה 12 שבועות. לאפשר מנוחה תקופות בעת צורך. לדוגמא, כמה עכברי MDX צריכים להפסיק לרוץ ויש לאפשר לו לנוח כמה דקות. אם זה קורה, כבה את החגורה מעל, לתת את כל עכברי תקופת מנוחה של שתי דקות, לכבות את החגורה לשתי דקות ב 4 מ '/ דקה. אחרי זה, להגביר את המהירות ל12 מ '/ דקה ולאפשר לעכברים כדי לסיים את הפרוטוקול. חשוב שכל העכברים להשלים את פרוטוקול כל הריצה.
הערה: במקרה עכברי MDX צריכים תקופות מנוחה, לשקול חימום לפני הפעילות הגופנית פרוטוקול 30 דקות. מפגש להתחמם זה מורכב: תקופה 2 דקות התאקלמות במהירות של 4 מ '/ דקה, ומייד אחרי חימום 8 דקות ב 8 מ' / דקה.
בידיים שלנו עכברי MDX נשיים 4-16 בן שבוע הם מסוגלים להשלים את פרוטוקול פעילות גופני 30 דקות ללא מנוחה. אחרים דיווחו כי בגיל מתאים עכברי MDX זכר 45% מהעכברים צריכים מנוחה תקופות כדי לסיים את התרגיל. הפרוטוקול להתחמם להפחיתשל כמות התחנות 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כוח אחיזת forelimb מסוג פרוע ועכברי MDX מגביר בין גיל 4-12 שבועות ומקטין שוב בעכברים מבוגרים. ליקויים בכוח כבר יכולים להיות שנצפו בעכברי MDX צעירים. נציגי נתונים של נקבות עכברים 9 שבוע ישן מוצגים באיורי 1 א 'וב' 1. למרות עייפות אינה שונה בין הזנים עדיין בגיל זה, עכברי MDX הם חלשים יותר מעכברי סוג בר. אין לנו נתונים עדיין בעיפנות בMDX ועכברי סוג בר מבוגרים יותר.
כדי להשיג תוצאות אמינות לשחזור, הערכות מרובות צריכות להיעשות על ידי אותו הנסיין. אנחנו כאן לתאר למשוך 15 פעמים / בודד, מספרים ואולם קטנים יותר של מושך (נמוך כמו 5 משייכות) גם לספק נתונים אמינים. תשומת לב קפדנית צריכה להיגרר למיצוב של הכפות על הרשת כפי שזה במידה רבה יכול להשפיע על תוצאות. במהלך המשיכה, יש להשתמש רק שני הרגליים קדמיות ויש להם בדואר ממוקם יפה זה לצד זה (איור 1 ג). כאשר העכבר הוא לא מראה התנגדות למשיכה, הערך לא צריך להילקח בחשבון.
עבור שתי בדיקות הגפה וארבעה תלויות איבר, בעיקר צעיר (4-16 שבועות) עכברי סוג בר יכולים להגיע בקלות לזמן התלייה המרבית של 600 שניות. Contrastingly, ביצועים של עכברי mdx צעירים נפגעים (שהם כמעט אף פעם לא להשיג זמן תלייה מרבי) וגם מתדרדרים עם גיל, למרות ששני הזנים לשים את כל המאמץ בביצוע אלה לתלות בדיקות ביכולות הטובות ביותר שלהם (2A דמויות ו3A). הבדלים גדולים יותר בתליית פעמים בין עכברי סוג MDX והפראי מתקבלים עם החוט. לכן, גם בגדלים השפעה קטנים של תרכובות בתפקוד שרירים ניתן לאתר באמצעות בדיקה זו. ביצועי תלייה (או כל סוג אחר של ביצועים) שונה בתוך ובין אנשים לאורך זמן וכתוצאה מכך בברים סטיית תקן גבוהים. NonethelESS, עכברי MDX לבצע באופן עקבי יותר גרועים מגיל מתאים עכברי סוג בר (איור 2 א). ביצוע הערכות מרובות יכול לספק תובנה מפורטת יותר בשיפורים פונקציונליים על טיפול מאשר רק מדידות נקודת קצה. יש לזכור שללמוד בעלי חיים בפגישה הראשונה איך לבצע בדיקה פונקציונלית. עקומת למידה זו, שקיימת בכל הבדיקות, נראה בבירור בין 4-6 שבועות של גיל. עם זאת, מכיוון שעכברים גם לצמוח במהירות בתקופת גיל זו, הבחנה בין השיפור עקב למידה ו / או צמיחה לא יכול להתבצע. הבדלים בין המינים בביצועים תלויים בשני גפיים לתלות מבחן יש גם נמצאים. ביצועים של עכברי mdx נשיים עולים על זו של גברים על ידי ~ 100 שניות, וביצועים של עכברי mdx נשיים הליכון תיגר הוא כמעט דומים לזו של הגברים ללא עוררין (השווה 2A דמויות עם 4 א). ממצא זה מדגיש את החשיבות של שימוש בגילnd מגדר מתאים עכברים כדי למנוע הטיה. יש לנו נתונים ראשוניים מצביעים על כך שהבדלים בביצועים בשני הבדיקות התלויות בין עליות MDX ופראיות סוג עכברים בישנים מאוד (18 חודשים) עכברים.
עכברים מסוימים להציג התנהגות בלתי הולמת, כדי למנוע תלוי על החוט כמו: איזון על התיל, קפיצה מהתיל במכוון וכו '(2D דמויות ו2E), אם כי רוב העכברים לעמוד במבחן ולתלות גם עם שניים או ארבעה גפיים ( 2B דמויות ו2C). לפעמים, עכברים חזקים לקפוץ מהתיל במכוון. הם תולים לפני קפיצה עם רק שתי hindlimbs והזנב על החוט ולהסתכל למטה כדי להעריך את המרחק אל הקרקע. התנהגות שאינה הולמת, כי הוא ראה מדי פעם על הרשת במהלך בדיקת תליית ארבעה גפיים מורכבת בכוונה לקפוץ מחוץ לרשת או לטפס על הרשת. כל הצורות של התנהגות בלתי הולמות יכולות להיות easily מכובד ולא צריך להיות מותר. עכברים שלהימנע מתלייה באחת מהדרכים אלה צריכים להיות ממוקמים ישירות בחזרה על החוט או רשת מבלי לעצור את שעון העצר.
על rotarod, עכברי MDX כמעט אף פעם לא לרוץ לזמן ריצה המרבי של 500 שניות, בעוד ששיעור גבוה יותר של עכברי סוג בר לעשות (איור 3 ב). עם גיל, ביצועים בריצה של שני הזנים פוחת. עכברים חלקם מסוגלים לבלום בחוזקה על הצינור מסתובב ולהימנע מהפעלתו על ידי 'סחרור' מסביב. זה לא ניתן לתיקון ולמגבלה חמורה של הבדיקה כאשר עכברים מרובים להתחיל לעשות את זה לתקופות ממושכות, וכך להגדיל את השונות בתוך קבוצות ניסוי. במיוחד עבור כמה עכברים שמנוהלים בחלקו וגלגלונים בחלקו, ובמהלך המעבר מסחרור בנפילת ריצה. עכברים קצת להסתובב בצינור מסתובב תוך כדי ריצה. התנהגות זו יש להפנות לישירות על ידי למקם מחדש את העכברים ברכבת התחתית, עםיצאתי לעצור את זה. גם התנהגות מסוג זה מגביל את השימושיות של בדיקה זו.
הליכון נאלץ ריצה הוא פעילות גופנית קלה ויעילה כדי להחריף הפתולוגיה מחלה בעכברי MDX nontreated, ואילו עכברי סוג בר שעברו באותו הפרוטוקול שאינם מושפעים. באופן כללי, העכברים להכיר את ההליכון אחרי אימון ראשוני ומוכנים להפעלה, במיוחד כאשר עכברים מרובים מפעילים בו זמנית. עכברים ישנים MDX (מעל 15 חודשים של גיל) יש להם קשיים בריצה ולא יכולים להתמודד עם אותה מהירות הריצה של 12 מ '/ דקה ל30 דקות משמשות לעכברים צעירים. לכן, מהירות ריצה איטית יותר של 8 מ '/ דקה ל30 דקות מומלצת שאפשרה לכל העכברים כדי לסיים את הפרוטוקול כולו. עכברי MDX פגיעים במיוחד להתכווצויות אקסצנטריות, ולכן ירידה בריצה יכול לשמש אך ורק לזמן קצר.
לחלופין, בדיקות פונקציונליות אחרות כמו t שני חוט תליית איברניתן לבצע est ישירות אחרי הריצה (איור 4 א). השימוש בעיצוב מחקר זה, הבדלים בין זנים או זרועות טיפול צפויים להגדיל כמו עכברים שלא טופלו MDX תיגר הליכון פחות מסוגלים לבצע בדיקות אלו מאשר עכברי MDX ישיבת 13.
כפי שהוזכר קודם לכן, כאשר לומדים את תפקוד שרירים בעכברי MDX, הזן פראי סוג C57BL/10ScSnJ צריך לשמש בו הוא של הרקע הגנטי המתאים. אנו ממליצים על כך כאפילו בין זני סוג בר טהורים הליכון ריצת ביצועים שונים 18,19. אבל גם בבדיקות פונקציונליות לא פולשנית, ביצוע תפקודי מושפע מרקע גנטי. איור 5 מדגים זאת בשלושה גרפים נציג שבו ביצועים של עכברי mdx על רקע BL/10 ועל רקע מעורב בהיקף של BL/10, BL/6J, DBA2 ו129OLA מושווה. כפי שניתן מוערך עכברי רקע המעורביםביצועים טובים יותר במבחני חוט תלייה וגרוע על rotarod.
איור 1. כוח forelimb אחיזה, נציג תוצאות ומיקום נכון של הכפות. כוח אחיזת א Forelimb המנורמל למשקל גוף של נקבת MDX 9 שבועות (n = 5) וסוג בר (n = 4) עכברים. כוח אחיזה כבר נפגעים בעכברי MDX צעירים. כוכביות מציינות p <0.05 והנתונים מוצגים כממוצע ± st.dev. B. עייפות של אותם אנשים, כפי שמוצגים ב, היה בממוצע פחות מ -10% ולא משתנה בין הזנים. C. כדי לקבל נתונים אמינים, תשומת לב צריך להיות משולם על המיצוב של הכפות במהלך ניתוח כוח אחיזת forelimb. מיקום נכון של העכבר; שתי רגליים קדמיות הן אחד ליד שני, hindlimbs arדואר לא נוגע ברשת והעכבר הוא מושך בקו ישר מיצוב שגוי ד של כפות רגליו הקדמיות;. העכבר לא מושך בקו ישר. כאשר זה קורה, או כאשר רק כף אחת או גם hindlimbs משמשות, העכבר מסתובב במשייכת או חסר כדי להראות התנגדות, אמורים להיות מושלכים נתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שתי בדיקות תלויות איבר, תוצאות נציג ומתאימה והולמת התנהגות תלויה. א 'דוגמא מייצגת של מבחן שתי תליית האיבר מתבצע אחת לשבוע בMDX הזכר (n = 18, 4-10 שבועות, n = 13, = 11 ו12 שבועות, n 10, 13 שבועות) וגיל ומין מתאים עכברי סוג בר (n = 6). עקומת למידה היא גלויה לשני הזנים בשבועות הראשונים של בדיקה. ביצועים של עכברי mdx היו גרועים יותר בהשוואה לזו של עכברים מסוג בר. הנתונים מוצגים כממוצע ± st.dev. זמן תלייה מרבי המוותר מצויינים על ידי הקו המקווקו. ב 'עמדת הפתיחה הנכונה של המבחן הזה היא עם שתי רגליים קדמיות. C. בהתאם ליכולת התפקודית של העכבר זה יכול גם להשתמש בhindlimbs וזנב. D ו-E קבוצה קטנה של עכברים, עכברים חזקים במיוחד מסוג בר, יכולה לעתים למנוע תלייה על ידי טיפוס על הסורגים בצד או איזון על החוט. עכברים מסוימים בכוונה לקפוץ מהתיל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Width =" files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg 500 "/>
איור 3. ארבע תליית איבר וrotarod ריצת מבחן. ביצועים תלויים איבר א ארבעה העריכו פעם בשבוע בMDX גברים (n = 18, 4-10 שבועות, n = 13, 11 ו12 שבועות, n = 8, 13 שבועות) וסוג בר ( n = 6) עכברים. במשך זמן, עכברי MDX לתלות פחות זמן מאשר עכברי סוג בר. ב Rotarod פועל פעמים לא היה שונה בין MDX הצעיר הגברי (n = 18, 4-10 שבועות, n = 13, 11 ו12 שבועות, n = 10, 13 שבועות ) ועכברי סוג בר (n = 6). הנתונים מוצגים כממוצעים ± st.dev.
איור 4. ההשפעה של ההליכון נאלץ לרוץ פרוטוקול פעילות גופני על ביצועים תפקודיים והפתולוגיה שרירי שלד בעכברים ממין נקבה. הפתולוגיה שריר הייתה במכווןהוחמר על ידי נותן עכברים לרוץ על הליכון אופקי שלוש פעמים בשבוע ב12 מ '/ דקה ל30 דקות למשך תקופה של 12 שבועות. מייד לאחר הריצה, עכברים היו צריכים להשתתף במבחן שני תליית איבר. בעוד כל עכברי הסוג בר (n = 5) יישארו תלוי עד המקסימום המוותר, כל עכברי MDX (n = 6) ליפול מהחוט קודם לכן (p <0.001, הנתונים מוצגים כממוצע ± st.dev.). B. הנוכחות נזק קרום נקבע על ידי הערכת רמות הפלזמה קריאטין קינאז (CK) שלדלוף החוצה של סיבי שריר מבעד לדמעות בקרום. רמות CK היו גבוהות בעכברי MDX בהשוואה לעכברי סוג בר לפני פעילות גופנית. רמות פעילות גופנית הליכון עלו באופן מיידי (p <0.01 מסומנים על ידי כוכבית, הנתונים מוצגים כממוצע ± st.dev.) בעכברי MDX, בעוד הם נותר נמוכים בעכברי סוג בר. תקליטור. שרירים של עכברי MDX הן פגיעות מאוד להליכון תרגיל, החמרה הפתולוגיה מחלה בהרחבהחרי כמה שבועות של ריצה. stainings אלה Haematoxylin וEosin של הארבע ראשי של nonexercised (C) 16 בן שבוע והליכון למימוש תכנית עכבר MDX שסיסטיק ונימק נרחבים מפותחים (ד '). שרירי א' של עכברי סוג בר שעברו באותו פרוטוקול הריצה אינם מושפעים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. השפעה של רקע מעורב בביצוע תפקודי בעכברים. הבדלי MDX בביצוע תפקודי השפעת רקע גנטית. כדי להמחיש זאת, ביצועים של MDX זכר (קטן BL/10 רקע, n = 18, 4-10 שבועות, n = 13, 11 ו12KS, n = 10, 13 שבועות) וMDX (מעורב BL/10, BL/6J, DBA2 ורקע 129OLA, n = 5) עכברים היה בהשוואה לאורך זמן. ביצועים במבחן תלוי איבר א 'שתי שונים משמעותי בין שני הזנים. תוצאות בדיקה תלויות איבר ב 'ארבע היו מעט גבוהות יותר בעכברי MDX רקע המעורבים. פעמים פועלות ג Rotarod גם היו שונות מעט בין הזנים. הנתונים מוצגים כממוצע ± st.dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבדיקות פונקציונליות המוצגות כאן הן לשחזור, קלים לביצוע ומתאימים לסוג בר ועכברי dystrophic עצמאיים של בני גילם. הבדיקות מספקות כלים שימושיים לטרום קליני להעריך את תפקוד שריר, כוח, מצב, ותיאום. כאשר בודקים את ההשפעות של מתחם על ההיסטוריה הטבעית של המחלה, הבדיקות פולשנית תוארו כאן (כוח אחיזת forelimb, שני מבחנים תלויים ובדיקת rotarod) יכול להיות משולב יפה במשטר מבחן פונקציונלי שבו בדיקות אלה מבוצעים בימים רצופים . פרוטוקולים אלה אינם מזיקים לעכברי MDX וניתן להשתמש בם באופן אורך 10. יש לזכור כי תוצאות של כל אחת מבדיקות אלו מופקות על ידי קבוצות שרירים שונות או חופפים בחלקו במקום שרירים בודדים. לכן, באמצעות שילוב של בדיקות מרובות מומלץ לקבל תמונה שלמה יותר ותובנה ובכך טובה יותר בפונקציונליות של ההתנסותקבוצות נפשיות. לחלופין, שיפורים תפקודיים של שרירים בלעדי ניתן להעריך באמצעות מדידות פיזיולוגיה שרירים 20.
כמו בדיקות התנהגותיות, גם בדיקות תפקודיות יכולות להראות וריאציה נרחבת בין עכברים שונים, או בתוך עכבר בין הערכות שונות. כדי להפחית וריאציה, יש לבצע את כל הבדיקות על ידי אותו ניסוי שמכיר עכברים. משתנים חיצוניים כמו ריחות וצלילים בחדר, שעה ביום והיום בשבוע שבו הבדיקה מבוצעת צריכה להישמר כקבוע ככל האפשר. עכברים צריכים להיות מין וגיל מתאים. בעת שימוש בהליכון הריצה להחריף את התקדמות מחלה, זה הכרחי להשתמש בפרוטוקול סטנדרטי שבה כל הפרמטרים הריצה (זמן ריצה, מהירות ושיפוע) נשמרים קבועים לאורך זמן לכל קבוצות הניסוי, כך שהמטופלים כל העכברים באותה מידה. על אף שרוב העכברים להוטים להשתתף בבדיקות פונקציונליות ורוב בעלי החיים מראים גבוהיםרמות נכונות, כמה עכברים (עכברים חזקים בעיקר מסוג בר) לעתים הימנעות מביצוע הבדיקה והימנעות להראות ההתנהגות. כאשר התנהגות זו לא תוקנה ל, יכולה להסיק מסקנות שווא 21. למרבה המזל, אלו סוגים של התנהגות הם נצפו רק מדי פעם ויכולים להיות מתוקן על ידי הצבת העכבר על גב התיל, רשת או rotarod, או משיכת זמן נוסף על מד כוח האחיזה.
שיפורים במבחן אחד תפקודי (למשל תלוי תפקוד שרירים הערכת מבחן) לא בהכרח צריכים שיתוף להתרחש עם שיפורים במבחן נוסף (כוח אחיזת forelimb הערכת כוח שריריו בלעדי). בעכברי MDX, ניתן להבחין שיפורים בתפקוד שרירים מוקדם יותר מאשר בכוח שרירים. הדבר בא לידי ביטוי גם בחולי DMD המשתתפים בניסויים קליניים שבו שיפורים משמעותיים קליני במבחן ההליכה 6 דקות לא cooccur עם שיפורים בכוח השרירים 6,7. עם זאת, ייתכן שזהבחלק תלוי במנגנון העבודה של המתחם נבדק וזה אפשרי, כי תרכובות אחרות לשפר את הכוח ולא פונקציה. לכן, התוצאות של הבדיקות יש לפרש במנגנון פעולה של התרכובת בראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לMargriet Hulsker על סיועה המצולם ולעזור בהשגת תמונות של עכברים וביקורות על ההערות בונות מאוד שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי ZonMw, לטפל-NMD (מספר חוזה LSHM-CT-2,006-036,825) ופרויקט ההורים דושן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
