Summary
Основным критерием результата в клинических испытаниях для нервно-мышечных расстройств, как правило, улучшение функции мышц. Таким образом, оценки влияния потенциальных терапевтических соединений на производительность мышц предварительной клинически на мышах имеет большое значение. Мы здесь опишем несколько функциональных тестов для решения этой проблемы.
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелым и прогрессивным мышечного истощения расстройства, для которых никакого лечения не доступен. Тем не менее, несколько потенциальных фармацевтических соединений и подходы генной терапии продвинулись в клинических испытаниях. С улучшением функции мышц является наиболее важным конечная точка в этих испытаниях, много внимания было уделено созданию надежной, воспроизводимой, и легко выполнять функциональные тесты для предварительного клинически оценить функцию мышц, силу, состояние, и координации в MDX модель мыши для DMD. Оба инвазивные и неинвазивные тесты доступны. Тесты, которые не усугубить заболевание может быть использован для определения естественную историю болезни и последствий терапевтических вмешательств (тест например. Сила передних конечностей сцепление, два различных висит испытаний с использованием либо проволоку или сетку и rotarod ход). С другой стороны, вынужден работает Беговая дорожка может быть использован для повышения прогрессирование заболевания и / или оценитьЗащитные эффекты терапевтических вмешательств на патологии болезни. Мы здесь описать, как выполнять эти наиболее часто используемых функциональных тестов в надежной и воспроизводимым образом. Используя эти протоколы, основанные на стандартных оперативных процедур позволяет сопоставление данных между различными лабораториями.
Introduction
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенным нервно-мышечных расстройств влияющих 1:5000 новорожденных мальчиков. Это тяжелая и прогрессивная мышечная изнуряющая болезнь вызывается мутациями в гене DMD, которые нарушают открытую рамку считывания и предотвратить синтез функционального белка дистрофина. Мышечные волокна, лишенные дистрофина уязвимы осуществлять индуцированного повреждения. По исчерпании регенеративной способности мышечных, и в связи с хроническим воспалением поврежденных мышц, волокна замещаются соединительной тканью и жиром, впоследствии приводит к потере функции. Как правило, пациенты с МДД теряют способность передвигаться на нижних конечностях, в начале второго десятилетия. Позже, также мышцы рук и плечевого пояса страдают и пациенты часто развиваются грудопоясничного сколиоз из-за асимметричного ослаблению мышц, поддерживающих позвоночник. Вспомогательная вентиляция, как правило, требуется в позднем подростковом возрасте или в начале двадцатых. Дыхательная и сердце свинец провалдо смерти в третьем или четвертом десятилетии 1.
Хотя ген причинным было обнаружено более 25 лет назад 2, нет никакого лечения доступны для пациентов с МДД. Однако, улучшение медицинского обслуживания и использование кортикостероидов увеличились продолжительность жизни в западном мире 3. С использованием животных моделей, таких как мыши MDX, крупные шаги вперед в обнаружении потенциальных терапевтических стратегий были сделаны. MDX мыши является наиболее часто используется DMD модель мыши. Он имеет точечную мутацию в экзоне 23 мышиного гена МДД и, следовательно, не имеет дистрофина 4. За последние пару лет, многие предлагаемые стратегии продвинулись в клинических испытаниях 5-9. В этих испытаниях, улучшение функции мышц является первичная конечная точка, утверждающая важность тестирования преимущество соединений на функции мышц у мышей в ходе предварительного клинической стадии тестирования.
Как МДДпациенты, также дистрофина негативные мышечных волокон MDX мышей уязвимы осуществлять индуцированного повреждения и их функции мышц нарушается сравнению с C57BL/10ScSnJ мышей дикого типа. Это ухудшение может быть оценена с различными функциональными пробами. Некоторые из этих испытаний являются неинвазивным и не мешают мышечной патологии (например, передних конечностей прочности сцепления, висит испытаний и rotarod подряд). Поэтому они могут быть использованы для мониторинга естественную историю болезни или определения влияния соединений на прогрессирование заболевания. Чтобы получить детальную картину влияния соединений на функции мышц в MDX мышей, функциональный тест режим, который не мешает прогрессирования заболевания, состоящей из всех этих тестов можно использовать 10.
С другой стороны, вынужден работает беговая дорожка может быть использован для намеренно усугубить прогрессирования заболевания и протестировать защитные возможности соединений 11. Беговая дорожка может бытьиспользуется в качестве критерия оценки, в которых время работы до изнеможения измеряется 12 или в качестве инструмента для MDX мышей усталости, так что они выполняют менее в последующем функциональной испытание, обеспечивающее большие различия в производительности между группами лечения 13. При выборе функциональных тестов, их влияние на прогрессирование заболевания следует иметь в виду, особенно при тестировании дистрофические мышей, как в MDX мыши 14.
Мы здесь подробно описывать, как выполнять наиболее часто используемые функциональные испытания в качестве надежного и воспроизводимым способом на основе имеющихся стандартных операционных процедур с TREAT-NMD сети. Нажмите здесь, чтобы посетить TREAT-НПРО .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты, описанные здесь были утверждены Комитетом по этике животных (DEC) из Медицинского центра Лейденского университета (LUMC) на. Мыши были выведены вивария в LUMC и хранятся в индивидуальном вентилируемые клетки с 12 ч света темных циклов. У них было вволю доступ к воде и стандартным кормом.
При выполнении любой из функциональных тестов, описанных ниже, экспериментальные условия должны строго контролироваться, чтобы уменьшить изменение. Предпочтительно, возрастные и гендерные подобранные мыши следует использовать, как производительность отличается между возрастом и полов. Мыши, принадлежащие к той же помета следует рандомизированы над экспериментальных группах. Животные должны быть проверены и тем же оператором, который ослепил в экспериментальных группах. Испытания должны проводиться в тот же времени суток и дня недели, одной комнате, чтобы уравнять запахи, шумы и т.д. 14 Большая разница между отдельными мышей и временных точках может наблюдаться для всехфункциональные тесты, поэтому 6-8 мышей / экспериментальная группа должна использоваться. Функциональная тест производительности также может в значительной степени отличаться между различными инбредных линий дикого типа. Таким образом, экспериментальных и контрольных мышей дикого типа всегда должны иметь соответствующие фоны (в случае MDX мышей использовать штамма дикого типа C57BL/10ScSnJ). Все данные, описанные здесь, были получены с C57BL/10ScSnJ штамма дикого типа, который мы называем дикого типа отсюда на. Испытания, описанные здесь, могут использоваться в продольном направлении от крайней мере 1-19 месячного возраста в MDX и мышей дикого типа. Испытания не должны повторяться более одного раза в неделю, чтобы предотвратить мышей от потери заинтересованность и готовность выполнить задачу.
1. Передних конечностей Возьмитесь Испытание на прочность
Используйте тест передних конечностей прочности сцепления для измерения прочности передних конечностей. Тест основан на склонность мыши инстинктивно понять сетку когда подвешивают за хвост 15 и ADAPTEд от DMD_M2.2.001.pdf .
- Аппарат создан: Прикрепите сетку к датчиком силы, который измеряет максимальное усилие, приложенное мышью на сетке во время тянуть. Убедитесь, что параметр включен режим Peak натяжения (T-PK) для буксировки. Единицы силы можно регулировать либо в унций-в-силу, г-из-силу, фунтов-из-силы, килограммов-из-силу, или Ньютонов.
Примечание: Мы предпочитаем работать с г как единицу значений. Несколько метров имеются в продаже, но только осевые датчики дать надежные результаты как рычажного типа датчиков силы отрицательно влияют физических законов эффекта рычага. Либо негибкими сетка или треугольник может быть использован с барами, которые 1-2 мм в диаметре. - Перед испытанием, оценки массы тела мыши, чтобы позволить нормализации веса тела.
- Используйте граммов в качестве единицы значений. Сброс счетчика в начале каждого RECOВИДЕОЗАПИСЬ.
- Отключив мышь из клетки, захватывая хвост и перемещая его в горизонтальном направлении сетки.
- Проверьте, что мышь хватается сетку плотно обеими передними лапами.
- Потяните мыши от сетки так, чтобы его понять нарушается; высшая сила, приложенная к сетке будет показан на дисплее преобразователя, который может быть либо вручную, либо автоматически записываются.
- Только принимать во внимание тянет в котором мышь показывает устойчивость к экспериментатора. Отклонение меры в котором только одна лапка, или задних конечностей были использованы и в котором мышь превратили в течение тянуть.
- Пусть мышь тянуть сетке три раза подряд, а затем вернуть его в клетку для отдыха в течение не менее одной минуты. Примечание: между серией тянет период отдыха необходимо для мыши, чтобы восстановиться и избежать образования привычки.
- Тогда давайте мышь выполнять четыре серии тянет, каждым из которых следует короткий период покоя. Таким образом, МОВэ потянул в общей сложности 15x (3 тянет х 5 раз = 15 тянет).
- Определить максимальную прочность сжатия и нормализовать вес тела на основе среднего значения трех высших ценностей из 15 значений, собранных.
- Дополнительно: Определите усталость, вычисляя декремент между средним первых двух и последних двух серий тянет 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 11 12 = C и 13 +14 + 15 = D. Формула: (C + D) / (A + B) дает значение 1 для мышей, которые не являются усталость. Это может быть выражено в процентах, так что мышь без усталости имеет значение 0% и мыши, которые передние конечности полностью усталость имеет значение 100%.
2. Висячие тесты
С висячими тестов, баланс, координацию и состоянии мышц могут быть оценены. Эти тесты основаны на том, что мыши очень хотят остаться висит на проводе или сетки до изнеможения 16. Есть два отличительных висит испытаний, в которых в начале теста либотолько две передние конечности или все четыре конечности используются, с помощью проволоки или сетки соответственно. Тест висит помощью проволоки и сетки являются самыми длинными метод времени подвеска заимствована из DMD_M.2.1.004.pdf и DMD_M.2.1.005.pdf соответственно. Фиксированная висит лимит используется 600 сек. Большинство мышей дикого типа можно повесить за 600 сек, в то время как дистрофические мышей не могу. Чтобы уменьшить время, затраченное выполнении этого теста, максимальное время висит был установлен на месте. Мыши, которые попадают с провода или сетки до этого даны до более двух попыток. Это делается, чтобы перестраховаться, что мыши действительно не в состоянии повесить и не попадают из-за неуклюжести.
- Висячие тест с двумя конечностями
- Аппарат создан: Плотно закрыть 2 мм толщиной металла ткань вешалка к полке с лентой и поддерживать вешалку около 370; см над слоем подстилки. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать на 55 см в ширину 2 мм толщиной металлической проволоки, которая плотно закреплены между 2 вертикальных клетей. Расстояние 37 см достаточно, чтобы поощрять мышей оставаться висит, но и достаточно низко, чтобы предотвратить мышей от травм при падении вниз. Провод не должен вибрировать или вытеснить в ходе испытания, поскольку это может отрицательно повлиять на функционирование мыши.
- Ручка мышь через хвост и привести его рядом с проволокой.
- Пусть мышь понять провод только с двумя передними лапами и снизить задних конечностей таким образом, что мышь висит только с двумя передними лапами на проводе (рис. 2В).
- Непосредственно запустить таймер, когда мыши. После освобождения, сильные мышей попытаться поймать провод со всеми четырьмя конечностями и хвостом, который позволил (рис. 2С).
- Когда мышь показывает неправильное поведение (например, балансируя на или намеренно спрыгнув провод как швладеть на рисунках 2D и 2Е), непосредственно обратиться к этому, заменив мышь на проводе без остановки таймера.
- Когда мышь падает провод, остановить таймер и записать время висит.
- Когда мышей способны повесить за 600 сек, снять их провод и вернуть их в клетку. Мыши, которые попадают до этого предела приведены максимум более двух попыток.
- Запишите максимальное время висит (т.е. самая длинная из испытаний) и использовать это для дальнейшего анализа.
- Висячие тест с четырьмя конечностями
- Аппарат создан: Используйте либо ручной квадратной или крышка большой клетке для крысы или кролика для этого теста. Расположите сетку 25 см выше мягкой подстилкой, чтобы предотвратить мышей от вредить при падении, но и препятствовать мышей намеренно спрыгнуть сетку. Плотно закрыть сетку так, что экспериментатор не придется вручную провести сетку во время эксперимента в качестве этих движений я мог быnterfere с выполнением мыши.
- Наведите мышь на сетке так, чтобы она захватывает его с четырьмя лапами.
- Переверните сетку так, чтобы мышь висит и непосредственно запуска таймера.
- Тест сессия заканчивается для мышей, которые в состоянии повесить на протяжении 600 секунд. Дайте мышей, которые попадают от сетки ранее максимум более двух попыток.
- Используйте максимальное время висит (IE. Самый длинный из испытаний) для дальнейшего анализа.
3. Rotarod Летние
С силой тест rotarod мышц, координация, баланс, и состояние может быть определено 17.
- Аппарат создан: Для этого теста, мыши должны работать на вращающейся трубки. Убедитесь, что постоянная скорость устанавливается на 5 оборотов в мин (оборотов в минуту), и что скорость увеличивается с 5-45 оборотов в минуту в течение первых 15 сек при запуске. После этого он должен поддерживать свою скорость.
- Поместите мышей на трубке rotarodкогда он вращается с медленной постоянной скоростью 5 оборотов в минуту. Пять мыши могут быть проверены одновременно.
- Запустите работать, когда все мыши расположенный. В течение первых 15 сек скорость трубки ускоряется от 5-45 мин, после чего он поддерживает эту скорость.
- Контролировать пробег. Время работы непрерывно записывается с помощью программного обеспечения. Продолжительность останавливается автоматически, когда мышь падает трубку, так как это активизирует строку времени, расположенный под трубы. Измените мышей, которые оборачиваются лицом в противоположную сторону на трубе во время работы без остановки трубку, чтобы повернуть.
- Закончите тестовую сессию для мышей, которые в состоянии работать в течение срока действия 500 сек. Дайте мышам максимум более двух попыток, позволяющих им улучшить их время работы, когда они падают раньше.
- Используйте максимальное время работы (т.е. самая длинная из испытаний) для дальнейшего анализа.
4. Беговая дорожка Упражнение
Беговая дорожка может быть использован тремя способами в качестве инструмента в предварительной клинических исследований. Во-первых, вынуждены работает беговая дорожка может быть использован для обострить патологию болезни, как описано в данном протоколе (см. также: DMD_M2.1.001.pdf ). Во-вторых, максимальный пробег способность мышей и последствий лечения на это может быть оценено (см. описание метода пусть мышей продлится до истощения DMD_M.2.1.003.pdf ). Наконец, беговой дорожке можно использовать до другого функционального тестирования, чтобы исчерпать мышь так, чтобы он выполняет менее во втором тесте 13. Это делается путем осуществления мышей два или три раза в неделю, как описано ниже, непосредственно следует либо одной из функциональных тестов, описанных в протоколе 1-3.
- Аппарат создан: Есть несколько беговые дорожки имеющиеся в продаже на котором несколько мышей может RUN одновременно и для которых высота, продолжительность и скорость можно регулировать. Некоторые беговые дорожки оснащены сеткой, чтобы доставить низкие удары интенсивности поощрять мышей бежать. Тем не менее, MDX мышей чувствительны к стрессу и может быть легко мотивированы в доступной форме нежным толчок с рукой в направлении движения. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы не использовать ударную сетку. Как правило, стимуляция рукой необходима только в течение первого пускового сессии.
- Поместите мышей на горизонтальной беговой дорожке.
- Запустите беговую дорожку на скорости движения 12 м / мин. Более низкие скорости (8 м / мин) должны быть использованы в старых мышей (> 15 месяцев), где более высокие скорости легко привести к истощению.
- В ходе первой сессии, поощрять мышей бежать, осторожно подталкивая их, когда они находятся в конце ленты.
- Когда мыши столкнулись продолжительностью 30 мин, поместить их обратно в клетку.
- Повторите это два раза в неделю в течение, например 12 недель. Разрешить отдыха периоды, когда это необходимо. Например, некоторые MDX мышей должны остановить бег и должно быть разрешено отдыхать в течение нескольких минут. Если это произойдет, поверните ремень с, дают все мыши период отдыха двух минут, поверните ремень на в течение двух минут при 4 м / мин. После этого увеличить скорость 12 м / мин и позволяют мыши, чтобы завершить этот протокол. Важно, чтобы все мыши завершить весь протокол работает.
Примечание: В случае MDX мышей нужно отдыхая периоды, рассмотреть разминка перед протоколом упражнений 30 мин. Это разогреть сессия состоит из: акклиматизации период 2 мин со скоростью 4 м / мин, сразу за которым следует 8 мин прогрева в 8 м / мин.
В наших руках 4-16 недельных самок MDX мышей в состоянии завершить протокол тренировки 30 минут без отдыха. Другие сообщили, что в соответствующей возрастной мыжской MDX мышам 45% от мышь требует отдыха периоды, чтобы закончить упражнение. Разминка протокол снизитьс количество остановок 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Передняя конечность сцепление сила дикого типа и MDX мышей увеличивает в возрасте от 4-12 недель и уменьшает снова в старых мышей. Нарушения в силу уже можно наблюдать у молодых MDX мышей. Репрезентативные данные из 9-недельных самок мышей показаны на фиг.1А и 1 В. Хотя усталость не отличается между штаммами еще в этом возрасте, MDX мышей слабее мышей дикого типа. У нас нет данных, но на утомляемость у пожилых MDX и мышей дикого типа.
Для получения надежных и воспроизводимых результатов, несколько оценки должны быть сделаны одним и тем же экспериментатором. Мы здесь описать тянуть 15 раз / человека, однако меньшее число тянет (по цене от 5 тянет) также получения достоверных данных. Особое внимание должно быть обращено на позиционировании лап на сетке, так как это может в значительной степени влиять на результаты. Во время спуска, только оба передние лапы должны быть использованы, и они должны бэ размещены красиво рядом друг с другом (рис. 1С). Когда мышь не показывает устойчивость к тянуть, значение не должно быть принято во внимание.
Для двух конечностей и четыре конечности висит тестов, особенно молодые (4-16 недель) у мышей дикого типа можно легко добраться максимальное время висит 600 сек. Контрастно, выступление юных MDX мышей нарушается (они почти никогда не достичь максимального времени висит), а также ухудшается с возрастом, хотя оба штамма поставить все усилия в выполнении этих повесить тесты на своих лучших способностей (2А и 3А). Большие различия в подвесной раз между мышами MDX и дикого типа получаются с проводом. Таким образом, даже небольшие размеры эффекта соединений на мышечной функции могут быть обнаружены с помощью этого теста. Подвесные производительность (или любой другой тип производительности) отличается внутри и между частными лицами с течением времени приводит к высокой стандартных отклонений стержней. NonethelESS, MDX мышей последовательно выполнять хуже, чем же возраста мышей дикого типа (рис. 2А). Выполнение нескольких оценок может обеспечить более детальный анализ в функциональных улучшений при обработке, чем только конечных точек измерений. Следует иметь в виду, что в первой сессии животные научиться выполнять функциональное тестирование. Эта кривая обучения, который присутствует во всех тестах, хорошо видна между 4-6 недельного возраста. Однако, поскольку мыши также быстро расти в этой возрастной период, различие между улучшением в результате обучения и / или роста не могут быть сделаны. Половые различия в подвесной производительность между двумя конечностями повесить тест, были также обнаружены. Выполнение женской MDX мышей превышает мужчин по ~ 100 сек, а производительность беговой дорожке оспорены женским MDX мышей почти сравнима с непревзойденные мужчин (сравните 2А с 4А). Эта находка подчеркивает важность использования возрастй пол соответствует мышей, чтобы избежать предвзятости. У нас есть предварительные данные, свидетельствующие, что различия в производительности в обеих подвесных тестов между MDX и дикого типа мышей увеличивается в очень старый (18 месяцев) мышей.
Некоторые мыши обнаруживают неадекватное поведение, чтобы избежать висит на проводе, как; балансируя на проволоке, спрыгивая провод намеренно т.д. (рис. 2D и 2Е), хотя большинство мышей выдержать испытание и повесить с двумя или четырьмя конечностями ( Цифры 2В и 2С). Иногда сильные мышей спрыгнуть провода намеренно. Они висят до прыжков с только двумя задних конечностей и хвоста на проводе и смотреть вниз, чтобы оценить расстояние до земли. Неадекватное поведение, что иногда видели на сетке во время испытания на четыре конечности висит состоит из намеренно спрыгнув сетку или подъем на сетке. Все нарушении формы поведения могут быть easilу выдающихся и не должно быть позволено. Мыши, которые избегают висит в одном из этих способов должно быть помещено обратно на провода или сетки без остановки таймера.
На rotarod, MDX мышей почти никогда не баллотироваться на максимальное время работы 500 сек, в то время как большая доля мышей дикого типа сделать (рис. 3б). С возрастом, бег производительность обоих штаммов уменьшается. Некоторые мыши могут зажать плотно к вращающемуся трубки и избежать нехватки на "cartwheeling 'вокруг. Это не может быть исправлена в течение и является серьезным ограничением теста, когда несколько мышей начать делать это в течение длительного времени, тем самым увеличивая вариацию в экспериментальных группах. Специально для некоторых мышей, которые частично работают и частично колесом, и во время перехода от cartwheeling в работающей падения. Некоторые мыши развернуться на вращающейся трубки во время работы. Такое поведение следует направлять для непосредственно репозиционирование мышей на трубе, сиз его остановки. Также этот вид поведения ограничивает полезность этого теста.
Принудительное беговой дорожке является простым и эффективным упражнением к обострению патологии заболевания у необработанных MDX мышей, в то время как мыши дикого типа, проходящие тот же протокол, не затрагиваются. Вообще, мыши ознакомиться с беговой дорожки после начального тренировки и готовы работать, особенно когда несколько мышей, работающих одновременно. Старые MDX мышей (старше 15-месячного возраста) испытывают трудности в управлении и не может справиться с той же скорости движения 12 м / мин в течение 30 мин, используемого для молодых мышей. Таким образом, медленнее скорость движения 8 м / мин в течение 30 мин рекомендуется включить все мышей, чтобы закончить весь протокол. Мышей MDX являются особенно уязвимыми для эксцентричных сокращений, поэтому спуск работает могут быть использованы только на короткое время.
С другой стороны, другие функциональные тесты, как двух конечностей висячие провода тПредполагаемое может осуществляться непосредственно после запуска (рис. 4а). Используя эту конструкцию изучения, различия между штаммами или обращения оружия, вероятно, возрастет, как беговая дорожка оспариваемые необработанные MDX мышей менее способны выполнять эти испытания, чем сидячий MDX мышей 13.
Как упоминалось ранее, при изучении функции мышц в MDX мышей дикого типа штамм C57BL/10ScSnJ должен быть использован, который соответствующего генетического фона. Мы советуем это как даже между инбредных линий дикого типа беговой дорожке производительность отличается 18,19. Но и в неинвазивных функциональных тестов, выполнение функций зависит от генетического происхождения. Рисунок 5 иллюстрирует это в трех представительных графиков, в которых работа MDX мышей на BL/10 фоне и на смешанной фон, состоящий из BL/10, BL/6J, DBA2 и 129OLA сравниваются. Как можно понять смешанные фоновые мышейлучше работать в висячих испытаний проволоки и хуже на rotarod.
Рисунок 1. Передних конечностей силы хвата, показательные результаты и правильное позиционирование лап. А. передних конечностей сцепление прочность нормализованы для массы тела 9 недель назад женской MDX (п = 5) и дикого типа (п = 4) мышей. Сила захвата уже нарушена у молодых MDX мышей. Звездочки указывают р <0,05 и данные представлены в виде среднего значения ± st.dev. Б. усталости одних и тех же лиц, как показано на A, составляла в среднем менее 10% и не менялась между штаммами. С. Для получения надежных данных, внимание должно быть уделено позиционированию лап во передних конечностей расчета на прочность сцепление. Правильное позиционирование мыши; две передние лапы рядом друг с другом, задние конечности аре не касаясь сетки и мышь тянет по прямой Д. Неправильное позиционирование передними лапами;. мышь не тянет по прямой. Когда это происходит, или когда только один переднюю лапу или также задние конечности используются, мышь оборачивается во потянув или не хватает оказать сопротивление, данные должны быть отброшены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Два конечностей висит Тесты, представительства результаты и уместно и неадекватное поведение висит. A. Типичный пример теста две конечности подвесной выполненной один раз в неделю в мужской MDX (п = 18, 4-10 недель, п = 13, 11 и 12 недель, п = 10, 13 недель) и возраст и соответствующего пола мышей дикого типа (п = 6). Обучение будет открыты для обоих штаммов в течение первых нескольких недель тестирования. Выполнение MDX мышей была хуже по сравнению с мышами дикого типа. Данные приведены как среднее ± st.dev. Максимальное время висит разрешено обозначается пунктирной линией. Б. Правильный стартовая позиция этого теста с двумя передними лапами. C. В зависимости от функциональной способности мыши можно также использовать задних конечностей и хвост. D и E. небольшое подмножество мышей, особенно сильные мышей дикого типа, иногда может избежать висит на восхождение на боковых барах или балансируя на проводе. Некоторые мыши намеренно спрыгнуть провода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Четыре конечности висит и rotarod ходовых испытаниях. А. Четыре конечности висит производительность оценивается один раз в неделю в мужской MDX (п = 18, 4-10 недель, N = 13, 11 и 12 недель, п = 8, 13 недель) и дикого типа ( п = 6) мышей. Со временем, MDX мышей повесить менее долго, чем мыши дикого типа. Б. Rotarod работает раз не отличались между молодой мужчина MDX (п = 18, 4-10 недель, н = 13, 11 и 12 недель, N = 10, 13 недель ) и мышей дикого типа (n = 6). Данные представлены как среднее ± st.dev.
Рисунок 4. Влияние принудительного беговой дорожке протокол тренировки по функциональному производительности и скелетных мышц патологии в самок мышей. Мышечная патология была намеренноусугубляется позволяя мыши работать на горизонтальной беговой дорожке три раза в неделю при 12 м / мин в течение 30 мин при длительности 12 недель. Непосредственно после запуска, мыши имели участвовать в две конечности подвесной теста. В то время как все у мышей дикого типа (N = 5) остаются висеть до максимума, все MDX мышей (п = 6) упасть провод ранее (р <0,001, данные, представленные как среднее ± st.dev.). Б. Наличие повреждения мембраны была определена путем оценки креатинкиназы в плазме (CK) уровней, которые вытекать из мышечных волокон сквозь слезы в мембране. Уровни CK были повышены в MDX мышей по сравнению с мышами дикого типа перед тренировкой. Беговая дорожка упражнения сразу повышенные уровни (р <0,01 обозначены звездочками, данных, представленных как среднее ± st.dev.) В MDX мышей, в то время как они оставались на низком уровне у мышей дикого типа. CD. Мышц MDX мышей очень уязвимы к беговой дорожке упражнения, ухудшение патология болезнь широкоосле несколько недель работает. Эти гематоксилин-эозином окрашивания из четырехглавой мышцы 16-недельных nonexercised (С) и беговой дорожке, осуществляемой (D) MDX мыши показывают, что обширный фиброз и некроз разрабатываются. E. Мышцы мышей дикого типа, перенесших тот же протокол бега не затрагиваются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние смешанного происхождения на функциональную производительность в MDX мышей. Различия в генетический фон влияния функциональной производительности. Чтобы проиллюстрировать это, выступление мужского MDX (BL/10 фон, п = 18, 4-10 недель, п = 13, 11 и 12 крошечныйкс, п = 10, 13 недель) и MDX (смешанный BL/10, BL/6J, DBA2 и 129OLA фон, п = 5) мышей по сравнению с течением времени. А. Два тест производительности конечностей висит значительно отличались между двумя штаммами. Б. Четыре результаты испытаний конечностей висит были несколько выше в смешанных фоновых MDX мышей. С. Rotarod время выполнения операций также немного отличались между штаммами. Данные приведены как среднее ± st.dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Функциональные тесты, представленные здесь, воспроизводимым, легко выполнить и применимы к дикого типа и дистрофических мышей независимо от их возраста. Испытания предоставить полезные инструменты для предварительного клинически оценить функцию мышц, силу, состояние и координацию. При тестировании эффектов соединения по естественной истории заболевания, неинвазивные тесты описано здесь (передняя конечность сцепление прочность, как висит тесты и тест rotarod) может быть красиво в сочетании в функциональном тестовом режиме, где эти испытания проводятся на дней подряд . Эти протоколы не наносит ущерба MDX мышей и могут быть использованы в продольном образом 10. Следует иметь в виду, что результаты каждого из этих тестов генерируются разные или частично перекрывающихся групп мышц, а не индивидуальной мышцы. Таким образом, используя комбинацию нескольких тестов рекомендуется получить более полную картину и тем самым лучше разобраться в функциональности экспериментальнымипсихические групп. Кроме того, функциональные улучшения единоличного мышцы можно оценить, используя измерения мышечной физиологии 20.
Как поведенческих тестов, также функциональные тесты могут показать обширную различия между различными мышами, или в пределах мыши между различными оценками. Чтобы уменьшить вариацию, все испытания должны проводиться одним и тем же экспериментатором, который знаком с мышами. Внешние переменные, такие как запахи и звуки в комнате, время суток и день недели, в который проводится испытание должны храниться как можно более постоянным. Мыши должны быть пол и возраст совпадают. При использовании беговой дорожке, чтобы усугубить развитие болезни, очень важно использовать стандартизированный протокол, в котором все работающие параметры (время, скорость и наклон) остаются постоянными в течение долгого времени для всех экспериментальных группах, так что все мыши одинаково лечить. Хотя большинство мышей стремятся участвовать в функциональных проб и большинство животных показывают высокийуровни готовности, некоторые мыши (в первую очередь сильная дикого типа мышей) иногда избежать выполнения поведение тест и показать избегания. Когда такое поведение не корректируется для, ложные выводы можно было сделать 21. К счастью, эти типы поведения наблюдается только изредка и могут быть исправлены в течение с помощью манипулятора мышь обратно на провода, сетки или rotarod или потянув другой раз на метр силы сцепления.
Улучшения в одной функциональной пробы (например, висит с оценкой функции мышц тест) не обязательно должны сотрудничать произойти с улучшениями в другом тесте (передняя конечность сцепление прочность оценки единственным мышечной силы). В MDX мышей, улучшения в функции мышц можно выделить раньше, чем в мышечной силы. Это также наблюдается у пациентов с МДД, участвующих в клинических испытаниях, где клинически значимые улучшения в тесте 6 мин пешком не cooccur с улучшением мышечной силы 6,7. Тем не менее, это можетчастично зависеть от рабочего механизма тестируемого соединения и вполне возможно, что другие соединения повышения прочности и не функцию. Таким образом, результаты испытаний должны быть интерпретированы с механизмом действия соединения в виду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Маргриет Хульскер за ее фотографической содействие и помощь в получении изображения мышей и рецензентов за их очень конструктивные замечания. Эта работа была поддержана ZonMw, лечить-ПРО (номер контракта ЛШМ-КТ-2006-036825) и родительский проект Дюшенна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
