Summary
سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقات الخلوية والجزيئية الأنساب الخلية ومسارات الإشارات المشاركة في تمايز الخلايا واستجلاء مصير وخصائص الخلايا الوليدة.
Abstract
على مدى السنوات العديدة الماضية تم التعرف على سطح حنوني كما محراب جرثومي من أهمية خلال الجنينية، ما حول الولادة والكبار العصبية وgliogenesis، بما في ذلك بعد الاصابة. ومع ذلك، وأساليب للاستجواب وراثيا هؤلاء السكان السلف وتتبع الأنساب الخاصة بهم كان محدودا نظرا لعدم وجود خصوصية أو تستغرق وقتا طويلا إنتاج الفيروسات. وبالتالي، فقد كان التقدم في هذه المنطقة بطيئة نسبيا مع عدد قليل من التحقيقات في هذا الموقع. وقد استخدم التثقيب الكهربائي لأكثر من عقد لدراسة خصائص الخلايا الجذعية العصبية في الأجنة، ومؤخرا في الدماغ بعد الولادة. نحن هنا وصف تقنية فعالة وسريعة، وبسيطة للتلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني استنادا إلى نهج التثقيب الكهربائي تكييفها. حنوني التثقيب الكهربائي سطح يسمح لوضع العلامات الوراثية السطحية والتلاعب من هذه الأسلاف، وبالتالي تمثل منهجا لتوفير الوقت واقتصادية لدراسة هذه الخلايا.
Introduction
الخلايا الجذعية والسلف العصبية موجودة في جميع أنحاء الثدييات CNS 1، 2. طبيعة وخصائص في مناطق جرثومي الجنينية والكبار المحيطة المناطق البطين من الدماغ والحبل الشوكي التي تم توثيقها على نطاق واسع في العقد الماضي 1-3. في جزء كبير منه، وكان هذا نتيجة لتطور أدوات الجينية على نحو متزايد دقيقة، مثل الجهاز العصبي محددة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية الأليلات floxed أو النسب فيروسات تتبع 4. ومع ذلك، المنطقة سلف واحد الفحص الشامل لديه منطقة حنوني السلف السطح فقط في الآونة الأخيرة وصفها بأي قدر من التفصيل 5-7 وينتظر.
يتم تعريف سطح حنوني من الدماغ كواجهة بين سطح الدماغ والسحايا المحيطة 8. خلال التنمية، الظهارية العصبية و، في وقت لاحق، قدم نهاية شعاعي الدبقية نعلق على هذا السطح 9،10. بعض التنوبويلاحظ الخلايا العصبية في الدماغ الواحد والإنسان والعديد من mitoses الخلايا العصبية في هذه المنطقة 11. في وقت لاحق، خلال تكوين الخلايا العصبية الجنينية، ومن المعروف interneurons القشرية لاجتياز المنطقة حنوني، بالإضافة إلى طرق الهجرة في منطقة المتوسط ومنطقة subventricular 12-14. خلال هذه الفترة، والخلايا الجذعية يمكن تربيتها من هذه المنطقة، ويبدو أن يكون موقع نشط من العصبية وgliogenesis 5. في الدماغ الكبار، فقد أفيد أن interneurons يمكن أن يولد من الأسلاف سطح حنوني التالية التحدي ميتة 7. ومع ذلك، فقد ظلت مساهمة هذه المنطقة إلى بلده لgenensis أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة غامضا ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة تحديدا التحقيق في هذه المنطقة 6. في أكيمة متفوقة وفي القشرة الدماغية، قد interneurons سطحية (أو طبقة أنا في القشرة) تعدل دائرة الانتاج من السكان الكامنة الخلايا العصبية مثير، وبالتالي المساهمة significantly إلى وظيفة هذه الهياكل. على وجه الخصوص، طبقة 1 interneurons في موقف رئيس لتنظيم إطلاق الخلايا العصبية في جميع أنحاء الطبقات العليا من القشرة المخية نظرا التواصل فيما بينها واسعة إلى الطبقات السطحية والعميقة من الأعمدة القشرية 15،16. بطريقة مماثلة، وتلقي interneurons الأفقي المدخلات مثير من الألياف القشرية وشبكية العين، مشروع على مساحة واسعة نسبيا ويتم المضاربة للتوسط تثبيط السكان العصبية الاستجابة للمحفزات البصرية البعيدة 17،18. أيضا، مورفولوجيا بهم هو مناسبة تماما للعب دور محتمل في النشاط موجة منقوشة في النظام البصري النامية 19. ومن المثير للاهتمام، والتنمية عصبون والنضج يحدث إلى حد كبير بعد الولادة. علاوة على ذلك، تم العثور على هذه العملية النضج إلى أن ينظم نشاط الخلايا العصبية وبالتالي فهي ركيزة من اللدونة التنموية مع عواقب مدى الحياة على حلبة ظيفة 20،21. والجدير بالذكر أن نموصوفة س المروجين والتي يمكن أن تستهدف بشكل خاص هذه الخلايا transgenically. يمكن أن تستهدف تقسيم الأسلاف مع الارتجاعي 7 ولكن الإنتاج الفيروس هو مضيعة للوقت وتتطلب مهارة لانتاج التتر عالية اللازمة لتنبيغ الخلية.
وقد أدى التثقيب الكهربائي إلى نهضة في دراسة النمو العصبي لأنه يسمح للاستجواب الوراثية السريع والفعال للمسارات الإشارات العصبية في الأسلاف 4، 22، 23. التثقيب الكهربائي ينطوي على حقن الحمض النووي البلازميد، تليها إيصال النبضات الكهربائية إلى الخارج من الرأس، لدفع unidirectionally الحمض النووي في الأسلاف المتكاثرة المحيطة البطينين 4، 22، 23. يبدو التثقيب الكهربائي يتطلب العبور من الخلايا من خلال المرحلة M من دورة الخلية للتعبير عن الجينات المحورة البلازميد 24. على وجه التحديد، وقد وجد أن فقطوالخلايا التي تمر عبر مرحلة M في غضون 8 ساعة من التثقيب الكهربائي من البلازميدات التعبير عن الجينات المحورة على الرغم من التنفيذ الفعال لجميع الخلايا داخل ~ 160 ميكرون من جدار البطين 24. وتكهن بأن هذا يرجع إلى الحاجة إلى المغلف النووية انهيار في السماح للوصول النووية من البلازميدات episomal، والمواد الكيميائية التي تسبب permeabilization النووية يمكن أن تحفز التعبير عن البلازميدات في خلايا آخر الإنقسامية 25. يعملون أصلا في الجنين 22، تم تكييفها للاستخدام التثقيب الكهربائي في الدماغ ما بعد الولادة في وقت لاحق من ذلك بكثير 26، 27. في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت التثقيب الكهربائي لاستخدامها في التلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني 6. علاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج أظهرنا أن هناك على ما يبدو اثنين الأنساب متميزة من الأسلاف في هذه المنطقة interneuronal ونجمي 6. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة، وقوية لاستهداف هذه الخلايا للاستجوابتطوير آليات تنظيم هذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا الإجراء هو وفقا لمتطلبات سيناي IACUC. يجب أن المحققين ضمان الامتثال IACUC المؤسسية قبل المتابعة. ويجب تعقيم جميع الأدوات والكواشف قبل استخدامها.
1. إعداد أدوات، حلول، وخليط الحمض النووي
- إدراج 100 ملم البورسليكات النار مصقول أنابيب زجاجية الشعرية في مجتذب micropipette. تعيين التدفئة للسماح للسحب المرجح القياسية لتشكيل غيض من ماصة ما يقرب من 17.5 ملم. قطع نصائح مع مقص جراحي حادة على مسافة حوالي 8-9 ملم من بداية تلميح لإنشاء ما يقرب من 100 ميكرون قطرها الافتتاح.
- جعل الأسهم 1٪ ث / ت حل سريع الخضراء عن طريق خلط تصفية nuclease خالية من المياه (باستخدام فلتر حقنة 20 ميكرون) مع الأخضر سريع الجفاف.
- عزل النقاء خالية من الذيفان الداخلي الحمض النووي البلازميد الذي يتركز إلى حد كبير (أي> 3 ميكروغرام / ميكرولتر)، مخففة في تريس، EDTA (TE) العازلة. إضافة كميات المطلوب من البلازميدإلى خليط المخفف في TE العازلة وإضافة نسبة من 1٪ 01:10 الحل الأخضر سريع (صنع 0.1٪ ث / ت تركيز النهائي من اللون الأخضر سريع). استخدام تركيز النهائي 0.5-2.0 ميكروغرام / ميكرولتر من البلازميد للتعبير قوية من الجينات المحورة.
2. تخدير الحيوان، ماصة جاري التحميل، وحنوني السطح البلازميد حقن
- لحث التخدير انخفاض حرارة الجسم على 1-2 يوم الفئران بعد الولادة عن طريق وضعها على طبق بيتري التي يتم وضعها على الجليد لمدة 5-8 دقائق (الوقت يعتمد على عمر الجرو / الوزن). بمجرد تأكيد انخفاض حرارة الجسم بسبب نقص الحركة من و / أو معسر أخمص القدمين الذيل المنعكس، والفئران جاهزة للحقن. وضع الحيوانات على الجليد مرة أخرى إذا ألم وردود الفعل واضحة. إجراء الحقن و electroporation يستغرق أقل من دقيقة 2-3 في مجموع ذلك الوقت انخفاض حرارة الجسم، والحقن، والإجراءات التثقيب الكهربائي وفقا لذلك للحفاظ على التخدير المناسبة.
- أثناء التخدير، وذلك باستخدام ماصة القياسية، ماصة بعناية المطلوب مبلغ plasmiد المزيج ليتم حقنه (0.5-2 ميكرولتر) على قطعة من الفيلم شمع البارافين لتكون مرجعا. هنا، يتم حقن إجمالي حجم 0.5 ميكرولتر من مزيج البلازميد. المقبل، وذلك باستخدام محقن الصغيرة، إدراج بعناية تجميعها ماصة الزجاج الشعرية في أنبوب يحتوي على خليط البلازميد. اتخاذ الاحتياطات إضافية لمنع غيض من كسر عن طريق التأكد من أنها لا تلمس حواف أنبوب. نضح الحل في ماصة عن طريق الاتصال برقم ببطء مرة أخرى الاتصال الهاتفي نقل. مرة واحدة تم تحميل حجم كاف في ماصة، والاتصال الهاتفي إلى الأمام حتى يعود الضغط إلى موقف محايد من 0 HPA.
- باستخدام 300-450 HPA الضغط للحقن لضمان الضغط المناسب لملء حتى سطح / الفضاء سحائي حنوني، ضع طرف بالقرب من pipetted حقن شمع البارافين المرجعية فيلم (من 2.2) واستخدام دواسة القدم من حاقن الصغرى لإخراج واحد حجم الفيلم على شمع البارافين. ضبط الضغط وفقا لذلك حتى مبلغ يساوي طرد الاشارة pipetted سابقاحجم البريد.
- مرة واحدة وقد تم معايرتها غيض، وقد أكدت التخدير، الجراء جاهزة للحقن.
- الهدف من التجربة هو لحقن مزيج البلازميد تحت الجمجمة وفوق سطح حنوني للسماح ل electroporation الحمض النووي نزولا إلى الأسلاف سطح حنوني (الشكل 1A). لحقن القشرة، مع الاستمرار على الجرو أسفل باستخدام الإبهام والسبابة من اليد أقل هيمنة. نصفي الكرة الأرضية القشرية وهياكل سطحية أخرى مثل أكيمات متفوقة واضحة بين P0 و P2، والسماح لاستهداف السهل من هذه الهياكل (الشكل 1B). باستخدام اليد والهدف المهيمنة في المنطقة المرجوة من القشرة (أي الحركية، الحسية الجسدية، الخ)، وإدراج ماصة الماضية الجلد والجمجمة مع الحرص على تجنب الشرايين الدماغية. تأكد لمنع أي اختراق مزيد من غيض الماضي الجمجمة (التي دلت على عدم وجود مزيد من المقاومة بعد ثقب الجمجمة).
- حقن البلازماحل معرف باستخدام دواسة القدم لحاقن الصغرى وتأكد من أنه يشتت بالتساوي على (2A الشكل) الأنسجة.
ملاحظة: من المهم جدا لتحديد تجريبيا النهج الذي يعظم تسليم البلازميد مع تجنب الورم الدموي بسبب ضغط السائل. ويمكن أن يتم هذا من خلال تعديل مدة الحقن، زاوية، وحجم، وموقع الهدف بدقة لتجنب اضطراب في الأوعية الدموية. - تأكد من محاولة الحفاظ على غيض من الجفاف في بين الحقن عن طريق وضع قطرات طرف في اختبار من الحقن التي سبق على ورق الشمع أو البارافين فيلم البلاستيك. هذا مطلوب لمنع تراكم رأس تبخرت وتبلور حل الحمض النووي، والتي يمكن أن تؤدي إلى انسداد من طرف وحدات التخزين والتسليم غير متناسقة.
3. التثقيب الكهربائي
- تعيين Electroporator إلى 135-150 V لمدة خمس البقول ودائم 50 ميللي ثانية، مع 950 ميللي ثانية في فترات بين كل نبضة. من أجل زيادة تصرف ومنع حرق الجلد، وتغطي 3 ملم tweezertrodes البلاتين مع جل التثقيب الكهربائي. تحقق من وجود ردود الافعال-معسر أخمص القدمين والذيل في هذه المرحلة لضمان التخدير. إذا استجابة، ضع على الجليد لعدة دقائق لتخدير.
- لقشرة (وأكيمة متفوقة) الحقن، توظيف 3 ملم القطب (الشكل 2B) لزيادة قابلية الجراء (بالمقارنة مع 7 - وأقطاب 10 ملم، والتي تستخدم ل electroporation منطقة البطين). وضع مسبار سالبة الشحنة من القطب فوق المنطقة المحقونة والتحقيق المشحونة إيجابيا في جميع أنحاء المنطقة المقابل تحت العين بحيث توجه القطب هو في 45-60 درجة زاوية بالنسبة إلى خط الوسط (الشكل 2C).
- استخدام دواسة القدم من electroporator لتحريك الحالية وعقد tweezertrodes في المكان لمدة 3-5 البقول، اعتمادا على العمر والوزن الجرو، واستهداف الحمض النووي على نحو فعال إلى خلايا سطح حنوني الأساسية عند المحاسبة عن انحناءمن نصفي الكرة الأرضية.
ملاحظة: يمكن اجتاحت القطب السالب فوق منطقة الحقن في بين النبضات أو يمكن استخدام القطب أكبر لزيادة مساحة electroporated. - مباشرة بعد التثقيب الكهربائي، وتنظيف بعناية قبالة هلام من الجراء ووضعها تحت مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق تقريبا.
- الجراء سوف تفقد تماما الوردي المحمر هوى الطبيعية في دقائق بعد التثقيب الكهربائي بسبب زرقة. مراقبة الجراء لاستعادة اللون الطبيعي وبدء الحركة الطبيعية قبل إعادتها إلى أقفاصها.
- ضمان إعادة التنشئة الاجتماعية مع الأم من خلال مراقبة ما اذا كانت يجلب الجراء العودة إلى العش ويبدأ الاستمالة لهم. إذا كانت تصبح عدوانية، وجعل الجراء متأكد لم يكن لديك بقايا جل واحتضان لهم مع بعض من الفراش لنقل رائحة لالجراء.
4. تعديلات لاستهداف أكيمات متفوقة
الاستهداف:
- Injeط أكيمة متفوقة في نفس منوال القشرة لكن لاحظ أن المنطقة المستهدفة تقع على بعد الخلفية والجانبية لامدا وتقريبا في خط الوسط (أرقام 3A 3B و). مع حقن ناجحة، هذا المزيج البلازميد بشكل طبيعي يملأ ملامح أكيمة متفوقة. مرة واحدة تم إجراء الحقن بنجاح، الحيوانات مستعدون ل electroporation.
التثقيب الكهربائي:
- بطريقة مشابهة جدا، لحقن أكيمة متفوقة، ووضع مسبار سالبة الشحنة من القطب فوق المنطقة المحقونة والتحقيق موجبة حول العين، خطم أو الذقن، والقيادة الحمض النووي في المناطق السطحية للأكيمة متفوقة (الشكل 3C) . في هذه الحالة، فإن التوجه هو القطب في 25-40 درجة زاوية بالنسبة إلى خط الوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حنوني السطح نتائج التثقيب الكهربائي في التعبير من الحمض النووي البلازميد في الخلايا معظمهم من الأسلاف، عند أو بالقرب من سطح حنوني 6. وبشكل أكثر تحديدا، واتجاه الأقطاب أمر بالغ الأهمية في فرض اتجاه حركة البلازميد والتعبير اللاحقة. وهكذا، في تكوينات القطب المزدوج، يتم توجيه البلازميد في حوالي متجه مباشرة بين القطب السلبي والإيجابي. لذلك، إذا تم وضع القطب السالب على موقع الحقن والقطب الموجب هو بطني إلى القطب السالب، ستضطر البلازميد في سطح حنوني. فمن المفترض أن توجيه الأقطاب لإنتاج ناقلات الحالية عمودي على سطح سيكون الأكثر مثالية. مع التوجه الكهربائي المناسبة واستخدام أصغر، الأقطاب أكثر استهدافا الوزراء البريطانى، البقاء على قيد الحياة بنسبة 100٪. ومع ذلك، في بعض المناطق، مثل الدماغ المتوسط، والرعاية لابد من اتخاذها لتجنب تسليم الحالية التي قد يتوقف القلب، وبالتالي مركز دراسات الوحدة العربيةالبريد الإقلال من الجراء الماوس electroporated. تكوينات ثلاثي القطب صفها حديثا أو تعديلات أخرى قد تساعد في استهداف مناطق أكثر صعوبة من خلال تجنب الهياكل المعنية في الوظائف الحيوية مثل معدل ضربات القلب 28. فمن المهم لمشاهدة الجراء لمناسبة إعادة الاحترار إلى درجة حرارة أجسامهم الطبيعية، وهي واضحة من قبل الحركة واللون. عند عودتهم إلى اللون، يمكن وضعها مرة أخرى في العش. الأمهات من CD1 سلالة من الفئران أننا في أغلب الأحيان توظف تبدأ على الفور رعاية الجراء التي تم إرجاعها. ومع ذلك، يمكن أن يكون أكثر سلالات أخرى متغيرة، وأصبحت عدوانية أو الإهمال. نقل رائحة الفراش إلى الجراء عادة يمنع هذه القضايا. في سلالات حيث الإهمال أو العدوان شديدة، وتعزيز الجراء للأمهات من سلالة CD1 هو الحل الأفضل.
ويلاحظ الخلايا المسمى عادة عدة أشهر بعد التثقيب الكهربائي 6. ومع ذلك، كما هو الحال مع أي شطريقة ectroporation، البلازميد الحمض النووي يخفف مع انقسام الخلية 29. ولم يلاحظ نفس الدرجة من البلازميد التخفيف ينظر في السكان وركوب الدراجات بسرعة (على سبيل المثال الأسلاف SVZ) في عدد السكان سطح حنوني لدينا، مما يشير إلى انتشار أقل 6. ومع ذلك، نحن الآن توظيف التقنيات تبديل وصف مؤخرا (مثل piggyBac) للتخفيف من حدة هذه المشكلة عن طريق السماح للتخفيف تماما عن الإدراج مستقرة من ترانسبوزونات في الحمض النووي الجيني 29، 30. بدلا من ذلك، يمكن electroporated لجنة المساواة العرقية البلازميدات Recombinase، معربا عن لجنة المساواة العرقية في الفئران مراسل للتوسط تتبع جينية مستقرة من هذه الخلايا 31.
وقد اقترح نتائجنا الأولية أن غالبية خلايا لدينا هي الإنقسامية في وقت التثقيب الكهربائي 6، وذلك تمشيا مع البيانات الموضحة في الجهاز العصبي المركزي الجنينية على وجه التحديد، أن التثقيب الكهربائي تسميات مجموعة من الخلايا المتكاثرة بين S و M من مراحل دورة الخلية 24. ومع ذلك، هناك حاجة إلى إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد هوية والأنساب من الخلايا electroporated على سطح حنوني وكذلك للتأكد بشكل قاطع الطابع التكاثري بهم كما أن هناك العديد من المواد الكيميائية المثال زائفة ووضع العلامات الوراثية للخلايا في الأدب 4. وعلاوة على ذلك، لاحظنا موقع الحقن المحلية لم تتخذ ورم دموي، خصوصا في القشرة عندما الحرص على تقديم كميات صغيرة أو عندما لم يتم اتباع الاحتياطات المناسبة لتجنب اضطراب في الأوعية الدموية.
لدينا توصيف السابقة يشير إلى اثنين على الأقل من الخلايا الأنساب - السلائف نجمي والأسلاف عصبون 6. الخلايا النجمية تميل إلى البقاء في حنوني السطح (الشكل 4A) وكل خلية يشكل سحابة كثيفة من نجمي الطرفية العمليات 6. تبقى Interneurons معظمها على سطح حنوني ولكن بعض الخلايا يمكن العثور عليها في ما يقرب من جميع الطبقات القشرية أو أعمق في أكيمة متفوقة 6. الالخلايا العصبية جنوب شرقي يحمل التشعبات واسعة النطاق، والتي يمكن أن يكون طالما عدة مئات من ميكرون (الشكل 4B). وقد لاحظ أننا لا أدلة لوسم قليلة التغصن أو الخلايا العصبية في القشرة مثير 6. تظهر غالبية خلايا electroporated أن مرت من خلال الانقسام في القرب الزماني بالقرب من القشرة EP الإجراء 6. على وجه التحديد، electroporated EGFP + الخلايا المسمى مزدوجة مع تكرار الحمض النووي علامة BrdU عندما نابض 2 ساعة قبل مع هذا التماثلية ثيميدين (أرقام 4C-4C 3). ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن رأينا أدلة على وضع العلامات خلية pericytic و / أو البطانية في هذه المناطق 6.
الشكل 1. التثقيب الكهربائي للسطح حنوني حديثي الولادة (A) القسم الاكليل التخطيطي تبين المنطقة من القشرة التي تستهدف على الحقن. عرض الخلايا على طول طبقات من القشرة هي أمثلة على السكان مختلطة الملاحظة الفعلية للخلايا electroporated، بما في ذلك الأسلاف interneuronal والسلائف astrocystic. (ب) صورة من بعد الولادة يوم 2 الماوس قبل الحقن، تحدد المناطق ذات الاهتمام سطح حنوني، والقشرة (CTX) وأكيمة متفوقة (SC).
الشكل 2. التثقيب الكهربائي بعد الولادة من القشرة السطحية (A) حقن مثال على القشرة الظهرية بعد استهداف نقطة الوسط بين العين وامدا، قبل التثقيب الكهربائي. (B) اعتمادا علىسن الجراء والمنطقة من اهتمام والمرونة أحجام متنوعة من tweezertrodes البلاتين يمكن استخدامها ل electroporation (3 ملم و 7 ملم و 9 ملم). وعادة ما تستخدم 3 ملم أقطاب قطر ل electroporation سطح حنوني (انظر النص للمناقشة). (C) التثقيب الكهربائي للقشرة. ملاحظة موضع tweezertrodes، ووضع مسبار إيجابية تحت العين، والسماح الحالية لتكون مدفوعة إلى الجانب البطني.
الرقم 3. أكيمة متفوقة استهدفت التثقيب الكهربائي بعد الولادة (A) حقن الجرو 2 يوما القديمة في أكيمة متفوقة، والتي تبين من ضبط النفس دليل الجرو تخدير ووضع غيض ماصة أبعد من مجرد الجمجمة. (ب) حقن تبين بلازما فرقتالحل الحمض النووي معرف في المنطقة من أكيمة متفوقة (SC). (C) الموضع من tweezertrodes ل electroporation من SC، والقيادة الحمض النووي نحو السطح الظهري للSC في موقع الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. أكيمة متفوقة استهدفت التثقيب الكهربائي بعد الولادة (A) أون الوجه، وإسقاط الحد الأقصى لصورة متحد البؤر مداخن من القشرة ظهراني بعد ~ 2 أسابيع التثقيب الكهربائي السيطرة البلازميدات مراسل الفلورسنت معربا عن البرسيم 32 (الأخضر) وTagBFP2 33 البروتين النووي (الأزرق مضان الموسومة الغشاء ملاحظةeudocolored الحمراء). (ب) القسم الاكليل من عصبون القشرية تقريبا شهرين بعد electroporation، وعرض التشعبات واسعة النطاق. قضبان نطاق قياس 100 ميكرومتر في (A، C) و 40 ميكرون في (B). (CC 3) قسم سهمي من سطح حنوني من أكيمة متفوقة مما يدل على أن غالبية EGFP + الخلايا وصفت من قبل نبضة واحدة من BrdU 2 ساعة قبل التثقيب الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجانب الأكثر أهمية ل electroporation ناجحة من الأسلاف سطح حنوني هي: 1) استهداف مزيج البلازميد إلى سطح حنوني؛ 2) تجنب توليد القيلة في موقع الحقن؛ و 3) تجنب الوفيات المرتبطة التثقيب الكهربائي الدماغ المتوسط.
تستهدف بشكل مناسب سطح حنوني يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس تعطيب وحذرا من الجمجمة لتجنب الاختراق من سطح حنوني. استهداف غير لائق على الجلد المغطي أو البطين الكامنة أو حمة الدماغ سوف يتضح من: 1) تشريد الصبغة الخضراء سريع مع الجلد على فرك بلطف الأنسجة (أي أخضر سريع المترجمة فوق الجمجمة في الجلد والنسيج الضام) أو 2) من خلال اختفاء الصبغة الخضراء بسرعة إلى الدماغ، مشيرا إلى أن هذا المزيج البلازميد قد ذهب إلى البطين و / أو حمة. سيتم يتضح حنوني السليم توطين سطح المزيج البلازميد عن طريق تراكم الصبغة تحت الجمجمة عشرفي لا يمكن منزعج من طيف النزوح الجلد. ومع ذلك، هناك حاجة الممارسة والبراعة لهذا الاستهداف الناجح. الأرجح هو سبب تشكيل ورم دموي بسبب عرقلة الأوعية الدموية عن طريق الحقن البلازميد. وسيراعى في جلطات الدم في موقع الحقن في الأيام والأسابيع التالية التثقيب الكهربائي عندما يتم جمع الأنسجة. لتجنب القيلة، وضبط طول نبض حقن السوائل و / أو الإحاطة علما النمط العام للالأوعية الدموية الدماغية لتجنب تعطل السفينة. بشكل عام، وأكيمة متفوقة هي أقل عرضة للتخثر. يتم تجنب الوفاة بسبب التيار الكهربائي الذي ألقاه tweezertrodes بسهولة باستخدام 3 مم tweezertrodes لتقديم المزيد من الوزراء البريطانى الحالية وعن طريق توجيه الأقطاب بعيدا عن الدماغ المتوسط بطني كما هو موضح (أرقام 2C و 3C).
A كبير من القصور والتقنية هي أن المنطقة المستهدفة محدودة بسبب حجم انتشار حل البلازميدوحجم الأقطاب. A تسليم 0.5 ميكرولتر من البلازميد يولد مساحة حوالي 3 ملم، وبالتالي، هي المتطابقة جيدا إلى 3 ملم حجم القطب. أيهما مقياس أصغر (منطقة انتشار حل أو منطقة القطب مجداف) سوف تملي الحجم النهائي للرقعة من خلايا electroporated. أيضا، وصفت مجموعة فرعية فقط من الخلايا بسبب الحاجة إلى الانقسام لالتحوير التعبير 24. ومع ذلك، وهذا هو مفيد لدراسة الجذعية أو السكان السلف وتمايز الخلايا.
حنوني التثقيب الكهربائي السطح هو أسلوب يسمح للتلاعب الجيني قوية من الأسلاف سطح حنوني وذريتهم. هذا الأسلوب هو السريع، بسيطة، وفعالة، وتوفير وسيلة أكثر تحديدا وأسهل من استهداف هذه الخلايا بالمقارنة مع النهج فيروسات أخرى مماثلة تنبيغ فقط. ارتفاع عيار الانتاج الفيروسية يأخذ مهارة أو أسابيع من الزمن، ويشكل مخاطر السلامة - وخاصة في حالة pseudot شمولي التوجهالارتجاعي yped. علاوة على ذلك، التثقيب الكهربائي إلى حد ما أكثر مرونة لأنها لا تتطلب الاستنساخ وإنتاج الفيروسية. ويمكن استخدام أي حقيقية النواة ناقلات التعبير، بما في ذلك البلازميدات الفيروسية. علاوة على ذلك، البلازميدات maxiprep إد يمكن أن تكون مختلطة والمتطابقة لسهولة التعاون التثقيب الكهربائي. عادة، هناك 90-95٪ ~ شارك في التعبير عن أي اثنين البلازميدات تعطى مع المروجين مماثلة. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أننا قد استخدمت هذه التقنية فقط في استهداف القشرة وأكيمة متفوقة، ينبغي أن تكون قابلة للطريقة معظم المناطق حنوني أو سطحية من الجهاز العصبي المركزي في بشرط أن يكون هناك مساحة لتراكم المحلية من الحمض النووي البلازميد قبل تسليم الحالي .
التثقيب الكهربائي بطبيعته يميل لصالح تنبيغ الخلايا الإنقسامية 24. وبالتالي، يجب أن يكون التثقيب الكهربائي من الحيوانات البالغة ممكنا ولكن من شأنه أن يؤدي على الأرجح في العديد من الخلايا أقل تعبير عن الجينات المحورة نتيجة لانخفاض النشاط التكاثري مع الشيخوخة. ومع ذلك، كما مفصل مؤخرا Jaubodinوالزملاء، واستهداف الخلايا تالية للتفتل في هذه المنطقة قد يكون ممكنا من خلال توظيف عبر الهكسان الحلقي-1، 2 - ديول، والذي يسمح للوصول البلازميد النووية permeablilizing المغلف النووية 25. أيضا، التثقيب الكهربائي هو متوافق جدا مع الكثير من التكنولوجيات لجنة المساواة العرقية أو أنواع الماوس الأخرى هندسيا 31. أخيرا، سوف تسمح التكنولوجيا ينقول لنقل الجينات الجسدية مستقرة من هذه الفئة من السكان 29 و 30. تماما، التثقيب الكهربائي سطح حنوني يمثل أداة متميزة ومرنة للتلاعب الجيني لهذه المجالات السلف فريدة من نوعها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من جائزة صموئيل Oschin الشامل منتدى معهد أبحاث السرطان السرطان فضلا عن أموال من معهد الطب التجديدي في سيناي، وغيران الأسرة. وأيد المشروع هو موضح في شكل كور قسيمة CTSI بتمويل من المركز الوطني للبحوث الموارد، منحة UL1RR033176، والآن في المركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم، منحة UL1TR000124. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
