Summary
Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.
Abstract
In den vergangenen Jahren ist der Pia-Oberfläche wurde als Keim Nische von Bedeutung bei der Embryonalentwicklung, perinatale und Erwachsenen Neuro-und Gliogenese identifiziert worden, darunter nach der Verletzung. Allerdings Verfahren zur genetischen Abfrage diese Vorläufer Bevölkerung und die Verfolgung ihrer Abstammungslinien beschränkt hatte aufgrund einer mangelnden Spezifität oder zeitaufwendig Produktion von Viren. So hat die Fortschritte in diesem Bereich mit nur einer Handvoll von Untersuchungen dieser Lage relativ langsam. Elektroporation ist seit über einem Jahrzehnt in der postnatalen Gehirn eingesetzt, um neurale Stammzelleigenschaften im Embryo zu studieren, und in jüngerer Zeit. Hier beschreiben wir eine effiziente, schnelle und einfache Technik für die genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläuferzellen auf Basis eines angepassten Ansatz Elektroporation. Pia-Oberfläche Elektroporation ermöglicht einfache genetische Kennzeichnung und Manipulation dieser Vorläuferzellen und damit zu einer zeitsparende und wirtschaftliche Lösung für das Studium dieser Zellen.
Introduction
Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen sind in der gesamten Säugetier-ZNS-1, 2. Art und Eigenschaften der embryonalen und adulten Keimzonen um die ventrikulären Regionen des Gehirns und des Rückenmarks sind ausführlich in den letzten zehn Jahren 1-3 dokumentiert. Zum großen Teil ist dies auf die Entwicklung von immer präzise genetische Werkzeuge, wie das Nervensystem spezifische Cre Rekombination von floxed Allele oder retroviral-Linie 4 Verfolgung gewesen. Allerdings ist eine Vorläuferregion-Pia-Oberfläche der Vorläufer-Zone hat erst vor kurzem im Detail 7.5 beschrieben und erwartet umfassende Untersuchung.
Der Pia-Oberfläche des Gehirns wird als die Schnittstelle zwischen der Oberfläche des Gehirns und der Hirnhaut umgebenden 8 definiert. Während der Entwicklung neuroepithelialen und später radiale Gliazellen Ende Füßen befestigen zu dieser Fläche 9,10. Einige der Tannest Neuronen im Gehirn und viele neuronale Mitosen in diesem Bereich 11 beobachtet. Später, während der embryonalen Neurogenese, kortikale Inter sind bekannt, die Pia-Region durchqueren, zusätzlich zu ihren Migrationsrouten in der Zwischenzone und Subventrikularzone 12-14. Während dieser Zeit können Stammzellen aus diesem Bereich kultiviert werden, und es scheint eine aktive Stelle des Neuro-und Gliogenese 5 sein. Im erwachsenen Gehirn, wurde berichtet, dass Inter kann von Pia-Oberfläche Vorfahren folgenden hypoxischen Herausforderung 7 geboren werden. Allerdings ist die Beteiligung der Region an, um seine während der embryonalen und postnatalen Entwicklung genensis hat obskuren Teil auf die Schwierigkeit, die speziell der Untersuchung dieser Region 6 geblieben. In den Colliculus superior und in der Großhirnrinde kann oberflächlich (oder Schicht I in der Rinde) Inter den Schaltungsausgang der zugrunde liegenden erregenden Neuronenpopulationen zu modulieren und damit beitragen significantly der Funktion dieser Strukturen. Insbesondere sind Schicht ein Inter in bester Lage, das Feuern von Neuronen in den oberen Schichten der Hirnrinde angesichts ihrer umfangreichen Konnektivität zu den oberflächlichen und tiefen Schichten der kortikalen Säulen 15,16 regulieren. In ähnlicher Weise erhalten horizontalen Inter erregenden Input von kortikalen und Netzhautfasern, Projekt über einen relativ weiten Bereich und spekuliert auf die Hemmung der neuronalen Populationen Reaktion auf visuelle Reize Fern 17,18 vermitteln. Auch ist ihre Morphologie gut geeignet, um eine mögliche Rolle in der strukturierten Wellenaktivität in den Entwicklungs visuelle System 19 spielen. Interessanterweise Intern Entwicklung und Reifung geschieht zu einem großen Teil postnatal. Ferner kann dieser Reifungsprozess wurde festgestellt, durch neuronale Aktivität reguliert werden und ist somit ein Substrat der Plastizität mit lebenslangen Folgen für Schaltungsfunktion 20,21. Insbesondere no Promotoren beschrieben, die gezielt können diese Zellen transgen. Die Aufteilung Vorfahren mit Retrovirus 7 richtet werden, aber die Virusproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Geschick, um die hohe Titer für die Zellübertragung notwendig ergeben.
Elektroporation hat zu einer Renaissance in der Studie der Entwicklung des Nervensystems geführt, wie es ermöglicht eine schnelle und effiziente Abfrage der genetischen Signalwege in neuronalen Vorläuferzellen 4, 22, 23. Die Elektroporation umfasst die Injektion von Plasmid-DNA, gefolgt von der Abgabe von elektrischen Impulsen an die Außenseite des Kopfes, um in einer Richtung in die proliferierenden Vorläuferzellen umgibt die Kammern 4, 22, 23 treiben die DNA. Elektroporation scheint Transitzellen durch M-Phase des Zellzyklus für die Expression von Transgenen Plasmid 24 erforderlich. Insbesondere wurde gefunden, dass nurZellen, die durch M-Phase innerhalb von 8 Stunden der Elektroporation von Plasmiden wird Transgene trotz ihrer wirksamen Zustellung an alle Zellen innerhalb von ~ 160 um der Kammerwand 24 zum Ausdruck bringen. Es wird spekuliert, dass dies in Berücksichtigung Kern Zugang der episomalen Plasmiden aufgrund der Notwendigkeit für die Kernhülle Bruch, Chemikalien verursacht Kern Permeabilisierung kann die Expression von Plasmiden, die in der Post mitotischen Zellen 25 zu induzieren. Ursprünglich in der Embryo-22 verwendet, Elektroporation wurde für den Einsatz in der postnatalen Gehirn viel später 26, 27 angepasst. Kürzlich haben wir Elektroporation zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläufer 6 angepasst. Weitere, mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass es offenbar zwei verschiedene Linien der Vorfahren in dieser Region und Astrozyten-intern 6. Dieses Protokoll Details eine einfache, schnelle und leistungsfähige Methode, um diese Zellen für die Abfrage Zielder Mechanismen, die Entwicklung dieser Zellen.
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Protocol
Dieses Verfahren ist in Übereinstimmung mit Cedars-Sinai IACUC Anforderungen. Die Ermittler sollten institutionelle IACUC Einhaltung zu gewährleisten, bevor Sie fortfahren. Alle Werkzeuge und Reagenzien sollten vor der Verwendung sterilisiert werden.
1. Vorbereitung der Werkzeuge, Lösungen und DNA-Gemisch
- Legen Sie 100-mm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller. Stellen Heizung für Standard-gewichtete Pull ermöglichen Pipettenspitze von ca. 17,5 mm bilden. Schneiden mit scharfen Spitzen chirurgische Schere in einem Abstand etwa 8-9 mm von Anfang an der Spitze auf rund ein Mikrometer Durchmesser Öffnung 100 erstellen.
- Es wird in eine Aktien 1% w / v schnelle grüne Lösung durch Mischen gefiltert Nuklease-freies Wasser (unter Verwendung eines 20-um-Spritzenfilter) mit trockenem schnell grün.
- Isolieren gereinigtes Endotoxin-freiem Plasmid-DNA, die hoch konzentriert ist (dh> 3 ug / ul), in Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnt. In gewünschten Mengen Plasmid-Mischung, um in TE-Puffer verdünnt und fügen eine 1:10-Verhältnis der 1% schnell grün-Lösung (Herstellung einer 0,1% w / v Endkonzentration von schnell grün). Verwenden Sie ein 0,5-2,0 ug / ul Endkonzentration von Plasmid für die Expression von Transgenen robust.
2. Tier Anästhesie, Pipette Laden und Pia-Oberfläche Plasmid-Injection
- Induzieren Hypothermie Narkose auf 1-2 Tage postnatalen Mäusen, indem sie auf einer Petrischale, die auf Eis für 5-8 min (Zeit abhängig vom Alter Welpe / Gewicht) platziert wird. Sobald Hypothermie wird durch Mangel an Bewegung von den Zehen-Quetsch-und / oder Schwanzreflex bestätigt, sind die Mäuse bereit, eingespritzt werden. Zeigen Tiere zurück auf dem Eis, wenn Schmerzen Reflexe sind offensichtlich. Der Einspritzverfahren und Elektroporation in weniger als 2-3 Minuten insgesamt so Zeit die Hypothermie, Injektion und Elektroporation Verfahren entsprechend geeignete Anästhesie zu halten.
- Während der Narkose, mit einem Standard-Pipette vorsichtig Pipette gewünschte Menge plasmid mischen, um auf ein Stück Paraffinwachs Film als Referenz eingespritzt werden (0,5-2 ul). Hier wird ein Gesamtvolumen von 0,5 ul Plasmid Mischung injiziert. Als nächstes mit einem Mikro-Injektor, sorgfältig zusammengebaut einfügen Glaskapillare Pipette in Röhrchen mit Plasmid-Gemisch. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um die Spitze zu brechen, indem sie verhindern, dass es nicht die Ränder der Röhre berühren. Saugen Sie die Lösung in die Pipette langsam durch die Übertragung der Wahl zurück Zifferblatt. Sobald ein ausreichendes Volumen hat, in die Pipette eingelegt wurde, wählen vorne, bis der Druck wieder in die Neutralposition von 0 hPa.
- Mit 300 bis 450 hPa Druck zur Injektion geeignete Druck für gleichmäßige Befüllung des Pia-Oberfläche / meningealen Raum zu gewährleisten, stellen Sie die Spitze in der Nähe des pipettierte Paraffinwachs Film Bezugseinspritzung (ab 2.2) und verwenden Sie das Pedal von der Mikro-Injektor, um ein Auswerfen Volumens auf den Paraffinfilm. Stellen Sie den Druck entsprechend, bis die Menge ausgestoßenen entspricht der zuvor pipettiert referencE Lautstärke.
- Sobald die Spitze wurde ins Gleichgewicht gebracht und Anästhesie wurde bestätigt, sind die Welpen bereit, eingespritzt werden.
- Das Ziel des Versuchs ist es, die Plasmid-Mischung unter dem Schädel und oberhalb der Pia-Oberfläche zu injizieren, um für die Elektroporation von DNA nach unten in die Pia-Oberfläche Vorläuferzellen (1A) zu erlauben. Für Kortex Injektionen, halten Sie den Welpen nach unten mit dem Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Die kortikalen Hemisphären und andere Oberflächenstrukturen wie beispielsweise die überlegene colliculi zwischen P0 und P2 sichtbar, so dass für einfache Ausrichtung dieser Strukturen (Abbildung 1B). Mit der dominanten Hand und Ziel gewünschten Bereich des Kortex (dh Motor, somatosensorischen, etc.), legen Pipette an der Haut und Schädel wobei darauf zu Hirnarterien zu vermeiden. Sicherstellen, dass ein weiteres Eindringen der Spitze an der Schädel (was durch das Fehlen von weiteren Widerstand nur nach Durchstechen des Schädels angedeutet ist) zu verhindern.
- Inject PlasmaID-Lösung unter Verwendung des Fußpedals der Mikro-Injektor und sicherzustellen, dass es gleichmäßig verteilt über das Gewebe (Abbildung 2A).
Hinweis: Es ist sehr wichtig, um einen Ansatz, der Plasmid-Lieferung maximiert, während die Vermeidung Hämatom aufgrund des Flüssigkeitsdrucks empirisch zu bestimmen. Dies kann durch Einstellen der Dauer der Einspritzung, wobei der Winkel, der Lautstärke und der genaue Zielort Gefäßstörungen zu vermeiden erfolgen. - Seien Sie sicher, dass Sie versuchen, und halten Sie die Spitze vor dem Austrocknen in zwischen den Injektionen indem Sie die Spitze im Testtröpfchen von Injektionen zuvor auf Wachs-Papier-oder Kunststoffparaffinfilm. Dies ist erforderlich, um Spitzen Akkumulation verdampft und kristallisiert DNA-Lösung, die die Verstopfung der Spitze und inkonsistent Liefermengen führen können, zu verhindern.
3. Elektroporation
- Stellen Sie die Electroporator auf 135-150 V für fünf Impulse, dauerhafte 50 ms, 950 ms mit Abständen zwischen jedem Puls. Um Leitfähigkeit zu erhöhen undverhindern, Brennen der Haut, bedecken 3-mm-Platin tweezertrodes Elektroporation mit Gel. Check für toe-Quetsch-und Heck Reflexe an dieser Stelle auf die Anästhesie zu gewährleisten. Wenn anspricht, setzen auf Eis für einige Minuten zu betäuben.
- Für Kortex (und Colliculus superior) Injektionen, verwenden eine 3-mm-Elektrode (2B), um die Lebensfähigkeit der Jungtiere zu erhöhen (im Vergleich mit der 7 - und 10-mm-Elektroden, die für ventrikuläre Zone Elektroporation verwendet werden). Platzieren der negativ geladene Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde auf der kontralateralen Bereich unterhalb des Auges, so daß die Elektrodenausrichtung bei einem 45-60 °-Winkel relativ zu der Mittellinie (Fig. 2C).
- Verwenden Sie das Fußpedal der Elektroporator auslösen Strom und halten tweezertrodes in Platz für 3-5 Impulse, je nach Alter und Gewicht Welpe, effektiv Targeting-DNA in Zellen zugrunde liegenden Pia-Oberfläche bei der Bilanzierung von Krümmungder Halbkugeln.
Hinweis: Der negative Pol auf die Injektionsbereich zwischen den Impulsen oder eine größere Elektrode eingesetzt, um den Bereich zu erhöhen Elektroporation werden gekehrt werden. - Unmittelbar nach der Elektroporation, sorgfältig säubern Gel aus Welpen und sie unter einer Wärmelampe für ca. 5 min.
- Pups wird akut verlieren ihre natürliche rötlich-rosa Farbton in den Minuten nach der Elektroporation durch Zyanose. Beachten Sie die Welpen für die Wiederherstellung der natürlichen Farbe und der Einleitung der normalen Bewegung, bevor sie dann wieder in ihre Käfige.
- Stellen Sie sicher, Resozialisierung mit der Mutter durch die Beobachtung, ob sie bringt die Welpen zurück ins Nest und beginnt, sie zu pflegen. Wenn sie aggressiv wird, stellen Sie sicher, dass Welpen nicht haben Reste von Gel und bebrüten sie mit einigen der Bettwäsche, den Geruch, um die Welpen übertragen.
4. Modifikationen für Targeting der Superior-Colliculi
Targeting:
- Inject der Colliculus superior in der gleichen Weise wie die Rinde, aber beachten Sie, dass der Zielbereich liegt nur posterior und lateral Lambda und etwa an der Mittellinie (3A und 3B). Mit der erfolgreichen Injektionen, die Plasmid-Mix natürlich füllt die Konturen des Colliculus superior. Sobald Injektionen wurden erfolgreich gemacht, sind Tiere, bereit für die Elektroporation.
Elektroporation:
- In einer sehr ähnlichen Weise für Colliculus superior Injektionen, platzieren Sie den negativ geladenen Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde um das Auge, Schnauze oder Kinn, Fahr DNA in den oberflächlichen Regionen des Colliculus superior (3C) . In diesem Fall ist die Elektrodenausrichtung bei einer 25-40 °-Winkel relativ zu der Mittellinie.
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Representative Results
Pia-Oberfläche Elektroporation führt zur Expression von Plasmid-DNA in Zellen-Vorläufer-meist an oder nahe der Pia-Oberfläche 6. Genauer gesagt, ist die Orientierung der Elektroden kritisch diktiert die Richtung der Bewegung Plasmid und anschließende Expression. Somit wird in Doppelelektrodenkonfigurationen, das Plasmid in etwa einer geraden Vektor zwischen dem negativen und positiven Elektrode gerichtet. Deshalb, wenn der negative Pol wird über die Injektionsstelle gelegt und der positive Pol ventral mit dem negativen Pol, wird das Plasmid in die Pia-Oberfläche gedrückt werden. Es wird angenommen, daß die Orientierung der Elektroden Stromvektoren senkrecht zu der Oberfläche zu erzeugen würden die meisten ideal. Mit geeigneten Elektrodenausrichtung und die Verwendung von kleineren, fokal-bezogene Elektroden ist 100% Überleben. In einigen Regionen, wie dem Mittelhirn, hat jedoch darauf geachtet werden, den aktuellen Liefer, die das Herz aufhören können, zu vermeiden, und damit cause verminderte Lebensfähigkeit der Elektroporation Maus Welpen. Neu beschriebenen tri-Elektrodenkonfigurationen oder andere Modifikationen in Zielregionen erschwert durch die Vermeidung von Strukturen in lebenswichtigen Funktionen wie Herzfrequenz 28 beteiligt zu unterstützen. Es ist wichtig, Jungtiere für die ordnungsgemäße Wiedererwärmung, ihre natürlichen Körpertemperatur, was sich durch Bewegung und Farbe ist zu beobachten. Als sie nach Farbe zurückkehren, sind sie wieder in das Nest gelegt werden. Mütter von CD1 Stamm von Mäusen, die wir am häufigsten beschäftigen sofort beginnen Pflege der Welpen zurück. Jedoch können auch andere Stämme mehr variabel sein, zu aggressiv oder nachlässig. Übertragen der Geruch der Bettwäsche bis die Welpen in der Regel verhindert, dass diese Fragen. In Stämmen, wo Vernachlässigung oder Aggression sind schwere, Förderung Jungtiere, deren Mütter von der CD1 Stamm ist die beste Lösung.
Markierte Zellen werden in der Regel nach der Elektroporation 6 beobachtet, viele Monate. Doch wie bei jedem electroporation Methode, Plasmid-DNA, verdünnt mit 29 Zellteilung. Das gleiche Maß an Plasmid Verdünnung in schnellen Radfahren Populationen (zB SVZ Vorfahren) zu sehen ist nicht in unserer Bevölkerung Pia-Oberfläche beobachtet, was weniger Proliferation 6. Jedoch beschäftigen wir kürzlich beschriebenen Umsetzung Technologien (zB piggyBac), um dieses Problem vollständig durch Verdünnung Berücksichtigung stabile Insertion des Transposons in die genomische DNA 29, 30 zu vermindern. Alternativ könnte Cre-Rekombinase-exprimierenden Plasmide in Cre Reportermäuse elektroporiert werden, um stabile genetische Verfolgung dieser Zellen 31 vermitteln.
Unsere ersten Ergebnisse legen nahe, dass der Großteil der Zellen zum Zeitpunkt der Elektroporation 6 mitotischen im Einklang mit in der embryonalen ZNS-spezifisch beschriebenen Daten, Etiketten, die Elektroporation eine Reihe von wuchernden Zellen zwischen S-und M-Phasen des Zellzyklus 24. Jedoch sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Identität und die Linien der elektroporierten Zellen auf der Pia-Oberfläche zu definieren sowie um endgültig festzustellen, ihre Proliferations Charakter, da es viele Beispiel störende chemische und genetische Markierung von Zellen in der Literatur 4. Darüber hinaus haben wir festgestellt, lokale Injektionsstelle Hämatome, vor allem in der Hirnrinde, wenn-Pflege nicht genommen wird, um kleine Volumina oder wenn entsprechende Vorkehrungen zu Gefäßstörungen zu vermeiden nicht befolgt zu liefern.
Unsere bisherigen Charakterisierung zeigt mindestens zwei Linien der Zellen - Astrozyten Vorläufer und Vorläuferzellen Intern 6. Astrozyten sind in der Regel an der Pia-Oberfläche (4A) bleiben und jede Zelle bildet eine dichte Wolke von Peripherie Astrozyten 6 verarbeitet. Inter meist an der Pia-Oberfläche bleiben, sondern einige Zellen können in fast allen kortikalen Schichten oder tiefer in der Colliculus superior 6 zu finden. These Neuronen zeigen umfangreiche Dendriten, die so lange wie mehrere hundert Mikrometer (4B) sein kann. Wir haben nicht für die Kennzeichnung von Oligodendrozyten oder erregenden Neuronen im Kortex 6 beobachtet Beweise. Die Mehrheit der Elektroporation Zellen scheinen durch Mitose in unmittelbarer zeitlicher Nähe zu den EP-Verfahren Kortex 6 bestanden haben. Insbesondere Elektroporation EGFP +-Zellen mit der DNA-Replikation Marker BrdU-markierten Doppel, wenn sie vor diesem Thymidin-Analogon (4C-4C 3) gepulst 2 Stunden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass wir Beweise Perizyten und / oder endothelialen Zellmarkierung in diesen Bereichen 6 ersichtlich.
Fig. 1 ist. ElektroporationDie Neugeborenen-Pia-Oberfläche (A) schematische Frontalschnitt, die den Bereich der Hirnrinde, die bei der Injektion ausgerichtet ist. Zellen entlang der Schichten des Cortex angezeigt sind Beispiele tatsächlich beobachteten gemischten Populationen von Zellen elektroporiert, einschließlich interneuronaler Vorläufern und astrocystic Vorstufen. (B) Bild einer postnatalen Tag 2 Maus vor der Injektion, umreißt die Bereiche der Pia-Oberfläche Zinsen, die Rinde (CTX) und Colliculus superior (SC).
2. Postnatale Elektroporation des oberflächlichen Cortex (A) Beispiel Injektion der dorsalen Kortex nach Ausrichtung der Mitte zwischen Auge und lambda, vor der Elektroporation. (B) Je nach derAlter der Jungtiere und Region von Interesse, Flexibilität verschiedenen Größen von Platin tweezertrodes können für die Elektroporation verwendet werden, (3 mm, 7 mm und 9 mm). 3-mm-Durchmesser Elektroden werden in der Regel für Pia-Oberfläche Elektroporation (siehe Text zur Diskussion) verwendet. (C) Die Elektroporation der Rinde. Beachten Sie die Anordnung der tweezertrodes, indem die positive Sonde unter dem Auge, damit Strom, der an der ventralen Seite angetrieben werden.
Abbildung 3. Colliculus superior gezielte postnatale Elektroporation (A) Injektion einer 2 Tage alten Welpen in den Colliculus superior, zeigt die Handhaltung des narkotisierten Welpen und die Platzierung der Pipettenspitze direkt hinter dem Schädel. (B), die die Injektion verteilt PlasmaID-DNA-Lösung in den Bereich des oberen Colliculus (SC). (C) Die Platzierung der tweezertrodes für die Elektroporation des SC, Fahr DNA in Richtung der dorsalen Oberfläche des SC an der Injektionsstelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Colliculus superior gezielte postnatale Elektroporation (A) En face, maximale Projektion der konfokalen Bildstapeln von dorsolateralen Kortex ~ 2 Wochen nach der Elektroporation von Steuer fluoreszierenden Reporter Plasmiden, die Membran-markierten Clover 32 (grün) und TagBFP2 33 Kernprotein (blaue Fluoreszenz pseudocolored rot). (B) Frontalschnitt eines kortikalen Intern rund zwei Monate nach der Elektroporation, umfangreiche Anzeige von Dendriten. Maßstabsbalken 100 &mgr; m messen (A, C) und 40 um (B). (CC 3) Sagittalschnitt der Pia-Oberfläche des oberen Colliculus zeigen, dass die Mehrheit der EGFP + Zellen werden durch einen einzigen Impuls von BrdU 2 Stunden vor der Elektroporation bezeichnet.
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Discussion
Der wichtigste Aspekt für die erfolgreiche Elektroporation von Pia-Oberfläche Vorläufer sind: 1) Targeting-Plasmid Mischung der Pia-Oberfläche; 2) Verhinderung der Entstehung von Hämatomen an der Injektionsstelle; und 3) die Vermeidung von Sterblichkeit, die mit Mittelhirn Elektroporation verbunden.
Geeigneter Ausrichtung der Pia-Oberfläche wird gemessen und sorgfältige Punktierung des Schädels erreicht, um das Eindringen der Pia-Oberfläche zu vermeiden. 1) Verschiebung der schnellen grünen Farbstoff mit der Haut auf sanftes Reiben des Gewebes (dh die schnell grün wird über dem Schädel in der Haut und Bindegewebe lokalisiert): Falsche Ausrichtung auf die darüber liegende Haut oder der zugrunde liegenden Herzkammer oder Gehirnparenchym werden nachgewiesen oder 2) durch das Verschwinden des schnellen grünen Farbstoff in das Gehirn, was darauf hinweist, dass das Plasmid Mischung wurde in die Herzkammer und / oder Parenchym Feld. Proper Pia-Oberfläche Lokalisierung der Plasmid-Mix durch Farbstoffakkumulation unter dem Schädel th nachgewiesen werdenbei nicht durch sanfte Hautverschiebung gestört werden. Dennoch wird der Praxis und Geschicklichkeit für diese erfolgreiche Targeting erforderlich. Hämatombildung wird wahrscheinlich durch Störung der Blutgefäße durch Plasmid-Injektion verursacht. Blutgerinnsel wird an der Injektionsstelle in den Tagen und Wochen nach der Elektroporation, wenn das Gewebe gesammelt beobachtet werden. Um Hämatome zu vermeiden, stellen Sie die Pulslänge des Fluidinjektion und / oder beachten Sie die allgemeinen Muster der Hirngefäßsystem mit der Behälter Störungen zu vermeiden. Im allgemeinen ist der Colliculus superior weniger anfällig gegen Blutgerinnung. Tod durch die tweezertrodes geliefert elektrischer Strom einfach mit 3 mm tweezertrodes mehr fokal liefern Strom und indem die Elektroden aus dem ventralen Mittelhirn als nachgewiesen (2C und 3C) vermieden.
Ein Haupt Nachteil dieser Technik ist, dass der Zielbereich wird durch die Größe des Plasmids Lösung Ausbreitung begrenztund die Größe der Elektroden. Eine Lieferung von 0,5 ul Plasmid erzeugt eine Fläche von etwa 3 mm, und somit ist die Elektrode 3 mm Größe gut abgestimmt. Unabhängig davon, welches Maß kleiner ist (Lösung Ausbreitungsfläche oder Elektrodenpaddelfläche) wird die endgültige Größe des Patches von Zellen elektroporiert diktieren. Außerdem sind nur eine Teilmenge von Zellen aufgrund der Notwendigkeit für die Mitose für die Transgen-Expression 24 gekennzeichnet. Dies ist jedoch für die Untersuchung Stamm-oder Vorläufergruppen und Zelldifferenzierung vorteilhaft.
Pia-Oberfläche Elektroporation ist eine Methode, so dass für die robusten genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorfahren und deren Nachkommen. Diese Technik ist schnell, einfach und effizient, wodurch eine genauere und einfachere Mittel gezielt diese Zellen, wenn sie mit der einzigen vergleichbaren Ansatz retrovirale Transduktion verglichen. Hohe Titer Virusproduktion braucht Geschick, Wochen Zeit und birgt Sicherheitsrisiken - vor allem im Fall von pantropen pseudotyped Retrovirus. Darüber hinaus ist die Elektroporation etwas flexibler, da es nicht viralen Klonierung und Herstellung erfordern. Einem eukaryotischen Expressionsvektor kann verwendet werden, einschließlich Plasmide, virale. Ferner kann Maxipräp-ed Plasmide gemischt und für eine einfache Zusammenarbeit Elektroporation abgestimmt werden. Typischerweise gibt es eine ~ 90-95% Co-Expression für zwei bestimmten Plasmide mit ähnlichen Promotoren. In sei angemerkt, daß, während wir nur verwendet diese Technik gezielt in der Rinde und Colliculus superior, sollte das Verfahren zugänglich meisten Pia oder oberflächlichen Regionen des ZNS, vorausgesetzt, es ist Raum für die lokale Ansammlung von Plasmid-DNA vor der aktuellen Liefer .
Elektroporation von Natur aus dazu neigt, die Transduktion von mitotischen Zellen 24 zu begünstigen. So sollte Elektroporation von erwachsenen Tieren möglich sein, aber wahrscheinlich in vielen Zellen, die weniger Transgenen durch reduzierte Proliferationsaktivität mit der Alterung führen. Jedoch, wie kürzlich von Jaubodin detailliertDiol, das für die Kern Plasmid Zugriff permeablilizing die Kernhülle 25 ermöglicht - und Kollegen, das Targeting von postmitotischen Zellen in diesem Bereich könnte möglich durch Verwendung trans-Cyclohexan-1, 2 sein. Auch ist die Elektroporation sehr viel mit Cre-Technologien entwickelt oder andere Maustypen 31 kompatibel. Schließlich wird Transposon-Technologie für stabile somatische Transgenese dieser Population 29, 30 zu ermöglichen. Insgesamt Pia-Oberfläche Elektroporation stellt eine hervorragende und flexibles Werkzeug für die genetische Manipulation dieser einzigartigen Vorläuferdomänen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung der Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award sowie Mittel aus dem Institut für Regenerative Medizin Cedars-Sinai und der Guerin Familie anzuerkennen. Das beschriebene Projekt wurde in Form einer CTSI Core-Gutschein vom National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176 finanziert unterstützt und ist jetzt in der National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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