Summary
Пиальных поверхности зона является уникальной предшественников в ЦНС, что уделяется все большее внимание. При этом мы подробно способ быстрого генетической манипуляции этой зоны предшественников с использованием модифицированного метода электропорации. Эта процедура может быть использована для клеточных и молекулярных исследований клеточных линий и сигнальных путей, участвующих в дифференцировке клеток и выяснить судьбу и свойства дочерние клетки.
Abstract
За последние несколько лет пиальных поверхность была определена в качестве зародышевого нише значение во время эмбрионального, перинатальной и взрослых нейро-и глиогенеза, в том числе после травмы. Тем не менее, методы генетически допрашивать этих групп населения предшественников и отслеживания их клоны были ограничены из-за отсутствия специфичности или времени производство вирусов. Таким образом, прогресс в этой области был довольно медленным только с горсткой исследований этого месте. Электропорация была использована уже более десяти лет, чтобы изучить нервные свойства стволовых клеток в эмбрион, а в последнее время в послеродовом мозга. Здесь мы опишем эффективную, быструю и простую технику для генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников на основе адаптированной для электропорации подхода. Пиальных поверхность электропорации позволяет легкому генетической маркировки и манипуляции этих предшественников, тем самым представляя экономия времени и экономичный подход к изучению этих клеток.
Introduction
Нервные стволовые и клетки-предшественники присутствуют в ЦНС млекопитающих 1, 2. Их природа и свойства в эмбриональных и взрослых зародышевых зонах, окружающих желудочковой области мозга и спинного мозга были хорошо документированы в последнее десятилетие 1-3. В значительной степени это было связано с развитием более точных генетических инструментов, таких как нервная система конкретного Cre рекомбинации floxed аллелей или ретровирусов линии трассировки 4. Тем не менее, один регион-прародитель относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность предшественников зона-недавно был описан только в деталях 5-7 и ждет комплексное обследование.
Пиальных поверхность мозга определяется как интерфейс между поверхностью мозга и окружающих мозговых оболочек 8. Во время развития нейроэпителиальные, а позднее, радиальные глиальные конечные футов приложить к этой поверхности 9,10. Некоторые из пихтыул нейроны в мозге человека и многих нейронных митозов наблюдаются в этом регионе 11. Позже, во время эмбрионального нейрогенеза, корковых интернейронов, как известно, пройти пиальных регион, в дополнение к их миграционных путей в промежуточной зоне и субвентрикулярной зоне 12-14. В течение этого периода, стволовые клетки можно культивировать из этой зоны, и это, кажется, активный центр нейро-и глиогенеза 5. Во взрослом мозге, было сообщено, что интернейроны может родиться от пиальных поверхностных предшественников следующее гипоксического вызов 7. Тем не менее, вклад этой области, чтобы его в genensis во время эмбрионального и постнатального развития остается неясным, в частности в связи с трудностью специально расследование этого региона 6. В верхний бугорок и в коре головного мозга, поверхностные (или слой I в коре) интернейроны может модулировать схему вывода основных возбуждающих популяций нейронов и тем самым способствовать significantly к функции этих структур. В частности, слой 1 интернейроны находятся в позиции, чтобы регулировать возбуждения нейронов на протяжении верхних слоях коры головного мозга с учетом их Широкие возможности подключения к поверхностных и глубоких слоев коры колонн 15,16. Аналогичным образом, горизонтальные интернейронов возбуждающих получать ввод от коры и сетчатки волокон, проекта в относительно широком области и предположили, посредником ингибирование нейрональных популяций, ответивших на удаленном зрительных стимулов 17,18. Кроме того, их морфология хорошо подходит играть потенциальную роль в узорной волновой активности в развивающихся зрительной системы 19. Интересно, что развитие интернейронов и созревание происходит в значительной степени после рождения. Кроме того, этот процесс созревания было установлено, регулируется нейронной активности и, следовательно, субстрат пластичности развития с пожизненных последствий для функции схемы 20,21. Примечательно, что пO промоторы описаны который может специфически нацелены эти клетки трансгенно. Разделительные предшественники могут быть направлены с ретровируса 7, но производство вируса занимает много времени и требует навыков, получая высокие титры клеток, необходимых для трансдукции.
Электропорацию привело к возрождению в изучении нервной системы, так как позволяет для быстрого и эффективного генетического допроса сигнальных путей в нейронных клеток-предшественников 4, 22, 23. Электропорации включает инъекции плазмидной ДНК, после чего доставки электрических импульсов к внешней части головы, в одном направлении приведения в действие ДНК в пролиферирующих клеток-предшественников, окружающих желудочки 4, 22, 23. Электропорации, как представляется, требуют транзит через клеток М-фазе клеточного цикла для экспрессии трансгенов плазмидных 24. В частности, было обнаружено, что толькоклетки, проходящие через M фазы в 8 часов электропорации плазмид выразит трансгены, несмотря на их эффективной доставки всех клеток в ~ 160 мкм желудочковой стенки 24. Он предположил, что это связано с необходимостью срыва ядерной оболочки в разрешении ядерной доступа из эписомные плазмид, как химические вещества, вызывающие ядерной пермеабилизации может индуцировать экспрессию плазмид в пост митотических клеток 25. Первоначально использовали в эмбрионе 22, электропорацию был адаптирован для использования в послеродовом мозга гораздо позже 26, 27. В последнее время мы приспособились электропорации для использования в генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников 6. Кроме того, с помощью этого подхода мы показали, что там, по-видимому два различных происхождений предшественников в этой области-межнейронной и астроцитов 6. Этот протокол детали простой, быстрый, и мощный способ предназначаться эти клетки для допросаразвития механизмов, регулирующих этих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта процедура в соответствии с требованиями Cedars-Sinai IACUC. Следователи должны обеспечить институциональную соответствие IACUC до судебного разбирательства. Все инструменты и реагенты должны быть стерилизованы перед использованием.
1. Подготовка Tools, решения, и ДНК смесь
- Вставьте 100-мм Fire полированного боросиликатного стекла капилляров в микропипетки съемник. Установить отопление для обеспечения стандартного средневзвешенного тянуть, чтобы сформировать пипетки приблизительно 17,5 мм. Cut наконечники с острыми хирургическими ножницами на расстоянии примерно 8-9 мм от начала наконечника, чтобы создать примерно отверстие диаметром мкм в 100.
- Сделать запас на 1% м / о быстрой зеленые решения путем смешивания отфильтрованного нуклеазы без воды (с использованием шприца фильтр 20 мкм) с сухим быстрого зеленый.
- Изолировать очищенной эндотоксина свободной ДНК плазмиды, что высококонцентрирована (т.е.> 3 мкг / мкл), разбавленный в Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера. Добавить желаемых количеств плазмидык смеси разводили в ТЕ-буфере и добавить соотношение 1:10 в 1%-зеленому раствору быстрого приготовления (0,1% вес / объем конечной концентрации быстрого зеленый). Использование 0,5-2,0 мкг / мкл конечной концентрации плазмиды для надежной экспрессии трансгенов.
2. Животное Анестезия, Внесите загрузка и мягкой мозговой оболочки поверхности плазмиды впрыска
- Вызвать гипотермии анестезии на 1-2 день после рождения мышей, разместив их на чашку Петри, который помещен на льду в течение 5-8 мин (время зависит от щенка возраста / веса). После гипотермии подтверждается отсутствием движения от ног-зажимая и / или хвостовой рефлекса у мышей готовы быть введен. Поместите животных обратно на лед, если боль рефлексы очевидны. Процедура инъекции и электропорации занять менее 2-3 мин в общей сложности, так что время гипотермия, раствор для инъекций, и процедуры электропорации соответственно для поддержания соответствующего анестезии.
- Во время анестезии с использованием стандартного пипетку осторожно пипеткой требуемое количество plasmiг смешать, который будет введен (0,5-2 мкл) на кусок парафина фильма для справки. Здесь, общий объем 0,5 мкл плазмиды смеси впрыскивается. Далее, используя микро инжектор, осторожно вставьте собранный стакан капиллярную пипетку в пробирку, содержащую плазмиду смеси. Принять дополнительные меры предосторожности, чтобы предотвратить наконечник от взлома, убедившись, это не прикасайтесь к краям трубки. Аспирируйте решение в пипетку, медленно набирая назад переноса диск. После того, как был обеспечен достаточный объем загружалась в пипетку, не набрать вперед, пока давление возвращается в нейтральное положение от 0 гПа.
- Использование 300-450 гПа давление для инъекций для обеспечения соответствующего давления для равномерное заполнение пиальных поверхности / менингеального пространства, поместить кончик рядом с пипеткой парафин отсчета фильм инъекции (от 2.2) и использовать педаль от микро форсунки, чтобы извлечь один Объем на парафина фильма. Отрегулируйте давление соответственно пока количество выбрасывается не сравняется с ранее пипеткой Ссылки на сайтыэ объем.
- После того, как кончик была уравновешена и анестезии был подтвержден, щенки готовы для инъекции.
- Целью эксперимента является придать плазмиды микс под черепом и выше пиальных поверхности, чтобы позволить для электропорации ДНК вниз в мягкой мозговой оболочки поверхностных предшественников (рис. 1А). Для коры инъекций, удерживайте щенка вниз, используя большой палец и указательный палец менее доминирующей рукой. Корковые полушарий и другие поверхностные структуры, такие как улучшенные двухолмия могут видеть между P0 и P2, что позволяет легкому адресности этих структур (рис. 1В). Использование доминирующую руку и целевой нужный область коры (т.е. двигателя, соматосенсорной и т.д.), вставьте пипетку мимо кожи и черепа, заботясь, чтобы избежать мозговых артерий. Убедитесь, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение наконечника мимо черепа (на что указывает отсутствие дальнейшего сопротивления только после прокалывания череп).
- Введите плазмуID решения с помощью ножной педали из микро форсунки и убедитесь, что он рассеивает равномерно по всей ткани (рис. 2А).
Примечание: Очень важно, чтобы эмпирически определить подход, который максимизирует доставку плазмидной избегая гематому из-за давления жидкости. Это может быть сделано путем регулировки длительности впрыска, угол, объем, и точное значение целевой сайт, чтобы избежать нарушения сосудов. - Обязательно попробуйте и держать кончик от высыхания между инъекциями, поместив кончик в каплях испытаний от инъекций, сделанных ранее на вощеную бумагу или пластиковую парафиновой пленки. Это необходимо, чтобы предотвратить накопление кончика испаряется и Crystalized раствора ДНК, что может привести к закупорке наконечника и объемов поставок, несовместимых.
3. Электропорацию
- Установите электропоратора в 135-150 V в течение пяти импульсов, длительностью 50 мсек, с 950 мс с интервалом между каждым импульсом. Для того чтобы увеличить проводимость ипредотвратить сжигание кожи, накрыть 3-мм платиновые tweezertrodes с электропорации геля. Проверьте ног-щипать и хвостовой рефлексов в этой точке для обеспечения анестезии. Если отзывчивый, разместить на льду в течение нескольких минут обезболить.
- Для коры (и верхний бугорок) инъекций, используют 3-мм электрод (рис. 2б), чтобы увеличить жизнеспособность щенков (по сравнению с 7 - и 10-мм электродами, которые используются для зоны желудочка электропорации). Поместите отрицательно заряженный зонд электрода над области инъекции и положительно заряженного зонда вокруг противоположной области под глазами такой, что ориентация электрод находится при 45-60 ° углом по отношению к срединной линии (рис. 2в).
- Используйте педаль электропоратора чтобы вызвать ток и удерживайте tweezertrodes на месте в течение 3-5 импульсов, в зависимости от щенка возраста и веса, эффективно ориентации ДНК в основных пиальных поверхностных клеток при учете кривизныполушарий.
Примечание: отрицательный полюс может быть охватила области инъекции в между импульсами или больше электрод может быть использован, чтобы увеличить площадь электропорации. - Сразу после электропорации, тщательно счистить гель от щенков и разместить их под инфракрасной лампой в течение примерно 5 мин.
- Щенки будут остро теряют естественной красновато-розовый оттенок в минут после электропорации из-за цианоз. Соблюдайте щенков для восстановления естественного цвета и началом нормального движения перед их возвращением в их клетки.
- Убедитесь ресоциализации с матерью, наблюдая приносит ли она щенков обратно в гнездо и начинает холить их. Если она становится агрессивным, убедитесь, что щенки не имеют остатки геля и инкубировать их с некоторыми из постельных принадлежностей передать запах щенков.
4. Модификации Ориентация Улучшенный двухолмия
Ориентация:
- ИнчжеКТ верхний бугорок таким же образом, что и коры, но отметили, что целевой регион находится только задняя и боковая лямбда и примерно по срединной линии (рис. 3А и 3В). С успешных инъекций, плазмиду смесь естественно заполняет контуры верхний бугорок. После инъекции были сделаны успешно, животные готовы к электропорации.
Электропорацию:
- В очень же образом, для превосходного инъекций бугорок, поместите отрицательно заряженный зонд электрода над области инъекции и положительно заряженной зонда вокруг глаз, морды или подбородок, вождение ДНК в поверхностные регионах верхний бугорок (рис. 3C) . В этом случае, ориентация электрод находится на 25-40 ° углом по отношению к средней линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пиальных поверхностные электропорации приводит к экспрессии ДНК плазмиды в клетки-предшественники в основном-на или вблизи пиальных поверхности 6. Более конкретно, ориентация электродов имеет решающее значение в диктовать направление движения плазмиды и последующей экспрессии. Таким образом, в конфигурации с двумя электродными, плазмиду направлен в почти прямую вектора между отрицательным и положительным электродом. Поэтому, если отрицательный полюс находится над месте инъекции, а положительный полюс вентральной к отрицательному полюсу, плазмиды будут вынуждены в пиальных поверхности. Предполагается, что ориентации электродов для получения векторов тока перпендикулярно поверхности будет наиболее идеальной. При соответствующей ориентации электродов и использование меньших, более фокально-адресных электродов, выживание составляет 100%. Тем не менее, в некоторых регионах, таких как среднего мозга, уход должен быть принят во избежание тока доставку, которые могут остановить сердце, и, таким образом, каустикэ снижается жизнеспособность электропорации щенков мыши. Вновь описанные три-электродные конфигурации или иные изменения, может помочь в ориентации более сложные регионы, избегая структур, участвующих в жизненно важных функций, таких как частота сердечных сокращений 28. Важно смотреть щенков для надлежащего повторного потепление в их естественной температуре тела, что является очевидным движением и цветом. Когда они возвращаются, чтобы цвета, они могут быть помещены обратно в гнездо. Матери из CD1 штамма мышей, которые мы наиболее часто используют сразу начать воспитание возвращенные щенков. Тем не менее, другие штаммы могут быть более разнообразными, становятся агрессивными или небрежными. Передача запах постельных принадлежностей для щенков обычно предотвращает эти проблемы. В штаммов, где пренебрежение или агрессия являются серьезными, содействие щенков от матерей из штамма CD1 является лучшим решением.
Меченые клетки, как правило, наблюдается много месяцев после электропорации 6. Тем не менее, как и в любом эльМетод ectroporation, ДНК плазмиды разбавляет с клеточного деления 29. То же степень разбавления плазмиды видели в быстрых населения велосипедных (например, СВЗ предшественниках) не наблюдается в нашей пиальных населения поверхности, предполагая, меньше пролиферацию 6. Тем не менее, мы сейчас работают недавно описанные технологии транспозиции (например PiggyBac), чтобы смягчить эту проблему разведения в целом, позволяя для стабильного вставки транспозонов в геномную ДНК 29, 30. Кроме того, Cre рекомбиназу-выражающие плазмиды могут быть электропорации в репортер мышей Cre посредничать стабильный генетический отслеживание этих клеток 31.
Наши предварительные результаты показали, что большинство наших клеток митотический во время электропорации 6, в соответствии с данными, описанными в эмбриональный CNS-конкретно, что электропорации этикетки набор пролиферирующих клеток между S и M фазах клеточного цикла 24. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, чтобы определить идентичность и клоны из электропорации клеток в пиальных поверхности, а также, чтобы окончательно убедиться в их пролиферативный характер, поскольку есть многие пример ложного химической и генетической маркировки клеток в литературе 4. Более того, мы уже отмечали местные место инъекции гематомы, особенно в коре-когда помощь не принято, чтобы доставить небольшие объемы или когда соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать сосудистой нарушения не последовало.
Наш предыдущий характеристика указывает по крайней мере, две линии клеток - астроцитарных прекурсоров и межнейронных предшественников 6. Астроциты как правило, остаются в пиальных поверхности (рис. 4А) и каждая клетка образует плотное облако периферической астроцитов процессы 6. Интернейроны основном остаются на пиальных поверхности, но некоторые клетки могут быть найдены почти во всех слоях коры или глубоких в верхний бугорок 6. ЧтЮВ нейроны обладают обширные дендриты, которые могут быть до тех пор, как несколько сотен микрон (рис. 4б). Мы не наблюдали доказательств для маркировки олигодендроцитов или возбуждающих нейронов в коре 6. Большинство электропорации клеток по-видимому, прошли через митоза в непосредственной временной близости к процедуре коры ЕР 6. В частности, электропорации EGFP + клетки дважды помечены репликации ДНК маркера BrdU, когда импульсный 2 час до с этим тимидина аналог (Цифры 4C-4C 3). Однако, важно отметить, что мы уже видели доказательства перицитарных и / или эндотелиальных клеток маркировки в этих регионах 6.
Рисунок 1. Электропорациянеонатальный поверхность относящийся к мягкой мозговой оболочке (А) Корональные части схематическое область коры, которая направлена на инъекции. Клетки отображаются вдоль слоев коры примеры фактических наблюдаемых смешанных популяций электропорации клеток, в том числе межнейронных предшественников и astrocystic предшественников. (B) Изображение послеродовой день 2 мыши перед инъекцией, с изложением регионы пиальных поверхности интерес, кора (Ctx) и верхний бугорок (SC).
Рисунок 2. Послеродовая электропорации поверхностной коры (А) Пример впрыска спинного мозга после ориентации середину между глазом и лямбда, перед электропорации. (В) В зависимости отвозраст щенков и области, представляющей интерес, гибкость различных размеров платиновых tweezertrodes может быть использован для электропорации (3-мм, 7 мм и 9-мм). Электроды диаметром 3 мм обычно используются для пиальных поверхности электропорации (см. текст для обсуждения). (C) электропорации в коре головного мозга. Обратите внимание на размещение ценных tweezertrodes, помещая положительный щуп под глазом, позволяют току подъезжать к брюшной стороне.
Рисунок 3. Верхний бугорок целевой послеродовой электропорации (A) Инъекция 2-дневный старого щенка в верхний бугорок, показывая ручной сдержанность анестезированной щенка и размещения кончика пипетки только вне черепа. (B) инъекций, показывающий диспергированный плазмуID раствор ДНК в районе верхний бугорок (SC). (С) Размещение в tweezertrodes для электропорации в СК, за рулем ДНК к спинной поверхности СЭ в месте инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Верхний бугорок целевой послеродовой электропорации (A) в фас, максимальный выступ конфокальной изображения стеки от дорсолатеральной коры ~ 2 недели после электропорации контроля люминесцентных репортер плазмид, экспрессирующих мембрана с метками Клевер 32 (зеленый) и TagBFP2 33 ядерный белок (синий флуоресценции псeudocolored красный). (В) Корональные части коркового интернейрона примерно два месяца после электропорации, показывая обширные дендритов. Масштабные бары измерения 100 мкм в (А, С) и 40 мкм в (В). (CC 3) Сагиттальный раздел пиальных поверхности верхний бугорок, демонстрирующий, что большинство EGFP + клеток помечены одиночного импульса BrdU 2 ч до начала электропорации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Самый важный аспект для успешного электропорации пиальных поверхностных предшественников являются: 1) адресности плазмиды смеси, чтобы пиальных поверхности; 2) предотвращение генерацию гематом в месте инъекции; и 3) избежать смертности, связанных с среднего мозга электропорации.
Соответственно ориентации пиальных поверхность осуществляется измеренного и тщательного прокалывания черепа, чтобы избежать проникновения пиальных поверхности. Неправильное ориентации на покрывающей кожи или основной желудочка или паренхимы мозга будут свидетельствовать: 1) смещение быстро зеленого красителя с кожей при слегка втирая ткани (т.е. быстро зеленый локализован выше черепа в коже и соединительной ткани) или 2) по исчезновению зеленого красителя быстрой в мозг, указывающее, что плазмида смесь вошло в желудочке и / или паренхимы. Правильное относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность локализация плазмиды смеси будут подтверждены накопления красителя под черепом йна не может быть нарушена нежным смещения кожи. Тем не менее, практика и ловкость для этого требуется успешного таргетирования. Формирование гематомы, скорее всего, вызвана нарушением сосудистой путем инъекции плазмиды. Сгустки крови будет наблюдаться в месте инъекции в дни и недели после электропорации, когда ткань собирается. Чтобы избежать гематом, отрегулировать длину импульса впрыска жидкости и / или принять к сведению общей структуре головного сосудистой, чтобы избежать нарушения сосудов. В общем, верхний бугорок менее восприимчив к свертывания. Смерть в результате поставленного по tweezertrodes электрического тока легко избежать, используя 3 мм tweezertrodes более централизовано поставлять ток и, направляя электроды от брюшной мозга о чем свидетельствует (рис. 2C и 3C).
Главным недостатком метода является то, что целевая область ограничена размером распространением раствора плазмидыи размер электродов. Поставка 0,5 мкл плазмиды генерирует площадь около 3 мм и, таким образом, хорошо согласован с размером 3 мм электрода. Какой бы мера меньше (спрэд решение площадь или площадь электродов весло) будет диктовать конечный размер пластыря из электропорации клеток. Кроме того, только подмножество ячеек помечены из-за необходимости митоза для экспрессии трансгена 24. Тем не менее, это выгодно для изучения шток или популяций предшественников и дифференцировку клеток.
Пиальных поверхность электропорации является метод, позволяющий для надежной генетической манипуляции пиальных поверхностных предшественников и их потомков. Этот метод является быстрым, простым и эффективным, обеспечивая более конкретные и более легкие средства ориентации этих клеток по сравнению с той лишь другого сопоставимого подхода-ретровирусная трансдукции. С высоким титром вируса продукция занимает навыков, недели времени, и представляет угрозу безопасности - особенно в случае пантропный pseudotyped ретровирус. Кроме того, электропорацию несколько более гибким, поскольку он не требует вирусной клонирование и производство. Любой вектор экспрессии эукариотических могут быть использованы, в том числе вирусных плазмид. Кроме того, максипреп-ред плазмиды могут быть смешаны и подобраны для легкого совместного электропорации. Как правило, существует ~ 90-95% со-выражение для любых двух заданных плазмид с аналогичными промоторов. В Следует отметить, что в то время как мы только использовали этот метод ориентации в коре и верхний бугорок, метод должен быть поддаются большинстве пиальных или поверхностных областей ЦНС при условии, что имеется пространство для местного накопления плазмидной ДНК до текущего доставки .
Электропорацию природой как правило в пользу трансдукцию митотических клеток 24. Таким образом, электропорации взрослых животных должно быть возможным, но, скорее всего, приведет к гораздо меньше клеток, экспрессирующих трансгены в связи с сокращением пролиферативной активности по мере старения. Однако, как недавно список по Jaubodinи его коллеги, нацеливание постмитотических клеток в этой области могло бы быть возможно за счет использования транс-циклогексан-1, 2 - диол, который позволяет для доступа ядерного плазмиды по permeablilizing ядерной оболочки 25. Кроме того, электропорации является очень совместимы с технологиями Cre или других инженерных типо мышей 31. Наконец, транспозонов технология позволит для стабильного соматической трансгенеза этого населения 29, 30. В общей сложности, относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность электропорации представляет собой выдающийся и гибкий инструмент для генетических манипуляций этих уникальных доменов предшественников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность поддержки со стороны Самуэль Ошина всеобъемлющем институт рака онкологического научного форума премии, а также средства от регенеративной медицины Института Cedars-Sinai, и Герена семьи. Проект описывается была поддержана в виде CTSI Основной ваучером, финансируемого Национальным центром исследований ресурсов, Грант UL1RR033176, и в настоящее время в Национальном центре для продвижения поступательного науки, Грант UL1TR000124. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
