Summary
La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.
Abstract
En los últimos años la superficie pial ha sido identificado como un nicho germinal de importancia durante embrionario, perinatal y adultos neuro-y gliogénesis, incluyendo después de la lesión. Sin embargo, los métodos para interrogar genéticamente estas poblaciones progenitoras y el seguimiento de sus linajes habían sido limitadas debido a la falta de especificidad o mucho tiempo la producción de virus. Por lo tanto, el progreso en esta región ha sido relativamente lento con sólo un puñado de investigaciones de esta ubicación. La electroporación se ha utilizado durante más de una década para estudiar las propiedades de células madre neurales en el embrión, y más recientemente en el cerebro postnatal. Aquí se describe una técnica eficiente, rápido, y sencillo para la manipulación genética de los progenitores superficie pial basadas en un enfoque adaptado electroporación. Pial electroporación superficie permite el etiquetado genética fácil y manipulación de estos progenitores, lo que representa un enfoque de ahorro de tiempo y económico para el estudio de estas células.
Introduction
Células madre y progenitoras neurales están presentes en todo el SNC de mamíferos 1, 2. Su naturaleza y propiedades en zonas germinales embrionarias y adultas que rodean las regiones ventriculares del cerebro y la médula espinal han sido ampliamente documentados en la década pasada 1-3. En gran parte, esto se ha debido al desarrollo de herramientas genéticas cada vez más precisas, como el sistema nervioso específico recombinación Cre de alelos floxed o linaje retroviral trazando 4. Sin embargo, una región-el progenitor pial progenitor superficie de la zona-sólo recientemente ha sido descrito en detalle 5-7 y espera examen exhaustivo.
La superficie de la pía madre del cerebro se define como la interfaz entre la superficie del cerebro y las meninges que rodean 8. Durante el desarrollo, neuroepitelial y, más tarde, radiales pies terminales gliales se adhieren a esta superficie de 9,10. Algunos de los abetosst neuronas en el cerebro humano y muchas mitosis neuronales se observan en esta región 11. Más tarde, durante la neurogénesis embrionario, las interneuronas corticales son conocidos para atravesar la región de la pía madre, además de sus rutas migratorias en la zona intermedia y la zona subventricular 12-14. Durante este período, las células madre pueden ser cultivadas a partir de esta zona y que parece ser un centro activo de la neuro-y gliogenesis 5. En el cerebro adulto, se ha informado de que las interneuronas pueden nacer de progenitores superficie pial siguiente desafío hipóxico 7. Sin embargo, la contribución de esta región a su a genensis durante el desarrollo embrionario y posnatal ha permanecido en la oscuridad, en parte debido a la dificultad de investigar específicamente esta región 6. En el colículo superior y en la corteza cerebral, interneuronas superficiales (o capa I en la corteza) pueden modular la salida del circuito de poblaciones de neuronas excitatorias subyacentes y por lo tanto contribuir cantidaantly a la función de estas estructuras. En particular, la capa 1 interneuronas están en una posición privilegiada para regular la descarga de las neuronas a través de las capas superiores de la corteza cerebral, dada su amplia conectividad a las capas superficiales y profundas de las columnas corticales 15,16. En una manera similar, las interneuronas horizontales reciben excitatorios de entrada a partir de fibras corticales y retinales, proyecto sobre un área relativamente amplia y se especula para mediar en la inhibición de las poblaciones neuronales que responden a estímulos visual remota 17,18. Además, su morfología es muy adecuado para jugar un papel potencial en la actividad de las ondas con dibujos en el desarrollo del sistema visual 19. Curiosamente, el desarrollo de las interneuronas y maduración ocurre en gran medida después del nacimiento. Además, este proceso de maduración se ha encontrado para ser regulada por la actividad neuronal y por lo tanto es un sustrato de la plasticidad del desarrollo con consecuencias de por vida sobre la función del circuito 20,21. Notablemente, No Los promotores se describen que pueden dirigirse específicamente a estas células transgénica. La división de progenitores pueden ser dirigidos con retrovirus 7, pero la producción de virus es mucho tiempo y requiere habilidad para producir los altos títulos necesarios para la transducción de células.
La electroporación ha llevado a un renacimiento en el estudio de desarrollo neurológico, ya que permite la interrogación genético rápido y eficiente de las vías de señalización de los progenitores neurales 4, 22, 23. La electroporación implica la inyección de ADN plásmido, seguido de la entrega de pulsos eléctricos a la parte exterior de la cabeza, para conducir unidireccionalmente el ADN en los progenitores proliferantes que rodean los ventrículos 4, 22, 23. La electroporación parece requerir el tránsito de células a través de la fase M del ciclo celular para la expresión de los transgenes plásmido 24. Específicamente, se ha encontrado que sólocélulas que pasan a través de la fase M dentro de 8 horas de la electroporación de plásmidos expresarán transgenes a pesar de su entrega efectiva a todas las células dentro de ~ 160 m de la pared ventricular 24. Se especula que esto se debe a la necesidad de la envoltura nuclear desglose en que permite un acceso nucleares de los plásmidos episomales, como los productos químicos que causan la permeabilización nuclear puede inducir la expresión de los plásmidos en las células mitóticas poste 25. Originalmente empleado en el embrión 22, electroporación se adaptó para su uso en el cerebro postnatal mucho más tarde 26, 27. Recientemente, hemos adaptado la electroporación para su uso en la manipulación genética de los progenitores superficie pial 6. Además, usando este enfoque, hemos demostrado que hay aparentemente dos linajes distintos de los progenitores en esta región-interneuronal y astrocítico 6. Este protocolo detalla una manera simple, rápida y potente para atacar estas células durante el interrogatorioel desarrollo de mecanismos de regulación de estas células.
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Protocol
Este procedimiento es conforme a los requisitos Cedars-Sinai IACUC. Los investigadores deben velar por el cumplimiento IACUC institucional antes de proceder. Todas las herramientas y los reactivos deben ser esterilizados antes de su uso.
1. Preparación de herramientas, soluciones, y la mezcla de ADN
- Inserte borosilicato pulido tubos capilares de vidrio de 100 mm de incendio en un extractor de micropipeta. Ajuste de calefacción para permitir la extracción ponderada estándar para formar la punta de la pipeta de aproximadamente 17,5 mm. Cortar las extremidades con tijeras quirúrgicas nítidas a una distancia aproximadamente de 8-9 mm desde el principio de la punta para crear más o menos una abertura de 100 micras de diámetro.
- Hacer una reserva 1% w / v solución verde rápido mezclando agua libre de nucleasa filtrada (utilizando un filtro de jeringa de 20 micras) con el verde de secado rápido.
- Aislar ADN purificado libre de endotoxina plásmido que está altamente concentrada (es decir,> 3 g / l), diluido en Tris-EDTA (TE) tampón. Añadir cantidades deseadas de plásmidoa la mezcla diluida en tampón TE y añadir una proporción de 1:10 de la solución de verde rápido 1% (o sea un 0,1% w / v de concentración final de verde rápido). Utilice una concentración final 0,5-2,0 g / l de plásmido para la expresión robusta de transgenes.
2. Anestesia para animales, Pipeta Loading, y Pial Superficie plásmido Inyección
- Inducir la anestesia hipotermia en 1-2 días los ratones postnatales que los coloca en una placa de Petri que se coloca en hielo durante 5-8 minutos (dependiendo de la edad de las crías / peso del tiempo). Una vez que la hipotermia se confirma por la falta de movimiento de dedo del pie-pellizcos y / o la cola reflejo, los ratones son lista para ser inyectada. Coloca los animales de vuelta en el hielo si los reflejos de dolor son evidentes. El procedimiento de inyección y electroporación tardan menos de 2-3 minutos en total, así que tiempo de la hipotermia, la inyección, y los procedimientos de electroporación en consecuencia para mantener la anestesia adecuada.
- Durante la anestesia, usando una pipeta estándar, cuidadosamente pipeta cantidad de plasmi desead mezclar a inyectar (0,5-2 l) en un pedazo de película de cera de parafina para referencia. Aquí, se inyecta un volumen total de 0,5 l de la mezcla de plásmido. A continuación, utilizando un inyector de micro, inserte cuidadosamente ensambladas pipeta capilar de vidrio en el tubo que contiene mezcla de plásmidos. Tome precauciones adicionales para evitar que la punta se rompa por asegurarse de que no toque los bordes del tubo. Aspirar la solución en la pipeta marcando lentamente el dial de transferencia. Una vez que un volumen suficiente ha sido cargado en la pipeta, marque hacia adelante hasta que la presión vuelve a la posición neutra de 0 hPa.
- El uso de 300-450 hPa de presión para la inyección para asegurar la presión adecuada para el llenado uniforme de la superficie / espacio meníngeo pial, coloque la punta cerca de la inyección de parafina referencia cinematográfica cera pipeta (desde 2.2) y utilizar el pedal del inyector micro para expulsar un volumen sobre la película de cera de parafina. Ajuste la presión en consecuencia hasta que la cantidad expulsada es igual a la referenc previamente pipeteadael volumen de correo.
- Una vez que la punta ha sido equilibrada y la anestesia se ha confirmado, cachorros están listos para ser inyectado.
- El objetivo del experimento es para inyectar la mezcla de plásmido bajo el cráneo y por encima de la superficie de la pía madre para permitir para la electroporación de ADN hacia abajo en los progenitores superficie pial (Figura 1A). Para las inyecciones de la corteza, mantenga el cachorro hacia abajo con el pulgar y el dedo índice de la mano menos dominante. Los hemisferios corticales y otras estructuras superficiales tales como los tubérculos cuadrigéminos superiores son visibles entre P0 y P2, lo que permite la fácil orientación de estas estructuras (Figura 1B). Uso de la región dominante mano y de destino deseado de la corteza (es decir, motor, somatosensorial, etc), insertar la pipeta más allá de la piel y el cráneo con cuidado para evitar las arterias cerebrales. Asegúrese de que para evitar cualquier penetración adicional de la punta más allá del cráneo (que se indica por la falta de resistencia adicional justo después de la perforación del cráneo).
- Inyectar plasmaID de solución mediante el pedal del inyector micro y asegúrese de que se dispersa de forma homogénea en el tejido (Figura 2A).
Nota: Es muy importante determinar empíricamente un enfoque que maximiza la entrega plásmido evitando al mismo tiempo un hematoma debido a la presión de fluido. Esto se puede hacer mediante el ajuste de la duración de la inyección, el ángulo, el volumen, y el sitio diana precisa para evitar la interrupción vascular. - No deje de probar y mantener la punta de la desecación entre inyecciones colocando la punta en forma de gotitas de prueba de las inyecciones de operaciones anteriores en el papel de la cera de parafina o película plástica. Esto es necesario para evitar la acumulación de punta de solución de ADN se evaporó y se cristalizó, que puede resultar en la obstrucción de la punta y volúmenes de entrega inconsistentes.
3. Electroporación
- Ajuste el Electroporador a 135-150 V para cinco pulsos, con una duración de 50 ms, con 950 ms en intervalos entre cada pulso. Con el fin de aumentar la conductancia yevitar la quema de la piel, cubrir de 3 mm tweezertrodes platino con gel de electroporación. Compruebe si los reflejos de los pies-pellizcos y de la cola en este punto para asegurar la anestesia. Si sensible, colocar en hielo durante varios minutos para anestesiar.
- Para la corteza (y colículo superior) inyecciones, emplear un electrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar la viabilidad de las crías (en comparación con el 7 - y 10-mm electrodos, que se utilizan para la electroporación zona ventricular). Coloque la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor de la región contralateral debajo del ojo de tal manera que la orientación del electrodo es en un ángulo de 45-60 ° con relación a la línea media (Figura 2C).
- Use el pedal del electroporador para activar la corriente y mantenga tweezertrodes en lugar de 3-5 pulsos, dependiendo de la edad de las crías y el peso, la orientación efectiva de ADN en las células de la superficie pial subyacentes en la contabilización de curvaturade los hemisferios.
Nota: El polo negativo se puede barrer sobre la zona de inyección en entre pulsos o un electrodo más grande puede ser empleado para aumentar el área de electroporación. - Inmediatamente después de la electroporación, la limpieza cuidadosa del gel a partir de crías y colocarlos bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 5 min.
- Los cachorros serán agudamente perder su color rojizo y rosado natural en los minutos después de la electroporación por cianosis. Tenga en cuenta las crías para la recuperación de color natural y el inicio de un movimiento normal antes de devolverlos a sus jaulas.
- Asegúrese de resocialización con la madre observando si ella trae las crías al nido y comienza la preparación de ellos. Si ella se vuelve agresivo, asegúrese de que las crías no tienen restos de gel y los incuban con algunos de la ropa de cama para transferir el olor de los cachorros.
4. Modificaciones para Apuntando al colículo superior
Orientación:
- Inject el colículo superior de la misma manera como la corteza, pero en cuenta que la región diana se encuentra justo posterior y lateral a lambda y más o menos en la línea media (Figuras 3A y 3B). Con inyecciones exitosas, la mezcla de plásmido llena, naturalmente, los contornos de la colículo superior. Una vez que las inyecciones se han realizado con éxito, los animales están listos para la electroporación.
Electroporación:
- De manera muy similar, para inyecciones del colículo superior, colocar la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor del ojo, hocico o la barbilla, la conducción de ADN en las regiones superficiales de la colículo superior (Figura 3C) . En este caso, la orientación del electrodo es en un ángulo de 25-40 ° con relación a la línea media.
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Representative Results
Pial superficie resultados de electroporación en la expresión de ADN plásmido en las células progenitores-sobre todo-en o cerca de la superficie pial 6. Más específicamente, la orientación de los electrodos es crítica en el dictado de la dirección del movimiento plásmido y expresión posterior. Por lo tanto, en configuraciones de electrodos duales, el plásmido está dirigida más o menos en un vector recta entre el electrodo negativo y positivo. Por lo tanto, si el polo negativo se coloca sobre el sitio de la inyección y el polo positivo es ventral al polo negativo, el plásmido se verá obligado en la superficie de la pía madre. Se asume que la orientación de los electrodos para producir vectores de corriente perpendicular a la superficie sería más ideal. Con la orientación del electrodo apropiado y el uso de electrodos más pequeños más focalizados de manera focal, la supervivencia es del 100%. Sin embargo, en algunas regiones, como el cerebro medio, el cuidado tiene que ser tomado para evitar la entrega de corriente que puede detener el corazón, y por lo tanto causandoe reducción de la viabilidad de las crías de ratón por electroporación. Configuraciones tri-electrodos recién descritos u otras modificaciones pueden ayudar en la selección de las regiones más difíciles evitando estructuras que intervienen en funciones vitales como la frecuencia cardíaca 28. Es importante observar cachorros para apropiado de re-calentamiento a la temperatura de su cuerpo natural, lo que es evidente por el movimiento y color. Cuando regresan a color, que pueden ser colocados de nuevo en el nido. Las madres de CD1 cepa de ratones que con mayor frecuencia empleamos comienzan inmediatamente nutrir a las crías devueltos. Sin embargo, otras cepas pueden ser más variables, llegando a ser agresivo o negligente. Transferir el olor de la ropa de cama a las crías normalmente evita estos problemas. En las cepas donde la negligencia o la agresión son graves, el fomento de las crías de madres de la cepa CD1 es la mejor solución.
Las células marcadas se observan por lo general varios meses después de la electroporación 6. Sin embargo, como con cualquier ELmétodo ectroporation, el plásmido de ADN se diluye con la división celular 29. El mismo grado de dilución de plásmido visto en las poblaciones de ciclos rápidos (por ejemplo progenitoras SVZ) no se observa en nuestra población de la superficie de la pía madre, lo que sugiere una menor proliferación 6. Sin embargo, ahora emplean tecnologías de transposición descritos recientemente (por ejemplo, piggyBac) para mitigar este problema de dilución por completo al permitir para la inserción estable de transposones en el ADN genómico 29, 30. Alternativamente, Cre recombinasa plásmidos que expresan podrían electroporación en reportero ratones Cre mediar rastreo genético estable de estas células 31.
Nuestros resultados iniciales han sugerido que la mayoría de las células son mitótico en el momento de la electroporación 6, de acuerdo con los datos descritos en el SNC embrionario-específicamente, que la electroporación las etiquetas de un conjunto de células que proliferan entre las fases S y M del ciclo celular 24. Sin embargo, se necesita más investigación para definir la identidad y linajes de células sometidas a electroporación en la superficie de la pía madre, así como para determinar definitivamente su carácter proliferativa ya que hay muchos ejemplo de química espuria y etiquetado genético de las células en la literatura 4. Por otra parte, hemos observado lugar de la inyección local no se toma hematoma, especialmente en la corteza-cuando la atención la entrega de volúmenes pequeños o cuando no se siguen las precauciones adecuadas para evitar la interrupción vascular.
Nuestra caracterización anterior indica al menos dos linajes de células - precursores de astrocitos y progenitores interneuron 6. Los astrocitos tienden a permanecer en la superficie pial (Figura 4) y cada célula forma una densa nube de astrocítica periférica procesa 6. Las interneuronas permanecen en su mayoría en la superficie pial pero algunas células se pueden encontrar en casi todas las capas corticales o profundos en el colículo superior 6. Thneuronas ESE exhiben amplias dendritas, que puede ser tan largo como varios cientos de micras (Figura 4B). No hemos observado pruebas para el etiquetado de los oligodendrocitos o neuronas excitadoras en la corteza 6. La mayoría de las células sometidas a electroporación parece haber pasado a través de la mitosis en estrecha proximidad temporal con el procedimiento EP corteza 6. Específicamente, electroporación células EGFP + son de doble etiqueta con el marcador BrdU replicación del ADN cuando es pulsado en 2 h antes con este análogo de la timidina (Figuras 4C-4C 3). Sin embargo, es importante señalar que hemos visto evidencia de etiquetado de células pericítico y / o endotelial en estas regiones 6.
Figura 1. Electroporación dela superficie pial neonatal (A) sección esquemática coronal que muestra la región de la corteza que se dirige después de la inyección. Las células que se muestran a lo largo de las capas de la corteza son ejemplos de poblaciones mixtas reales observados de células electroporadas, incluyendo progenitores y precursores astrocystic interneuronales. (B) Imagen de un postnatal día 2 de ratón antes de la inyección, destacando las regiones de interés superficie pial, la corteza (Ctx) y colículo superior (SC).
Figura 2. Electroporación postnatal de la corteza superficial (A) Ejemplo de inyección de la corteza dorsal después de la orientación del punto medio entre el ojo y lambda, antes de la electroporación. (B) En función de lala edad de las crías y región de interés, flexibilidad variados tamaños de tweezertrodes de platino se puede utilizar para la electroporación (3 mm, 7 mm, y 9 mm). Electrodos de diámetro de 3 mm se utilizan normalmente para la electroporación superficie pial (véase el texto para el debate). (C) La electroporación de la corteza. Tenga en cuenta la colocación de los tweezertrodes, la colocación de la sonda positiva por debajo del ojo, permitir que la corriente a ser conducido a la parte ventral.
Figura 3. Colículo superior dirigido electroporación posnatal (A) Inyección de un cachorro de 2-días de edad en el colículo superior, que muestra el sistema de retención manual de la cría anestesiado y la colocación de la punta de pipeta justo más allá del cráneo. (B) Inyección mostrando el plasma dispersasolución de ADN Identificación de la región del colículo superior (SC). (C) La colocación de los tweezertrodes para la electroporación de la SC, el ADN hacia la superficie dorsal de la SC en el sitio de la inyección se conduce. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Colículo superior dirigido electroporación posnatal (A) En la cara, máxima proyección de imagen confocal de pilas de la corteza dorsolateral ~ 2 semanas después de la electroporación de plásmidos informadores fluorescentes de control que expresan membrana-etiquetados trébol 32 (verde) y TagBFP2 33 proteína nuclear (fluorescencia azul pseudocolored rojo). (B) Corte coronal de un interneuronas corticales aproximadamente dos meses después de la electroporación, mostrando extensas dendritas. Las barras de escala miden 100 m en (A, C) y 40 micras en (B). (CC 3) Sección sagital de la superficie de la pía madre del colículo superior que demuestra que la mayoría de las células EGFP + son etiquetados por un solo pulso de BrdU 2 horas antes de la electroporación.
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Discussion
El aspecto más crítico para la electroporación éxito de progenitores superficie pial son: 1) la orientación de la mezcla de plásmido a la superficie de la pía madre; 2) evitando la generación de hematomas en el lugar de la inyección; y 3) evitar la mortalidad asociada con la electroporación mesencéfalo.
Apropiadamente la orientación de la superficie de la pía madre se lleva a cabo por punción medido y cuidadoso del cráneo para evitar la penetración de la superficie de la pía madre. Inadecuada focalización para la piel suprayacente o el ventrículo subyacente o parénquima cerebral se demostrará mediante: 1) el desplazamiento del tinte verde rápido con la piel al frotar suavemente el tejido (es decir, el verde rápido se localiza por encima de la calavera en la piel y el tejido conectivo) o 2) por la desaparición del colorante verde rápido en el cerebro, lo que indica que la mezcla de plásmido ha entrado en el ventrículo y / o parénquima. Pial localización adecuada de la superficie de la mezcla de plásmido se evidencia por la acumulación de colorante debajo del cráneo ªpor lo que no puede ser perturbado por el desplazamiento suave de la piel. Sin embargo, se requiere práctica y destreza para esta focalización exitosa. Formación de hematoma es probablemente causado por la ruptura de los vasos por la inyección de plásmido. Los coágulos de sangre se pueden observar en el sitio de la inyección en los días y semanas después de la electroporación, cuando se recolecta el tejido. Para evitar hematomas, ajuste la longitud de pulso de la inyección de fluido y / o tomar nota del patrón general de la vasculatura cerebral para evitar la interrupción del vaso. En general, el colículo superior es menos susceptible a la coagulación. La muerte debido a la corriente eléctrica entregada por los tweezertrodes se puede evitar fácilmente mediante el uso de 3 tweezertrodes mm para entregar más focalmente actual y por la dirección de los electrodos de distancia desde el cerebro medio ventral como se demostró (Figuras 2C y 3C).
Un jefe de deficiencia de la técnica es que el área objetivo está limitada por el tamaño de la dispersión de la solución plásmidoy el tamaño de los electrodos. Una entrega de 0,5 l de plásmido genera un área de aproximadamente 3 mm y, por lo tanto, es bien adaptado para el tamaño de electrodo de 3 mm. Cualquiera que sea la medida es menor (área de solución propagación o área paddle electrodo) dictará el tamaño final de la revisión de las células sometidas a electroporación. Además, sólo un subconjunto de células se marcan debido a la necesidad para la mitosis para la expresión del transgen 24. Sin embargo, esto es ventajoso para el estudio de tallo o poblaciones progenitoras y la diferenciación celular.
Pial electroporación superficie es un método que permite la manipulación genética de los progenitores robusta superficie pial y sus descendientes. Esta técnica es rápida, simple y eficiente, proporcionando un medio más específicos y más fácil de la orientación de estas células en comparación con el único otro enfoque-retroviral de transducción comparables. Producción viral alta titulación requiere habilidad, semanas de tiempo, y no plantea riesgos para la seguridad - en especial en el caso de Pseu pantrópicaretrovirus yped. Por otra parte, la electroporación es algo más flexible, ya que no requiere la clonación viral y la producción. Cualquier vector de expresión eucariota puede ser empleado, incluyendo plásmidos virales. Además, plásmidos maxiprep-ED pueden ser mezclados y emparejados para una fácil co-electroporación. Típicamente, hay un ~ 90-95% de co-expresión de dos plásmidos dados con promotores similares. En Cabe señalar que mientras que nosotros sólo hemos utilizado esta técnica focalización en la corteza y el colículo superior, el método debe ser susceptible a la mayoría de las regiones pial o superficiales de la CNS, siempre que haya espacio para la acumulación local de ADN plásmido antes de la entrega actual .
La electroporación por naturaleza tiende a favorecer la transducción de las células mitóticas 24. Por lo tanto, la electroporación de los animales adultos debería ser posible, pero probablemente resultaría en muchas menos células que expresan transgenes debido a la reducción de la actividad proliferativa con el envejecimiento. Sin embargo, se detalla como recientemente por Jaubodiny colegas, la focalización de células postmitóticas en esta región podría ser posible mediante el empleo de trans-ciclohexano-1, 2 - diol, el cual permite el acceso plásmido nuclear por permeablilizing la envoltura nuclear 25. Además, la electroporación es muy compatible con las tecnologías Cre u otros tipos de ratón modificados 31. Finalmente, la tecnología permitirá transposón para la transgénesis somática estable de esta población 29, 30. En total, la electroporación superficie pial representa una herramienta excepcional y flexible para la manipulación genética de estos dominios progenitoras únicas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto del Cáncer Cancer Research Award Samuel Oschin Integral Foro, así como los fondos del Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, y la familia de Guerin. El proyecto que se describe fue apoyado en la forma de un CTSI Core Vale financiado por el Centro Nacional de Recursos para investigación, Grant UL1RR033176, y ahora está en el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, de Grant UL1TR000124. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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