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Biology

डीएनए Crosslinked Polyacrylamide Hydrogels की तैयारी

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

हमारी प्रयोगशाला बेहतर सेल समारोह पर ऊतक कठोरता modulating के प्रभाव को समझने के लिए डीएनए Crosslinked polyacrylamide हाइड्रोजेल, एक गतिशील हाइड्रोजेल प्रणाली विकसित की है. यहाँ, हम इन हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए योजनाबद्ध, वर्णन, और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Abstract

Mechanobiology सेल आकारिकी और समारोह के निर्देशन में शारीरिक संकेतों की महत्वपूर्ण भूमिका पते कि एक उभरती वैज्ञानिक क्षेत्र है. ऊतक कठोरता रोग, विकास, और चोट के साथ modulates क्योंकि उदाहरण के लिए, सेल समारोह पर ऊतक लोच का प्रभाव mechanobiology अनुसंधान का एक प्रमुख क्षेत्र है. कोशिकाओं चढ़ाया जाता है एक बार कठोरता में परिवर्तन नहीं कर सकते हैं कि स्टेटिक ऊतक नकल उतार सामग्री, या सामग्री, मुख्यतः सेल कार्यों पर ऊतक कठोरता के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. स्थिर पढ़ाई से एकत्रित जानकारी मूल्यवान है, इन अध्ययनों विवो में सेलुलर microenvironment की गतिशील प्रकृति के संकेत नहीं हैं. बेहतर सेल समारोह पर गतिशील कठोरता के प्रभाव का पता करने के लिए, हम एक डीएनए Crosslinked polyacrylamide हाइड्रोजेल प्रणाली (डीएनए जैल) विकसित की है. अन्य गतिशील substrates के विपरीत, डीएनए जैल कमी या उत्तेजनाओं के बिना निर्माण के बाद कठोरता में वृद्धि करने की क्षमता है. डीएनए जैल डीएनए crossl से मिलकरएक polyacrylamide रीढ़ में polymerized रहे हैं कि स्याही. जोड़ना और एकल असहाय डीएनए के वितरण के माध्यम से crosslinks हटाने अस्थायी, स्थानिक, और जेल लोच की प्रतिवर्ती नियंत्रण की अनुमति देता है. हम डीएनए जेल लोच के गतिशील मॉडुलन fibroblast और न्यूरॉन व्यवहार को प्रभावित करती है कि पिछली रिपोर्टों में दिखाया गया है. इस रिपोर्ट और वीडियो में, हम तैयारी डीएनए जैल पर डीएनए जेल crosslinking तंत्र और कदम दर कदम निर्देश का वर्णन है कि एक योजनाबद्ध प्रदान करते हैं.

Introduction

स्थिर और गतिशील substrates सेल समारोह पर ऊतक लोच या कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है कि biomaterials की दो श्रेणियां हैं. स्टेटिक substrates वे कोशिकाओं चढ़ाया जाता है और / या एक बार गढ़े हैं बाद उनके भौतिक गुणों को बदलने में असमर्थ हैं. Polyacrylamide (पीए) जैल mechanobiology जांच 5,17 के लिए संश्लेषित किया गया है कि पहले दो आयामी, स्थिर substrates थे. पीए जैल बहुमुखी, सस्ती, आसानी से तैयार कर रहे हैं, और लोचदार moduli की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ निर्मित किया जा सकता है. इन तकनीकी फायदे पीए एक सामान्यतः लागू सब्सट्रेट जैल बनाने हालांकि, स्थिर substrates विवो में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और आसपास के सेलुलर वातावरण की गतिशील प्रकृति के संकेत नहीं हैं. उदाहरण के लिए, ईसीएम चोट, विकास, या रोग का एक परिणाम के रूप में कठोरता परिवर्तन आए. गतिशील substrates इसलिए mechanobiology पढ़ाई में ऊतक नकल उतार सब्सट्रेट मॉडल के रूप में इष्ट हैं

कई सिंथेटिक, प्राकृतिक, दो आयामी, तीन आयामी, स्थिर, और गतिशील biomaterials ऊतक कठोरता 1,3,6,16,23,26 नकल करने के लिए विकसित किया गया है. कुछ गतिशील substrates उनके यांत्रिक गुणों 2,4,7,8,12,15,16 को बदलने के लिए गर्मी, यूवी, विद्युत धारा, आयनों, और पीएच परिवर्तन की आवश्यकता है, लेकिन इन उत्तेजनाओं हाइड्रोजेल की जैव आवेदन सीमित कर सकते हैं. डीएनए Crosslinked polyacrylamide हाइड्रोजेल (डीएनए जैल) गतिशील दो आयामी लोचदार substrates हैं. डीएनए crosslinks मीडिया के लिए एकल असहाय डीएनए (ssDNA) के अलावा द्वारा डीएनए जेल कठोरता की, अस्थायी स्थानिक, और प्रतिवर्ती मॉडुलन के लिए अनुमति देते हैं या 9-11,13,14,18,21 बफर. उत्तेजनाओं लोच के मॉडुलन के लिए लागू कर रहे हैं, जहां aforementioned गतिशील जैल के विपरीत, डीएनए जैल लोच के परिवर्तन के लिए एप्लाइड ssDNA के प्रसार पर भरोसा करते हैं. इसलिए, कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं, जहां ऊपरी जेल सतह,, दर ओ क्योंकि संग्राहक पहला क्षेत्र हैच लोच मॉडुलन जेल मोटाई पर निर्भर है.

डीएनए जैल हालांकि बीआईएस acrylamide crosslinks डीएनए (चित्रा 1) से बना crosslinks के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं, वे एक polyacrylamide रीढ़ है कि उनके पीए जेल समकक्षों के समान हैं. दो ssDNAs (SA1 और SA2) जेल के डीएनए crosslinks बनाने के लिए एक crosslinker किनारा (एल 2) के साथ संकरण. SA1 और SA2 दोनों पीए नेटवर्क में प्रभावी समावेश के लिए 5'अंत में एक Acrydite संशोधन होते कि अलग दृश्यों है. जैल, SA1 और SA2 की तैयारी के लिए व्यक्तिगत रूप से एक पीए रीढ़ में polymerized रहे हैं और, बाद में, polymerized SA1 और SA2 एक साथ मिश्रित कर रहे हैं. एल 2, crosslinker, SA1 और SA2 मिश्रण में जोड़ा जाता है. L2 के आधार अनुक्रम दोनों SA1 और SA2 दृश्यों के लिए पूरक है और L2 डीएनए crosslinks के लिए फार्म SA1 प्लस SA2 साथ hybridizes. प्रारंभिक, डीएनए जेल लोच एल 2 सांद्रता और crosslinking (टेबल्स 1 दोनों द्वारा निर्धारित किया जाता है 2). SA1 और SA2 (100% जैल के रूप में नामित) एल 2 से 100% Crosslinked हैं क्योंकि एल 2, SA1, और SA2 के बराबर stoichiometric मात्रा युक्त डीएनए जैल stiffest जैल हैं. इसलिए एक कम डीएनए crosslinking का प्रतिशत और, में L2 के परिणाम की कम सांद्रता, नरम डीएनए जैल. (50% जैल के रूप में नामित) 50% Crosslinked जितनी कम जैल 9-11 निर्माण किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 डीएनए जेल crosslinking और uncrosslinking योजनाबद्ध 9-11,13,14,18,21 चरण 1:. SA1 (लाल) और SA2 (नीला) व्यक्तिगत रूप से एक polyacrylamide रीढ़ (काला) में polymerized रहे हैं. Polymerization के बाद, SA1 और SA2 polymerized समाधान एक साथ मिश्रित कर रहे हैं. चरण 2: एल 2 (हरा) जोड़ा और जेल की crosslinks के लिए फार्म SA1 प्लस SA2 साथ hybridizes है. चरण 3: आर 2 टी के साथ hybridizesवह L2 के toehold. चरण 4: R2 के toehold संकरण SA1 और SA2 से L2 के unzipping बढाती.

पीए जैल के विपरीत, डीएनए जैल ठोस बनाना सकते हैं और संश्लेषण के बाद नरम. कारण है कि, डीएनए जैल पर विकसित कोशिकाओं गतिशील कठोरता परिवर्तन के अधीन किया जा सकता है. सेल पक्षपाती जैल ठोस बनाना, एल 2 crosslinks का प्रतिशत बढ़ाने के लिए कम प्रतिशत जैल की संस्कृति मीडिया में जोड़ा जा सकता है. सेल पक्षपाती जैल नरम करने के लिए, एल 2 crosslinks 10,13,21 का प्रतिशत कम करने के लिए हटाया जा सकता है. L2 L2 SA1 और SA2 (1 टेबल) से uncrosslink करने की अनुमति 3'अंत में एक अतिरिक्त toehold अनुक्रम है. एल 2 को हटाने के आर 2 नामक एक उत्क्रमण कतरा के संकरण द्वारा पूरा किया है. आर 2 एल 2 की पूरी लंबाई के लिए पूरक है और L2 toehold साथ पहली hybridizes. Toehold संकरण Crosslink समाप्त और जेल कठोरता को कम कर देता है जो SA1 और SA2 से L2 के unzipping, आगे बढाती है.

इस रिपोर्ट में औरनिर्देश stiffening और डीएनए जैल नरमी की तैयारी के लिए प्रदान की जाती हैं कदम दर कदम वीडियो,. 100% और 80% जेल तैयारी में वर्णित हैं, वहीं इस प्रोटोकॉल अन्य प्रारंभिक और अंतिम Crosslinked प्रतिशत की डीएनए जैल बनाने के आधार पर किया जा सकता है. सामान्य में, 100% और 80% जैल, तैयार कर रहे हैं कांच कवर फिसल जाता है पर स्थिर, functionalized, और कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त. L2 के 80% जैल के मीडिया में जोड़ा जाता है और R2 100% जैल, चढ़ाना के बाद 48 घंटे के मीडिया में जोड़ा जाता है. मीडिया के लिए R2 के अलावा Crosslinked 80% से 100% जैल softens जबकि मीडिया को L2 के अलावा, 100% Crosslinked को 80% जैल stiffens. Stiffened जैल 80 → 100% जैल के रूप में नामित कर रहे हैं और नरम जैल पाठ में 80 → रूप में 100% जैल नामित कर रहे हैं. नियंत्रण या स्थिर जैल, ssDNA लिए TS से मिलकर या के रूप में 100% और 80% जैल का एक और सेट करने के लिए दिया जाता है. लोच मॉडुलन निम्नलिखित दो दिनों की एक न्यूनतम के बाद, कोशिकाओं संसाधित और विश्लेषण किया जा सकता है.

डीएनए Crosslink ठिकानों की # अनुक्रम (toehold) संशोधन तापमान के पिघलने (टी एम, डिग्री सेल्सियस) टिप्पणियां
5 '→ 3'
डिजाइन 1 SA1 10 जीसीए सी सी टी टीटीजी सी 5 'Acrydite 34.9
SA2 10 जीटीसी आगा ATG एक 5 'Acrydite 23.6
एल 2 30 टीसीए टीटीसी TGA सी जीसी एएए GGT जीसी जी सीटीए सीएसी टीटीजी 56 एक 10 बीपी toehold अनुक्रम शामिल है.
आर 2 30 CAA GTG टैग CGC एसीसी TTT GCG टीसीए GAA TGA आर 2 L2 के लिए पूरक है
डिजाइन 2 SA1 14 CGT GGC अता GGA सीटी 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT टीसीसी CAA टीसीए जीए 5 'Acrydite 40.2
एल 2 40 TCT जी ए टी TGG GAA एसी एक जीटीसी सीटीए टी जी सी सीएसी जी जी.टी. टीएसी सीटीटी कैट सी 65.9 एक 12 बीपी अनुक्रम toehold शामिल है.
आर 2 40 जी ए टी GAA GGT एएसी CGT GGC अता GGA CTG TTT सीसीसी AAT कैग एक 65.9 आर 2 L2 के लिए पूरक है
Desig3 SA1 20 ACG भूमिकाः GTG बुनना जीसीए ATG टीसी 5 'Acrydite 55
SA2 20 कैट GCT टैग GGA सीजीए CTG जीए 5 'Acrydite 56.6
एल 2 40 टीसीसी AGT CGT सीसीसी TAA जीसीए टीजी जी एसीए टीटीजी कैट एसीए सी सी टी CCG टी 68.8 Toehold शामिल नहीं है.
नियंत्रण नियंत्रण 20-40 एएए एएए (आदि) या
TTT TTT (आदि)

सेलुलर और यांत्रिक पढ़ाई डी कई का उपयोग किया है. SsDNA 9-11,13,14,18,21 के लिए तालिका 1 बेस दृश्योंifferent Crosslink डिजाइन स्थिर और गतिशील यांत्रिक गुणों की एक सीमा के साथ डीएनए जैल उत्पन्न करने के लिए. Crosslink डिजाइन में संग्राहक मापदंडों के आधार अनुक्रम और अनुक्रम लंबाई या Crosslink लंबाई हैं. बोल्ड और इटैलिक फोंट SA1 और L2 के बीच और क्रमशः SA2 और L2 के बीच आधार बाँधना वर्णन.

डिजाइन
1 2 3
Acrylamide एकाग्रता (%) 10 10 10 4
SA1 प्लस L2 के लिए संकरित SA2 (% Crosslinked) 50 80 100 50 80 100 100 100
<मजबूत> लोच (kPa, मतलब ± SEM) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

तालिका 2 डीएनए जैल 9-11,13,14,18,21. Acrylamide एकाग्रता, Crosslink प्रतिशत, और Crosslink लंबाई की यंग मापांक (ई) डीएनए जैल में संग्राहक जा सकता है. डिजाइन 1, 2, और 3 क्रमश: 20, 28, और 40 बीपी Crosslink लंबाई है. सभी डिजाइन के लिए 100% जैल जेल लोच को प्रभावित नहीं करता Crosslink लंबाई का संकेत भी इसी moduli है. हालांकि, acrylamide एकाग्रता में बदलाव डीएनए जेल लोच बदल.

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Protocol

नोट: सेल प्रसंस्करण के लिए जेल तैयारी से पूरे प्रोटोकॉल छह दिनों की एक न्यूनतम लेता है. जेल तैयारी के लिए अनुमानित समय 8 घंटे से अधिक एक हे / एन ऊष्मायन है. जेल स्थिरीकरण और डीएनए annealing के लिए अनुमानित समय 8 घंटे से अधिक एक हे / एन rinsing कदम है. जेल functionalization के लिए अनुमानित समय 2 घंटा है. सेल चढ़ाना और विकास के लिए समय संस्कृति के प्रकार और आवेदन पर निर्भर है, लेकिन चार दिनों की एक न्यूनतम आवश्यकता है.

डीएनए जैल के 1. तैयारी

नोट: तीन अलग चरणों में डीएनए जैल तैयार करें. सबसे पहले, व्यक्तिगत रूप से एक पीए रीढ़ में SA1 और SA2 ssDNA भाजन. ये समाधान SA1 polymerized समाधान और SA2 polymerized समाधान, क्रमशः कहा जाता है (§1.1). दूसरा, crosslinker, प्रतिवर्ती किनारा, और नियंत्रण ssDNAs भंग. Lyophilized L2 ssDNA (crosslinker) भंग. इस L2 के समाधान 100% कहा जाता है और 100% जैल (§1.2) बनाना प्रयोग किया जाता है. 100% L2 के समाधान के एक विभाज्य पतला80% करने के लिए. इस L2 के समाधान 80% कहा जाता है और 80% जैल निर्माण किया जाता है. §4 में उपयोग करने के लिए lyophilized आर 2 (प्रतिवर्ती किनारा) और नियंत्रण ssDNA भंग. क्रमशः, 100% और 80% जैल के लिए फार्म 10: 6 (एल 2 SA1: SA2) तीसरे, 10 के अनुपात में SA1 polymerized समाधान, SA2 polymerized समाधान, और 100% या 80% L2 के समाधान मिश्रण. (§1.3).

SA1 और SA2 polymerized समाधान की 1. तैयारी

  1. चुने और टेबल्स 1 और 2 से उपयुक्त SA1, SA2, एल 2, और r2 आधार दृश्यों के आदेश. बेस दृश्यों और अनुक्रम की लंबाई पिछली रिपोर्टों 9-11,13,14 में अनुकूलित किया गया.
  2. सभी समाधान योगों (टेबल्स 3-4) की गणना. नोट: समस्या निवारण प्रयोजनों के लिए सावधानी से दस्तावेज गणना. एक एक्सेल टेम्पलेट के निर्माण की सिफारिश की है और डीएनए जेल तैयारी के लिए बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है. (डिजाइन 2 के लिए सारणीकरण का एक उदाहरण के लिए टेबल्स 3 और 4 कृपया देखेंटेबल्स 1 और 2). तालिका 4 में विनिर्दिष्ट मात्रा में इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाएगा, लेकिन संस्करणों lyophilized ssDNA के हर विभाज्य के साथ अलग अलग होंगे.
समाधान समाधान के शेयर एकाग्रता SA1 या SA2 polymerized समाधान में शेयर समाधान के प्रतिशत (वी / वी) SA1 या SA2 polymerized समाधान में समाधान के अंतिम एकाग्रता
Acrylamide (कोई Bisacrylamide) 40% 25 10%
SA1 या SA2 समाधान 100% 60 60%
TBE बफर 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0.50%
ए पी एस 2% 2.5 0.05%

तालिका 3. SA1 या SA2 polymerized समाधान fabricating के लिए समाधान का प्रतिशत. पहले कॉलम डीएनए जैल तैयार करने के लिए समाधान से पता चलता है. दूसरा स्तंभ इन समाधान के शेयर सांद्रता से पता चलता है. तीसरे स्तंभ SA1 या SA2 polymerized समाधान में शेयर समाधान के प्रतिशत से पता चलता है (वी / वी). अंतिम स्तंभ SA1 और SA2 समाधान में अंतिम सांद्रता को दर्शाता है.

ssDNA समाधान (§1.1) <tr>
समाधान अवयव
समाधान शेयर एकाग्रता अंतिम समाधान एकाग्रता गणना रकम जोड़ने के लिए टिप्पणियां
SA1 समाधान Lyophilized SA1 ssDNA के 320.7 nmol 3.00 मिमी 320.7 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 107 μl Lyophilized ssDNA करने ते बफर के 107 μl SA1 समाधान SA1 polymerized समाधान का 60% है.
107 μl / 0.600 = 178 μl
178 μl SA1 polymerized समाधान (तालिका 3) की कुल मात्रा है.
SA2 समाधान Lyophilized SA2 ssDNA के 324.4 nmol 3.00 मिमी 324.4 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 108 μl Lyophilized ssDNA करने ते बफर के 108 μl SA2 समाधान SA2 polymerized समाधान का 60% है.
108 μl / 0.600 = 180 μl
180 μl SA2 polymerized समाधान (तालिका 3) की कुल मात्रा है.
100% L2 समाधान Lyophilized L2 ssDNA के 657.4 nmol 3.00 मिमी 657.4 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 219 μl Lyophilized ssDNA करने ते बफर के 219 μl 80% L2 के समाधान के लिए 100% L2 के एक विभाज्य पतला
80% L2 समाधान 100% L2 ssDNA की 80 μl 80% - 100% L2 के समाधान के 80 μl के लिए ते बफर के 20 μl
नियंत्रण समाधान Lyophilized के 332.6 nmol पाली टी या एक ssDNA 3.00 मिमी 332.6 nmol / 3.00 nmol μl <समर्थन> -1 = 111 μl Lyophilized ssDNA करने ते बफर के 111 μl
R2 समाधान Lyophilized R2 ssDNA के 193.8 nmol 3.00 मिमी 193.8 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 64.6 μl Lyophilized ssDNA करने ते बफर के 64.6 μl
Polymerized समाधान (§1.2)
SA1 polymerized समाधान 40% acrylamide 10% 178 μl X 0.25 = 44.5 μl 45 μl (ऊपर और 3 टेबल देखें) 178 μl की कुल मात्रा के आधार पर acrylamide, TBE, पी एस, और TEMED की राशि की गणना.
10x TBE 1x 178 μl X 0.10 = 17.8 μl 18 μl
100% SA1 समाधान 60% - 107 μl SA1 समाधान SA1 polymerized समाधान का 60% है (ऊपर और 3 टेबल देखें).
2% ए पी एस 0.05% 178 μl एक्स 0.025 = 4.45 μl 4.5 μl जोड़ें और TEMED जोड़ने से पहले पी एस मिश्रण.
20% TEMED 0.50% 178 μl एक्स 0.025 = 4.45 μl 4.5 μl
SA2 polymerized समाधान 40% acrylamide 10% 180 μl X 0.25 = 45 μl 45 μl (ऊपर और 3 टेबल देखें) 180 μl की कुल मात्रा के आधार पर acrylamide, TBE, पी एस, और TEMED की राशि की गणना.
10x TBE 1x 180 μl X 0.10 = 18 μl 18 μl
100% SA2 समाधान 60% - 108 μl SA2 समाधान SA2 polymerized समाधान का 60% है (ऊपर और 3 टेबल देखें).
2% ए पी एस 0.05% 180 μl एक्स 0.025 = 4.5 μl 4.5 μl जोड़ें और जोड़ने से पहले पी एस मिश्रण TEMED
20% TEMED 0.50% 180 μl एक्स 0.025 = 4.5 μl 4.5 μl
जेल समाधान (§1.3)
100% जेल समाधान 100% SA1 polymerized समाधान 10 भागों - 10 μl निम्नलिखित SA1 के साथ 100% जैल लिखें: SA2: L2 के अनुपात, 10: 10: 6.
100% SA2 polymerized पution 10 भागों - 10 μl
100% L2 समाधान 6 भागों - 6 μl
80% जेल समाधान 100% SA1 polymerized समाधान 10 भागों - 10 μl निम्नलिखित SA1 के साथ 80% जैल लिखें: SA2: L2 के अनुपात, 10: 10: 6.
100% SA2 polymerized समाधान 10 भागों - 10 μl
80% L2 समाधान 6 भागों - 6 μl
गतिशील जैल (§3-4)
80 → 100% जेल 80% जेल 100% जीईएल गणना 1: संस्कृति मीडिया में 100% L2 के समाधान के 1 μl गणना कवर फिसल जाता है पर 20 μl जैल होने के आधार पर कर रहे हैं. सबसे पहले, μl में जेल की 20 μl में 100% L2 के समाधान के कुछ हिस्सों में परिवर्तित. दूसरा, crosslinking की एक अतिरिक्त 20% के लिए आवश्यक 100% L2 के समाधान के (μl में) राशि की गणना. जेल के लिए 100% L2 के समाधान की इस राशि जोड़ें.
(20 μl / 26 भागों) 6 भागों = 4.6 μl x
गणना 2:
5 μl X 0.2 = 1 μl
100 → 80% जेल 100% जेल 80% जेल गणना 1: संस्कृति मीडिया में 100% R2 के समाधान के 1 μl गणना कवर फिसल जाता है पर 20 μl जैल होने के आधार पर कर रहे हैं. सबसे पहले, टी परिवर्तितμl में जेल की 20 μl में 100% L2 के समाधान की वह भागों. दूसरा, एक 20% जेल रचना को हटाया जाना जरूरी 100% L2 के समाधान के (μl में) राशि की गणना. जेल को R2 के समाधान की इस राशि जोड़ें.
(20 μl / 26 भागों) 6 भागों = 4.6 μl x
गणना 2:
5 μl X 0.2 = 1 μl
100% जेल (नियंत्रण) 100% जेल 100% जेल - संस्कृति मीडिया में नियंत्रण समाधान के 1 μl नियंत्रण समाधान की राशि R2 के समाधान की राशि जोड़ी के बराबर है.
80% जेल (नियंत्रण) 80% जेल 80% जेल - संस्कृति मीडिया में नियंत्रण समाधान के 1 μl नियंत्रण समाधान की राशि L2 के समाधान गयी 100% की राशि के बराबर है.

टेबल डीएनए जेल तैयारी के लिए 4 उदाहरण गणना. मॉक संख्या 80%, 100% की तैयारी, 100 → 80%, और 80 → 100% जैल के लिए गणना वर्णन करने के लिए प्रदान की जाती हैं. डीएनए जैल तालिका 1 में डिजाइन 2 हैं.

  1. 15 सेकंड के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र lyophilized SA1 ssDNA सभी ssDNA शीशी के नीचे स्थित है यह सुनिश्चित करने के लिए. नोट: SA1 समाधान का उचित एकाग्रता डीएनए जेल संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. शीशी (टेबल्स 3-4) 1x Tris-EDTA के 107 μl, 8.0 पीएच बफर (ते बफर) जोड़कर 3 मिमी SA1 का समाधान तैयार है.
  3. SsDNA गोली 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक ते बफर में हीट SA1 पूरी तरह भंग है. नोट: ताप तापमान डीएनए एक एकल असहाय अवस्था में है यह सुनिश्चित करने के पिघलने के तापमान (टी एम) ऊपर 5 डिग्री सेल्सियस से कम से कम होना चाहिए.
  4. 40% acrylamide और 1 जोड़कर SA1 polymerization के समाधान तैयार0x Tris-Borate-EDTA संकेत प्रतिशत पर (TBE) बफर (3 टेबल). इस उदाहरण में, SA1 समाधान के 107 μl (तालिका 4) को क्रमश: 45 और 18 μl जोड़ें.
  5. 3 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ देगास मिश्रण की सुविधा के लिए. समाधान में एक नाइट्रोजन गैस स्रोत से जुड़ी एक P200 टिप डालें और धीरे धीरे नाइट्रोजन गैस समाधान के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं. छींटे रोकने के लिए degassing SA1 हल करने से पहले पानी में नाइट्रोजन गैस के प्रवाह की दर का परीक्षण करें.
  6. समाधान इकट्ठा करने के लिए 2,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
  7. जेल polymerization आरंभ करने के लिए 2% अमोनियम persulfate (ए पी एस, टेबल्स 3-4) के 4.5 μl जोड़ें.
  8. मिश्रण करने के लिए ट्यूब कई बार पलटना.
  9. समरूप polymerization के लिए समाधान इकट्ठा करने के लिए 2,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
  10. Polymerization को उत्प्रेरित करने के लिए 20% tetramethylethylenediamine (TEMED, टेबल्स 3-4) के 4.5 μl जोड़ें.
  11. ट्यूब उलटेंकई बार मिश्रण करने के लिए.
  12. समरूप polymerization के लिए समाधान इकट्ठा करने के लिए 2,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
  13. 3-5 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ देगास polymerization को पूरा करने और संयुक्त राष्ट्र प्रतिक्रिया व्यक्त monomers कम करने के लिए.
  14. Polymerization पूरा करने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए समाधान सेते हैं. नोट: इस समाधान SA1 polymerized समाधान कहा जाता है.
  15. दोहराएँ lyophilized SA2 ssDNA साथ 1.1.3-1.1.16 कदम, लेकिन acrylamide का 45, 18, ​​4.5, और 4.5 μl जोड़ने, TBE, पी एस, और TEMED, SA2 समाधान (टेबल्स 3-4) के क्रमश: 108 μl. नोट: SA1 और SA2 polymerized समाधान एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

एल 2, आर 2, और नियंत्रण के समाधान के 2. तैयारी

  1. Lyophilized R2 ssDNA साथ कदम 1.1.3-1.1.5 दोहराएँ लेकिन ते बफर (तालिका 4) के 64.4 μl जोड़ें.
  2. ते बफर के 111 μl (तालिका 4 lyophilized नियंत्रण ssDNA साथ 1.1.3-1.1.5 चरणों को दोहराएँ लेकिन जोड़
  3. Lyophilized L2 ssDNA साथ 1.1.3-1.1.5 चरणों को दोहराएँ लेकिन ते बफर (तालिका 4) के 219 μl जोड़ें. नोट: यह 100% L2 के समाधान है. SA1 और SA2 polymerized समाधान (देखें §1.3) एक 100% Crosslinked डीएनए जेल (100% जेल) बनेगी 100% L2 के समाधान जोड़ने SA1, SA2, और L2 stoichiometrically बराबर हो जाएगा.
  4. 100% L2 के समाधान के 80 μl (तालिका 4) के लिए 1x ते बफर के 20 μl जोड़कर 80% से 100% L2 के समाधान के एक विभाज्य पतला. नोट: यह समाधान 80% L2 के समाधान है. SA1 और SA2 का केवल 80% L2 के लिए Crosslinked किया जाएगा क्योंकि SA1 और SA2 polymerized समाधान (देखें §1.3) एक 80% Crosslinked डीएनए जेल (80% जेल) के रूप में होगा 80% L2 के समाधान जोड़ने. समाधान एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

जेल समाधान के 3 तैयारी

  1. हीट SA1 और समाधान चिपचिपापन तक 70 डिग्री सेल्सियस पर SA2 polymerized समाधान (लगभग 1 मिनट) कम है. 80 डिग्री तक तापमान ऊपर उठाएँसमाधान अभी भी पिपेट को भी चिपचिपा है अगर सी.
  2. 10 μl या 10 μl को SA1 polymerized समाधान के 10 भागों या SA2 polymerized समाधान (तालिका 4) के 10 भागों को जोड़ने. नोट: SA1 और SA2 polymerized समाधान पिपेट को अत्यंत चिपचिपा और मुश्किल हो जाता है. सांद्रता जेल गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं, इस बिंदु से आगे एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का उपयोग करें या अन्य निपटने की तकनीक के लिए चर्चा देखें. इसके अलावा, कई, छोटे aliquots (> 20 μl) के बजाय एक एकल, बड़ी मात्रा में पिपेट.
  3. एक साथ (70 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के लिए) हीटिंग बारी और 1 मिनट की कुल के लिए (एक विंदुक टिप के साथ 15 सेकंड के लिए) सरगर्मी के माध्यम से मिक्स SA1 और SA2 polymerized समाधान.
  4. एक 100% जेल (तालिका 4) के लिए फार्म 6 μl या 100% L2 के समाधान के 6 भागों को जोड़ने.
  5. ताप बारी और कदम 1.3.3 में वर्णित के रूप में सरगर्मी से मिलाएं.
  6. इष्टतम annealing के तापमान पर 1 घंटे (35 डिग्री सेल्सियस) के लिए हीट जेल. गणना एकसबसे कम तापमान के पिघलने (तालिका 1) के साथ ssDNA अनुक्रम से 5 डिग्री सेल्सियस घटाकर तापमान nnealing.
  7. एक 60 मिमी पेट्री डिश में 100% जेल पिपेट.
  8. डीएनए crosslinks आरटी पर 4 घंटे के लिए जेल incubating द्वारा rehybridize को जारी करने की अनुमति.
  9. पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त और आरटी पर ओ / एन सेते साथ कवर जेल. नोट: जैल के बारे में 3 बार उनकी प्रारंभिक मात्रा प्रफुल्लित होगा. इसके अलावा, जैल जैल से बाहर फैलाना होगा बफर और अतिरिक्त acrylamide के साथ संतुलित करना होगा. पीबीएस में कैल्शियम और मैग्नीशियम डीएनए संकरण को स्थिर करने और (toubleshooting जेल फोड़ के लिए चर्चा देखें) फोड़ जेल रोका जा सके.
  10. पेट्री डिश से शेष बफर निकालें.
  11. 80% जैल बनाना, दोहराने 1.3.1-1.3.10 कदम है, लेकिन 80% L2 के समाधान के साथ कदम 1.3.4 में 100% L2 के समाधान की जगह. अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% और 80% जैल स्टोर. नोट: 80% और 100% जैल के बीच कठोरता मतभेद शारीरिक रूप से अलग पहचाना जाता है.
    12. </ राजभाषा>

    ग्लास पर 2 जेल स्थिरीकरण

    नोट: कांच कवर फिसल जाता है पर 100% या 80% जैल की aliquots स्थिर (चित्रा 2).

    1. के बारे में 30 सेकंड के लिए या जेल pipetting के लिए कम चिपचिपा है जब तक 70 डिग्री सेल्सियस पर 100% जेल गर्मी.
    2. जगह कांच कवर एक 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर निकल जाता है और 1-2 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. प्रत्येक गिलास को कवर पर्ची के लिए ऑप्टिकल चिपकने की एक बूंद जोड़ें.
    4. प्रत्येक गिलास को कवर पर्ची (तालिका 4) के लिए 100% जेल के 20 μl जोड़ें. नोट: 10-30 μl प्रत्येक कवर पर्ची पर तिरस्कृत किया जा सकता है.
    5. जेल पिघला और गिलास को कवर पर्ची से अधिक प्रसार करने की अनुमति. नोट: जेल टोपोलॉजी, भी पिघलने के बाद दिखाई देते हैं एक siliconized गिलास को कवर पर्ची के साथ जेल समतल नहीं करता है. हालांकि, अतिरिक्त सूजन बाद के चरणों में होते हैं और जेल असमता के लिए योगदान देगा.
    6. 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर डिश में गर्मी ब्लॉक और जगह से कांच युक्त जेल निकालें.
    7. दोहराएँ 8 के साथ 2.1-2.6 कदम 0% जेल.
    8. इष्टतम annealing के तापमान (35 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए हीट जैल. नोट: यह जैल सूखी बनने के लिए सामान्य है और जैल पीबीएस में incubated हैं जब यह समाधान हो जाएगा.
    9. 15 मिनट के लिए (यूवी, 365 एनएम) प्रकाश पराबैंगनी 80% और 100% जैल युक्त प्लेटों बेनकाब. नोट: यूवी जोखिम एक साथ गोंद इलाज और जैल sterilizes. एक यूवी crosslinking कक्ष उपलब्ध नहीं है, जैल एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सुसज्जित है कि एक पराबैंगनी प्रकाश के तहत रखा जा सकता है. यूवी जोखिम के बाद, जेल बाँझपन बनाए रखने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत इस प्रोटोकॉल के बाद के चरणों का प्रदर्शन करते हैं. इसके अलावा, इस बिंदु से आगे बाँझ समाधान का उपयोग करें.
    10. डीएनए crosslinks 4 घंटे के लिए आरटी पर rehybridize करने की अनुमति दें.
    11. पीबीएस जोड़ें और ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: पीबीएस ऊष्मायन, rinses equilibrates, और दोहराया हीटिंग जैल निर्जलीकरण कर सकते हैं क्योंकि फिर जैल पहुँच जाती है.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    (ग्रे) डीएनए जैल तैयार करने के बाद जेल स्थिरीकरण और functionalization चित्रा 2 योजनाबद्ध., जैल ऑप्टिकल गोंद (हरी) द्वारा कांच कवर फिसल जाता है (सफेद) से जुड़े होते हैं. जैल एक साथ ठीक हो और यूवी प्रकाश द्वारा निष्फल रहे हैं. सूजन के बाद, जैल लगभग 1 मिमी मोटी हैं. अगला, जैल (लाल बॉक्स उल्लिखित) एक दो कदम प्रक्रिया में क्रियाशील हैं. सबसे पहले, sulfo-SANPAH यूवी प्रकाश जोखिम से जेल सतहों पर acrylamide संयुग्मित है. दूसरा, जैल sulfo-SANPAH में sulfo-एन hydroxysuccinimide एस्टर करने के लिए देता है, जो कोलेजन या पाली डी lysine साथ incubated हैं. यह आंकड़ा 10 से संशोधित किया गया है.

    3 जेल functionalization

    नोट: polyacrylamide जैल अक्रिय सामग्री (चित्रा 2) के बाद से डीएनए जेल functionalization कोशिका आसंजन के लिए आवश्यक है. इस खंड में, जैल दो चरणों में क्रियाशील हो जाएगा. सबसे पहले, एन -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &# 39; -azido 2'- nitrophenylamino) hexanoate या sulfo-SANPAH covalently डीएनए जैल polyacrylamide रीढ़ को nitrophenyl azide समूह की photolysis से जोड़ा जाएगा. दूसरा, कोलेजन या पाली डी lysine में प्राथमिक एमाइंस जेल सतह के लिए प्रोटीन संलग्न करने के लिए sulfo-SANPAH में sulfo- एन -hydroxysuccinimide एस्टर को जोड़ना होगा.

    1. एक विंदुक के साथ कुओं में बफर निकालें और जेल महाप्राण के प्रति सावधान रहें. नोट: जेल aspirating की संभावना को कम करने के लिए वैक्यूम आकांक्षा प्रदर्शन नहीं करते.
    2. वैकल्पिक) धो जैल तीन बार आरटी पर 15 मिनट के लिए अतिरिक्त acrylamide monomer, TEMED, और ए पी दूर करने के लिए.
    3. प्रत्येक जेल कवर करने के लिए sulfo-SANPAH के बारे में 300 μl जोड़ें.
    4. 5 मिनट के लिए यूवी (365 एनएम) के लिए जैल बेनकाब.
    5. Sulfo-SANPAH निकालें.
    6. एक बार पीबीएस के साथ कुल्ला जैल अतिरिक्त sulfo-SANPAH दूर करने के लिए.
    7. दोहराएँ 3.3-3.6 कदम.
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या ओ / एन पर 1 घंटे के लिए पाली डी lysine की 0.2 मिलीग्राम / एमएल के बारे में 300 μl में जैल सेते. नोट: वैकल्पिक रूप से, कोलेजन टाइप 1 हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस के 0.2 मिलीग्राम / एमएल के साथ जैल सेते हैं.
    9. अतिरिक्त पाली डी lysine दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार जैल धो लें.
    10. जैल संतुलित करने के लिए 30 मिनट के लिए मीडिया के बारे में 300 μl में जैल सेते हैं.
    11. तुरंत चढ़ाना कोशिकाओं से पहले मीडिया निकालें.

    4 सेल संवर्धन और इमेजिंग

    नोट: इस खंड में, हम नरमी के बारे में या सेल चढ़ाना के बाद जैल के stiffening विवरण प्रदान करते हैं. एक विस्तृत सेल संवर्धन प्रोटोकॉल कई कारणों के लिए प्रदान नहीं की है. सबसे पहले, कई प्रकार की कोशिकाओं के डीएनए जैल पर पालन कर सकते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार सेल चढ़ाना के लिए अनुसंधानकर्ता द्वारा विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता होगी. दूसरा, मानक सेल और ऊतक संवर्धन तकनीक इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और कई मूल लेख, तकनीकी लेख, और संदर्भ पुस्तकों में पाया जा सकता है. विशेष रूप से डीएनए जैल पर fibroblasts और न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए तकनीक previ में पाया जा सकता हैous प्रकाशनों 9-11,19-21.

    1. प्लेट कोशिकाओं. इस लेख में उल्लेख किया न्यूरॉन्स या fibroblasts की विच्छेदन और / या संवर्धन के संबंध में प्रोटोकॉल के लिए, निम्न प्रकाशनों 9-11,19-21 में से एक को देखें.
    2. 48 घंटे की एक न्यूनतम करने के बाद जेल (तालिका 4) के करीब नियंत्रण, एल 2, या R2 के समाधान के 1 μl pipetting द्वारा जेल कठोरता मिलाना.
      1. Crosslinked 100% (80 → 100% जैल) को 80% से जैल ठोस बनाना, जेल के करीब 100% L2 के समाधान के 1 μl जोड़कर 80% जैल को L2 के शेष 20% जोड़ें.
      2. Crosslinked 80% (100 → 80% जैल) के लिए 100% से जैल नरम करने के लिए, आर 2 जेल के करीब 100% R2 के समाधान के 1 μl जोड़कर 100% जैल से crosslinks के 20% को दूर करने के लिए जोड़ें.
      3. नियंत्रण के लिए, जेल के करीब नियंत्रण समाधान के 1 μl जोड़कर 100% और 80% जैल का एक सबसेट को नियंत्रण समाधान के बराबर मात्रा में जोड़ें.
    3. बाद वांछित सेल प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन48 घंटे की एक न्यूनतम.

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Representative Results

हमारे अध्ययन से पहले, सेल ईसीएम बातचीत स्थिर अनुरूप biomaterials पर या अपरिवर्तनीय और यूनिडायरेक्शनल गतिशील substrates पर मनाया गया. ये substrates सही रूप में सेलुलर microenvironment की गतिशील प्रकृति को प्रतिबिंबित नहीं करते. हमारा काम नरमी पर सेल ईसीएम बातचीत का अध्ययन और गतिशील biomaterials stiffening के लिए एक अधिक शारीरिक मॉडल उपलब्ध कराने के द्वारा मौजूदा तकनीकी मानदंड में बदलाव. पिछले अध्ययनों में, हम इन जैल पर विभिन्न सेल morphologies और phenotypes का परीक्षण करके कोशिकाओं पर गतिशील substrates के प्रभाव का विश्लेषण किया. एक उदाहरण में, हम गतिशील डीएनए जैल पर fibroblast आकारिकी मूल्यांकन द्वारा fibroblasts पर सब्सट्रेट stiffening के प्रभाव निर्धारित की. L929 कोशिकाओं, एक माउस व्युत्पन्न fibroblast सेल लाइन, 80% और 100% जैल (चित्रा 3) 11 पर चढ़ाया गया. दो दिन चढ़ाना के बाद, 20% अतिरिक्त L2 के समाधान Crosslinked 100% (80 → 100%, केंद्र पैनल को जैल ठोस बनाना करने के लिए 80% जैल की मीडिया के लिए जोड़ा गया). 100% जैल और 80% जैल का एक और सेट स्थिर (दाएं और बाएं पैनल, क्रमशः) रहने के लिए नियंत्रण ssDNA प्राप्त किया. लाइट माइक्रोस्कोपी छवियों दो दिन मीडिया के लिए डीएनए की डिलीवरी के बाद कब्जा कर लिया गया. चित्रा 3 के रूप में देखा छवि धुंधलेपन, जेल सतह असमता की वजह से था और ठेठ और अपरिहार्य है. जेल सूजन और संकुचन, buffers और एल 2 18,21 के अलावा से जिसके परिणामस्वरूप, असमता जेल में योगदान देता है. आकृति विज्ञान ImageJ सॉफ्टवेयर (एनआईएच, बेथेस्डा, एमडी) के साथ मूल्यांकन और समारोह के एक संकेत के रूप में कार्य किया था. जैल stiffening (80 → 100%) पर हो fibroblasts पहलू अनुपात में कोई बदलाव नहीं किया था, लेकिन 100% जैल 11 पर हो fibroblasts की तुलना में एक बड़ा प्रक्षेपण क्षेत्र का प्रदर्शन किया. दिलचस्प है, स्थिर जैल पर हो fibroblasts की आकारिकी गतिशील जैल पर हो fibroblasts की आकृति विज्ञान से भिन्न था. 100% जैल पर हो fibroblasts 80% जैल पर हो fibroblasts की तुलना में एक छोटे प्रक्षेपण क्षेत्र और बड़ा पहलू अनुपात था. ये फिर सेsults fibroblast व्यवहार microenvironment की गतिशील प्रकृति पर निर्भर है कि संकेत मिलता है. एक अन्य अध्ययन में, न्यूरॉन्स पर नरम सब्सट्रेट का प्रभाव डेन्ड्राइट संख्या, डेन्ड्राइट लंबाई, और अक्षतंतु लम्बाई (चित्रा 4) के 10 सहित न्यूरोनल phenotypes का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था. चूहा व्युत्पन्न रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स 100% और 50% जैल पर बड़े हो रहे थे. चार दिन चढ़ाना के बाद, 50% R2 Crosslinked 50% (100 → 50%, केंद्र पैनल) के लिए जैल नरम करने के लिए 100% जैल की मीडिया को जोड़ा गया है. 50% जैल और 100% जैल का एक और सेट (क्रमशः, दाएं और बाएं पैनल) स्थिर रहने के लिए नियंत्रण ssDNA प्राप्त किया. तीन दिनों के बाद, न्यूरॉन्स तय किया गया और एक वृक्ष के समान मार्कर (MAP2, शीर्ष पैनल), एक axonal मार्कर (ताउ, मध्यम पैनल) के साथ immunostained, और नाभिक (DAPI, नीचे पैनल) phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए. मुलायम जैल (100% 50 →) पर हो न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स ओ हो गई की तुलना में कम प्राथमिक डेन्ड्राइट प्राथमिक डेन्ड्राइट संख्या या अक्षतंतु लंबाई में कोई मतभेद नहीं था, लेकिन प्रदर्शन किया n 50% जैल. Fibroblast पढ़ाई में के रूप में, स्थिर जैल पर तंत्रिका phenotypes गतिशील जैल पर तंत्रिका phenotypes से भिन्न थे. 50% जैल पर हो न्यूरॉन्स कम प्राथमिक डेन्ड्राइट और 100% जेल पर हो न्यूरॉन्स की तुलना में अब axons था. अंत में, fibroblast और न्यूरॉन छवियों कई प्रकार की कोशिकाओं गतिशील और स्थिर डीएनए जैल पर अध्ययन किया जा सकता है कि प्रदर्शन, डीएनए जेल असमता इमेजिंग चुनौतियों, मानक रूपात्मक और immunostaining तकनीक संभव है का कारण बनता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह कोशिकाओं के व्यवहार सब्सट्रेट गतिशीलता पर निर्भर है.

चित्रा 3
स्थिर और गतिशील डीएनए जैल पर हो चित्रा 3 Fibroblasts. L929 fibroblasts की प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों 80% (बाएं पैनल), 80 → 100% (केंद्र पैनल), और 100% जैल (सही पैनल) पर हो. स्केल बार 100 मीटर है. यह आंकड़ा 11 से संशोधित किया गया है.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank" href> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
डीएनए जैल पर हो चित्रा 4 न्यूरॉन्स. 100% (बाएं पैनल) पर हो रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों, 100 → 50% (केंद्र पैनल), और 50% (सही पैनल) जैल. MAP2 immunostaining, ताउ -1 immunostaining axons (मध्यम पैनल) इंगित करता है डेन्ड्राइट (शीर्ष पैनल) को इंगित करता है, और DAPI धुंधला नाभिक (नीचे पैनल) इंगित करता है. स्केल बार 100 मीटर है. यह आंकड़ा 10 से संशोधित किया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

डीएनए जैल की क्षमता को नरम या सेल आसंजन उन्हें सेल समारोह पर गतिशील ऊतक कठोरता की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल बनाता पहले और बाद में ठोस बनाना. सभी तीन डिजाइन यांत्रिक और जैविक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, सभी तीन डिजाइन Crosslink लंबाई डीएनए जेल लोच (तालिका 2) को प्रभावित नहीं करता है, यह दर्शाता विभिन्न Crosslink प्रतिशत पर समान elasticities है. इसके विपरीत, acrylamide एकाग्रता लोच को प्रभावित करता है. इन डिजाइनों जेल फोड़ प्रवृत्तियों के बाद से crosslinking कैनेटीक्स में अलग हो सकता है, या जैल की प्रवृत्ति मीडिया या बफर में भंग करने के लिए, Crosslink लंबाई बढ़ाने के साथ घट जाती है. डीएनए जैल पर हालांकि गतिज जानकारी सीमित है, लेकिन हम crosslinking की एक अतिरिक्त 30% दो दिनों में 50% डीएनए जैल 11 को L2 के प्रसव के बाद होता है पता है. फिर भी, जेल नरमी और stiffening से विशाल और सिकुड़ा बलों की पीढ़ी, क्रमशः, अपरिहार्य है और decoupled नहीं किया जा सकता18,21. अधिक ऊर्जा ssDNA 18 के तीन खड़ा बीच बांड फार्म के लिए आवश्यक है के बाद से 50 → 100% जैल केवल तनाव के बारे में 0.04 पा उत्पन्न जबकि 100 70 →% जैल, तनाव 21 के बारे में 0.5 पा उत्पन्न करते हैं. इसलिए, परिणाम की व्याख्या stiffening और जैल की नरमी से उत्पन्न तनाव और तनाव के विचार की आवश्यकता है.

डीएनए जैल तैयार करते समय तकनीकी चुनौतियों पैदा कर सकते हैं. सबसे लगातार तकनीकी मुद्दा जेल बढ़ रहा है. जेल फोड़ जेल सूजन, भंडारण, और सेल के विकास सहित डीएनए जेल तैयारी के कई चरणों के दौरान हो सकता है. जेल फोड़ कई कारकों के कारण होता है. सबसे पहले, जेल फोड़ अनुचित समाधान रचना का परिणाम हो सकता है. आम त्रुटियों lyophilized ssDNA और चिपचिपा तरल पदार्थ के अनुचित pipetting की अपर्याप्त भंग शामिल हैं. Pipetting त्रुटियों से बचने के लिए, समाधान की आसान pipetting के लिए जेल चिपचिपाहट कम या आवश्यक AM विभाज्य हीटिंग तापमान बढ़ाSA1 और दूसरा नाइट्रोजन बुदबुदाती कदम से पहले SA2 polymerized समाधान के ount. इसके अलावा, polymerized समाधान के दोहराया हीटिंग आंशिक रूप से समाधान लुप्त हो जाना और समाधान चिपचिपापन में वृद्धि कर सकते हैं. ते बफर के कुछ microliters जोड़ना चिपचिपाहट कम करने में मदद कर सकते हैं. दूसरा, जेल फोड़ गरीब डीएनए गुणवत्ता की वजह से हो सकता है. क्यूए / QC रिपोर्टों अक्सर समीक्षा की जानी चाहिए. क्यूए / QC रिपोर्टों स्वीकार्य हैं और जेल फोड़ अभी भी होती है, HPLC शुद्ध ssDNA डीएनए गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं. तीसरा, जेल फोड़ अपर्याप्त डीएनए annealing से परिणाम कर सकते हैं. हम मूल प्रोटोकॉल में annealing कदम और rehybridization कदम शामिल करके जेल फोड़ की घटनाओं को कम कर दिया है (कदम 1.3.6 और 2.8 देखो, क्रमशः 1.3.8 और 2.10,). जेल फोड़ बार annealing के विस्तार और ठंडा करने से रोका जा सकता है. जैल फिर से बढ़कर रहे हैं फिर भी, जब पानी भाप बन सकते हैं गर्मी के लिए अतिरिक्त जोखिम कांच से जेल टुकड़ी में वृद्धि का कारण है. टुकड़ी किसी भी annealing समय के लिए जरूरत से ज्यादा है, तो ऐनईलिंग चरणों (1.3.6 और 2.8) को समाप्त किया जा सकता है.

का सामना करना पड़ा एक और अक्सर तकनीकी समस्या अपर्याप्त सेल आसंजन है. सूजन जैल मुश्किल (तालिका 2) 18 बनाने सेल आसंजन unswollen जैल की तुलना में नरम हैं. प्रत्येक कोशिका प्रकार ऊतक कठोरता के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया के बाद से अन्य प्रकार की कोशिकाओं नहीं करते इसके अलावा, जबकि, कुछ प्रकार की कोशिकाओं के इस तकनीकी दुविधा अनुभव हो सकता है. पालन ​​कदम से कुछ विचार किया जाना चाहिए आसंजन मुद्दों को हल करने के लिए: (1), (3) कठोरता मापदंडों व्यवस्थित करना, (2) sulfo-SANPAH संयुग्मित ईसीएम प्रोटीन वैकल्पिक, एक उच्च चढ़ाना घनत्व का उपयोग (4) ईसीएम प्रोटीन बढ़ाने या sulfo-SANPAH एकाग्रता, और (5) ऊष्मायन बार वृद्धि हुई है. ऐसे acrylamide monomer, पी एस, और TEMED के रूप में अवशिष्ट विषाक्त एजेंटों को भी जैल पर आसंजन और कोशिका मृत्यु की कमी करने के लिए योगदान कर सकता है. प्रोटोकॉल में शामिल व्यापक washes पर्याप्त सिद्ध कर दिया है के बाद से हम इस मुद्दे का अनुभव नहीं है, लेकिन हम perf की सिफारिशयह समस्या तब होती 3.2 अगर वैकल्पिक कदम orming.

डीएनए जैल अधिक प्रभावी ढंग से गतिशील या स्थिर शर्तों के तहत सेल कार्यों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. हम डीएनए जैल पर हो fibroblasts और न्यूरॉन्स जेल लोच के मॉडुलन से प्रभावित कर रहे हैं कि पता चला है. सेल मैट्रिक्स बातचीत आम तौर पर तीन आयामी इंटरफेस, तीन आयामी गतिशील मैट्रिक्स अध्ययनों से जानकारी के बाद से अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा का उत्पादन करने में मदद मिलेगी. इसलिए, हम वर्तमान में एक तीन आयामी पाड़ में इस तकनीक का अनुवाद कर रहे हैं. हम डीएनए crosslinking प्रौद्योगिकी को बनाए रखते हुए, एक अधिक biocompatible सामग्री के साथ polyacrylamide रीढ़ की जगह है कि एक तकनीक विकसित कर रहे हैं. इस नई पाड़ एक तीन आयामी, गतिशील मॉडल और एक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में काम करेगा. इसकी biocompatibility मेडिकल डिवाइस अनुप्रयोगों के लिए अवसर खुल जाएगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को धन्यवाद देना चाहूंगा: डॉ फ्रैंक जियांग, डॉ डेविड लिन, डॉ बर्नार्ड Yurke और डॉ उदय Chippada डीएनए जेल प्रौद्योगिकी विकसित करने पर उनके योगदान के लिए; डॉ Norell Hadzimichalis, स्मित शाह, किम्बर्ली Peterman, उनकी टिप्पणियों और इस पांडुलिपि का संपादन के लिए रॉबर्ट ARTER; रीढ़ की हड्डी पर न्यू जर्सी आयोग रिसर्च (अनुदान # 07A-019-SCR1, एनएएल) और न्यू जर्सी तंत्रिका विज्ञान संस्थान (MLP) सहित धन स्रोतों; और ऊतक इंजीनियरिंग के प्रकाशकों, भाग एक की अनुमति चित्रा 3 पुनर्मुद्रण की अनुमति के लिए आंकड़े 2 और 4 और biomaterials पुनर्मुद्रण के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

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References

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डीएनए Crosslinked Polyacrylamide Hydrogels की तैयारी
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Previtera, M. L., Langrana, N. A.… More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

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