Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.
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Methodenartikel
Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanobiologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die kritische Rolle der körperliche Signale in der Leitung der Zellmorphologie und Funktion adressiert. Zum Beispiel ist die Wirkung der Elastizität des Gewebes auf die Zellfunktion ein wichtiger Bereich der Forschung, da Mechanobiologie Gewebesteifigkeit moduliert mit der Krankheit, Entwicklung und Verletzungen. Statische Gewebe-ähnlichen Materialien oder Materialien, die nicht ändern kann, wenn die Steifigkeit Zellen plattiert werden hauptsächlich verwendet, um die Effekte der Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktionen zu untersuchen. Während Informationen aus statischen Studien gesammelt wertvoll ist, sind diese Studien kein Hinweis auf die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung in vivo. Um die Wirkungen der dynamischen Steifigkeit auf die Zellfunktion besser erfüllen eine DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogel-System (DNS-Gele) entwickelt. Im Gegensatz zu anderen dynamischen Substraten, haben DNA-Gelen die Fähigkeit zu verringern oder zu erhöhen in der Steifigkeit nach der Herstellung ohne Reize. DNA-Gele bestehen aus DNA crosslTinten, die in einem Polyacrylamid-Grundgerüst polymerisiert werden. Hinzufügen und Entfernen von Vernetzungen durch Lieferung von Einzelstrang-DNA kann zeitlicher, räumlicher und reversible Steuerung Gelelastizität. Wir haben in früheren Berichten dargestellt, dass die dynamische Modulation der DNA-Gel Elastizität beeinflusst Fibroblasten und Neuronen Verhalten. In diesem Bericht und Video bieten wir eine schematische, die die DNA-Gel Vernetzungsmechanismen und Schritt-für-Schritt-Anleitung beschreibt auf die Vorbereitung DNA-Gelen.
Einleitung
Statische und dynamische Substrate gibt zwei Kategorien von Biomaterialien, die entwickelt wurden, um die Wirkungen einer Gewebe Elastizität oder Steifigkeit auf die Zellfunktion untersucht werden. Statische Substrate sind nicht in der Lage, ihre physikalischen Eigenschaften ändern, nachdem sie hergestellt sind, und / oder einmal Zellen plattiert. Polyacrylamid (PA)-Gelen wurden die ersten zweidimensionalen statischen Substraten für Untersuchungen Mechanobiologie 5,17 synthetisiert. PA Gele sind leicht herzustellen, preiswert, flexibel und kann mit einer Vielzahl von elastischen Moduli hergestellt werden. Obwohl diese technischen Vorteile machen PA-Gele hä....
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Protokoll
HINWEIS: Die gesamte Protokoll von Gelzubereitung zur Zellenverarbeitung dauert mindestens sechs Tage. Geschätzte Zeit für die Gel-Präparat ist 8 Stunden plus eine O / N Inkubation. Geschätzte Zeit für die Gel-Immobilisierung und DNA-Annealing ist 8 Stunden plus eine O / N Spülvorgang. Geschätzte Zeit für die Gel-Funktionalisierung ist 2 Stunden. Zeit für Zellwachstum und Beschichtung ist abhängig von Kultur-Typ und Anwendung, aber ein Minimum von vier Tagen erforderlich.
1. Herstellung von DNA-Gelen
HINWEIS: Bereiten DNA-Gelen in drei verschiedenen Schritten. Zuerst einzeln polymerisieren SA1 und SA2 ssDNA in e....
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Ergebnisse
Vor unserer Studien wurden zell ECM-Wechselwirkungen auf statische konform Biomaterialien oder irreversibel und unidirektionalen dynamischen Substraten beobachtet. Diese Substrate müssen nicht genau die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung. Unsere Arbeit verschiebt die bestehenden technischen Paradigmen, indem sie einen physiologischen Modell zur Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen auf Erweichung und Versteifungs dynamische Biomaterialien. In früheren Studien untersuchten wir die Wirkungen von dynamischen S.......
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Diskussion
Die Fähigkeit von DNA-Gelen zu erweichen oder zu versteifen, bevor und nachdem die Zelladhäsion macht sie zu einem idealen Modell, um die Rolle von Gewebesteifigkeit dynamisch auf die Zellfunktion untersucht werden. Alle drei Ausführungen sind in mechanischen und biologischen Untersuchungen verwendet. Allerdings haben alle drei Ausführungen ähnlich Elastizitäten bei verschiedenen Vernetzungsprozent anzeigt Vernetzungslänge nicht beeinflusst DNA Gel-Elastizität (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu betrifft Acr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke und Dr. Uday Chippada für ihre Beiträge zur Entwicklung der DNA-Gel-Technologie; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter für ihre Kommentare und Bearbeitungen dieser Handschrift; Finanzierungsquellen, einschließlich der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) und New Jersey Neuroscience Institute (MLP); und Herausgeber von Tissue Engineering, Teil A, für die Erlaubnis, 2 und 4 und Biomaterialien für die Erlaubnis, Abbildung 3 Reprint.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com | Wirbeln Sie ssDNA nicht. Drehen Sie die Durchstechflasche und/oder die Pipettenlösung vorsichtig um, um sie zu mischen. | |
| PBS mit Calcium und Magnesium | Jede Marke. | ||
| 100x Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com | T9285 | |
| 10x Tris-Borat-EDTA-Puffer (FSME-Puffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | FSME ist ein Fortpflanzungsgift. |
| 40% Acrylamid Lösung | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | Acrylamid ist ein Toxin. |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Eine 2%ige Lösung in TE-Puffer herstellen. APS ist ein Toxin und ein Reizstoff. |
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Bereiten Sie eine 20%ige Lösung in TE-Puffer vor. TEMED ist brennbar, ätzend und giftig. |
| Rundes Deckglas mit 12 mm Durchmesser | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | >fishersci.com 12-545-82 | |
| Norland optischer Klebstoff 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com | NOA72 | |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Jede Marke. | ||
| Mikrozentrifugenröhrchen | Jede Marke. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem oder Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com oder thermofisher.com | C111 oder 22589 | Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch eine Lösung von 0,315 mg/ml in Wasser vor. Bei 37 Grad auflösen; C und Filter sterilisieren. Es ist normal, ungelöstes Sulfo-SANPAH im Filter zu beobachten. Sulfo-SANPAH ist lichtempfindlich und daher sollte die Lösung bis zur UV-Einwirkung vor Licht geschützt werden. |
| Poly-D-Lysin (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Eine Lösung von 0,2 mg/ml in Wasser herstellen und mit dem Filter sterilisieren. |
| Kollagen Typ I | Affymetrix (Santa Clara, Kalifornien) affymetrix.com | 13813 | Bereiten Sie eine Lösung von 0,2 mg/ml in 0,2 N Essigsäure vor. Die Lösung muss immer kalt bleiben, um eine Polymerisation zu vermeiden. Essigsäure ist brennbar, giftig und ätzend. |
| 22 x 60 Deckglas | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Direktverdrängerpipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com | F148504 | |
| Heizblock | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| UV-Lichtquelle | Platzieren Sie Gele so nah wie möglich am UV-Licht. UV-Licht kann Haut- oder Augenverletzungen verursachen. | ||
| Thermometer | Jede Marke. | ||
| Stickstoffgas | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ | NI 5.0UH-R |
Referenzen
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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