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Biology

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

doi: 10.3791/51323 Published: August 27, 2014

Summary

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Abstract

Mechanobiologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die kritische Rolle der körperliche Signale in der Leitung der Zellmorphologie und Funktion adressiert. Zum Beispiel ist die Wirkung der Elastizität des Gewebes auf die Zellfunktion ein wichtiger Bereich der Forschung, da Mechanobiologie Gewebesteifigkeit moduliert mit der Krankheit, Entwicklung und Verletzungen. Statische Gewebe-ähnlichen Materialien oder Materialien, die nicht ändern kann, wenn die Steifigkeit Zellen plattiert werden hauptsächlich verwendet, um die Effekte der Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktionen zu untersuchen. Während Informationen aus statischen Studien gesammelt wertvoll ist, sind diese Studien kein Hinweis auf die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung in vivo. Um die Wirkungen der dynamischen Steifigkeit auf die Zellfunktion besser erfüllen eine DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogel-System (DNS-Gele) entwickelt. Im Gegensatz zu anderen dynamischen Substraten, haben DNA-Gelen die Fähigkeit zu verringern oder zu erhöhen in der Steifigkeit nach der Herstellung ohne Reize. DNA-Gele bestehen aus DNA crosslTinten, die in einem Polyacrylamid-Grundgerüst polymerisiert werden. Hinzufügen und Entfernen von Vernetzungen durch Lieferung von Einzelstrang-DNA kann zeitlicher, räumlicher und reversible Steuerung Gelelastizität. Wir haben in früheren Berichten dargestellt, dass die dynamische Modulation der DNA-Gel Elastizität beeinflusst Fibroblasten und Neuronen Verhalten. In diesem Bericht und Video bieten wir eine schematische, die die DNA-Gel Vernetzungsmechanismen und Schritt-für-Schritt-Anleitung beschreibt auf die Vorbereitung DNA-Gelen.

Introduction

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Statische und dynamische Substrate gibt zwei Kategorien von Biomaterialien, die entwickelt wurden, um die Wirkungen einer Gewebe Elastizität oder Steifigkeit auf die Zellfunktion untersucht werden. Statische Substrate sind nicht in der Lage, ihre physikalischen Eigenschaften ändern, nachdem sie hergestellt sind, und / oder einmal Zellen plattiert. Polyacrylamid (PA)-Gelen wurden die ersten zweidimensionalen statischen Substraten für Untersuchungen Mechanobiologie 5,17 synthetisiert. PA Gele sind leicht herzustellen, preiswert, flexibel und kann mit einer Vielzahl von elastischen Moduli hergestellt werden. Obwohl diese technischen Vorteile machen PA-Gele häufig angewendet Substrat, sind statische Substrate kein Hinweis auf die Dynamik der extrazellulären Matrix (ECM) und die umliegenden Zellumgebung in vivo. Zum Beispiel kann die ECM-Steifigkeit erfährt Änderungen als Folge von Verletzungen, die Entwicklung oder Krankheit. Dynamische Substrate werden daher als gehirnähnlichen Substrat Modelle in Mechanobiologie Studien begünstigt

Zahlreiche synthetische, natürliche, zweidimensionalen, dreidimensionalen, statischen und dynamischen Biomaterialien wurden entwickelt, um Gewebesteifigkeit 1,3,6,16,23,26 imitieren. Einige dynamische Substrate benötigen Wärme, UV, elektrischen Strom, Ionen und pH-Änderungen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu verändern 2,4,7,8,12,15,16, aber diese Reize Bio-Anwendung des Hydrogels zu beschränken. DNA-Polyacrylamid vernetzt Hydrogele (DNA Gele) sind dynamisch zweidimensionalen elastischen Substraten. DNA-Vernetzungen ermöglichen zeitlichen, räumlichen und reversible Modulation der DNA-Gel-Steifigkeit durch die Zugabe von Einzelstrang-DNA (ssDNA), um Medien oder Puffer 9-11,13,14,18,21. Im Gegensatz zu den oben erwähnten dynamischen Gele wo Stimuli zur Modulation der Elastizität aufgebracht, stützen sich die DNA Gele auf der Diffusion von Applied ssDNA zur Veränderung der Elastizität. Deshalb ist die obere Geloberfläche, wo Zellen gezüchtet werden, ist der erste Bereich moduliert, da die Geschwindigkeit of Elastizität Modulation hängt von der Gel-Dicke.

DNA-Gele sind ähnlich wie ihre Gegenstücke in PA-Gel, dass sie eine Polyacrylamid-Rückgrat haben jedoch die Bis-Acrylamid Vernetzungen mit Vernetzungen von DNA (Figur 1) zusammengesetzt ersetzt. Zwei ssDNAs (SA1 und SA2) hybridisieren mit einem Vernetzer Strang (L2) bilden die DNA-Quervernetzungen des Gels. SA1 und SA2 haben verschiedene Sequenzen, die sowohl eine ACRYDIT Modifikation am 5'Ende für eine effektive Einbindung in die PA-Netzwerk enthalten. Zur Herstellung des Gels, SA1 und SA2 werden einzeln in einem PA Gerüst polymerisiert und anschließend die polymerisierten SA1 und SA2 werden miteinander vermischt. L2, das Vernetzungsmittel wird zu der SA1 und SA2 Mischung zugegeben. Der L2-Basensequenz komplementär zu beiden SA1 und SA2 und L2 Sequenzen hybridisiert SA1 und SA2, um die DNA-Vernetzungen zu bilden. Initial, DNA-Gel Elastizität wird von beiden L2-Konzentrationen und Vernetzung (Tabellen 1 bestimmt 2). DNA-Gelen, die gleiche stöchiometrische Mengen L2, SA1, SA2 und sind die härtesten Gele, weil SA1 und SA2 sind 100% vernetzt durch L2 (als 100% Gele bezeichnet). Niedrigere Konzentrationen von L2 zu einem niedrigeren Prozentsatz an DNA-Vernetzung und damit weicher DNA Gele. Gele so niedrig wie 50% vernetzt (zu 50% Gele bezeichnet) wurden konstruiert, 9-11.

Figur 1
Abbildung 1. DNA-Gel Vernetzung und uncrosslinking schematische 9-11,13,14,18,21. Schritt 1: SA1 (rot) und SA2 (blau) werden einzeln in einem Polyacrylamid-Rückgrat (schwarz) polymerisiert. Nach der Polymerisation werden SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen miteinander vermischt. Schritt 2: L2 (grün) zu und hybridisiert mit SA1 und SA2, die Vernetzungen des Gels. Schritt 3: R2 hybridisiert mit ter Ansatzpunkt von L2. Schritt 4: Brückenkopf-Hybridisierung von R2 treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2.

Im Gegensatz zu PA-Gele können DNA-Gele zu versteifen und zu erweichen nach der Synthese. Aus diesem Grund können die Zellen auf DNA-Gelen gezüchtet, um dynamische Steifigkeit Änderungen unterzogen werden. Zellhaftenden Gelen erstarren kann L2 zu den Kulturmedien von geringen Prozentsatz Gels zugegeben werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen zu erhöhen. Erweichen zellhaft Gele können L2 entfernt werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen 10,13,21 verringern. L2 hat einen zusätzlichen Brückenkopf-Sequenz am 3'Ende zu ermöglichen L2 von SA1 und SA2 (Tabelle 1) uncrosslink. Entfernung von L2 durch Hybridisierung einer Umkehrstrang genannt R2 erreicht. R2 ist komplementär zu der vollen Länge von L2 und hybridisiert mit dem ersten Ansatzpunkt L2. Brückenkopf-Hybridisierung treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2, die die Vernetzungs beseitigt und reduziert das Gel Steifigkeit.

In diesem Bericht undVideo, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Herstellung von Versteifungs und Erweichung DNA-Gelen zur Verfügung gestellt. Während 100% und 80% Gel Präparate beschrieben, kann dieses Protokoll zugeschnitten werden, um DNA-Gelen anderer anfänglichen und endgültigen vernetzten Prozentsätze zu erstellen. Im allgemeinen sind 100% und 80% Gele hergestellt, auf Glas-Deckgläschen immobilisiert, funktionalisiert und mit Zellen besät. L2 ist mit den Medien 80% Gele gegeben und R2 ist mit dem Medium 100% Gelen, 48 h nach dem Plattieren zugegeben. Die Zugabe von L2 Medien versteift 80% bis 100% Gelen vernetzt, während die Zugabe von R2 Medien erweicht 100% Gele zu 80% vernetzt ist. Versteift Gele sind als 80 → 100% Gele bezeichnet und aufgeweicht Gele als 100 → 80% Gele im Text bezeichnet. Für die Kontrolle oder statische Gele, ssDNA aus Ts oder As ist, um einen weiteren Satz von 100% und 80% Gelen geliefert. Nach einem Minimum von zwei Tagen nach der Elastizität Modulations können Zellen verarbeitet und analysiert werden.

DNA-Vernetzung # Basen Sequenz (Brückenkopf) Änderung Schmelztemperatur (T m ° C) Kommentare
5 '→ 3'
Design 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'ACRYDIT 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'ACRYDIT 23,6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Ein 10 bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen.
R2 30 CAA GTG CGC TAG ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 ist komplementär zu L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'ACRYDIT 46,9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'ACRYDIT 40,2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 Ein 12-bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65,9 R2 ist komplementär zu L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'ACRYDIT 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'ACRYDIT 56,6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68,8 Ansatzpunkt ist nicht inbegriffen.
Kontrolle Kontrolle 20-40 AAA AAA (etc.) oder
TTT TTT (usw.)

Tabelle 1. Basissequenzen für ssDNA 9-11,13,14,18,21. Zelluläre und mechanischen Studien haben mehrere d verwendetifferent Vernetzungs Designs zur DNA-Gelen mit verschiedenen statischen und dynamischen mechanischen Eigenschaften zu erzeugen. Die in der Quer Design moduliert Parameter sind Basensequenz und Sequenzlänge oder vernetzen Länge. Bold und kursiv Schriften veranschaulichen Basenpaarung zwischen SA1 und L2 und zwischen SA2 und L2.

Design
1 2 3
Acrylamidkonzentration (%) 10 10 10 4
SA1 und SA2 auf den L2-hybridisiert (% vernetzt) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elastizität (kPa, Mittelwert ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12,67 ± 1,33 22.88 ± 2.77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabelle 2. Elastizitätsmodul (E) von DNA-Gelen 9-11,13,14,18,21. Acrylamidkonzentration, Vernetzungsprozent und Vernetzungs Länge kann in DNA-Gelen moduliert werden. Motive 1, 2 und 3 sind 20, 28 und 40 bp Vernetzungslängen sind. 100%-Gele für alle Ausführungen haben ähnliche Module anzeigt vernetzen Länge hat keinen Einfluss auf Gel-Elastizität. Variationen in Acrylamidkonzentration verändern jedoch DNA-Gel Elastizität.

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Protocol

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HINWEIS: Die gesamte Protokoll von Gelzubereitung zur Zellenverarbeitung dauert mindestens sechs Tage. Geschätzte Zeit für die Gel-Präparat ist 8 Stunden plus eine O / N Inkubation. Geschätzte Zeit für die Gel-Immobilisierung und DNA-Annealing ist 8 Stunden plus eine O / N Spülvorgang. Geschätzte Zeit für die Gel-Funktionalisierung ist 2 Stunden. Zeit für Zellwachstum und Beschichtung ist abhängig von Kultur-Typ und Anwendung, aber ein Minimum von vier Tagen erforderlich.

1. Herstellung von DNA-Gelen

HINWEIS: Bereiten DNA-Gelen in drei verschiedenen Schritten. Zuerst einzeln polymerisieren SA1 und SA2 ssDNA in eine PA-Backbone. Diese Lösungen werden als SA1 polymerisierten Lösung und SA2 polymerisierten Lösung, bzw. (§ 1.1). Zweitens, die Auflösung der Vernetzer, reversible Strang und Steuer ssDNAs. Lösen Sie die lyophilisierten L2 ssDNA (Vernetzer). Dies wird als 100%-Lösung L2 und wird verwendet, um 100%-Gelen (§ 1.2) herzustellen. Einen aliquoten von 100% L2-Lösungbis 80%. Dies wird als 80%-Lösung und L2 verwendet wird, um 80% Gele herzustellen. Auflösen lyophilisierten R2 (reversible Strang) und Steuer ssDNA in § 4 zu verwenden. Drittens mischen SA1 polymerisierte Lösung, SA2 polymerisierte Lösung und 100% bzw. 80% L2 Lösung in einem Verhältnis von 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) auf 100% und 80% Gele bilden. (§ 1.3).

1. Herstellung der SA1 und SA2 Polymerisiertes Lösungen

  1. Wählen und bestellen Sie das passende SA1, SA2, L2, R2 und Basensequenzen aus den Tabellen 1 und 2. Basensequenzen und Sequenzlänge wurden in früheren Berichten 9-11,13,14 optimiert.
  2. Berechnen Sie alle Lösungsformulierungen (Tabellen 3-4). HINWEIS: Akribisch Dokument Berechnungen für die Fehlerbehebung. Aufbau einer Excel-Vorlage wird empfohlen und kann wiederholt für die DNA-Zubereitung verwendet werden. Bitte siehe Tabellen 3 und 4 für ein Beispiel für die Aufstellung für Design 2 (Tabellen 1 und 2). Die in Tabelle 4 angegeben Mengen werden in diesem Protokoll verwendet werden, aber Volumen wird mit jedem Aliquot lyophilisierten ssDNA variieren.
Lösung Lager Lösungskonzentration Prozentsatz der Stammlösung in SA1 oder SA2 polymerisierte Lösung (v / v) Endgültige Konzentration der Lösung in SA1 oder SA2 polymerisierte Lösung
Acrylamid (No-Bisacrylamid) 40% 25 10%
SA1 oder SA2 Lösung 100% 60 60%
TBE-Puffer 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tabelle 3. Prozentsatz der Lösungen für die Herstellung von SA1 oder SA2 polymerisiert Lösungen. Die erste Spalte zeigt die Lösungen für die Formulierung der DNA-Gele. Die zweite Spalte zeigt die Lager Konzentrationen dieser Lösungen. Die dritte Spalte zeigt den Prozentsatz der Stammlösungen in SA1 oder SA2 polymerisiert Lösungen (v / v). Die letzte Spalte gibt die Endkonzentrationen in SA1 und SA2-Lösungen.

ssDNA-Lösungen (§ 1.1) <tr>
Lösungskomponenten
Lösung Auf Konzentration Endlösung Konzentration Berechnung Betragen hinzufügen Kommentare
SA1 Lösung 320,7 nmol lyophilisierter SA1 ssDNA 3,00 mm 320,7 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 107 ul 107 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA SA1 Lösung ist 60% der SA1 polymerisierten Lösung.
107 ul / 0,600 = 178 ul
178 ul ist das Gesamtvolumen der SA1 polymerisierte Lösung (Tabelle 3).
SA2 Lösung 324,4 nmol lyophilisierter SA2 ssDNA 3,00 mm 324,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 108 ul 108 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA SA2 Lösung ist 60% der SA2 polymerisierten Lösung.
108 ul / 0,600 = 180 ul
180 ul ist das Gesamtvolumen der SA2 polymerisierte Lösung (Tabelle 3).
100% L2-Lösung 657,4 nmol lyophilisierter L2 ssDNA 3,00 mm 657,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 219 ul 219 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA Einen aliquoten von 100% auf 80% L2 L2-Lösung
80% L2-Lösung 80 ul 100% L2 ssDNA 80% - 20 ul TE Puffer zu 80 ul 100% L2 Lösung
Steuerungslösung 332,6 nmol lyophilisierter Poly-T-oder A ssDNA 3,00 mm 332,6 nmol / 3,00 nmol ul <sup> -1 = 111 ul 111 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA
R2-Lösung 193,8 nmol lyophilisierter R2 ssDNA 3,00 mm 193,8 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 64,6 ul 64,6 ul TE Puffer lyophilisiert ssDNA
Polymerisiert Lösungen (§ 1.2)
SA1 polymerisierten Lösung 40% Acrylamid 10% 178 x 0,25 = ul ul 44,5 45 ul Berechnen der Menge an Acrylamid, TBE, APS und TEMED, bezogen auf ein Gesamtvolumen von 178 ul (siehe oben und Tabelle 3).
10x TBE 1x 178 x 0,10 = ul ul 17,8 18 ul
100% SA1 Lösung 60% - 107 ul SA1 Lösung ist 60% der SA1 polymerisierten Lösung (siehe oben und Tabelle 3).
2% APS 0,05% 178 x 0,025 = ul ul 4,45 4,5 ul Hinzufügen und mischen APS bevor TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 x 0,025 = ul ul 4,45 4,5 ul
SA2 polymerisierten Lösung 40% Acrylamid 10% 180 ul x 0,25 = 45 ul 45 ul Berechnen der Menge an Acrylamid, TBE, APS und TEMED, bezogen auf ein Gesamtvolumen von 180 ul (siehe oben und Tabelle 3).
10x TBE 1x 180 ul x 0,10 = 18 ul 18 ul
100% SA2 Lösung 60% - 108 ul SA2 Lösung ist 60% der SA2 polymerisierten Lösung (siehe oben und Tabelle 3).
2% APS 0,05% 180 ul x 0,025 = 4,5 ul 4,5 ul Hinzufügen und mischen APS bevor TEMED
20% TEMED 0,50% 180 ul x 0,025 = 4,5 ul 4,5 ul
Gel-Lösungen (§ 1.3)
100% Gel-Lösung 100% SA1 polymerisierten Lösung 10 Teile - 10 ul Komponieren 100% Gele mit dem folgenden SA1: SA2: L2-Verhältnis 10: 10: 6.
100% SA2 polymerisiert Solution 10 Teile - 10 ul
100% L2-Lösung 6 Teile - 6 ul
80% Gel-Lösung 100% SA1 polymerisierten Lösung 10 Teile - 10 ul Komponieren 80% Gele mit dem folgenden SA1: SA2: L2-Verhältnis 10: 10: 6.
100% SA2 polymerisierten Lösung 10 Teile - 10 ul
80% L2-Lösung 6 Teile - 6 ul
Dynamische Gelen (§3-4)
80 → 100% Gel 80% Gel 100% gel Berechnung 1: 1 ul 100% L2 Lösung in Kulturmedien Die Berechnungen basieren auf mit 20 ul Gele auf Deckgläser basiert. Zunächst wandeln die Teile 100% L2-Lösung in den 20 ul ul Gel in. Zweitens berechnen die Höhe (in ul) von 100% für weitere 20% der Vernetzung benötigt L2-Lösung. Fügen Sie diesen Betrag von 100% L2-Lösung zu einem Gel.
(20 ul / 26 Teile) x 6 Teile = 4,6 ul
Berechnung 2:
5 ul 0,2 x = 1 ul
100 → 80% Gel 100% Gel 80% Gel Berechnung 1: 1 ul 100% R2 Lösung in Kulturmedien Die Berechnungen basieren auf mit 20 ul Gele auf Deckgläser basiert. Zuerst konvertieren ter Teile 100% L2-Lösung in den 20 ul ul Gel in. Zweitens berechnen die Höhe (in ul) von 100% benötigt, um entfernt, um eine 20%-Gel komponieren L2-Lösung. Fügen Sie diesen Betrag von R2-Lösung zu einem Gel.
(20 ul / 26 Teile) x 6 Teile = 4,6 ul
Berechnung 2:
5 ul 0,2 x = 1 ul
100%-Gel (Control) 100% Gel 100% Gel - 1 ul Steuerungslösung in das Kulturmedium Menge an Kontroll-Lösung ist äquivalent zu der Menge an R2-Lösung gegeben.
80% Gel (Control) 80% Gel 80% Gel - 1 ul Steuerungslösung in das Kulturmedium Menge an Kontroll-Lösung ist äquivalent zu der Menge von 100% L2-Lösung gegeben.

Tabelle 4. Beispiel Berechnungen für die DNA-Zubereitung. Mock Zahlen sind vorgesehen, um die Berechnungen für die Herstellung von 80%, 100%, 100 → 80% und 80 → 100% Gele veranschaulichen. DNA-Gele sind Design 2 in Tabelle 1.

  1. Zentrifuge SA1 lyophilisierten ssDNA bei 2.000 × g für 15 s, um sicherzustellen, alle ssDNA befindet sich am Boden des Fläschchens. HINWEIS: Die richtige Konzentration der SA1-Lösung ist entscheidend für die DNA-Gel-Synthese.
  2. Vorbereitung 3 mM SA1 Lösung durch Zugabe von 107 ul 1x Tris-EDTA, pH 8,0 Puffer (TE-Puffer) in die Ampulle (Tabellen 3-4).
  3. Wärme SA1 in TE-Puffer bei 70 ° C für 5 min oder bis ssDNA Pellet vollständig aufgelöst ist. HINWEIS: Die Erwärmungstemperatur sollte mindestens 5 ° C über der Schmelztemperatur (T m) zu gewährleisten, ist in einer DNA-Einzelstrang-Zustand.
  4. Bereiten SA1 Polymerisation Lösung durch Zugabe von 40% Acrylamid und 10x Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer mit den angegebenen Prozentsätzen (Tabelle 3). In diesem Beispiel von 45, und 18 ul bzw. 107 ul SA1-Lösung (Tabelle 4).
  5. Entgasen mit Stickstoff für 3 Minuten Mischen zu erleichtern. Legen Sie eine p200 Spitze zu einem Stickstoffgasquelle in die Lösung befestigt und langsam ermöglichen Stickstoffgas durch die Lösung weiterzugeben. Testen Sie die Durchflussrate von Stickstoffgas in Wasser vor der Entgasung SA1 Lösung um Spritzer zu vermeiden.
  6. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung zu sammeln.
  7. Fügen 4,5 ul 2% Ammoniumpersulfat (APS, Tabellen 3-4), um Gel Polymerisation zu initiieren.
  8. Wird das Röhrchen mehrmals zu mischen.
  9. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung für homogene Polymerisation zu sammeln.
  10. Fügen 4,5 ul 20% Tetramethylethylendiamin (TEMED, Tabellen 3-4), um die Polymerisation zu katalysieren.
  11. Das Röhrchenmehrmals, um zu mischen.
  12. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung für homogene Polymerisation zu sammeln.
  13. Entgasen mit Stickstoff für 3-5 min zur Vervollständigung der Polymerisation und zur Minimierung nicht-umgesetzten Monomeren.
  14. Inkubieren Lösung für 10 min bei RT, um die Polymerisation zu vervollständigen. HINWEIS: Diese Lösung heißt SA1 polymerisierten Lösung.
  15. Die Schritte 1.1.3-1.1.16 mit lyophilisierten SA2 ssDNA, sondern fügen 45, 18, ​​4,5 und 4,5 ul Acrylamid, TBE, APS und TEMED, jeweils mit 108 ul der Lösung SA2 (Tabellen 3-4). HINWEIS: SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.

2. Herstellung von L2, R2, and Control Solutions

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten R2 ssDNA aber fügen 64,4 ul TE-Puffer (Tabelle 4).
  2. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten Steuer ssDNA aber fügen 111 ul TE-Puffer (Tabelle 4
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten L2 ssDNA aber fügen 219 ul TE-Puffer (Tabelle 4). Hinweis: Dies ist 100% L2-Lösung. Zugabe von 100% L2 Lösung SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen (siehe § 1.3) wird eine 100% vernetzten DNA-Gel (100% Gel) bilden, weil SA1, SA2, und L2 wird stöchiometrisch äquivalent sein.
  4. Ein Aliquot von 100% L2-Lösung zu 80% durch Zugabe von 20 ul 1x TE Puffer zu 80 ul 100% L2-Lösung (Tabelle 4). HINWEIS: Diese Lösung ist 80% L2-Lösung. Zugabe von 80% L2 Lösung SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen (siehe § 1.3) wird eine 80% vernetzten DNA-Gel (80% Gel) bilden, weil nur 80% der SA1 und SA2 wird L2 vernetzt werden. Lösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.

3. Herstellung von Gel-Lösungen

  1. Wärme SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen bei 70 ° C, bis die Lösungsviskosität reduziert (etwa 1 min). Erhöhen Sie die Temperatur bis zu 80 °C, wenn Lösung ist immer noch zu viskos Pipette.
  2. Werden 10 ul oder 10 Teile SA1 polymerisierte Lösung zu 10 ul oder 10 Teile SA2 polymerisierte Lösung (Tabelle 4). HINWEIS: SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen sind extrem zäh und schwierig, Pipette. Seit Konzentrationen sind entscheidend für die Gel-Bildung, verwenden Sie ein Verdrängungspipette von diesem Punkt an oder siehe Diskussion für andere Behandlungstechniken. Auch Pipette in mehrere kleine Teilmengen (> 20 ul) anstelle eines einzelnen, großen Volumen.
  3. Mischung SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen miteinander über alternierende Heizung (15 sec bei 70 ° C) und Rühren (für 15 sec mit einer Pipettenspitze) für eine Gesamtzahl von 1 min.
  4. Hinzufügen 6 ul oder 6 Teile 100% L2 Lösung, um eine 100%-Gel (Tabelle 4) zu bilden.
  5. Mischen durch abwechselnde Erhitzen und Rühren, wie in Schritt 1.3.3 beschrieben.
  6. Wärme Gel 1 h lang bei der optimalen Annealing-Temperatur (35 ° C). Berechnen Sie einennealing Temperatur durch Subtrahieren 5 ° C von der ssDNA-Sequenz mit der niedrigsten Schmelztemperatur (Tabelle 1).
  7. Pipettieren 100% Gel in einer 60-mm-Petrischale.
  8. DNA-Vernetzungen ermöglichen, weiterhin durch Inkubation Gel für 4 h bei RT rehybridisieren.
  9. Cover Gel mit PBS, Calcium und Magnesium und Inkubation O / N bei RT. HINWEIS: Die Gele werden etwa 3-fache ihres ursprünglichen Volumens aufquellen. Darüber hinaus werden Gele mit Puffer äquilibriert und überschüssiges Acrylamid wird der Gele diffundieren. Calcium und Magnesium in der PBS zu stabilisieren und verhindern, dass die DNA-Hybridisierung Gel platzt (siehe Diskussion für Toubleshooting Gel Platzen).
  10. Entfernen von Restpufferpetrischale.
  11. Zu 80% Gele herzustellen, wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.10 aber ersetzen 100% L2 Lösung in Schritt 1.3.4 mit 80% L2-Lösung. Speicher 100% und 80% Gele bei 4 ° C für bis zu einem Monat. HINWEIS: Die Steifigkeit Differenzen zwischen 80% und 100% Gele sind physikalisch unterscheidbar.
  12. </ Ol>

    2. Gel Immobilisierung auf Glas

    HINWEIS: Immobilisieren Aliquots von 100% oder 80% Gelen auf Glasdeckgläschen (Abbildung 2).

    1. Wärme 100% Gel bei 70 ° C für etwa 30 s oder bis Gels zum Pipettieren weniger viskos.
    2. Ort Glasplättchen auf einer 70 ° C Wärmeblock und lassen Sie es 1-2 Minuten erhitzen.
    3. Fügen Sie einen Tropfen Klebstoff auf jede optische Deckglas.
    4. Mit 20 ul 100% iges Gel zu jedem Deckglas (Tabelle 4). HINWEIS: 10-30 ul können auf jedem Deckglas verzichtet werden.
    5. Ermöglichen Gel zu schmelzen und sich über Deckglas. HINWEIS: Wenn Gel-Topologie noch nicht einmal nach dem Schmelzen erscheinen, glätten Gel mit einem silikonisierten Deckglas. Allerdings werden zusätzliche Schwellung in nachfolgenden Schritten auftreten und dazu beitragen, Gel Unebenheiten.
    6. Entfernen glashaltigen Gel aus Wärmeblock und in einen 24-Loch-Gewebekulturschale.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 mit 8 0% Gel.
    8. Wärme Gele 1 Stunde lang bei der optimalen Annealing-Temperatur (35 ° C). HINWEIS: Es ist normal, Gele trocken werden, und dies wird aufgelöst, wenn Gele werden in PBS inkubiert werden.
    9. Aussetzen Platten, die 80% und 100% Gelen (UV, 365 nm) Licht für 15 Minuten Ultraviolettlicht. HINWEIS: UV-Exposition gleichzeitig heilt Leim und sterilisiert Gele. Wenn eine UV-Vernetzung Kammer nicht verfügbar ist, können Gele unter UV-Licht, das in einem biologischen Sicherheitsschrank ausgestattet ist, angeordnet werden. Nach der UV-Exposition, führen nachfolgende Schritte in diesem Protokoll unter einem biologischen Sicherheitsschrank zur Gel Sterilität zu erhalten. Verwenden Sie auch sterile Lösungen von diesem Punkt an.
    10. Ermöglichen DNA-Vernetzungen bei RT für 4 h rehybridisieren.
    11. Fügen PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C. HINWEIS: PBS Inkubation Spülungen, Gleichgewicht, und schwillt Gele wieder, weil wiederholt Heizung können die Gele entwässern.

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    Abbildung 2. Schematische Darstellung des Gel-Immobilisierung und Funktionalisierung. Nach der DNA-Gele (grau) hergestellt, Gele werden auf Glasdeckgläschen (weiß) durch optische Kleber (grün) angebracht ist. Gele werden gleichzeitig ausgehärtet und durch UV-Licht sterilisiert. Nach dem Quellen, sind Gele etwa 1 mm dick. Als nächstes werden Gele in einem zweistufigen Verfahren funktionalisiert (rot umrandet Kasten). Zunächst wird Sulfo-SANPAH Acrylamid-Gel auf den Oberflächen durch UV-Belichtung konjugiert. Zweitens werden die Gele mit Kollagen oder Poly-D-Lysin inkubiert, was zu der Sulfo-N-hydroxysuccinimidester in Sulfo-SANPAH isst. Diese Zahl wurde von 10 geändert wurde.

    3. Gel Funktionalisierung

    HINWEIS: DNA Gel Funktionalisierung für die Zelladhäsion erforderlich, da Polyacrylamidgelen inerte Materialien (Abbildung 2). In diesem Abschnitt werden Gele in zwei Schritten funktionalisiert werden. Erste, N -Sulfosuccinimidyl-6 (4-# 39; Azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat oder Sulfo-SANPAH kovalent durch Photolyse nitrophenyl Azidgruppe zu dem Polyacrylamid-Rückgrat der DNA Gele verknüpft werden. Zweitens werden primäre Amine in Kollagen oder Poly-D-Lysin an die Sulfo N-Hydroxysuccinimid-Ester in Sulfo-SANPAH befestigen, um die Proteine ​​an die Gel-Oberfläche zu befestigen.

    1. Entfernen Puffer in Vertiefungen, die mit einer Pipette vorsichtig sein und nicht, um das Gel absaugen. HINWEIS: Vakuum-Aspiration führen nicht um die Wahrscheinlichkeit von Absaugen des Gels zu reduzieren.
    2. Optional) Wasch Gele dreimal für 15 min bei RT, um überschüssiges Monomer Acrylamid, TEMED und APS entfernen.
    3. Fügen Sie über 300 ul Sulfo-SANPAH, jedes Gel decken.
    4. Aussetzen Gels mit UV (365 nm) für 5 min.
    5. Entfernen Sulfo-SANPAH.
    6. Spülen Gele einmal mit PBS, um überschüssige Sulfo-SANPAH entfernen.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,6.
    8. Gele Inkubieren in 300 ul 0,2 mg / ml Poly-D-Lysin für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. HINWEIS: Alternativ inkubieren Gele mit 0,2 mg / ml Kollagen Typ 1 O / N bei 4 ° C ist.
    9. Zweimal waschen Gele mit PBS 5 min, um überschüssige Poly-D-Lysin zu entfernen.
    10. Gele in etwa 300 ul Medium Inkubation 30 min Gele äquilibrieren.
    11. Entfernen Sie das Medium unmittelbar vor dem Beschichten Zellen.

    4. Zellkultivierung und Imaging

    HINWEIS: In diesem Abschnitt geben wir Details über die Erweichung oder Versteifungs von Gelen nach der Zellbeschichtung. Eine detaillierte Zellkultivierungsprotokoll aus mehreren Gründen nicht vorgesehen. Erstens können zahlreiche Zelltypen auf DNA-Gele haften und jeder Zelltyp werden spezifische Anpassungen durch den Forscher für die Zell Beschichtung erfordern. Zweitens werden Standard-Zell-und Gewebekulturtechniken für diese Experimente verwendet und kann in zahlreichen Original-Artikel, technische Artikel, Bücher und Referenz gefunden werden. Techniken für die Beschichtung speziell Fibroblasten und Neuronen auf DNA-Gele können in Previ gefunden werdenschiedenen Publikationen 9-11,19-21.

    1. Plattenzellen. Für Protokolle über Dissektion und / oder Kultivierung von Neuronen oder Fibroblasten in diesem Artikel erwähnt, um eine der folgenden Publikationen 9-11,19-21 beziehen.
    2. Nach mindestens 48 Stunden, modulieren Gel Steifigkeit durch Pipettieren von 1 ul Steuer, L2, R2 oder Lösung in der Nähe des Gel (Tabelle 4).
      1. Gele von 80% bis 100% vernetzt (80 → 100% Gele) versteifen, die restliche 20% der L2 80% Gele durch Zugabe von 1 ul 100% L2 Lösung in der Nähe des Gels.
      2. Bis zu 80% vernetzt (100 → 80% Gele) erweichen Gele aus 100% addieren R2 bis 20% der Querverbindungen 100% Gele durch Zugabe von 1 ul 100% R2 Lösung nahe dem Gel zu entfernen.
      3. Für Kontrollen hinzu gleichen Volumina Kontrolllösung auf eine Teilmenge von 100% und 80% Gele durch Zugabe von 1 ul der Kontroll-Lösung in der Nähe des Gels.
    3. Führen Sie die gewünschte Zellverarbeitung und Datenanalyse nachein Minimum von 48 Stunden.

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Representative Results

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Vor unserer Studien wurden zell ECM-Wechselwirkungen auf statische konform Biomaterialien oder irreversibel und unidirektionalen dynamischen Substraten beobachtet. Diese Substrate müssen nicht genau die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung. Unsere Arbeit verschiebt die bestehenden technischen Paradigmen, indem sie einen physiologischen Modell zur Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen auf Erweichung und Versteifungs dynamische Biomaterialien. In früheren Studien untersuchten wir die Wirkungen von dynamischen Substrate auf Zellen durch die Untersuchung verschiedener Zellmorphologien und Phänotypen auf diesen Gelen. In einem Beispiel bestimmt man die Wirkung der Substratversteifungs auf Fibroblasten Fibroblasten-Morphologie durch Auswertung dynamischer DNA Gele. L929-Zellen, eine Maus-Fibroblasten-Zelllinie abgeleitet ist, wurden auf 80% und 100%-Gelen (3) 11 plattiert. Zwei Tage nach der Beschichtung, 20% mehr L2 Lösung wurde auf Medien von 80% Gele hinzugefügt, um die Gele zu 100% vernetzt (80 → 100%, Mitteltafel zu versteifen). 100% Gele und ein weiterer Satz von 80% Gele empfangenen Steuer ssDNA statische (rechts und links Platte, beziehungsweise) bleiben. Lichtmikroskopie Bilder wurden zwei Tage nach Abgabe von DNA an die Medien erfasst. Bild Unschärfen, wie in Abbildung 3 zu sehen, ist auf Gel-Oberfläche Unebenheiten und ist typisch und unvermeidlich. Gel Schwellung und Schrumpfung, durch den Zusatz von Puffern und L2 18,21 ergeben, trägt dazu bei Unebenheiten gelieren. Morphologie wurde mit ImageJ Software (NIH, Bethesda, MD) untersucht und dienten als Indikator für die Funktion. Fibroblasten auf Versteifungs Gele (80 → 100%) gewachsen hatte keine Veränderungen im Seitenverhältnis, aber zeigte eine größere Projektionsfläche als Fibroblasten auf 100% Gele 11 gewachsen. Interessanterweise ist die Morphologie von Fibroblasten auf statische Gele gewachsen war unähnlich der Morphologie von Fibroblasten auf dynamische Gelen gezüchtet. Fibroblasten auf 100% gewachsen Gele hatten eine kleinere Projektionsfläche und größeren Seitenverhältnis als Fibroblasten auf 80% Gele gewachsen. Diese WiederErgebnisse zeigen, dass Fibroblasten Verhalten ist abhängig von der Dynamik der Mikroumgebung. In einer weiteren Studie wurde die Wirkung von Weichmachersubstrat auf Neuronen durch Analyse neuronaler Phänotypen einschließlich Dendriten Nummer Dendritenlänge und Axonlänge (4) 10 bestimmt. Ratte stammRückenMarksNeuronen wurden auf 100% und 50% Gelen aufgewachsen. Vier Tage nach dem Plattieren wurden 50% R2 an die Medien von 100% Gele zugegeben, um die Gele zu 50% vernetzt (100 → 50%, Mitte) zu erweichen. 50% Gelen und einen weiteren Satz von 100% Gele empfangenen Steuer ssDNA statische (rechte und linke Platten bezeichnet) bleiben. Nach drei Tagen wurden Neuronen fixiert und mit einer dendritischen Marker (MAP2, Top-Platten), einer axonalen Marker (Tau, mittlere Panels) immun und Kerne (DAPI, Bodenplatten), um Phänotypen zu bewerten. Neuronen auf Erweichung Gelen (100 → 50%) gewachsen waren keine Unterschiede in der primären Dendriten Nummer oder Axonlänge, zeigte aber kürzer als primäre Dendriten Neuronen o gewachsen n 50% Gele. Wie in Fibroblasten-Studien waren neuronalen Phänotypen auf statischen Gele unähnlich neuronalen Phänotypen auf dynamischen Gele. Neuronen auf 50% gewachsen Gele hatten weniger Primär Dendriten und Axone mehr als Neuronen auf 100% Gel gewachsen. Abschließend Fibroblasten und Neuronen-Bilder zeigen, dass mehrere Zelltypen können auf dynamische und statische DNA-Gelen untersucht werden, bewirkt, dass DNA-Gel Unebenheiten Abbildungs ​​Herausforderungen, Standard morphologischen und Immuntechniken möglich sind, und vor allem das Verhalten von Zellen ist abhängig von Substrat Dynamik.

Figur 3
Abbildung 3. Fibroblasten auf statische und dynamische DNA-Gelen aufgewachsen. Repräsentative Lichtmikroskopische Bilder von L929 Fibroblasten auf 80% (links), 80 → 100% (Mitte), und 100% Gelen (rechts) gewachsen. Maßstab ist 100 um. Diese Zahl hat sich von 11 geändert wurde.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Neuronen auf DNA-Gelen aufgewachsen. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Rückenmarksneuronen auf 100% (links Platten) aufgewachsen, 100 → 50% (Mitte), und 50% (rechte Felder) Gele. MAP2 Immunfärbung zeigt Dendriten (oben Platten) zeigt Tau-1-Immunfärbung Axone (Mitte Platten) und DAPI-Färbung zeigt Kern (Bodenplatten). Maßstab ist 100 um. Diese Zahl wurde von 10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die Fähigkeit von DNA-Gelen zu erweichen oder zu versteifen, bevor und nachdem die Zelladhäsion macht sie zu einem idealen Modell, um die Rolle von Gewebesteifigkeit dynamisch auf die Zellfunktion untersucht werden. Alle drei Ausführungen sind in mechanischen und biologischen Untersuchungen verwendet. Allerdings haben alle drei Ausführungen ähnlich Elastizitäten bei verschiedenen Vernetzungsprozent anzeigt Vernetzungslänge nicht beeinflusst DNA Gel-Elastizität (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu betrifft Acrylamidkonzentration Elastizität. Diese Muster können in Vernetzungskinetik seit Gel Platzen Tendenzen unterscheiden, oder die Tendenz der Gele in den Medien oder Puffer lösen, nimmt mit zunehmender Vernetzung der Länge. Allerdings kinetische Informationen über DNA-Gelen ist begrenzt, aber wir wissen, eine zusätzliche 30% der Vernetzung erfolgt zwei Tage nach Lieferung L2 zu 50% DNA-Gelen 11. Dennoch ist die Erzeugung der expansiven und Kontraktionskräfte von Gel Erweichung und Versteifung bzw. unvermeidbar und können nicht entkoppelt werden18,21. 100 → 70% Gele erzeugen etwa 0,5 Pa Stress 21, während 50 → 100% Gele erzeugen nur etwa 0,04 Pa von Stress, da mehr Energie wird benötigt, um Anleihen zu den drei Ständen der ssDNA 18 zu bilden. Daher ist die Interpretation der Ergebnisse erfordert die Berücksichtigung von Stress und Belastung durch die Versteifung und Erweichung der Gele erzeugt.

Technische Herausforderungen bei der Vorbereitung DNA-Gelen entstehen. Die häufigste technische Problem ist Gel Platzen. Gel Bersten kann während mehrerer Stufen der DNA-Zubereitung, einschließlich Quellen des Gels, der Lagerung, und das Zellwachstum auf. Gel Zerplatzen wird durch mehrere Faktoren verursacht werden. Erstens kann ein Gel Platzen unsachgemäße Lösung Zusammensetzung sein. Häufige Fehler sind unzureichende Auflösung des gefriergetrockneten ssDNA und unsachgemäße Pipettieren von viskosen Flüssigkeiten. Pipettieren Fehler zu vermeiden, erhöhen die Heiztemperatur auf Gel-Viskosität für einfacher Pipettieren von Lösungen reduzieren oder aliquotiert die gewünschte Uhrount von SA1 und SA2 polymerisierte Lösung vor dem zweiten Schritt Einleiten von Stickstoff. Auch kann wiederholtes Erhitzen der polymerisierten Lösungen teilweise verdampfen die Lösung und erhöhen Lösungsviskosität. Zugabe von ein paar Mikroliter TE-Puffer kann dazu beitragen, die Viskosität zu verringern. Zweitens kann Gel Platzen eine Folge von schlechter DNA-Qualität sein. QA / QC-Berichte müssen häufig überprüft werden. Wenn QA / QC-Berichte sind akzeptabel und Gel Platzen immer noch auftritt, kann HPLC ssDNA DNA-Qualität zu verbessern. Drittens kann Gel Platzen unzureichende DNA Glühen führen. Wir haben das Auftreten von Gel Platzen, indem Glühschritte und Umhybridisierung Schritte in der Original-Protokoll reduziert werden (siehe Schritte 1.3.6 und 2.8; 1.3.8 und 2.10, beziehungsweise). Gel Platzen könnte durch Verlängerung Glühen und Kühlzeiten verhindert werden. Jedoch zusätzliche Wärmeeinwirkung kann das Wasser verdampfen, um eine Erhöhung der Gel Loslösung von Glas verursachen, wenn Gele werden erneut angeschwollen. Wenn Ablösung ist übertrieben für jede Glühdauer, die annEaling Schritte beseitigt (1.3.6 und 2.8) werden.

Eine weitere häufige technische Problem aufgetreten ist unzureichend Zelladhäsion. Die gequollenen Gele sind weicher als die nicht aufgequollenen Gelen (Tabelle 2) 18 Herstellung Zelladhäsion schwierig. Da jeder Zelltyp reagiert anders auf Gewebesteifigkeit, einige Zelltypen kann diese technische Dilemma erleben, während andere Zelltypen nicht. Um die Haftung Fragen einige der Folgeschritte berücksichtigt werden lösen: (1) mit einem hohen Beschichtungs-Dichte, (2) abwechseln, die ECM-Proteine ​​konjugiert Sulfo-SANPAH, (3) modulieren die Steifigkeitsparameter, (4) zu erhöhen ECM-Protein oder Sulfo-SANPAH Konzentration, und (5) zu erhöhen Inkubationszeiten. Rest toxische Mittel, wie Acrylamid-Monomer, APS und TEMED könnte auch zu mangelnder Haftung und Zelltod auf Gelen beitragen. Wir haben dieses Problem nicht, da umfangreiche Erfahrung in den Waschanlagen-Protokoll integriert haben sich als ausreichend erwiesen, aber wir empfehlen performing Optionaler Schritt 3.2, wenn dieses Problem auftritt.

DNA Gele können verwendet werden, um eine Vielzahl von Zellfunktionen unter dynamischen oder statischen Bedingungen besser zu studieren. Wir haben gezeigt, dass Fibroblasten und Neuronen auf DNA-Gelen gezüchtet durch die Modulation des Gels Elastizität beeinflusst werden. Seit Zell-Matrix-Interaktionen sind in der Regel drei-dimensionalen Schnittstellen, Informationen aus dreidimensionalen dynamischen Matrix Studien werden dazu beitragen, relevante Daten mehr biologisch zu produzieren. Daher sind wir derzeit übersetzen diese Technologie in einem dreidimensionalen Gerüst. Wir entwickeln eine Technik, die die Backbone-Polyacrylamid mit einem biokompatiblen Material ersetzt, während die DNA-Vernetzungstechnologie. Dieses neue Gerüst wird als dreidimensionale, dynamische Modell und einem Gewebe-Engineering-Gerüst zu dienen. Seine Biokompatibilität werden Möglichkeiten für die medizinische Geräteanwendungen öffnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke und Dr. Uday Chippada für ihre Beiträge zur Entwicklung der DNA-Gel-Technologie; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter für ihre Kommentare und Bearbeitungen dieser Handschrift; Finanzierungsquellen, einschließlich der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) und New Jersey Neuroscience Institute (MLP); und Herausgeber von Tissue Engineering, Teil A, für die Erlaubnis, 2 und 4 und Biomaterialien für die Erlaubnis, Abbildung 3 Reprint.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com
T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com
12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com
NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com
C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com
13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com
F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/
NI 5.0UH-R

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References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3, (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11, (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5, (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76, (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66, (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82, (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1, (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36, (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16, (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31, (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5, (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126, (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127, (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5, (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6, (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1, (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110, (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38, (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40, (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29, (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102, (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49, (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16, (23-24), 2133-2137 (2004).
Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele
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Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

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