Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

وقد وضعت لدينا مختبر بولي أكريلاميد الهلاميات المائية crosslinked-DNA، ونظام هيدروجيل دينامية، لفهم أفضل للآثار تصلب الأنسجة تحوير على وظيفة الخلية. هنا، ونحن نقدم الخطط، والأوصاف، وبروتوكولات لإعداد هذه الهلاميات المائية.

Abstract

Mechanobiology هو أحد المجالات العلمية الناشئة التي تتناول الدور الحاسم من العظة المادية في توجيه مورفولوجيا الخلايا ووظيفتها. على سبيل المثال، فإن تأثير مرونة الأنسجة على وظيفة الخلية هو أحد المجالات الرئيسية للبحوث mechanobiology بسبب تصلب الأنسجة ينظم مع المرض، والتنمية، والإصابات. المواد محاكاة الأنسجة الثابتة، أو المواد التي لا يمكن أن يغير تصلب مرة واحدة ومطلي الخلايا، وتستخدم في الغالب للتحقيق في آثار تصلب الأنسجة على وظائف الخلية. في حين أن المعلومات التي تم جمعها من الدراسات ذات قيمة ثابتة، هذه الدراسات ليست مؤشرا على الطبيعة الديناميكية لالمكروية الخلوية في الجسم الحي. أفضل لمعالجة آثار تصلب الحيوية على وظيفة الخلية، قمنا بتطوير نظام بولي أكريلاميد هيدروجيل-crosslinked الحمض النووي (DNA المواد الهلامية). على عكس ركائز الحيوية الأخرى، والمواد الهلامية الحمض النووي لديها القدرة على خفض أو زيادة في صلابة بعد التصنيع دون المحفزات. تتكون المواد الهلامية الحمض النووي DNA من crosslالأحبار التي يتم بلمرة في العمود الفقري بولي أكريلاميد. إضافة وإزالة crosslinks عبر إيصال الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل يسمح الزمانية والمكانية، والسيطرة عكسها من مرونة هلام. أظهرنا في تقارير سابقة أن التشكيل الديناميكي للمرونة هلام DNA يؤثر الليفية العصبية والسلوك. في هذا التقرير والفيديو، ونحن نقدم التخطيطي الذي يصف آليات يشابك هلام الحمض النووي وخطوة بخطوة إرشادات حول إعداد المواد الهلامية DNA.

Introduction

ركائز والدينامية هي فئتين من المواد الحيوية التي تم تطويرها لدراسة الآثار المترتبة على مرونة الأنسجة أو تصلب على وظيفة الخلية. ركائز ثابتة غير قادرة على تغيير الخواص الفيزيائية لهم بعد أنها ملفقة و / أو مرة ومطلي الخلايا. كانت بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية وثنائية الأبعاد، أول ركائز ثابتة التي تم توليفها لتحقيقات mechanobiology 5،17. المواد الهلامية السلطة الفلسطينية هي سهلة التحضير وغير مكلفة، وتنوعا، ويمكن أن تكون ملفقة مع مجموعة واسعة من معاملات الرجوعية المرنة. على الرغم من هذه المزايا التقنية تجعل PA المواد الهلامية ركيزة تطبق عادة، ركائز ثابتة لا تدل على الطبيعة الديناميكية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) والبيئة المحيطة الخلوية في الجسم الحي. على سبيل المثال، ECM يخضع التعديلات صلابة نتيجة الإصابة، والتنمية، أو المرض. ولذلك يفضل ركائز ديناميكية كنماذج الركيزة محاكاة الأنسجة في الدراسات mechanobiology

العديد الاصطناعية، تم تطويرها، المواد الحيوية ثنائية الأبعاد، ثلاثية الأبعاد، ثابتة، والديناميكية الطبيعية لتقليد تصلب الأنسجة 1،3،6،16،23،26. بعض ركائز ديناميكية تتطلب الحرارة والأشعة فوق البنفسجية، تيار كهربائي، الأيونات، وتغيرات درجة الحموضة لتغيير خواصها الميكانيكية 2،4،7،8،12،15،16، ولكن يمكن تقييد هذه المحفزات الحيوية تطبيق هيدروجيل ل. بولي أكريلاميد الهلاميات المائية-crosslinked الحمض النووي (DNA المواد الهلامية) هي ركائز مرنة ثنائية الأبعاد الديناميكية. crosslinks DNA تسمح لتعديل الزمني، المكاني، وعكسها من هلام DNA صلابة بإضافة الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) إلى وسائل الإعلام أو العازلة 9-11،13،14،18،21. على عكس المواد الهلامية الديناميكية المذكورة أعلاه حيث يتم تطبيق محفزات للتعديل من مرونة، والمواد الهلامية DNA تعتمد على نشر ssDNA التطبيقية للتغيير مرونة. ولذلك، فإن سطح هلام العلوي، حيث تزرع الخلايا، هو المجال الأول التضمين لأن نسبة سو مرونة التشكيل يعتمد على سمك هلام.

المواد الهلامية DNA مماثلة لنظرائهم هلام السلطة الفلسطينية في أن لديهم العمود الفقري بولي أكريلاميد، يتم استبدال إلا أن crosslinks مكرر الأكريلاميد مع crosslinks تتكون من الحمض النووي (الشكل 1). اثنين ssDNAs (SA1 وSA2) يهجن مع حبلا crosslinker (L2) لتعويض crosslinks DNA من هلام. SA1 وSA2 يكون تسلسل المتميزة التي تحتوي على كل من تعديل Acrydite في نهاية 5'لإدراجها فعال في شبكة السلطة الفلسطينية. لإعداد المواد الهلامية، وSA1 SA2 وبلمرة فردي في العمود الفقري للسلطة الفلسطينية و، في وقت لاحق، وSA1 بلمرة وSA2 تختلط معا. L2، وcrosslinker، يضاف إلى SA1 وSA2 الخليط. تسلسل قاعدة L2 مكمل لكلا SA1 وSA2 متواليات وL2 يهجن مع SA1 بالإضافة SA2 لتشكيل crosslinks DNA. يتم تحديد الأولية، ومرونة هلام DNA من قبل كل من تركيزات L2 ويشابك (الجداول 1 و2). DNA المواد الهلامية التي تحتوي على كميات متكافئة متساوية من L2، SA1، وSA2 هي أقسى المواد الهلامية لSA1 وSA2 هي 100٪ crosslinked بواسطة L2 (تسمى 100٪ المواد الهلامية). تركيزات أقل من L2 النتيجة في نسبة أقل من يشابك DNA، وبالتالي، والمواد الهلامية DNA ليونة. الهلام منخفضة تصل إلى 50٪ crosslinked (المعينة إلى 50٪ الهلام) تم بناؤها 9-11.

الشكل 1
الرقم 1. هلام DNA يشابك وuncrosslinking التخطيطي 9-11،13،14،18،21 الخطوة 1: SA1 (أحمر) وSA2 (الازرق) وبلمرة فردي في العمود الفقري بولي أكريلاميد (أسود). بعد البلمرة، يتم خلط SA1 وSA2 حلول بلمرة معا. يضاف L2 (الخضراء) ويهجن مع SA1 بالإضافة SA2 لتشكيل crosslinks من هلام: الخطوة 2. الخطوة 3: R2 يهجن مع تيانه موطئ قدم من L2. الخطوة 4: التهجين موطئ قدم من R2 يدفع للحيويي من L2 من SA1 وSA2.

على عكس المواد الهلامية السلطة الفلسطينية، يمكن أن المواد الهلامية DNA تشديد وتخفيف بعد التوليف. لهذا السبب، والخلايا نمت على المواد الهلامية الحمض النووي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية صلابة. لتشديد المواد الهلامية خلايا ملتصقة، L2 يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة انخفاض نسبة المواد الهلامية لزيادة نسبة crosslinks. لتليين المواد الهلامية خلايا ملتصقة، يمكن إزالتها L2 لتقليل نسبة crosslinks 10،13،21. L2 ديه تسلسل موطئ قدم إضافي في نهاية 3'للسماح L2 لuncrosslink من SA1 وSA2 (الجدول 1). ويتم إنجاز إزالة L2 بواسطة التهجين من حبلا انعكاس دعا R2. R2 هو مكمل لكامل طول L2 ويهجن مع أول موطئ قدم L2. موطئ قدم التهجين يدفع للحيويي من L2 من SA1 وSA2، الذي يلغي تشعبي ويقلل من تصلب هلام.

في هذا التقرير و الفيديو، وتقدم خطوة بخطوة تعليمات لإعداد تشنج وتليين المواد الهلامية DNA. بينما وصفت 100٪ و 80٪ الاستعدادات هلام، هذا البروتوكول يمكن أن تكون مصممة لخلق المواد الهلامية الأخرى DNA نسب crosslinked الأولية والنهائية. بشكل عام، يتم إعداد 100٪ و 80٪ المواد الهلامية، وثبتوا على زلات الغطاء الزجاجي، بين functionalized، والمصنف مع الخلايا. يضاف L2 لوسائل الإعلام من 80٪ والمواد الهلامية وأضاف R2 إلى وسائل الإعلام من المواد الهلامية 100٪، 48 ساعة بعد الطلاء. إضافة إلى وسائل الإعلام L2 صمود 80٪ إلى 100٪ المواد الهلامية crosslinked، في حين أن إضافة R2 إلى وسائل الإعلام يلطف الهلام 100٪ إلى 80٪ crosslinked. وتتم تسمية المواد الهلامية تشديد إلى 80 → 100٪ والمواد الهلامية وتتم تسمية المواد الهلامية خففت الى 100 → 80٪ والمواد الهلامية في النص. من أجل السيطرة أو المواد الهلامية ثابتة، ssDNA تتألف من تس أو كما يتم تسليمها إلى مجموعة أخرى من 100٪ و 80٪ والمواد الهلامية. بعد مدة لا تقل عن يومين التالية مرونة التشكيل، وخلايا يمكن معالجتها وتحليلها.

EEP-together.within الصفحات = "دائما">
تشعبي DNA # القواعد تسلسل (موطئ القدم) التعديل ذوبان درجة الحرارة (T م، ° C) تعليقات
5 '→ 3 "
تصميم 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 "Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG و 5 "Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 يتم تضمين تسلسل موطئ قدم 10 نقطة أساس.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA غا TGA R2 هو مكمل لL2
تصميم 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 "Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 "Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG غا AC وGTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 يتم تضمين تسلسل موطئ قدم 12 نقطة أساس.
R2 40 GAT غا GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT AAT CCC CAG و 65.9 R2 هو مكمل لL2
Desig من 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 "Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 "Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 لم يتم تضمين موطئ قدم.
السيطرة السيطرة 20-40 AAA AAA (الخ) أو
TTT TTT (الخ)

الجدول 1. تسلسل قاعدة لssDNA 9-11،13،14،18،21. واستخدمت الخلوية والدراسات الميكانيكية عدة دتصاميم تشعبي ifferent لتوليد المواد الهلامية الحمض النووي مع مجموعة من الخواص الميكانيكية والدينامية. المعلمات التضمين في تصميم تشعبي هي تسلسل قاعدة وطول تسلسل أو طول تشعبي. توضح الخطوط جريئة والمائل قاعدة الاقتران بين SA1 وL2 وبين SA2 وL2، على التوالي.

تصميم
1 2 3
تركيز مادة الأكريلاميد (٪) 10 10 10 4
SA1 بالإضافة إلى تهجين SA2 L2 (٪ crosslinked) 50 80 100 50 80 100 100 100
<قوية> مرونة (كيلو باسكال، يعني ± SEM) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

الجدول 2. معامل يونغ (E) من المواد الهلامية DNA 9-11،13،14،18،21. تركيز مادة الأكريلاميد، نسبة تشعبي، وطول تشعبي يمكن التضمين في المواد الهلامية DNA. التصاميم 1 و 2 و 3 لها 20، 28، و 40 نقطة أساس أطوال تشعبي، على التوالي. 100٪ المواد الهلامية لجميع التصاميم لديها معاملات الرجوعية مماثلة مشيرا طول تشعبي لا يؤثر مرونة هلام. ومع ذلك، والاختلافات في تركيز مادة الأكريلاميد تغير مرونة هلام DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول كامل من إعداد هلام لمعالجة الخلايا تأخذ ما لا يقل عن ستة أيام. الوقت المقدر للإعداد هلام هو 8 ساعات بالإضافة إلى O / N الحضانة. الوقت المقدر لتجميد جل والصلب DNA هو 8 ساعات بالإضافة إلى خطوة O / N الشطف. الوقت المقدر للهلام functionalization هو 2 ساعة. الوقت المناسب لطلاء الخلايا والنمو يعتمد على نوع الثقافة والتطبيق، ولكن لا بد من حد أدنى من أربعة أيام.

1. إعداد الهلام DNA

ملاحظة: إعداد المواد الهلامية DNA في ثلاث خطوات متميزة. أولا، تتبلمر فردي SA1 وSA2 ssDNA في العمود الفقري للسلطة الفلسطينية. وتسمى هذه الحلول SA1 حل بلمرة وSA2 حل بلمرة، على التوالي (§1.1). ثانيا، حل crosslinker، حبلا عكسها، وssDNAs السيطرة. حل L2 ssDNA مجفف بالتجميد (crosslinker). وهذا ما يسمى 100٪ حل L2 ويستخدم لصنع المواد الهلامية٪ 100 (§1.2). تمييع قسامة من 100٪ L2 الحلإلى 80٪. وهذا ما يسمى حل L2 80٪ ويستخدم لصنع 80٪ الهلام. حل مجفف بالتجميد R2 (حبلا عكسها) والسيطرة ssDNA لاستخدامها في §4. ثالثا، مزيج SA1 حل بلمرة، SA2 حل بلمرة، و 100٪ أو 80٪ L2 حل في نسبة 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) لتشكيل 100٪ و 80٪ والمواد الهلامية، على التوالي. (§1.3).

1. إعداد SA1 وSA2 حلول بلمرة

  1. اختيار وتأمر SA1 المناسب، SA2، L2، R2 وتسلسل قاعدة من الجدولين 1 و 2. تم الأمثل تسلسل القاعدة وطول التسلسل في التقارير السابقة 9-11،13،14.
  2. حساب كل الصيغ الحل (الجداول 3-4). ملاحظة: حسابات ثيقة بدقة لأغراض استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ويوصى بناء قالب اكسل ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا لتحضير هلام DNA. يرجى الاطلاع على الجداول 3 و 4 مثال على جدولة للتصميم 2 (الجداول 1 و 2). وسوف تستخدم وحدات التخزين المحددة في الجدول رقم 4 طوال هذا البروتوكول ولكن سوف تختلف أحجام مع كل قسامة من ssDNA مجفف بالتجميد.
حل الأسهم تركيز الحل النسبة المئوية للأسهم الحل في SA1 أو SA2 الحل بلمرة (V / V) تركيز النهائي من الحل في SA1 أو الحل SA2 مبلمر
الأكريلاميد (عدم Bisacrylamide) 40٪ 25 10٪
SA1 أو SA2 الحل 100٪ 60 60٪
عازلة TBE 10X 10 1X
TEMED 20٪ 2.5 0.50٪
APS 2٪ 2.5 0.05٪

الجدول 3. نسبة من الحلول لافتعال SA1 أو حلول بلمرة SA2 ويبين العمود الأول الحلول لصياغة المواد الهلامية DNA. ويظهر العمود الثاني تركيزات المخزون من هذه الحلول. ويبين العمود الثالث نسبة الحلول الأسهم في SA1 أو حلول بلمرة SA2 (ت / ت). العمود الأخير يعكس تركيزات النهائي في SA1 وSA2 الحلول.

حلول ssDNA (§1.1) <TR>
مكونات الحل
حل الأسهم تركيز تركيز المحلول النهائي الحساب إلى إضافة مبلغ تعليقات
حل SA1 320.7 نانومول من مجفف بالتجميد SA1 ssDNA 3.00 ملي 320.7 نانومول / 3.00 نانومول ميكرولتر -1 = 107 ميكرولتر 107 ميكرولتر من العازلة TE إلى مجفف بالتجميد ssDNA حل SA1 هو 60٪ من SA1 حل بلمرة.
107 ميكرولتر / 0.600 = 178 ميكرولتر
178 ميكرولتر هي الحجم الكلي للSA1 حل بلمرة (الجدول 3).
حل SA2 324.4 نانومول من مجفف بالتجميد SA2 ssDNA 3.00 ملي 324.4 نانومول / 3.00 نانومول ميكرولتر -1 = 108 ميكرولتر 108 ميكرولتر من العازلة TE إلى مجفف بالتجميد ssDNA حل SA2 هو 60٪ من SA2 حل بلمرة.
108 ميكرولتر / 0.600 = 180 ميكرولتر
180 ميكرولتر هي الحجم الكلي للSA2 حل بلمرة (الجدول 3).
100٪ L2 الحل 657.4 نانومول من مجفف بالتجميد L2 ssDNA 3.00 ملي 657.4 نانومول / 3.00 نانومول ميكرولتر -1 = 219 ميكرولتر 219 ميكرولتر من العازلة TE إلى مجفف بالتجميد ssDNA تمييع قسامة من 100٪ إلى 80٪ L2 L2 الحل
80٪ L2 الحل 80 ميكرولتر من 100٪ L2 ssDNA 80٪ - 20 ميكرولتر من العازلة TE إلى 80 ميكرولتر من 100٪ L2 الحل
حل التحكم 332.6 نانومول من مجفف بالتجميد بولي T أو وssDNA 3.00 ملي 332.6 نانومول / 3.00 نانومول ميكرولتر <سوب> -1 = 111 ميكرولتر 111 ميكرولتر من العازلة TE إلى مجفف بالتجميد ssDNA
R2 الحل 193.8 نانومول من مجفف بالتجميد R2 ssDNA 3.00 ملي 193.8 نانومول / 3.00 نانومول ميكرولتر -1 = 64.6 ميكرولتر 64.6 ميكرولتر من العازلة TE إلى مجفف بالتجميد ssDNA
حلول بلمرة (§1.2)
SA1 حل بلمرة 40٪ الأكريلاميد 10٪ 178 ميكرولتر X 0.25 = 44.5 ميكرولتر 45 ميكرولتر حساب كمية مادة الأكريلاميد، TBE، APS، وTEMED على أساس إجمالي حجم 178 ميكرولتر (انظر أعلاه والجدول 3).
10X TBE 1X 178 ميكرولتر × 0.10 = 17.8 ميكرولتر 18 ميكرولتر
100٪ حل SA1 60٪ - 107 ميكرولتر حل SA1 هو 60٪ من الحل بلمرة SA1 (انظر أعلاه والجدول 3).
2٪ APS 0.05٪ 178 ميكرولتر X 0.025 = 4.45 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر إضافة وخلط APS قبل إضافة TEMED.
20٪ TEMED 0.50٪ 178 ميكرولتر X 0.025 = 4.45 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر
SA2 حل بلمرة 40٪ الأكريلاميد 10٪ 180 ميكرولتر X 0.25 = 45 ميكرولتر 45 ميكرولتر حساب كمية مادة الأكريلاميد، TBE، APS، وTEMED على أساس إجمالي حجم 180 ميكرولتر (انظر أعلاه والجدول 3).
10X TBE 1X 180 ميكرولتر × 0.10 = 18 ميكرولتر 18 ميكرولتر
100٪ حل SA2 60٪ - 108 ميكرولتر حل SA2 هو 60٪ من الحل بلمرة SA2 (انظر أعلاه والجدول 3).
2٪ APS 0.05٪ 180 ميكرولتر X 0.025 = 4.5 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر إضافة وخلط APS قبل إضافة TEMED
20٪ TEMED 0.50٪ 180 ميكرولتر X 0.025 = 4.5 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر
حلول هلام (§1.3)
100٪ حل جل 100٪ SA1 حل بلمرة 10 أجزاء - 10 ميكرولتر تكوين الهلام 100٪ مع SA1 التالية: SA2: نسبة L2، 10: 10: 6.
100٪ SA2 سول بلمرةution 10 أجزاء - 10 ميكرولتر
100٪ L2 الحل 6 أجزاء - 6 ميكرولتر
80٪ محلول هلام 100٪ SA1 حل بلمرة 10 أجزاء - 10 ميكرولتر يؤلف 80٪ الهلام مع SA1 التالية: SA2: نسبة L2، 10: 10: 6.
100٪ SA2 حل بلمرة 10 أجزاء - 10 ميكرولتر
80٪ L2 الحل 6 أجزاء - 6 ميكرولتر
المواد الهلامية الديناميكية (§3-4)
80 → 100٪ هلام 80٪ هلام 100٪ جنرال الكتريكل حساب 1: 1 ميكرولتر من 100٪ L2 الحل في وسائل الإعلام ثقافة تستند الحسابات على وجود 20 ميكرولتر المواد الهلامية على زلات الغطاء. أولا، تحويل أجزاء من 100٪ L2 حل في 20 ميكرولتر من هلام في ميكرولتر. ثانيا، حساب كمية (في ميكرولتر) من 100٪ L2 حل اللازمة لإضافية 20٪ من يشابك. إضافة هذا المبلغ من 100٪ L2 حل لهلام.
(20 ميكرولتر / 26 أجزاء) × 6 = 4.6 ميكرولتر أجزاء
الحساب 2:
5 ميكرولتر X 0.2 = 1 ميكرولتر
100 → 80٪ هلام 100٪ هلام 80٪ هلام حساب 1: 1 ميكرولتر من 100٪ R2 الحل في وسائل الإعلام ثقافة تستند الحسابات على وجود 20 ميكرولتر المواد الهلامية على زلات الغطاء. أولا، تحويل رانه أجزاء من 100٪ L2 حل في 20 ميكرولتر من هلام في ميكرولتر. ثانيا، حساب كمية (في ميكرولتر) من 100٪ L2 حل اللازمة لإزالتها أن يؤلف هلام 20٪. إضافة هذه الكمية من R2 حل لهلام.
(20 ميكرولتر / 26 أجزاء) × 6 = 4.6 ميكرولتر أجزاء
الحساب 2:
5 ميكرولتر X 0.2 = 1 ميكرولتر
100٪ هلام (التحكم) 100٪ هلام 100٪ هلام - 1 ميكرولتر من حل التحكم في وسائل الإعلام ثقافة كمية من محلول السيطرة يعادل مبلغ R2 حل الإضافة.
80٪ هلام (التحكم) 80٪ هلام 80٪ هلام - 1 ميكرولتر من حل التحكم في وسائل الإعلام ثقافة كمية من محلول تحكم ما يعادل مبلغ 100٪ تضاف حل L2.

يتم توفير أرقام الجدول 4. الحسابات مثال لتحضير هلام DNA. وهمية لتوضيح الحسابات لإعداد 80٪، 100٪، 100 → 80٪، و 80 → 100٪ المواد الهلامية. المواد الهلامية DNA هي تصميم 2 في الجدول 1.

  1. الطرد المركزي مجفف بالتجميد SA1 ssDNA في 2،000 x ج لمدة 15 ثانية لضمان جميع ssDNA هو في أسفل القارورة. ملاحظة: تركيز السليم للحل SA1 أمر بالغ الأهمية لتخليق الحمض النووي هلام.
  2. إعداد 3 ملم من SA1 حل عن طريق إضافة 107 ميكرولتر من 1X تريس، EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 العازلة (TE العازلة) للقارورة (الجداول 3-4).
  3. يذوب SA1 الحرارة في TE العازلة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى ssDNA بيليه تماما. وينبغي أن تكون درجة حرارة التدفئة لا تقل عن 5 درجات مئوية فوق درجة حرارة انصهار (T م) لضمان DNA في حالة واحدة تقطعت بهم السبل: ملاحظة.
  4. إعداد الحل البلمرة SA1 بإضافة 40٪ الأكريلاميد و10X تريس بورات-EDTA (TBE) العازلة في النسب المشار إليها (الجدول 3). في هذا المثال، إضافة 45 ميكرولتر و 18، على التوالي، إلى 107 ميكرولتر من الحل SA1 (الجدول 4).
  5. ديغا مع غاز النيتروجين لمدة 3 دقائق لتسهيل الخلط. إدراج غيض P200 تعلق على مصدر غاز النيتروجين في الحل والسماح ببطء غاز النيتروجين بالمرور الحل. اختبار معدل تدفق غاز النيتروجين في الماء قبل التفريغ حل SA1 لمنع بقع.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 2000 x ج لجمع الحل.
  7. إضافة 4.5 ميكرولتر من 2٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS، الجداول 3-4) لبدء جل البلمرة.
  8. عكس الأنبوب عدة مرات لخلط.
  9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 2000 x ج لجمع حل لبلمرة متجانسة.
  10. إضافة 4.5 ميكرولتر من 20٪ tetramethylethylenediamine (TEMED، الجداول 3-4) لتحفيز بلمرة.
  11. عكس الأنبوبعدة مرات لخلط.
  12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 2000 x ج لجمع حل لبلمرة متجانسة.
  13. ديغا مع غاز النيتروجين لمدة 3-5 دقيقة لاستكمال البلمرة وتقليل أحادية، كان رد فعل الامم المتحدة.
  14. احتضان الحل لمدة 10 دقيقة في RT لاستكمال البلمرة. ملاحظة: يسمى هذا الحل SA1 حل بلمرة.
  15. كرر الخطوات 1.1.3-1.1.16 مع مجفف بالتجميد SA2 ssDNA، ولكن يضيف 45، 18، 4.5، و 4.5 ميكرولتر من الأكريلاميد، TBE، APS، وTEMED، على التوالي، إلى 108 ميكرولتر من الحل SA2 (الجداول 3-4). ملاحظة: SA1 والحلول بلمرة SA2 يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

2. إعداد L2، R2، وحلول التحكم

  1. كرر الخطوات 1.1.3-1.1.5 مع مجفف بالتجميد R2 ssDNA لكن إضافة 64.4 ميكرولتر من العازلة TE (الجدول 4).
  2. كرر الخطوات 1.1.3-1.1.5 مع مجفف بالتجميد السيطرة ssDNA لكن إضافة 111 ميكرولتر من العازلة TE (الجدول 4
  3. كرر الخطوات 1.1.3-1.1.5 مع مجفف بالتجميد L2 ssDNA لكن إضافة 219 ميكرولتر من العازلة TE (الجدول 4). ملاحظة: هذا هو 100٪ L2 الحل. بإضافة 100٪ L2 حل لSA1 والحلول بلمرة SA2 (انظر §1.3) سوف تشكل 100٪ crosslinked هلام الحمض النووي (100٪ هلام) لأن SA1، SA2، وL2 معادلا stoichiometrically.
  4. تمييع قسامة من 100٪ L2 حل 80٪ من خلال إضافة 20 ميكرولتر من 1X TE عازلة ل80 ميكرولتر من 100٪ L2 حل (الجدول 4). ملاحظة: هذا الحل هو حل 80٪ L2. مضيفا 80٪ L2 حل لSA1 والحلول بلمرة SA2 (انظر §1.3) سوف تشكل 80٪ هلام DNA crosslinked (80٪ هلام) لأنه سيتم crosslinked فقط 80٪ من SA1 وSA2 إلى L2. ويمكن تخزين الحلول في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

3. إعداد حلول جل

  1. يتم تخفيض الحرارة وSA1 SA2 حلول بلمرة عند 70 درجة مئوية حتى حل اللزوجة (حوالي 1 دقيقة). رفع درجة حرارة تصل إلى 80 درجةC إذا حل لا يزال لزج جدا ماصة.
  2. إضافة 10 ميكرولتر أو 10 أجزاء من SA1 حل بلمرة إلى 10 ميكرولتر أو 10 أجزاء من SA2 حل بلمرة (الجدول 4). ملاحظة: SA1 والحلول بلمرة SA2 هي لزجة جدا ويصعب ماصة. منذ تركيزات حاسمة لتكوين هلام، استخدم ماصة الإيجابية التشريد من هذه النقطة إلى الأمام أو انظر المناقشة لتقنيات المناولة الأخرى. أيضا، في ماصة متعددة، مأخوذة صغيرة (> 20 ميكرولتر) بدلا من واحد، حجم كبير.
  3. مزيج SA1 وSA2 حلول بلمرة معا عبر بالتناوب التدفئة (لمدة 15 ثانية في 70 ° C) واثارة (لمدة 15 ثانية مع تلميح ماصة) لما مجموعه 1 دقيقة.
  4. إضافة 6 ميكرولتر أو 6 أجزاء من 100٪ L2 حل لتشكيل هلام 100٪ (جدول 4).
  5. مزيج بالتناوب التدفئة واثارة كما هو موضح في الخطوة 1.3.3.
  6. هلام الحرارة لمدة 1 ساعة في درجة الحرارة المثلى الصلب (35 ° C). حسابnnealing درجة الحرارة عن طريق طرح 5 ° C من تسلسل ssDNA مع أدنى درجة حرارة انصهار (الجدول 1).
  7. ماصة هلام 100٪ إلى 60 ملم طبق بتري.
  8. تسمح crosslinks DNA على مواصلة rehybridize التي يحتضنها الجل لمدة 4 ساعة عند RT.
  9. هلام غطاء مع برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم واحتضان O / N في RT. ملاحظة: سوف الهلام تنتفخ حوالي 3 مرات حجمها الأولي. بالإضافة إلى ذلك، سوف تتوازن مع المواد الهلامية العازلة والأكريلاميد الزائد سوف تنتشر من المواد الهلامية. الكالسيوم والمغنيسيوم في برنامج تلفزيوني استقرار تهجين الحمض النووي ومنع هلام الانفجار (انظر مناقشة لtoubleshooting هلام انفجار).
  10. إزالة ما تبقى العازلة من طبق بيتري.
  11. لصنع 80٪ الهلام، كرر الخطوات من 1.3.1-1.3.10 لكن استبدال 100٪ L2 حل في الخطوة 1.3.4 مع 80٪ L2 الحل. تخزين 100٪ و 80٪ والمواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد. ملاحظة: الاختلافات صلابة بين 80٪ و 100٪ المواد الهلامية يمكن تمييزها جسديا.
    12. </ OL>

    2. جل الشلل على الزجاج

    ملاحظة: شل aliquots من 100٪ أو 80٪ والمواد الهلامية على زلات الغطاء الزجاجي (الشكل 2).

    1. تسخين 100٪ هلام عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية أو حتى أقل هلام لزج لpipetting ل.
    2. مكان غطاء زجاجي ينزلق إلى 70 درجة مئوية كتلة الحرارة وتسمح للحرارة لمدة 1-2 دقيقة.
    3. إضافة قطرة من مادة لاصقة البصرية إلى كل زلة غطاء زجاجي.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من 100٪ هلام إلى كل زلة غطاء زجاجي (الجدول 4). ملاحظة: يمكن الاستغناء 10-30 ميكرولتر على كل زلة غطاء.
    5. السماح للهلام لتذوب وتنتشر على الغطاء الزجاجي الانزلاق. ملاحظة: إذا لم يظهر هلام طوبولوجيا حتى بعد ذوبان، تتسطح هلام مع صلكنزد غطاء زجاجي زلة. ومع ذلك، سوف يحدث تورم إضافي في الخطوات اللاحقة والمساهمة في هلام التفاوت.
    6. إزالة هلام التي تحتوي على الزجاج من كتلة الحرارة والمكان الى 24 طبق جيدا زراعة الأنسجة.
    7. كرر الخطوات من 2،1-2،6 مع 8 0٪ هلام.
    8. المواد الهلامية الحرارة لمدة 1 ساعة في درجة الحرارة المثلى الصلب (35 ° C). ملاحظة: فمن الطبيعي للالهلام لتصبح جافة وهذه ستحل عندما يتم تحضين المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني.
    9. فضح لوحات تحتوي على 80٪ و 100٪ المواد الهلامية للأشعة فوق البنفسجية (UV، 365 نانومتر) ضوء لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: التعرض للأشعة فوق البنفسجية الغراء تشفي في وقت واحد، ويعقم المواد الهلامية. إذا يشابك غرفة للأشعة فوق البنفسجية ليست متاحة، المواد الهلامية يمكن وضعها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي هي مجهزة تجهيزا في خزانة السلامة البيولوجية. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، نفذ الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول في إطار مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للحفاظ على هلام العقم. أيضا، استخدم الحلول العقيمة من هذه النقطة إلى الأمام.
    10. تسمح crosslinks DNA لrehybridize في RT لمدة 4 ساعة.
    11. إضافة PBS واحتضان O / N في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يشطف PBS الحضانة، equilibrates، وتتضخم المواد الهلامية مرة أخرى بسبب التدفئة المتكررة يمكن أن يذوى المواد الهلامية.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    الشكل 2. تخطيطي لتجميد جل وfunctionalization. بعد أن يتم إعداد المواد الهلامية DNA (الرمادي)، وترفق المواد الهلامية لزلات غطاء زجاجي (أبيض) بواسطة الغراء البصرية (الخضراء). ويتم علاجه في وقت واحد المواد الهلامية وتعقيم بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. بعد تورم، والمواد الهلامية هي حوالي 1 مم. المقبل، وبين functionalized المواد الهلامية في عملية من خطوتين (مربع أوجز الحمراء). أولا، مترافق سلفو-SANPAH لمادة الأكريلاميد على السطوح جل عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية. ثانيا، يتم تحضين المواد الهلامية مع الكولاجين أو بولي-D-يسين، والتي يعلقها على استر سلفو-N-hydroxysuccinimide في سلفو-SANPAH. تم تعديل هذا الرقم من 10.

    3. جل Functionalization

    مطلوب DNA هلام functionalization للالتصاق الخلية منذ الهلام بولي أكريلاميد هي مواد خاملة (الشكل 2): ملاحظة. في هذا القسم، سيتم بين functionalized المواد الهلامية في خطوتين. أولا، N--Sulfosuccinimidyl 6- (4 &# 39؛ -azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate أو سيتم ربط سلفو-SANPAH تساهميا بواسطة التحلل الضوئي من مجموعة nitrophenyl أزيد على العمود الفقري بولي أكريلاميد من المواد الهلامية DNA. ثانيا، سوف الأمينات الأولية في الكولاجين أو بولي-D-يسين نعلق على N استر -hydroxysuccinimide سلفو في سلفو-SANPAH إرفاق البروتينات على سطح هلام.

    1. إزالة عازلة في الآبار مع ماصة ويجب الحرص على عدم نضح هلام. ملاحظة: لا تؤدي الشفط للحد من احتمال الشفط هلام.
    2. اختياري) الهلام غسل ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في RT لإزالة الزائد الأكريلاميد مونومر، TEMED، وكالة الأنباء الجزائرية.
    3. إضافة حوالي 300 ميكرولتر من سلفو-SANPAH لتغطية كل هلام.
    4. كشف المواد الهلامية للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة سلفو-SANPAH.
    6. المواد الهلامية شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائد سلفو-SANPAH.
    7. كرر الخطوات من 3،3-3،6.
    8. احتضان المواد الهلامية في حوالي 300 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل من بولي-D-يسين لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C. ملاحظة: بدلا من ذلك، واحتضان المواد الهلامية مع 0.2 ملغ / مل من نوع الكولاجين 1 O / N في 4 درجات مئوية.
    9. يغسل الهلام مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لإزالة الزائد بولي-D-يسين.
    10. احتضان المواد الهلامية في حوالي 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن المواد الهلامية.
    11. إزالة وسائل الإعلام على الفور قبل الطلاء الخلايا.

    4. التثقيف الخليوي والتصوير

    ملاحظة: في هذا القسم، ونحن نقدم التفاصيل المتعلقة تليين أو تشنج من المواد الهلامية بعد الطلاء الخلية. لم يتم توفير بروتوكول مفصل زراعة الخلايا لعدة أسباب. أولا، يمكن أن العديد من أنواع الخلايا تلتزم على المواد الهلامية DNA وسيكون لكل نوع من الخلايا تتطلب تعديلات محددة من قبل الباحث لطلاء الخلية. ثانيا، يتم استخدام تقنيات زراعة الخلايا والأنسجة القياسية لهذه التجارب ويمكن العثور عليها في العديد من المواد الأصلية، مقالات تقنية، والكتب المرجعية. تقنيات لتصفيح تحديدا الليفية والخلايا العصبية على المواد الهلامية DNA يمكن العثور عليها في previالمنشورات الأوس 9-11،19-21.

    1. لوحة الخلايا. لبروتوكولات بشأن تشريح و / أو زراعة الخلايا العصبية أو الخلايا الليفية المذكورة في هذه المقالة، راجع إلى واحدة من المنشورات التالية 9-11،19-21.
    2. بعد مدة لا تقل عن 48 ساعة، تعدل هلام صلابة من قبل pipetting 1 ميكرولتر من السيطرة، L2، R2 أو حل قريب من هلام (الجدول 4).
      1. لتشديد المواد الهلامية من 80٪ إلى 100٪ crosslinked (80 → 100٪ الهلام)، إضافة ال 20٪ المتبقية من L2 إلى 80٪ الهلام بإضافة 1 ميكرولتر من 100٪ L2 حل مقرب من هلام.
      2. لتليين المواد الهلامية من 100٪ إلى 80٪ crosslinked (100 → 80٪ الهلام)، إضافة R2 لإزالة 20٪ من crosslinks من 100٪ المواد الهلامية بإضافة 1 ميكرولتر من 100٪ R2 حل مقرب من هلام.
      3. للضوابط، إضافة كميات متساوية من حل التحكم لمجموعة فرعية من 100٪ و 80٪ والمواد الهلامية بإضافة 1 ميكرولتر من السيطرة الحل قريب من هلام.
    3. أداء معالجة الخلايا وتحليل البيانات المطلوب بعدما لا يقل عن 48 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل دراستنا، لم يلاحظ التفاعلات خلية ECM على المواد الحيوية المتوافقة ثابتة أو على ركائز ديناميكية لا رجعة فيها وأحادي الاتجاه. هذه ركائز لا تعكس بدقة الطبيعة الديناميكية لالمكروية الخلوية. التحولات عملنا النماذج التقنية القائمة من خلال توفير نموذج أكثر فيزيولوجي لدراسة التفاعلات خلية ECM على تخفيف تشنج والحيوية الديناميكية. في الدراسات السابقة، قمنا بتحليل آثار ركائز الحيوية على الخلايا عن طريق دراسة مختلف الأشكال التضاريسية الخلية والظواهر على هذه المواد الهلامية. في مثال واحد، توصلنا إلى آثار الركيزة تشنج على الخلايا الليفية من خلال تقييم مورفولوجيا الخلايا الليفية على المواد الهلامية DNA الديناميكية. كانت مطلية خلايا L929، خط الخلية الليفية المشتقة من الماوس، على 80٪ و 100٪ المواد الهلامية (الشكل 3) 11. بعد يومين من الطلاء، و 20٪ تم إضافة L2 حل إضافي لوسائل الإعلام من 80٪ الهلام لتشديد المواد الهلامية إلى 100٪ crosslinked (80 → 100٪، لوحة مركز). المواد الهلامية 100٪ ومجموعة أخرى من 80٪ والمواد الهلامية تلقت السيطرة ssDNA أن تبقى ثابتة (يمين ويسار اللوحة، على التوالي). تم القبض على الصور المجهري الخفيفة بعد يومين من تسليم DNA لوسائل الاعلام. صورة التشويش، كما رأينا في الشكل 3، كان من المقرر أن جل التفاوت السطحية وغير نموذجي ولا مفر منها. هلام تورم والانكماش، نتيجة لإضافة المخازن المؤقتة وL2 18،21، ويسهم في هلام التفاوت. تم تقييم التشكل مع برنامج يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD) وكان بمثابة مؤشر على وظيفة. كان الليفية المزروعة في تشنج المواد الهلامية (80 → 100٪) أي تغييرات في نسبة الارتفاع، ولكن أظهرت منطقة الإسقاط أكبر من الخلايا الليفية نمت على 100٪ المواد الهلامية 11. ومن المثير للاهتمام، كان مورفولوجيا الخلايا الليفية نمت على المواد الهلامية ثابتة يختلف عن مورفولوجيا الخلايا الليفية نمت على المواد الهلامية الديناميكية. كان الليفية نمت على المواد الهلامية 100٪ منطقة الإسقاط أصغر ونسبة الارتفاع أكبر من الخلايا الليفية نمت على 80٪ الهلام. هذه إعادةsults تشير إلى أن سلوك الخلايا الليفية تعتمد على الطبيعة الديناميكية لالمكروية. في دراسة أخرى، تم تحديد آثار الركيزة تليين على الخلايا العصبية من خلال تحليل الظواهر العصبية بما في ذلك رقم التغصنات، طول التغصنات، وطول المحور العصبي (الشكل 4) 10. وقد نمت الخلايا العصبية في النخاع الشوكي المستمدة من الفئران على 100٪ و 50٪ والمواد الهلامية. بعد أربعة أيام من الطلاء، وأضيف 50٪ R2 إلى وسائل الإعلام من المواد الهلامية 100٪ لتليين المواد الهلامية إلى 50٪ crosslinked (100 → 50٪، والألواح وسط). 50٪ المواد الهلامية ومجموعة أخرى من المواد الهلامية 100٪ تلقت السيطرة ssDNA أن تبقى (لوحات اليمين واليسار، على التوالي) ثابتة. بعد ثلاثة أيام، تم إصلاح الخلايا العصبية وimmunostained مع علامة شجيري (MAP2، لوحات أعلى)، علامة محور عصبي (تاو، والألواح الوسطى)، والنوى (دابي، والألواح السفلية) لتقييم الظواهر. كانت الخلايا العصبية المزروعة في تليين المواد الهلامية (100 → 50٪) عدم وجود فروق في عدد التغصنات الأساسي أو طول محور عصبي، ولكن أظهرت التشعبات الأولية أقصر من الخلايا العصبية نمت س ن 50٪ الهلام. كما هو الحال في الدراسات الليفية، كانت الظواهر العصبية على المواد الهلامية ثابتة تختلف عن الظواهر العصبية على المواد الهلامية الديناميكية. كانت الخلايا العصبية نمت على 50٪ الهلام التشعبات الأولية أقل ومحاور أطول من الخلايا العصبية نمت على 100٪ هلام. في الختام، الخلايا الليفية والخلايا العصبية الصور تثبت أن أنواع الخلايا متعددة يمكن دراستها على المواد الهلامية DNA ثابتة وديناميكية، هلام DNA التفاوت يسبب تحديات التصوير، وتقنيات المورفولوجية والمناعية القياسية الممكنة، والأهم من سلوك الخلايا يعتمد على ديناميكية الركيزة.

الرقم 3
الرقم 3. الخلايا الليفية نمت على المواد الهلامية DNA والدينامية. الصور المجهري ضوء الممثل من الخلايا الليفية L929 نمت على 80٪ (اللوحة اليسرى)، 80 → 100٪ (لوحة في الوسط)، والمواد الهلامية٪ 100 (اللوحة اليمنى). شريط النطاق هو 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من 11.أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" الهدف = "_ على بياض"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. الخلايا العصبية المزروعة في المواد الهلامية DNA. الصور الفلورسنت التمثيلية من الخلايا العصبية في النخاع الشوكي نمت على 100٪ (لوحات اليسار)، و 100 → 50٪ (لوحات الوسط)، و 50٪ (لوحات اليمين) الهلام. MAP2 المناعية يشير التشعبات (لوحات أعلى)، تاو-1 المناعية يشير محاور (لوحات المتوسطة)، وتلطيخ دابي يشير نواة (لوحات أسفل). شريط النطاق هو 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قدرة المواد الهلامية DNA لتليين أو تشديد قبل وبعد التصاق الخلايا يجعلها نموذجا مثاليا لدراسة دور تصلب الأنسجة الحيوية على وظيفة الخلية. وقد استخدمت جميع التصاميم الثلاثة في الدراسات الميكانيكية والبيولوجية. ومع ذلك، كل التصاميم الثلاث لديها مرونة مماثلة على مختلف النسب المئوية تشعبي، مشيرا إلى طول تشعبي لا تؤثر مرونة هلام الحمض النووي (الجدول 2). في المقابل، تركيز مادة الأكريلاميد يؤثر مرونة. قد تختلف هذه التصاميم في حركية يشابك منذ انفجار النزعات هلام، أو الميل من المواد الهلامية لتذوب في وسائل الإعلام أو عازلة، والنقصان مع زيادة طول تشعبي. لكن المعلومات الحركية على المواد الهلامية DNA محدودة، ولكننا نعرف على 30٪ إضافية من يشابك يحدث بعد يومين من تسليم L2 إلى 50٪ الهلام DNA 11. ومع ذلك، فإن الجيل القوات توسعية ومقلص من تليين هلام وتشنج، على التوالي، أمر لا مفر منه، ولا يمكن أن تنفصل18،21. 100 → 70٪ الهلام تولد حوالي 0.5 باسكال الإجهاد 21، في حين أن 50 → 100٪ المواد الهلامية يولد إلا حوالي 0.04 باسكال من التوتر حيث انه يلزم المزيد من الطاقة لتكوين روابط بين المدرجات ثلاثة من ssDNA 18. ولذلك، فإن تفسير النتائج يتطلب النظر في الضغط العصبي والتوتر الناتجة عن تشنج وتليين المواد الهلامية.

يمكن أن تنشأ التحديات التقنية عند إعداد المواد الهلامية DNA. القضية الفنية الأكثر شيوعا هو هلام انفجار. يمكن أن يحدث هلام انفجار خلال عدة مراحل من الحمض النووي بما في ذلك إعداد هلام هلام تورم، والتخزين، ونمو الخلايا. وتسبب انفجار هلام بعوامل متعددة. أولا، يمكن أن يكون جل انفجار نتيجة لتكوين الحل غير لائق. وتشمل الأخطاء الشائعة تذويب عدم كفاية ssDNA مجفف بالتجميد وpipetting لغير السليم للسوائل لزجة. لتجنب الأخطاء pipetting ل، رفع درجة حرارة التدفئة لتقليل هلام اللزوجة لpipetting لأسهل الحلول أو قسامة صباحا المطلوبةount من SA1 وSA2 حل بلمرة قبل الخطوة فقاعات النيتروجين الثانية. أيضا، التدفئة المتكرر للحلول بلمرة يمكن أن تتبخر جزئيا الحل والحل زيادة اللزوجة. يمكن إضافة بضع ميكرولتر من TE عازلة تساعد على تقليل اللزوجة. ثانيا، يمكن أن يكون جل انفجار نتيجة لسوء نوعية الحمض النووي. يجب مراجعة تقارير QA / QC بشكل متكرر. إذا تقارير QA / QC مقبولة وهلام انفجار لا يزال يحدث، يمكن HPLC المنقى ssDNA تحسين نوعية الحمض النووي. ثالثا، يمكن أن تنجم عن انفجار هلام كافية الصلب DNA. خفضنا نسبة حدوث انفجار بواسطة هلام بما في ذلك الخطوات الصلب والخطوات rehybridization في البروتوكول الأصلي (انظر خطوات 1.3.6 و 2.8، 1.3.8 و 2.10، على التوالي). يمكن منع هلام انفجار من خلال توسيع الصلب والتبريد مرات. ومع ذلك، تعرض إضافي للحرارة يمكن أن يتبخر الماء ليسبب زيادة في هلام مفرزة من الزجاج عندما يتم إعادة المواد الهلامية تضخم. إذا مفرزة مفرطة لأي وقت الصلب، وآنخطوات إيلينغ يمكن القضاء على (1.3.6 و 2.8).

آخر مشكلة فنية متكررة واجهتها هي عدم كفاية التصاق الخلية. المواد الهلامية تورم أكثر نعومة من المواد الهلامية unswollen (الجدول 2) 18 صنع خلية التصاق صعبا. وعلاوة على ذلك، لأن كل نوع من الخلايا يستجيب بشكل مختلف لتصلب الأنسجة، وبعض أنواع الخلايا قد تواجه هذه المعضلة الفنية بينما تفعل أنواع الخلايا الأخرى لا. لحل القضايا التصاق بعض الخطوات المتابعة ينبغي النظر في: (1) استخدام الطلاء عالية الكثافة، (2) بالتناوب البروتينات ECM مترافق إلى سلفو-SANPAH، (3) تعدل المعلمات صلابة، (4) زيادة البروتين ECM أو تركيز سلفو-SANPAH، و (5) زيادة مرات الحضانة. المواد السامة المتبقية مثل مونومر الأكريلاميد، APS، وTEMED يمكن أن تسهم أيضا في عدم وجود التصاق وموت الخلايا على المواد الهلامية. ونحن لم تشهد هذه المسألة منذ يغسل واسعة إدراجها في بروتوكول أثبتت كافية، ولكن من المستحسن الأداء الإقتصادي الأداءorming خطوة اختيارية 3.2 حالة حدوث هذه المشكلة.

ويمكن استخدام DNA لدراسة المواد الهلامية أكثر فعالية مجموعة متنوعة من وظائف الخلية تحت ظروف ديناميكية أو ثابتة. لقد أثبتنا أن الخلايا الليفية والخلايا العصبية المزروعة في المواد الهلامية DNA تتأثر تعديل مرونة هلام. منذ التفاعلات خلية مصفوفة وعادة ما تكون واجهات ثلاثية الأبعاد، ومعلومات من دراسات مصفوفة ديناميكية ثلاثية الأبعاد سوف يساعد على إنتاج المزيد بيولوجيا البيانات ذات الصلة. لذلك، نحن حاليا ترجمة هذه التكنولوجيا في سقالة ثلاثية الأبعاد. نحن نعمل على تطوير تقنية الذي يحل محل العمود الفقري بولي أكريلاميد بمادة حيويا أكثر، مع الحفاظ على التكنولوجيا يشابك DNA. وهذه السقالة الجديدة بمثابة ثلاثي الأبعاد، نموذج ديناميكي وسقالة الأنسجة الهندسة. سوف توافق مع الحياة في فتح فرص للتطبيقات الجهاز الطبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور فرانك جيانغ، الدكتور ديفيد لين، الدكتور برنارد Yurke والدكتور عدي Chippada لمساهماتهم في تطوير التكنولوجيا هلام DNA. الدكتور نوريل Hadzimichalis، سميت شاه، كيمبرلي بيترمان، روبرت أرتير على تعليقاتهم والتعديلات من هذا المخطوط. مصادر التمويل بما في ذلك لجنة جيرسي جديد على الحبل الشوكي البحوث (جرانت # 07A-019-SCR1، NAL) ونيو جيرسي معهد العلوم العصبية (MLP). وناشري هندسة الأنسجة، الجزء ألف الإذن لطبع أرقام 2 و 4 و الحيوية للحصول على إذن لإعادة طبع الشكل 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 90، الهندسة الحيوية (العامة)، مطاطا، اللزجة، مكررا الأكريلاميد، الركيزة، وصلابة، ديناميكي، ثابت، الخلايا العصبية، الخلايا الليفية، والامتثال، ECM، mechanobiology، الانضباطي
إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Previtera, M. L., Langrana, N. A.… More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter