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Biology

Zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का विश्लेषण

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उच्च स्तर oxidative तनाव हालत की ओर सेलुलर redox राज्य के एक बदलाव के कारण हो सकता है. यह स्थिति अणुओं (लिपिड, डीएनए, प्रोटीन) के ऑक्सीकरण का कारण बनता है और कोशिका मृत्यु हो जाती है. ऑक्सिडेटिव तनाव भी प्रभाव डालता है जैसे मधुमेह, retinopathies, neurodegeneration, और कैंसर जैसे कई रोग की स्थिति की प्रगति. इस प्रकार, यह एकल कक्षों के स्तर पर ही नहीं बल्कि पूरी जीवों के संदर्भ में न केवल oxidative तनाव की स्थिति की जांच करने के लिए उपकरण को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम इस तरह पढ़ाई करते हैं और vivo में oxidative तनाव को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल को पेश करने के लिए vivo प्रणाली में एक उपयोगी रूप में zebrafish भ्रूण पर विचार करें. "मैं) एक oxidative तनाव के गुणात्मक माप के लिए" पूरे भ्रूण आरओएस का पता लगाने विधि "और द्वितीय) एक: फ्लोरोसेंट आरओएस जांच और zebrafish ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट लाइनों का लाभ उठाते हुए, हम इन विवो में oxidative तनाव को मापने के लिए दो अलग अलग तरीकों का विकासoxidative तनाव की मात्रात्मक मापन के लिए एकल कक्ष आरओएस पहचान पद्धति ". इस के साथ साथ, हम ऑक्सीडेंट एजेंटों और शारीरिक या आनुवंशिक तरीकों से ऊतकों में oxidative तनाव में वृद्धि से इन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है और यह इस तरह के मस्तिष्क संबंधी बीमारियों और कैंसर के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव संबंधी विकृतियों के पशु मॉडल में आरओएस के पते कारण प्रभाव रिश्तों में मदद मिलेगी.

Introduction

ऑक्सिडेटिव तनाव विशेष रूप से एक असंतुलित सेलुलर redox राज्य का परिणाम है कि एक शर्त के रूप में परिभाषित किया गया है. नियमित तौर पर कोशिकाओं के अंदर होती है कि जटिल redox प्रतिक्रियाओं सेलुलर redox राज्य का निर्धारण. Redox प्रतिक्रियाओं में कमी और अणुओं (यानी redox प्रतिक्रियाओं) के ऑक्सीकरण उत्पादन जैविक अणुओं के बीच परमाणु इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण में मिलकर बनता है कि सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं से मिलकर. इन प्रतिक्रियाओं एक चरम संरचनात्मक अस्थिरता और पड़ोसी biomolecules के साथ आदान प्रदान कि असंतुलित इलेक्ट्रॉनों का सहज सक्रियण की विशेषता है जो इलेक्ट्रॉनिक रूप से सक्रिय प्रजातियों (यानी समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजाति), द्वारा उत्प्रेरित कर रहे हैं. ये अनियमित प्रतिक्रियाओं डीएनए की क्षति, प्रोटीन carboxylation, और लिपिड ऑक्सीकरण में परिणाम है, और अंततः कोशिका मृत्यु 1 पैदा होती हैं. Oxidative तनाव के स्तर में वृद्धि उम्र बढ़ने और विभिन्न रोग राज्यों 2 की प्रगति के साथ संबद्ध किया गया है. ऑक्सिडेटिव तनाव हैमधुमेह और हृदय रोगों 3,4 में संवहनी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार होने की सूचना दी गई. यह भी अल्जाइमर रोग में neuronal अध: पतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और पार्किंसंस रोग 5. इसके अलावा, oxidative तनाव कैंसर प्रगति और metastatic घटनाओं 6,7 गवर्निंग में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में प्रदर्शित किया गया है. इसके अलावा, सूजन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना और आगे समर्थन oxidative तनाव 8 मई.

या नाइट्रोजन (RNS, प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों), जीवित कोशिकाओं में, समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों ऑक्सीजन (प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों आरओएस) से प्राप्त कर रहे हैं. (एच 2 ओ 2), और हाइड्रोजन पेरोक्साइड - (ओ 2) आरओएस superoxide आयनों, (. OH) हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी शामिल हैं. प्राथमिक RNS नाइट्रस ऑक्साइड (सं.) है. माध्यमिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से एक श्रृंखला betwee सहज बातचीत के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता हैn आरओएस और RNS या मुफ्त धातुओं 9 आयनों. एच 2 ओ 2 Fe 2 + हाइड्रॉक्सिल कण उत्पन्न के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, उदाहरण के लिए - superoxide आयनों peroxynitrate (ONOO) के रूप में नाइट्रस ऑक्साइड के साथ प्रतिक्रिया करता है. आरओएस और RNS की वजह से कई biomolecules के साथ प्रतिक्रिया करने की क्षमता के लिए, शारीरिक redox राज्य 10 के रखरखाव के लिए एक बड़ा खतरा माना जाता है. बनाए रखने के लिए redox राज्य कोशिकाओं एंटी ऑक्सीडेंट अणुओं और एंजाइमों detoxifying की एक श्रृंखला से सुसज्जित हैं. . 11 - superoxide dismutase (वतन), catalase, glutathione peroxidase और Peroxiredoxins अनिवार्य रूप से एच 2 2 हे, ओह, और OONO सहित समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों से सेलुलर सुरक्षा प्रदान करता है कि एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमी-शस्त्रागार का गठन. इसके अलावा विटामिन सी और ई, polyphenols और CoenzymeQ10 (CoQ10) जैसे एंटी ऑक्सीडेंट अणुओं आरओएस और उनके खतरनाक डे बुझाने के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं12,13 rivatives. हालांकि, आरओएस और RNS, या एंटी ऑक्सीडेंट प्रणाली में शिथिलता, के एक अत्यधिक उत्पादन oxidative तनाव 14 की ओर सेलुलर redox राज्य पाली.

उनके नकारात्मक अर्थ इसके अलावा, आरओएस अलग मूल की कोशिकाओं में विभिन्न शारीरिक भूमिका निभा सकते हैं. कोशिकाओं सामान्य रूप से इस तरह मेजबान सुरक्षा और घाव की मरम्मत 15-17 के रूप में सामान्य जैविक घटनाओं मध्यस्थता संकेतन अणुओं के रूप में आरओएस का उत्पादन. रिएक्टिव प्रजातियां आम तौर पर संकेत कारकों, वृद्धि कारक है, और कैल्शियम का स्तर 18,19 के intracellular उतार चढ़ाव के जवाब में इस तरह के NOX (NADPH oxidase) और XO (Xantine oxidase) के रूप में intracellular एंजाइमों से कोशिकाओं में उत्पादित कर रहे हैं. यह आरओएस विभिन्न तरह के p53 या इस तरह के एटीएम kinase, डीएनए की क्षति 20 के जवाब का एक मास्टर नियामक के रूप में सेलुलर घटकों के रूप में महत्वपूर्ण परमाणु कारकों की गतिविधि मिलाना सकता है कि सूचना मिली है. तुलनात्मक रूप से आरओएस जोरदार वें मध्यस्थता द्वारा सेलुलर संकेत को प्रभावितई ऑक्सीकरण और संकेत पारगमन 21 की महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में स्थापित कर रहे हैं, जो प्रोटीन tyrosine फास्फेटेजों (PTPs), की निष्क्रियता. इसके अलावा, प्रोटिओमिक आधारित तरीके RNS भी विशिष्ट प्रोटीन संशोधनों और आणविक संकेत के परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं कि प्रदर्शित करता है. RNS एस nitrothiols (SNO) में उन्हें संशोधित करने और इस तरह के भड़काऊ और autoimmune रोग 22,23 के रूप में रोग राज्यों के साथ सहवर्ती आणविक मार्ग ट्रिगर सिस्टीन thiol समूहों के साथ प्रतिक्रिया.

सेल संस्कृति प्रयोगों केवल आंशिक रूप से विवो में अभिनय कारकों की भीड़ पुन: पेश हैं, यह पशु मॉडल 24,25 में redox पढ़ाई प्रदर्शन करने के लिए महान ब्याज की है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, zebrafish oxidative तनाव गतिशीलता 26 अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त हड्डीवाला पशु मॉडल माना गया है. zebrafish कई फायदे हड्डीवाला देव दौरान सेलुलर और आनुवंशिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुदान कि एक नया मॉडल प्रणाली हैelopment और रोग. भ्रूण के बड़े समूहों प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए साप्ताहिक उत्पन्न और उपलब्ध किया जा सकता है. इसके अलावा zebrafish भ्रूण की असाधारण ऑप्टिकल स्पष्टता, साथ ही अपने छोटे आकार, एक पूरे जीवों 27 में एकल कक्ष इमेजिंग और गतिशील ट्रैकिंग सक्षम बनाता है. पिछले दशक में, zebrafish म्यूटेंट के एक काफी संख्या में इस तरह के कैंसर और आनुवंशिक रोगों 28-31 के रूप में मानव रोग की स्थिति के लिए मॉडल उत्पन्न किया गया है. सबसे महत्वपूर्ण बात, ट्रांसजेनिक लाइनों की एक भीड़ आनुवंशिक और जैविक जोड़तोड़ 32 की विस्तृत अवसर अनुमति देने के लिए निर्मित किया गया है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक ऊतक विशेष zebrafish लाइनों नियमित रूप से vivo अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. इन लाइनों vivo में एकल कक्षों की पहचान करने की क्षमता है, साथ ही वे शामिल शारीरिक संरचना की पेशकश की एक चयनित प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं.

कई विषाक्तता अध्ययन पहले से ही टी का इस्तेमाल किया हैवह दवाओं की खोज और oxidative तनाव 33-35 के क्षेत्र के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस हड्डीवाला की उपयुक्तता, सुझाव redox homeostasis पर रसायनों के vivo प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए zebrafish. कुछ फ्लोरोसेंट जांच zebrafish लार्वा 36,37 में oxidative तनाव की निगरानी के लिए परीक्षण किया गया है, भले ही zebrafish ऊतकों में oxidative तनाव का स्तर और जीवित कोशिकाओं का पता लगाने और मापने के लिए कोई स्थापित assays कर रहे हैं. यहाँ हम zebrafish भ्रूण की जीवित कोशिकाओं में oxidative तनाव के vivo मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. इमेजिंग उपकरणों, FACS छँटाई, फ्लोरोसेंट जांच और समर्थक ऑक्सीडेटिव स्थितियां सभी zebrafish भ्रूण और ऊतकों में पता लगाने और oxidative प्रजातियों की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल परख उत्पन्न करने के लिए संयुक्त रहे हैं.

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Protocol

उपकरण और कार्य समाधान के 1. तैयारी

  1. मछली पानी के घोल तैयार करें. आसुत पानी की 50 मिलीलीटर में समुद्री नमक 'त्वरित महासागर' के 2 जी भंग करके एक शेयर समाधान करें. मछली पानी (60 माइक्रोग्राम / एमएल सागर नमक अंतिम एकाग्रता) का उपयोग करने के लिए तैयार तैयार करने के लिए 1 एल आसुत जल के लिए स्टॉक मछली पानी के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. उपयोग से पहले मछली पानी का उपयोग करने के लिए तैयार आटोक्लेव. यह समाधान zebrafish भ्रूण माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  2. भ्रूण बढ़ते लिए methylcellulose तैयार करें. बाँझ मछली पानी के 50 एमएल में methylcellulose के 1.5 ग्राम भंग. हलचल प्लेट पर एक चुंबक का उपयोग करके विघटन की सुविधा. पाउडर का पूरा विघटन कई घंटे की आवश्यकता हो सकती है. छोटे ट्यूबों में स्पष्टता और विभाज्य के लिए समाधान की जाँच करें. महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और उपयोग पर aliquots पिघलना. प्रयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए 950 XG पर methylcellulose अपकेंद्रित्र. Aliquots की फ्रीज पिघलना चक्र से बचें.
  3. Tricaine / एथिल 3 aminobenzoate मीटर की 50 मिलीलीटर की तैयारी100 मिलीलीटर पानी में tricaine की 200 मिलीग्राम भंग और Tris-एचसीएल 1 एम (पीएच 9) का उपयोग करते हुए 7.0 पीएच को समायोजित करके ethanesulphonate नमक (शेयर समाधान). कोई 30 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस शेयर की दुकान. चेतावनी: tricaine विषैला होता है. उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार प्रयोग करें.
  4. Zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव उत्प्रेरण
    1. सामान्य oxidative तनाव शामिल होने के लिए एक ऑक्सीडेंट समाधान तैयार: एच 2 2 हे स्टॉक समाधान (हाइड्रोजन पेरोक्साइड, 100 मिमी) जोड़कर ऑक्सीडेंट समाधान के 50 मिलीलीटर मछली पानी के लिए. 2 मिमी और 100 माइक्रोन के बीच एक अंतिम एकाग्रता के एच 2 ओ 2 का प्रयोग करें. शीघ्र ही उपयोग से पहले इस समाधान तैयार करें. ऑक्सीडेंट समाधान पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने और एकल कक्ष आरओएस-तरीकों का पता लगाने के लिए दोनों के लिए लागू किया जा सकता है. इस समाधान की दुकान नहीं है. चेतावनी: एच 2 ओ 2 खतरनाक, और साँस लेना द्वारा हानिकारक है और अगर निगल लिया. दहनशील सामग्री के साथ संपर्क में आग का कारण बन सकता है. एक धूआं हुड के तहत संभाल और उचित pers पहननेonal सुरक्षा उपकरण.
    2. Mitochondria व्युत्पन्न oxidative तनाव शामिल होने के लिए एक ऑक्सीडेंट समाधान तैयार: डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 2 मिलीलीटर में rotenone के 3.9 मिलीग्राम भंग करके एक ऑक्सीडेंट शेयर समाधान (5 मिमी) बनाते हैं. अंधेरे में कमरे के तापमान पर इस समाधान रखें.
      1. समाधान का उपयोग करने के लिए एक तैयार करने के लिए मछली पानी की 10 मिलीलीटर rotenone शेयर समाधान भंग. 5-50 माइक्रोन के बीच एक एकाग्रता में rotenone का प्रयोग करें. 100 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में rotenone का उपयोग न करें. उचित मात्रा में, इस ऑक्सीडेंट समाधान पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने और एकल कक्ष आरओएस-तरीकों का पता लगाने के लिए दोनों के लिए लागू किया जा सकता है. चेतावनी: Rotenone जहरीले और खतरनाक है. उचित एहतियाती बयान के अनुसार संभाल लेना.
    3. जीन द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा तोड़े नीचे: तोड़े नीचे nrf2a जीन अभिव्यक्ति zebrafish भ्रूण में morpholino microinjection से पहले Timme-Laragy ए एट अल, 2012 38 द्वारा रिपोर्ट के रूप में..
    4. Oxid प्रेरितऊतकों को नुकसान के बाद तनाव ative:. पहले Niethammer एट अल, 2009 39 द्वारा वर्णित के रूप में 72 HPF पर zebrafish भ्रूण की पूंछ पंख पर एक घाव मार्जिन उत्पन्न करते हैं.
  5. एकल कक्ष आरओएस का पता लगाने विधि के लिए आरओएस का पता लगाने के समाधान के 5 मिलीलीटर की तैयारी:
    1. एक काम समाधान (: 2.5-10 माइक्रोन एकाग्रता रेंज) तैयार करने के क्रम में HBSS (हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान) में सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील आणविक जांच भंग: जनरल आरओएस का पता लगाने के लिए समाधान. यह समाधान शीघ्र ही उपयोग से पहले तैयार किया जाना चाहिए.
    2. Mitochondria से प्रेरित विशिष्ट पहचान आरओएस के लिए समाधान: फौरन उपयोग करने से पहले, DMSO के एक 5 मिमी शेयर समाधान बनाने के साथ एक mitochondrial आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच भंग. एक काम समाधान (: 2.5-10 माइक्रोन एकाग्रता रेंज) तैयार करने के क्रम में HBSS में शेयर समाधान भंग.
      नोट: आरओएस का पता लगाने के काम कर समाधान की रोशनी और ऑक्सीजन जोखिम और उनके संबंधित शेयर समाधान से बचें. का उपयोग करके प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखेंएक एल्यूमीनियम पन्नी. दुकान या HBSS में भंग कर फिर से उपयोग जांच न करें. एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर.
      चेतावनी: उचित दिशा निर्देशों के अनुसार एक धूआं हुड के तहत आणविक जांच और DMSO संभाल लेना.
  6. पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने विधि के लिए आरओएस का पता लगाने के समाधान के 5 मिलीलीटर की तैयारी: एक काम समाधान (: 2.5-5 माइक्रोन एकाग्रता रेंज) तैयार करने के क्रम में HBSS में (DMSO में स्थिर) सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच स्टॉक समाधान भंग. प्रकाश और ऑक्सीजन जोखिम से बचें. प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें. उपयोग करने से पहले इस समाधान तैयार करें. इस समाधान की दुकान या फिर से उपयोग न करें. चेतावनी: उचित दिशा निर्देशों के अनुसार एक धूआं हुड के तहत आणविक जांच संभाल लेना.
  7. पीबीएस 1x की 15 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीलीटर जोड़कर स्थान पर समाधान के 25 एमएल बनाओ. बाँझ समाधान रखें. 4 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान स्टोर आरओएस पहचान पद्धति - यह समाधान केवल एकल कक्ष के लिए आवश्यक है.
  8. 28 और पर zebrafish हवा इनक्यूबेटर सेट# 176; सी.
  9. एकल कक्ष आरओएस का पता लगाने विधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र सेट करें.

2. वयस्क मछलियों के संभोग और Zebrafish भ्रूण का चयन

  1. सेट अप वयस्क zebrafish जोड़ी मानक प्रोटोकॉल 40 के अनुसार पार. विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार उचित ट्रांसजेनिक लाइन का चयन करें.
  2. अंडे जमा और मछली पानी / भ्रूण मध्यम के साथ एक 90 मिमी डिश में उन्हें जगह है. भ्रूण को विकसित करने और वांछित विकास मंच के लिए विकसित होगा जब तक 28 डिग्री सेल्सियस पर अंडे रखें (जैसे, 48 HPF, 72 HPF; HPF: घंटे बाद निषेचन).
  3. भ्रूण के विकास के लिए स्क्रीन. सभी unfertilized अंडे या अविकसित भ्रूण को बाहर निकालें.
  4. 50 मिलीलीटर मछली पानी में tricaine (शेयर समाधान) के 1 मिलीलीटर जोड़कर भ्रूण anesthetize.
  5. एक stereomicroscope के तहत टीजी फ्लोरोसेंट भ्रूण का चयन करें.

ऑक्सीडेंट एजेंट के साथ भ्रूण की 3. उपचार

  1. 48 घंटे के बीच कम से कम 30 भ्रूण का प्रयोग करेंपीएफ और 72 अलग हालत प्रति HPF. Tricaine को दूर करने के क्रम में ताजा मछली पानी के साथ दो बार भ्रूण धो लें.
  2. तीन बर्तन में फ्लोरोसेंट भ्रूण भाजित. कोई 30 से अधिक भ्रूण / पकवान रखो.
  3. वॉशिंग समाधान निकालें और ऑक्सीडेंट समाधान के 10 मिलीलीटर या नियंत्रण समाधान के रूप में मछली पानी के 10 एमएल जोड़ें.
  4. 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 10 मिनट के लिए भ्रूण सेते ऊष्मायन अवधि विशिष्ट ऊतकों में प्रेरित किया जा करने के लिए oxidative तनाव के स्तर से निर्भर करता है. Oxidative तनाव से प्रभावित कोशिकाओं उत्तरोत्तर कोशिका मृत्यु से गुजरना रूप में संक्षिप्त अवधि के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं.
  5. घूमता द्वारा HBSS और धोने भ्रूण युक्त एक नई डिश में भ्रूण स्थानांतरण. 28 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म HBSS

4. पूरा पर्वत आरओएस जांच विधि

  1. ऑक्सीडेंट उपचार के बाद भ्रूण लीजिए और एक छोटी ट्यूब में कोई 10 से अधिक भ्रूण डाल दिया. HBSS के साथ जितना संभव कुल्ला. एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें.
  2. के लिए आरओएस का पता लगाने के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ेंप्रत्येक ट्यूब.
  3. प्रकाश जोखिम से बचने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में भ्रूण सेते हैं.
  4. ऊष्मायन समय के दौरान पूरे भ्रूण विश्लेषण के लिए एक गिलास स्लाइड तैयार करते हैं. एक "अवसाद" गिलास स्लाइड पर methylcellulose के 300 μl रखो और एक विंदुक टिप के साथ कांच की सतह पर फैल गया. Methylcellulose जारी करने के दौरान बुलबुले से बचें.
  5. ऊष्मायन समय के अंत में, तुरंत आरओएस का पता लगाने के समाधान निकालने और HBSS के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने. ट्यूब कई बार inverting द्वारा भ्रूण धो लें. विंदुक या भंवर मत करो.
  6. ऊपर एक गिलास पाश्चर पिपेट में महाप्राण भ्रूण. पिपेट के उद्घाटन के पास और धीरे स्थिति भ्रूण methylcellulose में उन्हें बेदखल करना. एक ठीक नायलॉन लाइन के साथ उचित भ्रूण मालूम.
  7. इलाज भ्रूण के साथ नियंत्रण भ्रूण की प्रतिदीप्ति तुलना कर लें. सभी भ्रूण उसी का उपयोग imaged हैं ताकि वैकल्पिक रूप से, प्रतिदीप्ति stereomicroscope या confocal खुर्दबीन के मापदंडों को ठीकइमेजिंग सेटिंग्स.

5. सिंगल सेल आरओएस-जांच विधि

  1. 3.5: कदम से प्रारंभ करें. हर हालत के लिए कम से कम 35 भ्रूण है सुनिश्चित करें.
  2. एक नई डिश में भ्रूण स्थानांतरण. मछली पानी जितना संभव निकालें. ठंडा पीबीएस 1x के 10 एमएल और protease inhibitors कॉकटेल के 400 μl जोड़ें. मैन्युअल संदंश के साथ भ्रूण dechorionate और एक ठीक सुई के साथ की जर्दी बोरी हटा दें. नोट: जर्दी बोरी निकाल रहा है निम्नलिखित FACS विश्लेषण के लिए स्वच्छ नमूने सुनिश्चित करता है. यह कदम FACS साधन के अनुसार बचा जा सकता है.
  3. स्थानांतरण de-अंड की जर्दी वाला एक 24 अच्छी तरह से multiwell थाली में भ्रूण (15 भ्रूण / अच्छी तरह से) और सभी मछली पानी निकाल दें.
  4. HBSS के 300 μl, 30 μl collagenase पी, प्रत्येक कुएं में 50 μl ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें.
  5. एक तंग पिपेट टिप (1000 μl) के साथ धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और नीचे भ्रूण homogenize.
  6. 20 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और हर 5 मिनट pipetting द्वारा नमूने homogenize.
  7. ऊतक disr जाँचेंयौगिक सूक्ष्मदर्शी पर homogenate के एक विभाज्य देख कर uption. Pipetting द्वारा एकल कक्ष निलंबन की सुविधा. अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए भ्रूण सेते मत करो.
  8. बंद करो समाधान के 200 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. धीरे pipetting द्वारा मिक्स.
  9. तंग नीचे के साथ एक पूर्व ठंडा ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण. बर्फ पर ट्यूब रखें और प्रकाश जोखिम से बचें.
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 250 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  11. धीरे pipetting द्वारा बर्फ के ठंडे HBSS के साथ ऊपरी चरण और फिर से निलंबित कोशिकाओं निकालें.
  12. कक्षों की गणना और आप अपने नमूने के सभी कक्षों की एक ही नंबर है सुनिश्चित करें. कम से कम 2 x 10 6 कोशिकाओं का उपयोग न करें.
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 250 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं
  14. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच युक्त बर्फ ठंडा HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ गोली निलंबित.
  15. अंधेरे में 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब सेते हैं. Oxidative तनाव के स्तर के अनुसार ऊष्मायन समय भिन्न है और टी के लिएजांच की वह संवेदनशीलता.
  16. एक FACS ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. बर्फ पर ट्यूबों रखें और FACS विश्लेषण से पहले प्रकाश जोखिम से बचें.
  17. एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) के साथ कोशिकाओं तरह. टीजी ऊतक प्रतिदीप्ति (जैसे, GFP) और आरओएस का पता लगाने (जैसे, विशिष्ट mitochondrial आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच, सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच) के लिए इस्तेमाल किया आणविक जांच की उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के अनुसार सेट तरंग दैर्ध्य.
  18. हर हालत के लिए, एक ही FACS सेटिंग्स लागू करने के द्वारा एक ही प्रयोगात्मक सत्र के भीतर सभी नमूनों को मापने. विभिन्न जैविक प्रतिकृति का मतलब के रूप में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना. हर हालत के लिए कम से कम दो replicates का विश्लेषण करें.

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Representative Results

यहाँ वर्णित विधि को लागू करके, हम आसानी से उपाय कर सकते हैं और zebrafish भ्रूण के ऊतकों में oxidative तनाव (और आरओएस स्तर) का पता लगा. वयस्क zebrafish पार करने के बाद, अंडे एकत्र की है और 72 घंटे के बाद निषेचन (HPF) को 28 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है. मजबूत समर्थक ऑक्सीडेंट अभिकर्मकों के साथ भ्रूण का 1) उपचार या ऊतक चोट के बाद 2) को बढ़ावा देने आरओएस गठन: oxidative तनाव उत्पन्न करने के लिए आदेश में, हम दो अलग अलग दृष्टिकोण का प्रस्ताव.

हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2), सामान्य सेलुलर आरओएस के गठन के एजेंट के रूप में, और rotenone, विशिष्ट mitochondrial आरओएस चालक के रूप में: पहला दृष्टिकोण में, हम विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार दो अलग अभिकर्मकों कार्यरत हैं. Rotenone deregulations oxidative तनाव 41 की प्रेरणा हैं जो आदि, की जटिल मैं के एक अवरोध है.

दूसरे दृष्टिकोण में, हम एक zebrafish भ्रूण की पूंछ पंख पर एक घाव बनाकर आरओएस के संचय प्रेरित39. वैकल्पिक रूप से, oxidative तनाव की स्थिति morpholino इंजेक्शन के साथ oxidative तनाव 38 की साइटोटोक्सिक प्रभाव के खिलाफ प्राथमिक सेलुलर रक्षा है कि NRF2 एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया मार्ग नीचे दस्तक द्वारा zebrafish ऊतकों में पदोन्नत किया जा सकता है.

Oxidative तनाव zebrafish भ्रूण में प्रेरित किया है एक बार, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के संचय सक्रियण पर फ्लोरोसेंट (यानी ऑक्सीकरण) बन जो सामान्य या mitochondrial विशिष्ट आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच का उपयोग करके मापा जा सकता है.

उपचार किये भ्रूण पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने पद्धति का उपयोग करके या चित्र 1 में संक्षेप के रूप में एक सेल आरओएस पहचान पद्धति लागू करने से विश्लेषण किया जा सकता है. तरीकों के बीच चयन oxidative तनाव के गुणात्मक या मात्रात्मक माप प्रदर्शन करने की जरूरत पर निर्भर करता है. दोनों तरीकों के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं चित्रा 3.

पूरा पर्वत आरओएस-जांच विधि

चित्रा 2 oxidative तनाव के vivo इमेजिंग के लिए पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने विधि के आवेदन से पता चलता है. विशेष रूप से, इस विधि एक्सोजेनस समर्थक ऑक्सीडेंट उपचार के साथ ही इस तरह के घाव चोट या जीन विलोपन के रूप में अधिक शारीरिक स्थितियों से उत्पन्न "कम" oxidative तनाव से उत्पन्न "मजबूत" oxidative तनाव दोनों का पालन करने के लिए लागू किया गया है.

ऑक्सीडेटिव प्रजाति की शारीरिक स्तर 72 HPF में रहते zebrafish भ्रूण की पूंछ पंख पर एक सूक्ष्म चोट या एक व्यापक घाव उत्पन्न करके प्रेरित कर रहे हैं. यह चोट के बाद, एच 2 ओ 2 घाव 39 के बाद घाव मार्जिन 20 मिनट पर जम जाता है कि प्रदर्शन किया गया है. घाव मार्जिन पर oxidative तनाव के संचय की कल्पना करने के लिए, भ्रूण एक सामान्य के साथ incubated रहे थेआरओएस के प्रति संवेदनशील जांच और 39 लोग घायल हो गए के बाद 20 मिनट में imaged. घायल पूंछ के साथ बरकरार पूंछ पंख की तुलना करके, यह घाव मार्जिन (2A चित्रा) पर फ्लोरोसेंट जांच का एक संग्रह भेद करने के लिए संभव है. गैर विशिष्ट कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत सभी दोनों स्थितियों में पूंछ पंख ऊतक के आसपास का पता चला है.

घाव मार्जिन में आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच की विशिष्ट संचय, एच 2 घाव पर ओ 2 के स्तर को मान्य करने के क्रम में एक औषधीय दृष्टिकोण से उतारा गया है. यह घाव मार्जिन एच 2 ओ 2 संचय DUOX अवरोध करनेवाला VAS2870 39 को अत्यंत संवेदनशील है कि प्रदर्शन किया गया है के बाद से, भ्रूण घायल हो गए पहले इस अवरोध करनेवाला के साथ पहले से इलाज किया गया. आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के प्रतिदीप्ति की तुलना, वीएएस पूर्व इलाज भ्रूण और संबंधित नियंत्रणों से, संकेत आरओएस संचय (यानी एच 2 ओ 2 पर निर्भर है कि इंगित करता है) (चित्रा 2 बी).

इसके अलावा, हम rotenone साथ zebrafish भ्रूण के इलाज से zebrafish ऊतकों में oxidative प्रजातियों के उच्च स्तर उत्पन्न. Rotenone इलाज भ्रूण और नियंत्रण विशेष रूप से आरओएस प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के साथ incubated रहे थे. बाद में, जांच को धोया गया था और भ्रूण एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप के अंतर्गत imaged थे. oxidative तनाव भ्रूण (चित्रा -2) के पूरे शरीर में पाया गया था. उच्च बढ़ाई छवियों जांच सफलतापूर्वक चित्रा (2 डी) metabolized है जहां संरचनात्मक क्षेत्रों दिखा. प्रतिदीप्ति छवियों (कम पैनल) आरओएस पॉजिटिव कोशिकाओं से संकेत मिलता है, जबकि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (ऊपरी पैनल), संरचनात्मक ढांचे भेद. फ्लोरोसेंट छवियों द्वारा दिखाया गया है परिणाम मुख्य रूप से इलाज भ्रूण के साथ नियंत्रण की तुलना द्वारा हासिल की है, जो oxidative तनाव का पता लगाने की एक गुणात्मक रिपोर्ट कर रहे हैं.

सिंगल सेल-आरओएस जांच विधि

चित्रा 3 रिपोर्टों प्रतिनिधि FACS भूखंडों और एकल कक्ष आरओएस पहचान पद्धति लागू करने से oxidative तनाव की मात्रा का ठहराव. इस विधि प्रोटोकॉल रिपोर्ट में समर्थक ऑक्सीडेंट शर्तों के अधीन और चित्रा किंवदंतियों में विस्तृत थे कि zebrafish कोशिकाओं में oxidative तनाव के स्तर को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है. बताया गया है, oxidative तनाव एक आरओएस के प्रति संवेदनशील आणविक जांच के साथ एकल कक्षों में अलग zebrafish ऊतकों incubating द्वारा मापा गया है. हदबंदी की प्रक्रिया और FACS ही सेल नुकसान का कारण बन सकता है, नमूनों के विश्लेषण से ही "जीवित कोशिकाओं" oxidative तनाव quantitation के लिए माना जाता है कि आवश्यकता है. तदनुसार, अलग कोशिकाओं "लाइव सेल" शारीरिक मापदंडों (चित्रा 3) दिखा कोशिकाओं के अंश का चयन करके और (3B चित्रा) मृत कोशिकाओं को बाहर निकालकर विश्लेषण कर रहे हैं. इस प्रकार, नमूने लिए quantitated रहे हैंऑक्सीडेटिव तनाव का स्तर आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के प्रतिदीप्ति के लिए और इस तरह के GFP (चित्रा -3 सी) के लिए सकारात्मकता के रूप में एक अंतर्जात प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए अनुसार. आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना हैंडलिंग और तकनीकी प्रक्रियाओं से प्रेरित oxidative तनाव का मूल्यांकन करने के क्रम में शामिल किया जाना चाहिए (चित्रा -3 सी, पैनल: कंट्रोल -). रिश्तेदार FACS साजिश मात्रा का ठहराव विभिन्न जैविक प्रतिकृति (चित्रा 3 डी ई) की माप दिखा histograms में प्रदर्शन किया.

हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार पर oxidative तनाव स्तर quantitation इसके अलावा, इस पद्धति nrf2a morphants और संबंधित नियंत्रण (चित्रा 3F) में हमें इस तरह के शारीरिक शर्तों के भीतर oxidative तनाव के स्तर quantitate के लिए लागू किया गया है.

इसके अलावा, mitochondrial आरओ हमें ऐसे विशिष्ट आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के साथ एकल कक्ष आरओएस विधि का पता लगाने के संयोजन सेएस संवेदनशील जांच, यह विशिष्ट mitochondria लक्षित समर्थक ऑक्सीडेंट उपचार (चित्रा 3 जी) के संदर्भ में oxidative तनाव को मापने के लिए भी संभव है.

चित्रा 1

चित्रा 1. Zebrafish भ्रूण में आरओएस के स्तर को मापने के लिए विधि के योजनाबद्ध आंकड़ा. Zebrafish वयस्कों उचित प्रजनन टैंक में पार कर रहे हैं. निषेचित अंडे तो बर्तन में एकत्र की है और भ्रूण पूरी तरह से oxidative तनाव की. प्रेरण दवा उपचार द्वारा या आनुवंशिक या शारीरिक अपमान द्वारा, या तो अलग अलग तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है. वैकल्पिक रूप से, एक आनुवंशिक उत्परिवर्ती विश्लेषण किया जाता है, के मामले में यह इस ऊष्मायन छोड़ और आगे ले जाने के लिए संभव है. इस बिंदु पर, यह दो अलग अलग तरीकों का पालन आगे बढ़ने के लिए संभव है. "पूरे मीटर के अनुसारount आरओएस का पता लगाने "विधि (बाएं), zebrafish भ्रूण तुरंत एक फ्लोरोसेंट आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच (1) और फिर प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन (2) के साथ विश्लेषण के साथ incubated हैं. "एकल कक्ष आरओएस का पता लगाने" विधि (दाएं) में, zebrafish भ्रूण (1), एक फ्लोरोसेंट आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच (2) के साथ incubated और प्रतिदीप्ति पता लगाने और (3) के लिए FACS द्वारा विश्लेषण एकल कक्षों में अलग हैं. "पूरे माउंट-आरओएस पहचान" विधि में मुख्य रूप से एक गुणात्मक परख, गुणात्मक और oxidative तनाव के स्तर की माप मात्रात्मक दोनों "एकल कोशिका आधारित" विधि अनुदान के रूप में रहने वाले भ्रूण में oxidative तनाव का पता लगाने की अनुमति देता है.

चित्रा 2
72 HPF में चित्रा 2. पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने विधि के प्रतिनिधि परिणाम. ए) zebrafish भ्रूण अधीन थेपहले एट अल Niethammer द्वारा वर्णित के रूप में घायल हो गए हैं., 2009 39. प्रतिनिधि confocal छवियों घायल दुम फिन के घाव मार्जिन पर समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (आरओएस) संचय (Arrowhead) दिखा. ऑक्सीडेटिव प्रजातियों सामान्य आरओएस जांच के साथ पकड़ा गया है (CellROX; 2.5 माइक्रोन) 20 मिनट घाव के बाद किया गया है. स्केल बार 20 माइक्रोन. बी) 72 HPF पर zebrafish भ्रूण के घाव मार्जिन दिखा प्रतिनिधि confocal छवियों. घाव बना दिया गया है से पहले भ्रूण 90 मिनट के लिए VAS2870 (20 माइक्रोन) या DMSO के साथ pretreated थे. घाव के बाद 20 मिनट, आरओएस एक सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच (2.5 माइक्रोन CellROX) के साथ पकड़ा गया है. Zebrafish भ्रूण में rotenone प्रेरित oxidative तनाव दिखा स्केल बार 20 माइक्रोन. सी) पूरे शरीर की छवि. ऑक्सिडेटिव तनाव दृढ़ता के रूप में पैनल डी में दिखाया भ्रूण) की दुम क्षेत्र में पाया जाता है. Rotenone मुख्य रूप से skel को प्रभावित करने mitochondrial आदि की एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला हैzebrafish में etal मांसपेशियों की कोशिकाओं. स्केल बार, 180 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. एकल कक्षों आरओएस का पता लगाने विधि के प्रतिनिधि परिणाम. ए) zebrafish भ्रूण की एक ठेठ नमूना दिखा प्रतिनिधि FACS साजिश एकल कक्षों के लिए अलग. जीवित कोशिकाओं FSC-एच और एसएससी एच मानकों के साथ अनुसार R1 क्षेत्र में gated हैं. एसएससी एच: 539 (वोल्ट), 1.0 (AmpGain), विधि: रैखिक; FSC-एच:. Zebrafish भ्रूण की एक ठेठ नमूना दिखा E00 (वोल्ट), 2.1 (AmpGain) बी) के प्रतिनिधि FACS साजिश एकल कक्षों के लिए अलग. FACS विश्लेषण करने से पहले, नमूना Propidium आयोडाइड के साथ incubated किया गया है (पीआई, 1 ग्राम / एमएल) के 5 मिनट के लिए. मृत कोशिकाओं पीआई प्रतिदीप्ति (FL2 एच चैनल) के साथ अनुसार R2 के क्षेत्र पर gated हैं. FSC-एच: E00 (वोल्ट), 2.1 (AmpGain), विधि: रैखिक, एसएससी एच: 539 (वोल्ट), 1.0 (AmpGain), विधि: लीनिकट. वोल्टेज चैनल: FL-2:. दिखा 613 प्रवेश सी) प्रतिनिधि FACS भूखंडों समर्थक ऑक्सीडेंट उपचार (एच 2 हे 2) और संबंधित नियंत्रण के अधीन zebrafish भ्रूण अलग. Endothelial कोशिकाओं GFP चैनल द्वारा दिखाए जा रहे हैं. FACS भूखंडों उल और उर पर oxidative तनाव (आरओएस) से प्रभावित सभी कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं. नकारात्मक कोशिकाओं कम quadrants (करूँगा और LR) पर प्लॉट किए जाते हैं. टीजी (Kdrl: GFP) 48hpf पर s843 zebrafish भ्रूण 10 मिनट के लिए नियंत्रण के रूप में एच 2 ओ 2 (2 मिमी) या एच 2 ओ के साथ incubated रहे थे. प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में FACS विश्लेषण करने से पहले, भ्रूण कार्रवाई कर रहे हैं. Oxidative तनाव से प्रभावित कोशिकाओं को एक सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच (; 2.5 माइक्रोन CellROX) का उपयोग कर पता चला रहे हैं. आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के साथ incubated नहीं एक नमूना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है. संबंधित नियंत्रण के साथ समर्थक ऑक्सीडेंट उपचार के अधीन नमूना मुकाबले कोशिकाओं की संख्या ऊपरी quadrants (उल + उर) प्लॉट पर अधिक है. FACS acquisइस प्रकार के रूप ition सेटिंग्स थे: वोल्ट चैनल: FL-1: 582 प्रवेश; सीए-4:. एच 2 ओ 2 का इलाज भ्रूण और संबंधित नियंत्रण में oxidative तनाव से प्रभावित कोशिकाओं का प्रतिशत (उल + उर) दिखा 410 प्रवेश डी) हिस्टोग्राम. माप सी में दिखाए नमूनों से संबंधित हैं. Oxidative तनाव से प्रभावित कोशिकाओं को एक सामान्य आरओएस के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच (; 2.5 माइक्रोन CellROX) का उपयोग कर पता चला रहे हैं. परिणाम एच 2 ओ 2 का इलाज भ्रूण और संबंधित नियंत्रण में oxidative तनाव (आरओएस) से प्रभावित endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत (+ GFP) दिखा एसडी. ई) हिस्टोग्राम ± n = 2 अलग जैविक प्रतिकृति का मतलब कर रहे हैं. माप सी में दिखाए नमूनों से संबंधित हैं. परिणाम एन = 2 nrf2a morphants में oxidative तनाव (आरओएस) से प्रभावित कोशिकाओं का प्रतिशत (nrf2a एमओ) दिखा एसडी. एफ) हिस्टोग्राम ± विभिन्न जैविक replicates और संबंधित नियंत्रणों का मतलब कर रहे हैं24 HPF पर (Ctrl एमओ). 72 HPF में DMSO), 10 माइक्रोन) और संबंधित नियंत्रण (Ctrl;. परिणाम इलाज भ्रूण में mitochondrial oxidative तनाव से प्रभावित कोशिकाओं का प्रतिशत (Rotenone दिखा एसडी जी) हिस्टोग्राम ± n = 2 अलग जैविक प्रतिकृति का मतलब कर रहे हैं. एकल कक्षों में भ्रूण की हदबंदी के बाद, mitochondrial oxidative तनाव (mitochondrial आरओएस) एक mitochondrial विशिष्ट जांच (5 माइक्रोन MitoSOX) के साथ मापा गया था. परिणाम एसडी ± n = 3 अलग जैविक प्रतिकृति का मतलब कर रहे हैं.

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Discussion

गंभीर कदम

यहाँ बताया zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का पता लगाने के लिए प्रक्रिया को दो अलग अलग तरीकों शामिल हैं. एकल कक्ष आरओएस का पता लगाने विधि (चित्रा 1) और अधिक विशिष्ट मात्रात्मक माप की अनुमति देता है, जबकि पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने के विधि, मुख्य रूप से आरओएस का पता लगाने के लिए एक गुणात्मक परख है. दोनों तरीकों zebrafish भ्रूण पर vivo में आरओएस का पता लगाने का आकलन करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करते हैं. हालांकि, वे दोनों कुछ महत्वपूर्ण कदम उपस्थित थे.

विधि मैं से संबंधित महत्वपूर्ण कदम

पूरे माउंट आरओएस का पता लगाने के लिए पहली विधि आसानी से रह रहे भ्रूण (चित्रा 2) के सभी ऊतकों में oxidative तनाव का पता लगाने के लिए महान लाभ है. भ्रूण ऊतकों को जांच का 1) पारगम्यता, 2) जांच विषाक्तता और 3) वें: फिर से विचार किया जाना चाहिए और परख के परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि तीन महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण पहलू हैंकम आरओएस एकाग्रता के लिए ई जांच संवेदनशीलता.

पहला पहलू विशेष रूप से विधि 42 के vivo आवेदन से संबंधित है. आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच की "सेल पारगम्यता" संपत्ति इस परख की उपलब्धि के लिए एक अनिवार्य विशेषता है. आदर्श रूप में, सभी पानी में घुलनशील रसायन रहते zebrafish भ्रूण में प्रसव के लिए उपयोगी हैं; हालांकि oxidative तनाव का पता लगाने के लिए अभिकर्मकों के सबसे पानी में अघुलनशील है. इस प्रकार यह आमतौर पर DMSO (डाइमिथाइल sulfoxide) में घुलनशील हैं कि जांच का प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है.

आरओएस जांच की एकाग्रता से जुड़ा हुआ भ्रूण पर संभव विषाक्त प्रभाव होते हैं. साइड इफेक्ट सामान्य रूप से ऊतकों को नुकसान (यानी परिगलन) या जांच के त्वरित चयापचय से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Hydroethidine जांच कारण भ्रूण की मौत के साथ zebrafish भ्रूण की लंबी incubations (दिन), जबकि 5 की उच्च खुराक - (और -6) में N-Carboxy -2 ', 7'-Dichlorofluorescein Diacetate परिणामआंत (अप्रकाशित डेटा) में प्रतिदीप्ति पर विशेष संचय. इस समस्या को दूर करने के लिए यह जांच के साथ ऊष्मायन के दौरान भ्रूण पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. एक ही जांच के साथ कई सांद्रता और ऊष्मायन के समय के परीक्षण के रूप में अच्छी तरह से फायदेमंद होगा. इष्टतम ऊष्मायन समय की अनुमति देता सतही ऊतकों को नुकसान के बिना आणविक जांच के वितरण और ऑक्सीकरण. रासायनिक जांच (0.5-10 माइक्रोन) का उपयोग कर ऊष्मायन बार आम तौर पर 10-30 मिनट की सीमा में तय किया जा सकता है और 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए. यह हालत यह आंतरिक भ्रूण ऊतकों के लिए प्रतिबंधित है जब ऑक्सीडेटिव प्रजातियों की राशि शारीरिक स्तर के करीब है या जब विशेष रूप से स्थापित करने के लिए काफी मुश्किल हो सकता है. एक पूरे जीव एक आरओएस का पता लगाने के रासायनिक जांच के साथ incubated है जब जांच मुख्य रूप से ऑक्सीकरण और फ्लोरोसेंट हो जाता है, जहां वास्तव में, सबसे सतही ऊतकों (यानी त्वचा, आंखों, और दिल) कर रहे हैं. बाद में, जांच उत्तरोत्तर, आंतरिक अंगों के लिए दिया जिगर या ve हैssels. एक परिणाम के रूप में, आरओएस का पता लगाने की जांच के साथ zebrafish भ्रूण की ऊष्मायन के लिए एक उपयुक्त समय सभी ऊतकों में oxidative तनाव का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस पद्धति का उपयोग करते समय अंत में, यह ऊतकों द्वारा व्यक्त oxidative तनाव के स्तर की जांच की संवेदनशीलता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच के सबसे पतले उनकी संवेदनशीलता के लिए विशेषता है और इस विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम जांच अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए कि इसका मतलब नहीं कर रहे हैं. सभी आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच आम तौर पर oxidative तनाव के उच्च स्तर का पता लगाने, लेकिन उनमें से ज्यादातर ऑक्सीडेटिव तनाव का स्तर 43 से कम से कम पारियों के प्रति संवेदनशील नहीं हैं.

इस नुकसान को सीमित करने और एक अधिक विस्तृत और सटीक विश्लेषण अनुमति देने के लिए यह oxidative तनाव के एकल कक्षों का पता लगाने के आधार पर दूसरी विधि को लागू करने का सुझाव दिया है.

विधि द्वितीय से संबंधित महत्वपूर्ण कदम

एसचिमनी के पास सेल आरओएस का पता लगाने विधि कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है. वे मुख्य रूप से परख करने के लिए संबद्ध आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच के प्रकार) 1) भ्रूण सेल हदबंदी की दक्षता से और 2 से निर्धारित होते हैं.

एकल कक्षों में भ्रूण की हदबंदी 44 प्रवाह cytometry के माध्यम से zebrafish सेल विश्लेषण के लिए पिछले प्रोटोकॉल से अनुकूलित और दृढ़ता से पूरी प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित करने वाले दो महत्वपूर्ण पहलुओं को प्रस्तुत किया गया है. दूसरा एक अलग कोशिकाओं की वसूली से संबंधित है, जबकि पहले पहलू, भ्रूण को अलग कर देना करने के लिए इस्तेमाल विधि का संबंध है.

एकल कक्षों में भ्रूण की हदबंदी मुख्य रूप से हदबंदी अभिकर्मकों की एकाग्रता (यानी collagenase पी और trypsin) द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हालांकि, यह ऊतक हदबंदी की दक्षता incubated भ्रूण और उनके विकास मंच की संख्या पर निर्भर है कि विचार किया जाना चाहिए. पहले विकास के चरणों में zebrafish भ्रूण (24 HPF-48 HPF) क्योंकि 45 विकास प्रगतिशील ऊतकों के लार्वा (96 HPF-120 HPF) से हदबंदी अभिकर्मकों को अधिक समझदार हैं. इस प्रकार, हदबंदी की प्रक्रिया में समायोजन 72 HPF से विभिन्न विकासात्मक चरणों में zebrafish भ्रूण के साथ काम करना आवश्यक है. अभिकर्मकों की एकाग्रता कम आंशिक रूप से ही भ्रूण dissociates जबकि अभिकर्मकों के साथ अत्यधिक ऊष्मायन, कोशिका मृत्यु का कारण बनता है. इसे सही ढंग से ऊतकों disaggregate के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी कोशिकाओं को इकट्ठा करने और बनाए रखने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है. एक महत्वपूर्ण विचार कोशिकाओं ऊतक विभाजन के बाद बरामद कर रहे हैं, जिस पर तापमान है. यह ऊतकों या हैंडलिंग प्रक्रियाओं के यांत्रिक विघटन करने के लिए माध्यमिक oxidative तनाव को सीमित करने के क्रम में centrifugation के दौरान बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

जुड़े जांच के संबंध में दूसरा महत्वपूर्ण कदम ब्याज की एक विशिष्ट ऊतक पर विश्लेषण से जुड़ा हुआ है. एक सेल popul का पता लगाने के लिए सबसे आसान तरीकाzebrafish में समझना हाल के दशकों 46,47 में स्थापित किया गया है कि ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए ठहरने की पेशकश की है. हालांकि चयनित ट्रांसजेनिक लाइन की प्रतिदीप्ति आरओएस का पता लगाने की जांच के साथ संगत होना चाहिए. यह पृष्ठभूमि ऊतक प्रतिदीप्ति और कम, लेकिन जांच से उत्सर्जित विशिष्ट, प्रतिदीप्ति संकेत के बीच पार से बात करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग

दोनों तरीकों विवो में oxidative तनाव को मापने के लिए एक आसान और लागत प्रभावी परख की पेशकश को देखते हुए, यह कई परिस्थितियों के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए संभव है:

अलग आनुवंशिक (जैसे, रोग) कानून में oxidative तनाव की माप

ऑक्सीडेंट और एंटीऑक्सीडेंट जीन आसानी morpholinos (हानि के समारोह) या mRNA (लाभ के समारोह) के इंजेक्शन से zebrafish भ्रूण में modulated किया जा सकता है. जीन तोड़े नीचे और microin की हाल ही में रिपोर्ट प्रयोगोंzebrafish भ्रूण में छाया हुआ mRNA की jection विकास के दौरान oxidative तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने में एंटीऑक्सीडेंट Nrf2a और Nrf2b जीनों के लिए विभिन्न भूमिकाओं की स्थापना की. जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के दृष्टिकोण neuronal कोशिकाओं 38,48 में हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया और oxidative तनाव को स्तनधारी और zebrafish के बीच एक विकासवादी संरक्षित अक्ष का आकलन किया. इसके अलावा, oxidative तनाव का अध्ययन करने के लिए एक महान अवसर कई zebrafish उत्परिवर्ती लाइनों द्वारा की पेशकश की है. उदाहरण के लिए, zebrafish ducttrip (डीटीपी) उत्परिवर्ती एक रोग की स्थिति के संबंध में oxidative तनाव के लक्षण वर्णन के लिए एक दिलचस्प उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है. डीटीपी उत्परिवर्ती (ahcy) जीन और उसके लक्षण वर्णन Ahcy गतिविधि का नुकसान आरओएस का स्तर 49 को प्रभावित करने से जिगर अध: पतन का कारण बनता है पता चला है कि एस adenosylhomocysteine ​​hydrolase के लिए एक कमी वहन करती है. यों, एक नुकसान के कार्यात्मक zebrafish उत्परिवर्ती NRF2 fh318 ले जानेtranscriptional कारक NRF2 जीन का पता उत्परिवर्तन, कम रीढ़ 50 में यह एंटीऑक्सीडेंट जीन की सुरक्षात्मक भूमिका की जांच करने के लिए पर्याप्त रुचि के साथ देखा जाता है.

दवा यौगिकों से चालू होने रिडॉक्स राज्य की माप

छोटे दवाओं के साथ zebrafish भ्रूण के उपचार oxidative तनाव को बाधित या सक्रिय कर सकते हैं. हमने हाल ही में CoQ10 उपचार 51 से बरामद किया जा सकता है कि oxidative तनाव प्रेरित zebrafish भ्रूण की कि statin उपचार प्रदर्शित करता है. वैकल्पिक रूप से, मानव RYR1 से संबंधित myopathies के लिए zebrafish पशु मॉडल में oxidative तनाव का विश्लेषण मांसपेशियों की बीमारी 52 के लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण के रूप में एंटीऑक्सीडेंट दवा एनएसी (एन एसिटाइल सिस्टीन) की भूमिका पर प्रकाश डाला.

छोटे अणुओं और उनके ऑक्सीडेटिव गुण विशेषताएँ दवाओं की बड़ी पैमाने पर प्रदर्शन

zebrafish एक अच्छी तरह से स्थापित पशु आधुनिक हैबड़ी रासायनिक जांच के लिए एल. गंभीर रूप से पार्किंसंस रोग 53 के रूप में स्तनधारी neurodegenerative रोगों में प्रभावित होता है जो डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स अस्तित्व की modulators के रूप में zebrafish पहचान एंटीऑक्सीडेंट में प्रदर्शन छोटे अणुओं के हाल के एक रासायनिक जांच. इस विधि vivo में नया समर्थक या एंटी ऑक्सीडेंट अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

महत्व और सीमाएं

"पूरे माउंट" और "एकल कोशिका" आरओएस-तरीकों का पता लगाने के लिए दोनों की शोहरत सरल प्रयोगशाला तकनीक और बुनियादी उपकरणों का उपयोग करके oxidative तनाव की विवो माप में प्रदर्शन करने की क्षमता पर निर्भर करता है. आरओएस का पता लगाने जांच के साथ संयोजन में एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish के आवेदन मात्र oxidative तनाव का रहस्योद्घाटन, लेकिन यह भी एक ऊतकों के स्तर पर एक जीवित जीव और मात्रा का ठहराव के संदर्भ में अपनी पहचान न केवल अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात है, इन assays हो सकता हैव्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया और महसूस किया जा करने के लिए विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, दोनों तरीकों समय लेने वाली प्रक्रिया नहीं कर रहे हैं और नमूने के बड़े सेट करने के लिए उचित समय के साथ लागू किया जा सकता है. सभी एक साथ इन व्यावहारिक लाभ विशेष महत्व के इन तरीकों विवो में oxidative तनाव विश्लेषण में सुधार करने के लिए बनाते हैं.

हालांकि इन assays भी कुछ सीमाएं दिखा. सामान्य में, अब व्यावसायिक तौर पर उपलब्ध सबसे आरओएस के प्रति संवेदनशील जांच जीवित कोशिकाओं में oxidative तनाव के स्तर के ठीक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं. प्रतिदीप्ति आधारित assays 54 का उपयोग करते हुए, खासकर जब, लेकिन हाल ही में उनकी विशिष्टता के बारे में चिंताओं को उठाया गया है - (. ओ 2) आमतौर पर इस्तेमाल किया hydroethidine और MitoSOX जांच superoxide की संवेदन के लिए डिजाइन किए गए थे. तुलनात्मक रूप से कुछ रिपोर्टों अनन्य एच 2 के लिए dichlorofluorescein Diacetate (DCFH डीए) के बारे में संदेह उन्नत 2 हे 55,56 संवेदन. इसके अलावा इन redox सक्रिय फ्लोरोसेंट जांच आंशिक गैर विशिष्ट सक्रियण (यानी ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति) की विशेषता है और ऑक्सीकरण के बाद प्रतिवर्ती नहीं हैं. फ्लोरोसेंट जांच आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण हो जाने के बाद इसे वापस अपने गैर फ्लोरोसेंट कम राज्य के लिए नहीं आ सकते हैं. नतीजतन अस्थायी समाधान के साथ आरओएस उतार चढ़ाव का पता लगाने के लिए इस तरह के रासायनिक जांच 43 के आवेदन के द्वारा ही सीमित है.

इस क्षेत्र के एक काफी सीमा अनन्य RNS का पता लगाने के लिए जांच की कमी का प्रतिनिधित्व करती है. हाल ही में, प्रोटिओमिक आधारित तरीके RNS nitroso सक्रिय तनाव की बायोमार्कर के रूप में माना जाता है और प्रोटीन ऑक्सीकरण / नाइट्रीकरण (जैसे, विरोधी SNO सिस्टीन, विरोधी 3 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting assays के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है कि प्रोटीन संशोधनों को प्रेरित दिखा दिया कि Nitrotyrosine) 22,23. हालांकि, इन सभी assays ऑक्सीडेटिव stre के केवल अप्रत्यक्ष नाप रहे हैंएसएस RNS से ​​चालू होने और अधिकांश मामलों में वे जीवित कोशिकाओं या zebrafish भ्रूण रहने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं, जिसका अर्थ है सेलुलर अर्क की आवश्यकता होती है.

पारंपरिक जांच करने के लिए एक मान्य विकल्प आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग redox संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करती है. इस समूह के प्रमुख घटक हैं: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, rxYFP और cpYFP, ​​पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन और हाइपर जांच, एक विशिष्ट एच 2 ओ 2 के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच 57 से व्युत्पन्न दोनों से व्युत्पन्न roGFP,. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के द्वारा बनाई गई इन इंजीनियर redox जांच के सभी प्रतिदीप्ति आधारित ratiometric quantifications की अनुमति और रासायनिक जांच से (सेकंड से मिनट के लिए) उच्च अस्थायी समाधान सक्षम 58. में विवो हाइपर व्यक्त zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन द्वारा प्रदर्शन के रूप में इन biosensors के आवेदन भी संभव है अंतर्जात एच 2 हे 2 स्तर 39,59 की वास्तविक समय संवेदन के लिए. मैंआनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर के साथ zebrafish mplementing oxidative तनाव की जांच के लिए एक इष्टतम प्रणाली प्रदान करता है, लेकिन एक ट्रांसजेनिक पशु लाइन और उचित इमेजिंग उपकरण स्थापित करने की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत zebrafish में oxidative तनाव का पता लगाने के लिए प्रक्रिया आनुवंशिक तरीकों की तुलना में कम सटीक है, लेकिन जल्दी है और समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों के उच्च स्तर के vivo का पता लगाने के लिए एक प्राथमिक परख प्रदान करता है. व्यक्तिगत प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और / या नाइट्रोजन प्रजातियों की सटीक माप वर्तमान में इस शोध क्षेत्र की एक सीमा है. भविष्य में, आगामी nanoscale के redox सेंसर इस मुद्दे को हल करने में मदद कर सकता है. nanoparticle और नैनोट्यूब आधारित redox सेंसर के सफल आवेदन कई इन विट्रो अध्ययन में परीक्षण किया है, लेकिन अब 60 तक vivo में assays के रूप में उपलब्ध नहीं किया गया है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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विकास जीवविज्ञान अंक 89, Zebrafish भ्रूण endothelial कोशिकाओं redox राज्य विश्लेषण oxidative तनाव का पता लगाने, FACS (प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर) आणविक जांच
Zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का विश्लेषण
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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