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Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Alti livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono causare un cambiamento di stato redox cellulare verso condizione di stress ossidativo. Questa situazione provoca ossidazione di molecole (lipidi, DNA, proteine) e porta alla morte delle cellule. Lo stress ossidativo influenza anche la progressione di diverse condizioni patologiche come il diabete, retinopatie, neurodegenerazione, e cancro. Quindi, è importante definire strumenti per studiare le condizioni di stress ossidativo non solo a livello di singole cellule, ma anche nel contesto di organismi interi. Qui, si considera l'embrione zebrafish come un utile sistema in vivo tali studi e presentare un protocollo per misurare in vivo stress ossidativo. Approfittando di sonde fluorescenti ROS e linee fluorescenti transgeniche zebrafish, sviluppiamo due metodi differenti per misurare lo stress ossidativo in vivo: i) un "metodo ROS-detection intero embrione" per la misura qualitativa dello stress ossidativo e ii) uno "unicellulare metodo di rilevazione ROS "per misure quantitative di stress ossidativo. Qui, dimostriamo l'efficacia di queste procedure, aumentando lo stress ossidativo nei tessuti da agenti ossidanti e metodi fisiologici o genetici. Questo protocollo è suscettibile per schermi genetiche in avanti e vi aiuterà relazioni indirizzo di causa-effetto di ROS in modelli animali di patologie legate allo stress ossidativo come disturbi neurologici e cancro.

Introduction

Lo stress ossidativo è specificamente definita come una condizione che deriva da uno stato redox cellulare sbilanciato. Le reazioni redox complesse che si verificano normalmente all'interno delle cellule determinano il redox-stato cellulare. Reazioni redox comprendono tutte le reazioni chimiche che consistono nel trasferimento di elettroni tra atomi di molecole biologiche che producono riduzione e ossidazione di molecole (ad esempio reazioni redox). Queste reazioni sono catalizzate da specie attivata elettronicamente (cioè le specie pro-ossidanti), caratterizzati da una instabilità strutturale estremo e l'attivazione spontanea di elettroni sbilanciati che scambiano con biomolecole limitrofi. Queste reazioni irregolari risultano in danni al DNA, proteine ​​carbossilazione, e l'ossidazione dei lipidi, e alla fine portano alla morte delle cellule 1. Aumento dei livelli di stress ossidativo sono stati associati con l'invecchiamento e la progressione di diversi stati patologici 2. Lo stress ossidativo èstato segnalato per essere responsabile di alterazioni vascolari nel diabete e le malattie cardiovascolari 3,4. Esso svolge anche un ruolo fondamentale nella degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson 5. Inoltre, lo stress ossidativo è stato dimostrato come un fattore critico nel governo progressione del cancro ed eventi metastatici 6,7. Inoltre, le risposte infiammatorie e immunitarie possono suscitare e sostenere ulteriormente lo stress ossidativo 8.

In cellule viventi, specie pro-ossidative sono derivati ​​da ossigeno (ROS, specie reattive dell'ossigeno) o di azoto (RNS; specie reattive). ROS includono il radicale idrossile, l'anione superossido (OH.) (O 2 -), e il perossido di idrogeno (H 2 O 2). Il primario RNS è l'ossido di azoto (NO).. Una serie di specie reattive secondarie può essere generato da interazioni spontanee between ROS e RNS o metalli liberi ioni 9. Ad esempio, l'anione superossido reagisce con l'ossido di azoto per formare peroxynitrate (ONOO -), mentre H 2 O 2 reagisce con Fe 2 + genera radicali idrossilici. ROS e RNS, grazie alla loro capacità di reagire con diverse biomolecole, sono considerati una minaccia pericolosa per il mantenimento dello stato fisiologico redox 10. Per mantenere le cellule stato redox sono dotati di una serie di disintossicante molecole antiossidanti ed enzimi. La superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi e Peroxiredoxins costituiscono essenzialmente l'antiossidante enzimatico-arsenale che fornisce protezione cellulare da specie pro-ossidanti compreso H 2 O 2, OH e Oono -. 11. Anche molecole anti-ossidanti come la vitamina C ed E, polifenoli e CoenzymeQ10 (CoQ10) sono di importanza critica per placare ROS e la loro de pericolosarivati ​​12,13. Tuttavia, una eccessiva produzione di ROS e RNS, o una disfunzione del sistema antiossidante, sposta la redox-stato cellulare verso lo stress ossidativo 14.

Oltre alla loro connotazione negativa, ROS può svolgere vari ruoli fisiologici in cellule di diversa origine. Cellule normalmente producono ROS come molecole di segnalazione per mediare eventi biologici normali, come la difesa ospite e ferita riparazione 15-17. Specie reattive sono normalmente prodotti in cellule da enzimi intracellulari come NOx (NADPH) e XO (xantina ossidasi) in risposta a fattori di segnalazione, fattori di crescita e le fluttuazioni dei livelli di calcio intracellulare 18,19. E 'stato riportato che i ROS differenzialmente può modulare l'attività di importanti fattori nucleari come p53 o componenti cellulari come l'ATM-chinasi, il principale regolatore della risposta al danno del DNA 20. Analogamente ROS influenzano fortemente segnalazione cellulare mediando the ossidazione e inattivazione di proteina tirosina fosfatasi (PTP), che sono stabiliti come regolatori critici di trasduzione del segnale 21. Inoltre, le metodologie di proteomica basata dimostrano che RNS sono anche responsabili di specifiche modificazioni delle proteine ​​e alterazioni della segnalazione molecolare. RNS reagiscono con i gruppi tiolo cisteina li modificano in S-nitrothiols (SNO) e innescando meccanismi molecolari concomitanti con stati patologici come le malattie infiammatorie e autoimmuni 22,23.

Da esperimenti di coltura cellulare solo parzialmente riproducono la moltitudine di fattori che agiscono in vivo, è di grande interesse per eseguire studi redox in modelli animali 24,25. Per ottenere ciò, il zebrafish è stato considerato un modello animale vertebrato adatto per studiare la dinamica di stress ossidativo 26. Lo zebrafish è un nuovo modello di sistema che concede numerosi vantaggi di studiare eventi cellulari e genetici durante vertebrato development e la malattia. Grandi cluster di embrioni possono essere generate e disponibili settimanale per esigenze sperimentali. Inoltre, la straordinaria chiarezza ottica di embrioni di zebrafish, nonché le loro piccole dimensioni, permette l'imaging singola cellula e l'inseguimento dinamico in un insieme di organismi 27. Nell'ultimo decennio, un numero considerevole di zebrafish mutanti sono stati generati per modellare condizioni patologiche umane come il cancro e malattie genetiche 28-31. Ancora più importante, una moltitudine di linee transgeniche è stata prodotta per consentire ampie possibilità di manipolazioni genetiche e biologiche 32. Ad esempio, le linee transgeniche zebrafish tessuto-specifici sono regolarmente utilizzati per studi in vivo. Queste linee esprimono una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore selezionato, offrendo la possibilità di identificare le singole cellule in vivo, così come la struttura anatomica di comprendere.

Diversi studi tossicologici hanno già utilizzato tegli Zebrafish per valutare l'effetto in vivo delle sostanze chimiche sulla omeostasi redox, suggerendo l'idoneità di questo vertebrato come modello animale per il campo della scoperta di nuovi farmaci e stress ossidativo 33-35. Anche se alcuni sonde fluorescenti sono stati testati per monitorare lo stress ossidativo in larve di zebrafish 36,37, non ci sono test stabiliti per rilevare e misurare i livelli di stress ossidativo nei tessuti zebrafish e cellule viventi. Qui si descrive un procedimento per la quantificazione in vivo di stress ossidativo in cellule di embrioni di zebrafish vivente. Strumenti di imaging, FACS ordinamento, sonde fluorescenti e le condizioni pro-ossidative sono tutti combinati per generare un semplice test per l'individuazione e la quantificazione delle specie ossidanti in embrioni e tessuti di zebrafish.

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Protocol

1. Preparazione di strumenti e soluzioni di lavoro

  1. Preparare la soluzione di acqua pesce. Ottenere una soluzione stock sciogliendo 2 g di 'Ocean istantanea' sali marini in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 1,5 ml di brodo di pesce di acqua a 1 L di acqua distillata per preparare pronto a utilizzare l'acqua del pesce (/ sali marini ml 60 mcg concentrazione finale). Autoclave pronto all'uso pesci d'acqua prima dell'uso. Questa soluzione viene utilizzata come mezzo zebrafish.
  2. Preparare metilcellulosa per il montaggio degli embrioni. Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 50 ml di acqua sterile pesce. Facilitare la dissoluzione utilizzando un magnete su una piastra di agitazione. La completa dissoluzione della polvere può richiedere diverse ore. Controllare la soluzione per chiarezza e aliquote in piccoli tubi. Conservare a -20 ° C per mesi e scongelare le aliquote a uso. Centrifugare la metilcellulosa a 950 xg per 5 minuti prima di utilizzare. Evitare cicli di congelamento-scongelamento di aliquote.
  3. Preparare 50 ml di tricaine / etil 3-amminobenzoato msale ethanesulphonate (soluzione) sciogliendo 200 mg di tricaine in 100 ml di acqua e aggiustare il pH a 7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservare questo stock a 4 ° C per non più di 30 giorni. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare secondo le appropriate linee guida di trattamento.
  4. Indurre stress ossidativo in embrioni di zebrafish
    1. Preparare una soluzione ossidante per l'induzione dello stress ossidativo generico: Marca 50 ml di soluzione ossidante con l'aggiunta di H 2 O Soluzione 2 stock (perossido di idrogeno; 100 mm) per l'acqua il pesce. Usare H 2 O 2 di una concentrazione finale tra 2 mM e 100 mM. Preparare questa soluzione poco prima dell'uso. La soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. Non conservare questa soluzione. ATTENZIONE: H 2 O 2 è pericoloso e nocivo per inalazione e ingestione. Il contatto con materiale combustibile può provocare un incendio. Maneggiare sotto cappa aspirante e usura pers appropriatedispositivi di protezione onal.
    2. Preparare una soluzione ossidante per l'induzione dello stress ossidativo dei mitocondri-derivati: ottenere una soluzione stock ossidante (5 mm), sciogliendo 3,9 mg di rotenone in 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione a temperatura ambiente al buio.
      1. Sciogliere soluzione stock rotenone a 10 ml di acqua i pesci per fare una soluzione pronta all'uso. Utilizzare rotenone ad una concentrazione compresa tra 5-50 micron. Non utilizzare rotenone a concentrazioni superiori a 100 micron. A concentrazioni appropriate, questa soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. ATTENZIONE: Rotenone è tossico e pericoloso. Manipolare secondo adeguate prudenza.
    3. Indurre stress ossidativo gene knock-down: knock-down dell'espressione genica nrf2a in embrioni di zebrafish da morpholino microiniezione come precedentemente riportato da Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Indurre oxidative stress dopo il danno tissutale: generare un margine ferita alla pinna caudale di embrioni di zebrafish a 72 HPF come precedentemente descritto da 2009 39 Niethammer et al..
  5. Preparare 5 ml di soluzione ROS-rilevazione per singola cella metodo di ROS-rilevamento:
    1. Soluzione per il rilevamento ROS generale: sciogliere la sonda molecolare ROS-sensitive generico in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), al fine di preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). Questa soluzione deve essere preparata poco prima dell'uso.
    2. Soluzione per il rilevamento specifico ROS indotta dai mitocondri: Poco prima dell'uso, sciogliere un mitocondriale sonda ROS-sensibile con DMSO fare un soluzione stock 5 mm. Sciogliere soluzione di riserva in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron).
      NOTA: Evitare la luce e l'ossigeno l'esposizione di soluzioni di lavoro ROS di rilevamento e le rispettive soluzioni stock. Proteggere il tubo dalla luce utilizzandoun foglio di alluminio. Non conservare o di riutilizzo sonde disciolti in HBSS. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C per un mese.
      ATTENZIONE: Maneggiare le sonde molecolari e DMSO sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate.
  6. Preparare 5 ml di soluzione ROS di rilevamento per l'intero metodo di montaggio ROS-rilevamento: Sciogliere la soluzione generica sonda magazzino ROS-sensitive (stabilizzato in DMSO) in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2.5-5 micron). Evitare la luce e l'esposizione all'ossigeno. Proteggere il tubo dalla luce. Preparare questa soluzione prima dell'uso. Non conservare o ri-utilizzare questa soluzione. ATTENZIONE: Maneggiare sonde molecolari sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate.
  7. Fai 25 ml di Soluzione di arresto con l'aggiunta di 10 ml di siero fetale bovino a 15 ml di PBS 1x. Mantenere soluzione sterile. Conservare questa soluzione a 4 ° C. Questa soluzione è necessaria solo per la singola cella - metodo di rilevazione ROS.
  8. Impostare l'incubatore d'aria zebrafish a 28 &# 176; C.
  9. Impostare la centrifuga a 4 ° C per il metodo di rilevamento ROS singola cella.

2. L'accoppiamento di pesci adulti e selezione di embrioni di zebrafish

  1. Set-up adulto coppia zebrafish attraversa secondo protocolli standard 40. Selezionare la linea transgenica appropriato in conformità con le specifiche esigenze sperimentali.
  2. Raccogliere le uova e metterli in un piatto di 90 mm con terreno di pesci d'acqua / embrione. Conservare le uova a 28 ° C fino embrioni svilupparsi e crescere allo stadio desiderato di sviluppo (ad esempio, 48 HPF, 72 hpf; hpf: ore dopo la fecondazione).
  3. Schermo per lo sviluppo di embrioni. Escludere tutte le uova non fecondate o embrioni sottosviluppati.
  4. Anestetizzare gli embrioni con l'aggiunta di 1 ml di tricaine (soluzione) in 50 ml di acqua i pesci.
  5. Selezionare embrioni fluorescenti Tg sotto uno stereomicroscopio.

3. Trattamento di embrioni con ossidante agente

  1. Utilizzare almeno 30 embrioni tra 48 hpf e 72 HPF per ogni condizione diversa. Lavare embrioni due volte con acqua pesce fresco per rimuovere tricaine.
  2. Suddiviso embrioni fluorescenti in tre piatti. Mettere non più di 30 embrioni / piatto.
  3. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 10 ml della soluzione ossidante o 10 ml di acqua pesce come soluzione di controllo.
  4. Incubare gli embrioni per 10 minuti a 1 ora a 28 ° C. Il periodo di incubazione dipende dal livello di stress ossidativo essere indotta in tessuti specifici. Brevi periodi sono i migliori come le cellule colpite da stress ossidativo progressivamente subiscono la morte delle cellule.
  5. Trasferimento degli embrioni in un nuovo piatto contenente HBSS ed embrioni di lavaggio agitando. Pre-HBSS caldo a 28 ° C.

4. Intero monte ROS Metodo di rilevazione

  1. Raccogliere embrioni dopo il trattamento ossidante e mettere non più di 10 embrioni in un piccolo tubo. Risciacquare con HBSS il più possibile. Proteggere il tubo da luce utilizzando un foglio di alluminio.
  2. Aggiungere 1 ml di soluzione di ROS rilevamento perogni provetta.
  3. Incubare embrioni al buio per 15 minuti a 28 ° C per evitare l'esposizione alla luce.
  4. Durante il tempo di incubazione preparare un vetrino per tutta l'analisi embrione. Mettete 300 ml di metilcellulosa su una "depressione" vetrino e stenderlo sulla superficie del vetro con un puntale. Evitare le bolle mentre si rilascia il metilcellulosa.
  5. Al termine del periodo di incubazione, rimuovere immediatamente la soluzione ROS rilevamento e lavare due volte con 2 ml di HBSS. Lavare gli embrioni capovolgendo la provetta diverse volte. Non pipetta o vortice.
  6. Aspirare embrioni superiore in una pipetta Pasteur di vetro. Posizione embrioni vicino all'apertura della pipetta e delicatamente espellere nel metilcellulosa. Orientare gli embrioni adeguatamente con un filo di nylon fine.
  7. Confrontare la fluorescenza di embrioni di controllo con embrioni trattati. In alternativa, fissare parametri del stereomicroscopio a fluorescenza o un microscopio confocale in modo che tutti gli embrioni vengono esposte utilizzando lo stessoImpostazioni di imaging.

5. Single Cell Method ROS rilevamento

  1. Inizia dal punto: 3.5. Assicurarsi di avere almeno 35 embrioni per ogni condizione.
  2. Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto. Rimuovere l'acqua i pesci, per quanto possibile. Aggiungere 10 ml di ghiacciata PBS 1x e 400 ml di inibitori della proteasi Cocktail. Dechorionate manuale embrioni con una pinza e rimuovere il sacco vitellino con un ago sottile. Nota: la rimozione sacco vitellino assicura campioni puliti per la successiva analisi FACS. Questo passaggio può essere evitato secondo strumento FACS.
  3. Trasferimento de-yolked embrioni in una piastra a 24 pozzetti multiwell (15 embrioni / pozzetto) e rimuovere tutti i pesci d'acqua.
  4. Aggiungere 300 ml di HBSS, 30 microlitri collagenasi P, 50 microlitri tripsina-EDTA in ciascun pozzetto.
  5. Omogeneizzare embrioni pipettando gentilmente su e giù con un puntale stretto (1.000 ml).
  6. Incubare a 28 ° C per 20 min e omogeneizzare campioni pipettando ogni 5 min.
  7. Controllare DISR tessutouption osservando un'aliquota di omogenato al microscopio composto. Facilitare sospensione singola cella pipettando. Non incubare gli embrioni per più di 30 min.
  8. Arrestare la reazione aggiungendo 200 ml di soluzione di arresto. Mescolare pipettando delicatamente.
  9. Trasferire sospensione di cellule in una provetta pre-raffreddata con fondo stretto. Tenere la provetta in ghiaccio ed evitare l'esposizione alla luce.
  10. Centrifugare per 5 minuti a 250 xga 4 ° C.
  11. Rimuovere la fase superiore e risospendere le cellule con ghiaccio freddo HBSS pipettando delicatamente.
  12. Contare le celle e assicurarsi di avere lo stesso numero di cellule in tutti i campioni. Non utilizzare meno di 2 x 10 6 cellule.
  13. Celle di centrifugazione per 5 minuti a 250 xg a 4 ° C.
  14. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con 1 ml di ghiaccio raffreddato HBSS contenente la sonda ROS-sensitive.
  15. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 3 minuti al buio. Tempo di incubazione variare a seconda del livello di stress ossidativo e di tegli sensibilità della sonda.
  16. Trasferire le cellule in una provetta FACS. Tenere le provette su ghiaccio ed evitare l'esposizione alla luce prima analisi FACS.
  17. Ordinare le celle con un cell sorter fluorescenza-attivato (FACS). Lunghezze d'onda impostato conformemente fluorescenza Tg tessuto (ad esempio, GFP) e gli spettri di eccitazione / emissione della sonda molecolare utilizzato per il rilevamento ROS (ad esempio, sonde specifiche mitocondriali ROS-sensibili, generici sonde sensibili ROS).
  18. Per ogni condizione, misurare tutti i campioni all'interno della stessa sessione sperimentale, applicando le stesse impostazioni FACS. Calcolare la percentuale di cellule fluorescenti come media di diverse repliche biologiche. Analizzare almeno due repliche per ogni condizione.

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Representative Results

Applicando il metodo descritto qui, possiamo facilmente misurare e rilevare lo stress ossidativo (e livelli di ROS) nei tessuti embrionali di zebrafish. Dopo aver attraversato zebrafish adulto, uova vengono raccolte e permesso di sviluppare a 28 ° C per 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Al fine di indurre stress ossidativo, proponiamo due diversi approcci: 1) Il trattamento degli embrioni con forti reagenti pro-ossidanti o 2) promuovere la formazione di ROS dopo la lesione del tessuto.

Nel primo approccio, abbiamo impiegato due reagenti diversi a seconda delle esigenze specifiche: perossido di idrogeno (H 2 O 2), come il nucleo cellulare agente formatura ROS, e rotenone, come il driver specifico ROS mitocondriale. Rotenone è un inibitore del complesso I della ETC, che deregolamentazione sono causativo di stress ossidativo 41.

Nel secondo approccio, abbiamo indotto accumulo di ROS creando una ferita alla pinna caudale di un embrione zebrafish39. Alternativa, condizioni di stress ossidativo possono essere promosse nei tessuti zebrafish abbattendo con l'iniezione morpholino la Nrf2 via di risposta antiossidante che è la difesa cellulare primaria contro gli effetti citotossici di stress ossidativo 38.

Una volta che lo stress ossidativo è indotta in embrioni di zebrafish, l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) può essere misurata utilizzando sonde specifiche ROS sensibili generici o mitocondriali, che diventano fluorescenti su attivazione (cioè ossidazione).

Embrioni trattati possono essere analizzati utilizzando l'intero metodo di montaggio ROS-rilevamento o applicando il metodo di rilevazione singola cellula-ROS come riassunto nella Figura 1. La selezione tra metodi si basa sulla necessità di effettuare la misurazione qualitativa o quantitativa di stress ossidativo. Risultati rappresentativi di entrambi i metodi sono rappresentati in Figura 2 Figura 3.

Tutta Monte Metodo ROS rilevamento

La Figura 2 mostra l'applicazione del metodo di montaggio dell'intero ROS-rilevazione per imaging in vivo dello stress ossidativo. In particolare, questo metodo è stato applicato a seguire sia "forte" stress ossidativo generato dai trattamenti pro-ossidanti esogene e "basso" stress ossidativo generato da condizioni più fisiologiche quali lesioni ferita o delezione di un gene.

Livelli fisiologici di specie ossidative sono indotte da generare un micro lesioni o un'ampia ferita alla pinna caudale di un embrione zebrafish vivo a 72 HPF. È stato dimostrato che dopo la lesione, H 2 O 2 si accumula la ferita margine 20 min dopo la ferita 39. Per visualizzare l'accumulo di stress ossidativo al margine della ferita, gli embrioni sono stati incubati con un genericoSonda ROS-sensibile e ripreso a 20 minuti dopo il ferimento di 39. Confrontando alette di coda intatte con code feriti, è possibile distinguere un accumulo della sonda fluorescente al margine della ferita (Figura 2A). Non specifici segnale di fluorescenza debole viene rilevato in tutto il tessuto pinna caudale in entrambe le condizioni.

Per convalidare l'accumulo specifico della sonda ROS sensibile al margine della ferita, l'H 2 O 2 livelli presso la ferita è stata abbassata di un approccio farmacologico. Poiché è stato dimostrato che il margine di ferita H 2 O 2 accumulo è estremamente sensibile al DUOX-inibitore VAS2870 39, gli embrioni sono stati pre-trattati con questo inibitore prima ferimento. Confronto della fluorescenza della sonda ROS-sensibili, da VAS embrioni pre-trattate ei rispettivi controlli, indica che il segnale è dipendente ROS accumulo (ad esempio H 2 O 2) (Figura 2B).

Inoltre, abbiamo generato alti livelli di specie ossidanti nei tessuti zebrafish trattando embrioni di zebrafish con rotenone. Embrioni e controlli rotenone trattati sono stati incubati con un generico sonda ROS-sensibile per rilevare specificamente specie ROS. Successivamente, la sonda è stato lavato fuori e gli embrioni sono stati ripresi sotto un microscopio a fluorescenza stereo. Lo stress ossidativo è stato rilevato in tutto il corpo degli embrioni (Figura 2C). Immagini ad alto ingrandimento mostrano regioni anatomiche in cui la sonda viene metabolizzato con successo (Figura 2D). Immagini campo luminoso (pannelli superiori) distinguono strutture anatomiche, mentre le immagini di fluorescenza (pannelli inferiori) indicano le cellule ROS-positivi. Come mostrato dalle immagini fluorescenti i risultati sono principalmente una relazione qualitativa di rilevazione stress ossidativo, che si ottiene confrontando controllo con embrioni trattati.

Single Cell-ROS Metodo di rilevazione

Figura 3 rapporti FACS rappresentativi trame e quantificazione dello stress ossidativo mediante l'applicazione del metodo di rilevazione ROS singola cella. Questo metodo è stato adattato per misurare i livelli di stress ossidativo nelle cellule zebrafish che sono stati sottoposti a condizioni pro-ossidanti come riportato nel protocollo e dettagliate didascalie delle figure. Come descritto, lo stress ossidativo è stata misurata incubando tessuti zebrafish dissociate in singole cellule con una sonda molecolare ROS-sensibili. Poiché la procedura di dissociazione e la FACS si possono causare danni alle cellule, l'analisi di campioni richiede che solo "cellule vive" sono considerati per la quantificazione stress ossidativo. Di conseguenza, le cellule dissociate vengono analizzati selezionando la frazione di cellule che mostrano parametri fisici "cellule vive" (Figura 3a) ed escludendo le cellule morte (Figura 3B). Così, i campioni vengono quantizzati perlivelli di stress ossidativo secondo la fluorescenza della sonda ROS sensibile e per mostrare una fluorescenza endogena come la positività per la GFP (Figura 3C). Un campione di controllo negativo per la sonda ROS sensibile dovrebbe essere inclusa per valutare lo stress ossidativo indotto da manipolazione e procedure tecniche (Figura 3C; pannello: controllo -). Relativa FACS trama quantificazione dimostrato in istogrammi che mostrano le misure di diverse repliche biologiche (Figura 3D-E).

Oltre livello di stress ossidativo quantificazione su trattamenti perossido di idrogeno, questo metodo è stato applicato per quantificare i livelli di stress ossidativo condizioni fisiologiche tali noi in morphants nrf2a e rispettivi controlli (Figura 3F).

Inoltre, combinando il metodo di rilevazione ROS-cella singola con specifiche sonde ROS-sensibili come noi mitocondriale ROSonde S-sensibile, è anche possibile misurare lo stress ossidativo nel contesto di specifici trattamenti pro-ossidanti mitocondri targeting (figura 3G).

Figura 1

Figura 1. Figura schematica del metodo per misurare i livelli di ROS in embrioni di zebrafish. Adulti Zebrafish sono incrociate nelle apposite vasche di allevamento. Uova fecondate sono poi raccolti in piatti e conservati a 28 ° C per consentire embrione di sviluppare pienamente. Induzione di stress ossidativo può essere realizzato in diversi modi, sia per trattamenti farmaceutici o da insulti genetiche o fisiche. In alternativa, in caso di un mutante genetico viene analizzata, è possibile saltare questa incubazione e andare avanti. A questo punto, è possibile procedere secondo due metodi differenti. Secondo il "intero mount metodo ROS-detection "(a sinistra), zebrafish embrioni vengono immediatamente incubato con una sonda fluorescente ROS sensibile (1) e poi analizzati con fluorescenza o microscopio confocale (2). Nel "singola cellula ROS rilevamento" metodo (a destra), embrioni di zebrafish sono dissociate in singole cellule (1), incubate con una sonda ROS sensibile fluorescente (2) e analizzate mediante FACS per rivelazione di fluorescenza e quantificazione (3). Mentre il metodo "tutto il monte-ROS rilevamento" permette la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni viventi principalmente come un test qualitativo, il metodo contributi "basati su singola cellula", sia qualitative e misurazioni quantitative dei livelli di stress ossidativo.

Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi di tutto il metodo di montaggio ROS-rilevamento. A) embrioni di zebrafish a 72 HPF sono stati sottopostia ferire come precedentemente descritto da Niethammer et al., 2009 39. immagini confocali rappresentative mostrano specie pro-ossidanti (ROS) di accumulo (freccia) al margine della ferita della pinna caudale feriti. Specie ossidative sono stati rilevati con la sonda ROS generico (CellROX; 2,5 micron) 20 min dopo la ferita è stato fatto. Barra della scala 20 micron. B) immagini confocali rappresentative che mostrano margini della ferita di embrioni di zebrafish a 72 HPF. Gli embrioni sono stati pretrattati con VAS2870 (20 mM) o DMSO per 90 min prima di aver effettuato la ferita. ROS è stata rilevata con una sonda generica ROS-sensitive (CellROX; 2,5 micron) 20 min dopo la ferita. Barra della scala 20 micron. C) l'immagine del corpo intero che mostra rotenone stress ossidativo indotto in embrioni di zebrafish. Lo stress ossidativo è fortemente rilevato nella regione caudale degli embrioni come mostrato nel pannello D). Rotenone è un potente inibitore di ETC mitocondriale che colpisce principalmente skelcellule muscolari Etal in zebrafish. Barra della scala, 180 micron.

Figura 3
Figura 3. Risultati rappresentativi delle singole cellule ROS metodo di rilevamento. A) rappresentativa FACS diagramma che mostra un esempio tipico di embrioni di zebrafish dissociata a cellule singole. Cellule vive sono gated nella regione R1 accordo con i parametri FSC-H e SSC-H. SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (AmpGain), Mode: lineare; FSC-H:. E00 (Voltage), 2.1 (AmpGain) B) Rappresentante FACS grafico mostra un tipico esempio di embrioni di zebrafish dissociato da singole cellule. Prima dell'analisi FACS, il campione è stato incubato con ioduro di propidio (PI; 1 mg / ml) per 5 min. Le cellule morte sono gated sulla regione R2 accordo con PI fluorescenza (FL2-H del canale). FSC-H: E00 (Voltage), 2.1 (AmpGain), Mode: lineare, SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (AmpGain), Mode: livicino. Canali di tensione: FL-2:. 613 Log C) FACS Rappresentante trame mostrano dissociate embrioni di zebrafish sottoposti a trattamento pro-ossidante (H 2 O 2) e rispettivi controlli. Le cellule endoteliali sono visualizzate per canale GFP. Trame FACS rappresentano tutte le cellule colpite da stress ossidativo (ROS) su UL e UR. Cellule negative vengono tracciati su quadranti inferiori e LR (LL). Tg (Kdrl: GFP) s843 zebrafish a 48hpf state incubate con H 2 O 2 (2 mM) o H 2 O come controllo per 10 min. Prima dell'analisi FACS, gli embrioni vengono elaborati come descritto nel protocollo. Cellule colpite da stress ossidativo vengono rilevati utilizzando una sonda generica ROS sensibile fluorescente (CellROX; 2,5 mM). Un campione non incubate con la sonda ROS-sensitive è stata inclusa come controllo negativo. Confrontando il campione sottoposto a trattamento pro-ossidante con il comando corrispondente, il numero di cellule tracciata quadranti superiori (UL + UR) è più alto. Acquis FACSimpostazioni ition sono stati i seguenti: i canali di tensione: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Log D) Istogramma che mostra la percentuale di cellule (UL + UR) affetti da stress ossidativo in H 2 O 2 embrioni trattati e rispettivo controllo. Le misure sono relative a campioni indicati in C. Cellule colpite da stress ossidativo vengono rilevati utilizzando una sonda generica ROS sensibile fluorescente (CellROX; 2,5 mM). I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD. E) istogramma che mostra la percentuale di cellule endoteliali (GFP +) caratterizzate da stress ossidativo (ROS +) in H 2 O 2 embrioni trattati e rispettivo controllo. Le misure sono relative a campioni indicati in C. I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD. F) istogramma che mostra la percentuale di cellule colpite da stress ossidativo (ROS +) in morphants nrf2a (nrf2a MO) e rispettivi controlli(Ctrl MO) a 24 HPF. I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD G) istogramma che mostra la percentuale di cellule colpite da stress ossidativo mitocondriale negli embrioni trattati (rotenone;. 10 micron) e rispettivi controlli (Ctrl; DMSO) a 72 HPF. Dopo dissociazione di embrioni in cellule singole, mitocondriale stress ossidativo (ROS mitocondriale +) è stata misurata con una sonda specifica mitocondriale (MitoSOX; 5 pM). I risultati sono la media di n = 3 diverse repliche biologiche ± SD.

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Discussion

Fasi critiche

La procedura per la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni di zebrafish qui descritti comprende due metodi differenti. L'intero metodo di montaggio ROS rilevamento è principalmente un test qualitativo per ROS-rilevamento, mentre il metodo ROS rilevamento singola cella consente misurazioni quantitative più specifici (Figura 1). Entrambi i metodi offrono un modo rapido e semplice per valutare in vivo ROS-rilevazione sugli embrioni di zebrafish. Tuttavia, entrambi presentano alcuni punti critici.

I passaggi critici relativi a Metodo I

Il primo metodo per montare tutto ROS rilevamento ha il grande vantaggio di rilevare facilmente lo stress ossidativo in tutti i tessuti di embrioni viventi (Figura 2). Tuttavia ci sono tre importanti aspetti critici che devono essere considerati e possono influenzare l'esito del test: 1) la permeabilità della sonda ai tessuti embrionali, 2) la tossicità sonda e 3) the sensibilità della sonda a bassa concentrazione di ROS.

Il primo aspetto concerne specificatamente per l'applicazione in vivo del metodo 42. La struttura "cell-permeabilità" della sonda ROS-sensitive è un elemento essenziale per il raggiungimento di questo test. Idealmente, tutti i prodotti chimici solubili in acqua sono ottimali per la consegna in embrioni vivi zebrafish; Tuttavia la maggior parte dei reagenti per la rilevazione dello stress ossidativo sono insolubili in acqua. Così di solito è consigliato di utilizzare le sonde che sono solubili in DMSO (dimetilsolfossido).

Ci sono possibili effetti tossici su embrioni legati alla concentrazione della sonda ROS. Gli effetti collaterali sono normalmente rappresentati da danno tissutale (cioè necrosi) o il metabolismo accelerato della sonda. Di incubazione lunghi (giorni) di embrioni di zebrafish con hydroethidine sonda causa embrione morte, mentre alti dosaggi di 5 - (e 6), carbossi-due ', 7', diclorofluoresceina diacetato risultati in naccumulo on-specifico della fluorescenza nell'intestino (dati non pubblicati). Per superare questo problema è importante monitorare embrioni durante l'incubazione con la sonda. Prove di diverse concentrazioni e tempi di incubazione con la stessa sonda sarebbe utile pure. Il tempo ottimale di incubazione consente la consegna e l'ossidazione della sonda molecolare senza danni superficiali dei tessuti. I tempi di incubazione con sonde chimiche (0,5-10 micron) possono essere generalmente fissati nel range di 10-30 minuti e non devono superare 1 ora. Questa condizione può essere molto difficile da impostare soprattutto quando la quantità di specie ossidative trova vicino a livelli fisiologici o quando è limitata ai tessuti embrionali interne. In effetti, quando un intero organismo viene incubata con una sonda chimica ROS-rilevamento, i tessuti più superficiali (cioè della pelle, occhi e cuore) sono dove la sonda è principalmente ossidato e diventa fluorescente. Più tardi, la sonda viene progressivamente consegnato agli organi interni, fegato o vessels. Di conseguenza, un tempo adeguato per l'incubazione di embrioni di zebrafish con la sonda ROS-rilevazione è fondamentale per rilevare lo stress ossidativo in tutti i tessuti.

Infine, quando si utilizza questo metodo, è importante prendere in considerazione la sensibilità della sonda per il livello di stress ossidativo espressa dai tessuti. La maggior parte delle sonde disponibili in commercio non sono finemente caratterizzati per la loro sensibilità e questo significa che la sonda ottimale per applicazioni specifiche deve essere determinata empiricamente. Tutte le sonde ROS-sensibili generalmente rilevano alti livelli di stress ossidativo, ma la maggior parte di loro non sono sensibili a cambiamenti minimi dei livelli di stress ossidativo 43.

Per limitare questo inconveniente e consentire un'analisi più dettagliata e precisa si suggerisce di applicare il secondo metodo basato su singole cellule rilevamento di stress ossidativo.

I passaggi critici correlati al metodo II

La single-cell metodo di ROS-rilevazione presenta alcuni passaggi critici. Essi sono determinate principalmente dalla 1) l'efficienza di dissociazione cellulare embrionale e 2) il tipo di sonda ROS sensibile associato al dosaggio.

La dissociazione di embrioni nelle singole cellule è stato ricavato da precedenti protocolli per l'analisi di cellule zebrafish tramite citometria a flusso 44 e presenta due aspetti critici che influenzano fortemente l'esito dell'intera procedura. Il primo aspetto riguarda il metodo utilizzato per dissociare embrioni, mentre il secondo è legato al recupero di cellule dissociate.

La dissociazione di embrioni in singole cellule è controllata principalmente dalla concentrazione dei reagenti di dissociazione (cioè collagenasi P e tripsina). Tuttavia, si deve considerare che l'efficienza di dissociazione del tessuto dipende dal numero di embrioni incubate e loro stadio di sviluppo. Embrioni di zebrafish nelle fasi precoci di sviluppo (24 hpf-48 HPF) sono più sensibili ai reagenti di dissociazione di larve (96 HPF-120 hpf) a causa di tessuti crescita progressiva 45. Così, le regolazioni della procedura di dissociazione sono necessari quando si lavora con embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo di 72 HPF. Incubazione eccessiva con reagenti provoca la morte cellulare, mentre ridotta concentrazione dei reagenti dissocia solo parzialmente gli embrioni. Come è importante disaggregare correttamente i tessuti, è altrettanto importante raccogliere e conservare le cellule singole. Una considerazione importante è la temperatura alla quale le cellule vengono recuperate dopo divisione tessuto. È importante mantenere le cellule su ghiaccio oa 4 ° C durante la centrifugazione in modo da limitare lo stress ossidativo secondario alla rottura meccanica dei tessuti o procedure di manipolazione.

Il secondo passo critico in riferimento alla sonda associata è legata alla analisi su un tessuto specifico di interesse. Il modo più semplice per rilevare un Vuh cellularezione in zebrafish è offerto dalla vasta gamma di linee transgeniche che sono stati stabiliti negli ultimi decenni 46,47. Tuttavia la fluorescenza della linea transgenica selezionato deve essere compatibile con la sonda ROS-rilevamento. E 'fondamentale per evitare cross-talk tra fluorescenza di fondo del tessuto e il basso, ma specifico, segnale di fluorescenza emesso dalla sonda.

Le applicazioni di questo protocollo

Considerando entrambi i metodi offrono un saggio efficace semplice ed economico per misurare lo stress ossidativo in vivo, è possibile applicare questo protocollo a diverse condizioni:

Misure di stress ossidativo in diversi genetica (ad esempio, patologiche) Condizioni

Ossidante e geni antiossidanti possono essere facilmente modulate in embrioni di zebrafish tramite l'iniezione di Morpholinos (perdita di funzione) o mRNA (guadagno-di-funzione). Esperimenti riportati recente del gene knock-down e microinproiezione di capped mRNA in embrioni di zebrafish stabilito ruoli diversi per i geni antiossidanti Nrf2a e Nrf2b a proteggere le cellule dallo stress ossidativo durante lo sviluppo. Approcci di modulazione dell'espressione genica valutati un asse conservata evolutiva tra mammiferi e zebrafish alla risposta ipossia e stress ossidativo in cellule neuronali 38,48. Inoltre, una grande opportunità di studiare lo stress ossidativo è offerto da numerose linee mutanti di zebrafish. Ad esempio, il ducttrip zebrafish (DTP) mutante rappresenta un esempio interessante per la caratterizzazione di stress ossidativo in relazione ad uno stato patologico. Il mutante DTP porta un deficit per il idrolasi S-adenosilomocisteina (AHCY) gene e la sua caratterizzazione rivelato che la perdita di attività AHCY provoca la degenerazione del fegato influenzando livelli di ROS 49. Equivalentemente, il pesce zebra mutante fh318 Nrf2, portando un funzio perdita din mutazione del fattore trascrizionale del gene Nrf2, è stato considerato con notevole interesse per studiare il ruolo protettivo di questo gene antiossidante in vertebrati inferiori 50.

Misure di Redox Stato innescate da composti farmaceutici

Trattamento di embrioni di zebrafish con piccoli farmaci in grado di inibire o attivare lo stress ossidativo. Abbiamo recentemente dimostrato che il trattamento con statine di embrioni di zebrafish indotto stress ossidativo che può essere recuperato da un trattamento CoQ10 51. In alternativa, l'analisi dello stress ossidativo nel modello animale zebrafish per miopatie RYR1 legate umani evidenziato il ruolo del farmaco antiossidante NAC (N-acetil cisteina) come un potenziale approccio terapeutico per la malattia muscolare 52.

Large Scale screening di piccole molecole e farmaci per caratterizzare le loro proprietà ossidativo

Lo zebrafish è un animale mod consolidatael per lo screening chimico di grandi dimensioni. Una recente analisi chimica di piccole molecole eseguite in zebrafish antiossidanti identificati come modulatori dei neuroni dopaminergici sopravvivenza, che è fortemente influenzato in malattie neurodegenerative mammiferi come il morbo di Parkinson 53. Questo metodo può essere utilizzato per lo screening di nuove molecole pro o anti-ossidanti in vivo.

Significato e limiti

L'importanza di entrambi "tutto il monte" e "monocellulari" metodi ROS di rilevamento si basa sulla capacità di eseguire misure in vivo dello stress ossidativo, utilizzando semplici tecniche di laboratorio e le attrezzature di base. L'applicazione del zebrafish come modello animale in combinazione con sonde ROS-rilevamento permette non solo il semplice rivelazione di stress ossidativo, ma anche la sua rilevazione nel contesto di un organismo vivente e quantificazione a livello dei tessuti singoli. È importante sottolineare che questi test possono essereeseguita con gli strumenti disponibili in commercio e non richiedono competenze specifiche da realizzare. Inoltre, entrambi i metodi non sono procedure che richiede tempo e possono essere applicati con momento opportuno per grandi serie di campioni. Tutti insieme questi vantaggi pratici rendono questi metodi di particolare importanza per migliorare l'analisi dello stress ossidativo in vivo.

Tuttavia questi test mostrano anche alcune limitazioni. In generale, la maggior parte delle sonde ROS-sensibili ora disponibili in commercio non sono valutati per fini di analisi qualitativa e quantitativa dei livelli di stress ossidativo nelle cellule viventi. Il hydroethidine comunemente usato e sonde MitoSOX sono stati progettati per il rilevamento della superossido (O 2 -.), Ma recentemente le preoccupazioni circa la loro specificità sono state sollevate, soprattutto quando si utilizza basato sulla fluorescenza saggi 54. Analogamente alcuni rapporti avanzati dubbi circa la diacetato diclorofluoresceina (DCFH-DA) per H esclusiva 2 2 sensing 55,56. Inoltre queste sonde fluorescenti redox-attivi sono caratterizzati da parziale attivazione non specifica (cioè tessuto auto-fluorescenza) e non sono reversibili dopo l'ossidazione. Una volta che la sonda fluorescente viene ossidato da ROS non può tornare alla sua non-fluorescenti stato ridotto. Di conseguenza la rilevazione delle fluttuazioni ROS con risoluzione temporale è limitata dalla applicazione di tali sonde chimiche 43.

Una notevole limitazione di questo campo è rappresentato dall'assenza di sonde di rilevamento esclusivo della RNS. Recentemente, le metodologie di proteomica basato dimostrato che RNS indurre modificazioni delle proteine ​​che sono considerati come biomarcatori di stress nitroso-attivo e può essere valutata tramite saggi di immunoblotting utilizzando anticorpi specifici per la proteina di ossidazione / nitrazione (ad esempio, anti-SNO-cisteina, anti-3- nitrotirosina) 22,23. Tuttavia, tutti questi test sono solo misure indirette di ossidativo stress innescato da RNS e nella maggior parte dei casi essi richiedono estratti cellulari, il che significa che essi non sono applicabili per le cellule viventi o che vivono embrioni di zebrafish.

Una valida alternativa alle sonde convenzionali è rappresentata da proteine ​​fluorescenti sensibili redox geneticamente codificati. I principali costituenti di questo gruppo sono: roGFP, derivato da proteine ​​fluorescenti verdi, rxYFP e cpYFP, ​​entrambi derivati ​​dalla proteina fluorescente gialla e la sonda iper, una specifica H 2 O 2 sonda fluorescente sensibile 57. Tutte queste sonde redox ingegnerizzati creata di proteine ​​fluorescenti permettono quantificazioni raziometrici basato sulla fluorescenza e consentire una maggiore risoluzione temporale (da secondi a minuti) di sonde chimiche 58. In vivo applicazione di questi biosensori è anche possibile, come dimostrato dalla linea transgenica zebrafish esprime Hyper per il rilevamento in tempo reale di H 2 O 2 endogena livelli 39,59. Iomplementing il zebrafish con sensori geneticamente codificati offre un ottimo sistema per studiare lo stress ossidativo, ma richiede la creazione di una linea di animali transgenici e adeguati strumenti di imaging. La procedura per la rilevazione dello stress ossidativo in zebrafish qui presentato è meno preciso rispetto ai metodi genetici, ma è veloce e fornisce un riferimento primario per la rilevazione in vivo di elevati livelli di specie pro-ossidanti. Accurata misurazione di ossigeno reattive dell'individuo e / o specie azotate è attualmente un limite di questo campo di ricerca. In futuro, le prossime redox-sensori nanoscala potrebbero aiutare a risolvere questo problema. L'applicazione di successo di redox-sensori di nanoparticelle e nanotubi basati è stato testato in diversi studi in vitro, ma non disponibili come test in vivo fino ad ora 60.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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Biologia dello Sviluppo Numero 89, Embrioni di zebrafish cellule endoteliali l'analisi dello stato redox la rilevazione dello stress ossidativo, FACS (fluorescenza attivato cell sorter) sonde molecolari
Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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