Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Высокие уровни активных форм кислорода (АФК) может вызвать изменение состояния сотовой окислительно-восстановительного к окислительному состоянии стресса. Эта ситуация вызывает окисление молекул (липидов, ДНК, белков) и приводит к гибели клеток. Окислительный стресс также влияет на прогрессирование нескольких патологических состояний, таких как диабет, ретинопатия, нейродегенеративные и рак. Таким образом, важно определить инструменты для исследования окислительных условиях стресса не только на уровне одиночных клеток, но также в контексте целых организмов. Здесь мы рассмотрим данио эмбриона в качестве полезного в системе естественных условиях для выполнения таких исследований и приводим протокол для измерения в естественных условиях окислительного стресса. Воспользовавшись люминесцентных АФК зондов и рыбок данио трансгенных флуоресцентных линий мы разрабатываем два различных метода для измерения окислительного стресса в естественных условиях: I) "Весь эмбрион метод РОС-обнаружение" для качественного измерения окислительного стресса и б) А "одноклеточных РОС метод обнаружения "для количественных измерений окислительного стресса. В данном случае мы демонстрируют эффективность этих процедур, увеличивая окислительный стресс в тканях путем окислительных агентов и физиологических или генетических методов. Этот протокол является поддаются для форвардных генетических экранов, и это поможет адрес причинно-следственных связей АФК на животных моделях окислительного стресса, связанных патологий, таких как неврологические расстройства и рак.

Introduction

Окислительный стресс специально определяется как состояние, что результаты от неуравновешенное состояние сотовой окислительно-восстановительной. Сложные окислительно-восстановительные реакции, которые обычно происходят в клетках определения клеточной редокс-состояние. Окислительно-восстановительные реакции состоит из всех химических реакций, которые состоят в передаче электронов между атомами биологических молекул, производящих восстановление и окисление молекул (то есть окислительно-восстановительных реакций). Эти реакции катализируется электронном активированных видов (т.е. про-окислительные видов), которые характеризуются крайней структурной неустойчивости и спонтанной активации неуравновешенных электронов, которые обмениваются с соседними биомолекул. Эти неправильные реакции приводят в повреждении ДНК, белка карбоксилирования, и окисление липидов, и в конечном итоге привести к гибели клеток 1. Повышенные уровни оксидативного стресса были связаны со старением и прогрессировании различных патологических состояний 2. Окислительный стресс имеетСообщалось, что ответственность за сосудистых изменений в диабет и сердечно-сосудистых заболеваний 3,4. Он также играет важную роль в дегенерации нейронов при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона 5. Кроме того, окислительный стресс была продемонстрирована в качестве важнейшего фактора в управлении прогрессирование рака и метастатических события 6,7. Кроме того, воспаление и иммунный ответ может вызвать и дальнейшее сопровождение окислительный стресс 8.

В живых клетках, про-окислительные видов являются производными от кислорода (ROS; активных форм кислорода) или азота (RNS; видов активного азота). ROS включают гидроксильный радикал, в супероксид-анион (OH). (O 2 -) и перекись водорода (H 2 O 2). Первичный RNS является закись азота (NO.). Ряд вторичных активных форм могут быть получены путем взаимодействия спонтанных betweeн АФК и RNS или свободных металлов ионов 9. Например, супероксид-анион реагирует с закисью азота с образованием пероксинитрат (ONOO -), в то время как H 2 O 2 в реакцию с Fe 2 + генерирует гидроксильные радикалы. АФК и RNS, из-за их способности реагировать с несколько биомолекул, считаются опасной угрозой для поддержания физиологического состояния окислительно-восстановительного 10. Чтобы поддерживать окислительно-восстановительное состояние клетки снабжены серией детоксикации молекул антиоксидантными и ферменты. Супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и Пероксиредоксины существу составляют антиоксидантным ферментативную-арсенал, который обеспечивает сотовой защиты от про-окислительных видов в том числе H 2 O 2, ОН и Oono -. 11. Также молекулы антиоксиданта, как витамин С и Е, полифенолы и CoenzymeQ10 (коэнзима Q10) имеют решающее значение для утоления ROS и их опасного деrivatives 12,13. Однако избыточное производство АФК и RNS, или дисфункции в системе Антиоксидант, сдвигает клеточный редокс-состояние к окислительному стрессу 14.

Кроме того, их негативный оттенок, ROS могут играть различные физиологические роли в клетках различного происхождения. Клетки обычно производят ROS как сигнальные молекулы в качестве посредника нормальные биологические события, такие как хост-защиту и заживления ран 15-17. Активные формы обычно получают в клетках путем внутриклеточных ферментов, таких как NOx (НАДФН-оксидазы) и XO (ксантина оксидазы) в ответ на сигнальных факторов, факторов роста и внутриклеточных колебаний уровней кальция 18,19. Было сообщено, что ROS может дифференциально модулировать активность важных ядерных факторов, таких как p53 или клеточных компонентов, таких как ATM-киназы, мастер регулятора ответ на повреждение ДНК 20. Аналогично АФК сильно влияют сотовой сигнализации на посредничество тыс.э окисления и инактивация белка тирозина фосфатазы (PTPs), которые устанавливаются в качестве важнейших регуляторов передачи сигнала 21. Кроме того, протеомные основе методологии продемонстрировать, что RNS также несут ответственность за конкретные изменения белковых и изменений молекулярной сигнализации. RNS реагировать с цистеином тиоловых групп модифицирующих их в S-nitrothiols (SNO) и молекулярных путей, вызывающих одновременно с патологических состояний, таких как воспалительных и аутоиммунных заболеваний 22,23.

Поскольку культура клеток эксперименты лишь частично воспроизвести множество факторов, действующих в естественных условиях, это представляет большой интерес для выполнения окислительно-восстановительные исследования на животных моделях 24,25. Чтобы достичь этого, данио рерио был рассмотрен подходит позвоночных животной модели для исследования динамики окислительные стресс 26. Данио это новая модель системы, которая предоставляет ряд преимуществ для изучения клеточных и генетических событий во позвоночных разработчикаelopment и болезни. Большие кластеры эмбрионов могут быть получены и доступны в неделю в течение эксперимента потребностей. Кроме того, внеочередное оптическая прозрачность из эмбрионов данио рерио, а также их небольшой размер, позволяет один визуализации клеток и динамический трекинг в целом организмов 27. В последнее десятилетие, значительное число рыбок данио мутантов были получены для моделирования человеческих патологических состояний, таких как рак и генетические заболевания 28-31. Самое главное, множество трансгенных линий был произведен, чтобы позволить широкие возможности генетических и биологических манипуляций 32. Например, трансгенные тканеспецифические данио линии регулярно используются для естественных условиях исследования в. Эти строки выражают флуоресцентный белок под контролем выбранного промоутер, предлагая возможность идентифицировать отдельные клетки в естественных условиях, а также анатомическое строение они составляют.

Несколько токсикологические исследования уже используются тон данио рерио, чтобы оценить эффект в естественных условиях на окислительно-восстановительного гомеостаза химических веществ, что свидетельствует о пригодности этой позвоночных как животной модели для области лекарственных препаратов и окислительного стресса 33-35. Хотя некоторые флуоресцентные зонды были протестированы для мониторинга окислительного стресса у рыбок данио личинки 36,37, нет никаких установленных анализы для обнаружения и измерения уровня оксидативного стресса у рыбок данио тканей и живые клетки. Здесь мы опишем процедуру количественного в естественных условиях окислительного стресса в живых клетках эмбрионов данио рерио. Обработки изображений инструменты, СУИМ сортировка, флуоресцентные зонды и про-окислительные условия все объединены для создания простого анализа для обнаружения и количественного определения окислительных видов у эмбрионов рыбок данио и тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка инструментов и рабочих растворов

  1. Приготовьте раствор рыба воды. Сделать исходного раствора путем растворения 2 г морской соли "Instant Ocean" в 50 мл дистиллированной воды. Добавить 1,5 мл фондовом рыбы водой до 1 л дистиллированной воды для приготовления готовых к использованию рыбы воду (60 мкг / мл морские соли конечная концентрация). Автоклав готов к использованию рыбы воду перед использованием. Это решение используется в качестве данио эмбриона среды.
  2. Подготовка метилцеллюлозы для эмбриона монтажа. Растворить 1,5 г метилцеллюлозы в 50 мл стерильной воды рыбы. Облегчения растворения с помощью магнита на магнитной мешалки. Полное растворение порошка может потребоваться несколько часов. Проверьте решение для ясности и Алиготе в трубочки. Хранить при -20 ° С в течение месяцев и оттаять аликвоты при использовании. Центрифуга метилцеллюлозы при 950 мкг в течение 5 мин перед использованием. Избегайте циклов замерзания-оттаивания из аликвоты.
  3. Подготовка 50 мл Tricaine / этил 3-аминобензойной кислоты мэтансульфонат соль (исходный раствор) путем растворения 200 мг Tricaine в 100 мл воды и довести рН до 7,0 с помощью трис-HCl 1 М (рН 9). Храните этот запас при 4 ° С в течение не более 30 дней. ВНИМАНИЕ: Tricaine является токсичным. Используйте в соответствии с надлежащих принципов обработки.
  4. Склонение окислительный стресс у эмбрионов данио рерио
    1. Подготовить окислителя решение для общего индукции окислительного стресса: Сделайте 50 мл раствора оксидантов, добавив Н 2 О 2 исходный раствор (перекись водорода; 100 мм) до рыбы воды. Используйте H 2 O 2 из конечной концентрации от 2 мм до 100 мкм. Подготовьте это решение незадолго до использования. Решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. Не храните это решение. ВНИМАНИЕ: H 2 O 2 опасно, и вреден при вдыхании и проглатывании. Контакт с горючим материалом может вызвать пожар. Ручка под вытяжкой и носить соответствующую челнальных защиты.
    2. Подготовить окислителя решение для индукции окислительного стресса митохондрий, полученных: Сделайте окислителя маточного раствора (5 мм) путем растворения 3,9 мг ротенона в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Держите это решение при комнатной температуре в темноте.
      1. Растворите Ротенон исходного раствора в 10 мл рыбного воды, чтобы сделать готовый к использованию решение. Использование ротенон в концентрации от 5-50 мкМ. Не используйте ротенон в концентрациях, превышающих 100 мкм. В соответствующих концентрациях, это решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. ВНИМАНИЕ: Ротенон является токсичным и опасным. Ручка в соответствии соответствующие меры предосторожности.
    3. Вызвать окислительный стресс геном нокдауна: бросовым экспрессию генов nrf2a у эмбрионов данио рерио по морфолиногруппой микроинъекции как ранее сообщал Timme-Laragy А. и др., 2012 38..
    4. Вызвать OxidAtive стресс после повреждения тканей: генерировать маржу раны в хвостовой плавник эмбрионов данио рерио в 72 часов после оплодотворения, как описано ранее Niethammer др., 2009 39..
  5. Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для одного клеток методом РОС-обнаружения:
    1. Решение для общего обнаружения ROS: Растворите общий РОС-чувствительную молекулярную зонд в HBSS (Хэнкса сбалансированный солевой раствор) в целях подготовки рабочего раствора (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм). Это решение должно быть подготовлено незадолго перед использованием.
    2. Раствор для конкретных обнаружения АФК индуцированной митохондрий: Незадолго до использования, растворить митохондриальную РОС-чувствительный зонд с ДМСО делая 5 мМ маточного раствора. Растворите исходного раствора в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прямого воздействия света и кислорода воздействия РОС-обнаружения рабочих растворов и их соответствующие растворы. Защитите трубу от света с помощьюалюминиевая фольга. Не храните и не повторное использование зондов, растворенные в HBSS. Храните растворы при -20 ° С в течение месяца.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярные зонды и ДМСО под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов.
  6. Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для метода крепления РОС-обнаружения всей: Растворите общий РОС-чувствительный датчик исходного раствора (стабилизированная в ДМСО) в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрация: 2,5-5 мкм). Избегайте свет и воздействия кислорода. Защитите трубу от света. Подготовка этого решения перед использованием. Не храните и не используйте повторно это решение. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярных зондов под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов.
  7. Сделать 25 мл стоп-раствора добавлением 10 мл фетальной бычьей сыворотки в 15 мл PBS 1X. Держите решение стерильными. Храните это решение при 4 ° С. Это решение требуется только для одной ячейки - метод обнаружения РОС.
  8. Установите данио воздуха инкубатор на 28 &# 176; С.
  9. Установка центрифуги при 4 ° С для метода ROS обнаружения одной ячейки.

2. Спаривание взрослых рыб и отбор эмбрионов рыбок данио

  1. Настройка взрослых данио пара пересекает соответствии со стандартными протоколами 40. Выберите соответствующий трансгенной линии в соответствии с конкретными экспериментальными потребностей.
  2. Собирайте яйца и поместить их в 90-мм блюдо с рыбой воды / эмбриона среды. Хранить яйца при 28 ° С до тех пор эмбрионы не будет развиваться и расти до желаемой стадии развития (например, 48 часов после оплодотворения, 72 часов после оплодотворения; HPF: часов после оплодотворения).
  3. Экран для развивающихся эмбрионах. Исключить все неоплодотворенные яйца или слаборазвитые эмбрионов.
  4. Обезболить эмбрионов путем добавления 1 мл Tricaine (исходный раствор) в 50 мл рыбного воды.
  5. Выберите эмбрионов люминесцентные ТГ под стереомикроскопом.

3. Лечение эмбрионов с окислителем Агента

  1. Используйте как минимум 30 эмбрионов между 48 чпф и 72 часов после оплодотворения в различных условиях. Вымойте эмбрионов дважды свежей рыбы воды, чтобы удалить Tricaine.
  2. Сплит люминесцентные эмбрионов в трех блюд. Положите не более 30 эмбрионов / блюдо.
  3. Извлеките промывочного раствора и добавляют 10 мл раствора окислителя или 10 мл воды рыбы, как контрольного раствора.
  4. Выдержите эмбрионов в течение 10 мин до 1 часа при 28 ° С Инкубационный период зависит от уровня окислительного стресса, индуцированного быть в определенных тканей. Короткие периоды являются лучшими как клетки, затронутые окислительного стресса постепенно пройти гибель клеток.
  5. Передача эмбрионы в новую чашку, содержащую HBSS и эмбрионов мыть, вращая. Предварительно теплой HBSS при 28 ° С

4. Всего Гора РОС Метод обнаружения

  1. Сбор эмбрионов после лечения окислителя и поставить не более 10 эмбрионов в трубочку. Промыть ССРХ как можно больше. Защитите трубу от света с помощью алюминиевой фольги.
  2. Добавьте 1 мл раствора РОС-обнаружения длякаждая трубка.
  3. Инкубируйте эмбрионов в темноте в течение 15 мин при 28 ° С для предотвращения попадания света.
  4. Во время инкубации подготовить на стеклянное скольжение для всей анализа эмбриона. Положите 300 мкл метилцеллюлозы на "депрессия" стекло и распространять его на поверхности стекла с кончика пипетки. Избегайте пузырей при освобождении метилцеллюлозы.
  5. В конце инкубационного периода, немедленно извлеките решение РОС-обнаружения и мыть дважды 2 мл HBSS. Вымойте эмбрионов путем обращения трубки несколько раз. Не пипетки или вихрь.
  6. Эмбрионы Аспирируйте до в стеклянную пипетки Пастера. Эмбрионы положении рядом открытии пипетки и осторожно извлечь их в метилцеллюлозы. Ориентируйтесь эмбрионов соответственно с тонкой линии нейлона.
  7. Сравните флуоресценцию контрольных эмбрионов с обработанных эмбрионов. С другой стороны, закрепить параметры флуоресценции стереомикроскопа или конфокальной микроскопии, так что все эмбрионы отображаемого использованием того жеНастройки визуализации.

Single Cell Метод РОС-5 обнаружения.

  1. Начните с шага: 3.5. Убедитесь в том, чтобы иметь по крайней мере 35 эмбрионов для каждого условия.
  2. Трансфер эмбрионов в новое блюдо. Удалить воде рыба как можно больше. Добавьте 10 мл ледяной PBS 1X и 400 мкл ингибиторов протеазы коктейль. Вручную dechorionate эмбрионов щипцами и удалить желток мешок с тонкой иглой. Примечание: Удаление желтка мешок обеспечивает чистые образцы для последующего анализа FACS. Этот шаг может быть предотвращено в соответствии с FACS инструмента.
  3. Передача де-yolked эмбрионов в 24-а многоямного пластины (15 эмбрионов / лунку) и удалить все рыбы воды.
  4. Добавить 300 мкл HBSS, 30 мкл коллагеназы P 50 мкл трипсина-ЭДТА в каждую лунку.
  5. Гомогенизируют эмбрионов, осторожно пипеткой вверх и вниз с плотно кончика пипетки (1000 мкл).
  6. Инкубируют при 28 ° С в течение 20 мин и гомогенизируют с помощью пипетки образцы каждые 5 мин.
  7. Проверьте ткани DISRuption наблюдая аликвоты гомогената в микроскоп соединения. Содействие суспензии отдельных клеток с помощью пипетки. Не инкубировать эмбрионов в течение более 30 мин.
  8. Остановите реакцию добавлением 200 мкл стоп-раствора. Смешайте с помощью пипетки осторожно.
  9. Передача клеточной суспензии в предварительно охлажденной трубки с жесткой нижней части. Держите трубку на льду и предотвращения попадания света.
  10. Центрифуга в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° С.
  11. Снимите верхнюю фазу и вновь приостановить клеток с ледяной ССРХ, осторожно пипеткой.
  12. Граф клеток и убедитесь, что у вас есть такое же количество клеток во всех ваших образцов. Не используйте менее 2 х 10 6 клеток.
  13. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° C.
  14. Удалить супернатант и приостановить гранул с 1 мл ледяной охлажденной ССРХ содержащих РОС-чувствительный датчик.
  15. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 3 мин в темноте. Vary время инкубации в соответствии с уровнем окислительного стресса и тон чувствительность датчика.
  16. Трансфер клетки к FACS трубы. Держите пробирки на лед и предотвращения попадания света перед анализом FACS.
  17. Сортировки клеток с флуоресцентно-активированном клеточном сортере (FACS). Набор длины волн в соответствии с Tg ткани флуоресценции (например, GFP) и спектров возбуждения / эмиссии молекулярного зонда, используемого для обнаружения ROS (например, конкретных митохондриальных АФК-чувствительных датчиков, родовых РОС-чувствительных датчиков).
  18. Для каждого условия, измерить все образцы в течение той же экспериментальной сессии, применяя те же настройки FACS. Рассчитать процент флуоресцентных клеток как среднего различных биологических повторяет. Анализ по меньшей мере два повторов для каждого состояния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Применяя метод здесь описанное, мы можем легко измерить и обнаружить окислительный стресс (и уровни ROS) в данио эмбриональных тканей. После пересечения взрослых данио, яйца собирают и позволили разработать при 28 ° С до 72 ч после оплодотворения (HPF). Для того, чтобы вызвать оксидативный стресс, мы предлагаем два различных подхода: 1) лечения эмбрионов с сильными про-окислителя реагентов или 2) содействие РОС формирования после повреждения тканей.

В рамках первого подхода, мы использовали два различных реагентов в зависимости от конкретных потребностей: перекись водорода (H 2 O 2), как универсального клеточного формирования агента ROS, и ротенон, как конкретного митохондриальной водителя ROS. Ротенон является ингибитором комплекса I части и т.д., которые дерегулирования являются причинным окислительного стресса 41.

Во втором подходе, мы индуцированной накопление АФК, создав рану в хвостовой плавник эмбрионов рыбок данио39. Кроме того, окислительные условия стресса может быть повышен в данио тканей, сбив с впрыском морфолиногруппой на Nrf2 антиоксидантной путь ответа, который является основным сотовой защита от цитотоксического действия окислительного стресса 38.

После того, как оксидативный стресс индуцируют у эмбрионов данио рерио, накопление активных форм кислорода (ROS) может быть измерена с помощью универсальных или митохондриальных конкретные РОС-чувствительные зонды, которые становятся флуоресцентный при активации (т.е. окисление).

Обработанные эмбрионы могут быть проанализированы с помощью метода крепление ROS обнаружения всю или путем применения одного метода обнаружения клеток ROS как представлено на рисунке 1. Выбор между методами зависит от необходимости выполнять качественное или количественное измерение окислительного стресса. Представитель результаты обоих методов представлены на рисунке 2 Рисунок 3.

Всего Метод Гора РОС-обнаружения

Рисунок 2 иллюстрирует применение способа в целом крепление РОС-обнаружения для в естественных изображений окислительного стресса. В частности, этот метод был применен следовать как "сильный" окислительный стресс, порожденный экзогенных про-окислителя лечения, а также "низкий" окислительного стресса, порожденного более физиологических условиях, таких как раны травм или делеции гена.

Физиологические уровни окислительных видов индуцируются генерации микро травмы или широкий рану на хвостовом плавнике живой данио эмбриона на 72 часов после оплодотворения. Было продемонстрировано, что после травмы, H 2 O 2 накапливается в рану запас 20 мин после раны 39. Для того чтобы визуализировать накопление окислительного стресса на полях раны, эмбрионы инкубировали с общимРОС-чувствительных зонд и отображаемого на 20 мин после ранения 39. При сравнении интактные хвостовое оперение с поврежденных хвостов, можно отличить накопление флуоресцентного зонда на краю раны (рис. 2а). Неспецифические слабый сигнал флуоресценции обнаружена по всему хвостовой плавник ткани в обоих условиях.

Чтобы подтвердить конкретную накопление РОС-чувствительной зонда на полях раны, Н 2 О 2 уровнях, на раны были снижены на фармакологического подхода. Поскольку было показано, что запас рана H 2 O 2 накопление чрезвычайно чувствителен к DUOX-ингибитор VAS2870 39, эмбрионы были предварительно обработаны этого ингибитора перед ранение. Сравнение флуоресценции РОС-чувствительной зонда, от VAS предварительно обработанных эмбрионов и соответствующих органов управления, указывает, что сигнал зависит от накопления АФК (т.е. H 2 O 2) (Фиг. 2В).

Кроме того, мы получили высокие уровни окислительных видов в данио тканей обработкой эмбрионов рыбок данио с ротенона. Ротенон обработанных эмбрионов и контроль инкубировали с общим РОС-чувствительной зонда специально выявления видов ROS. После этого зонд промывают, и эмбрионы были обследованы под флуоресценции-стерео микроскопом. Оксидативный стресс был обнаружен во всем теле эмбрионов (рис. 2в). Высокое увеличение изображения показывают анатомические области, где зонд успешно метаболизируется (рис. 2, г). Яркий поля изображения (верхние панели) отличить анатомические структуры, в то время как флуоресцентные изображения (нижние панели) указывают РОС-положительных клеток. Как показали флуоресцентных изображений результаты в основном качественный доклад окислительного обнаружении напряжения, что достигается путем сравнения контроль с обработанными эмбрионов.

Single Cell-РОС Метод обнаружения

Рисунок 3 отчеты представительные FACS участки и количественное определение окислительного стресса путем применения ROS метод обнаружения одной ячейки. Этот метод был адаптирован для измерения окислительные уровень стресса у рыбок данио клеток, которые подвергались усло-окислителя, отраженной в протоколе и, изображенной на рисунке легенд. Как описано, окислительный стресс был измерен путем инкубации данио ткани разложенных на отдельные клетки с РОС-чувствительной молекулярной зонда. Поскольку процедура диссоциации и сам FACS может привести к повреждению клеток, анализ образцов требует, чтобы только "живые клетки" считаются для оксидативного стресса количественного определения. Соответственно, диссоциированных клеток анализировали путем выбора фракцию клеток, показывающих "живой клетке" физические параметры (рис. 3а) и, исключая мертвые клетки (фигура 3В). Таким образом, образцы количественно дляУровни окислительный стресс в соответствии с флуоресценции РОС-чувствительного датчика и для показа эндогенный флуоресценции, такие как положительности для GFP (фиг.3С). Отрицательный контрольный образец для РОС-чувствительной зонда должны быть включены в целях оценки окислительного стресса, индуцированного обработки и технические процедуры (рис. 3C; панель: управление -). Относительная СУИМ участок количественное продемонстрировано в гистограмм, показывающих измерений различных биологических повторяет (рисунок и 3D-E).

Кроме окислительного уровня стресса количественного после водорода лечения перекиси, этот метод был применен для количественного окислительные уровень стресса в физиологических условиях таких нас в nrf2a морфантов и соответствующих органов управления (рис. 3F).

Кроме того, путем объединения метод обнаружения РОС одноклеточные с конкретными РОС-чувствительных датчиков таких нас митохондриальная ROS-чувствительных зондов, можно также измерить окислительного стресса в контексте конкретных митохондрий, ориентированных про-окислителя лечения (рис. 3G).

Рисунок 1

Рисунок 1. Схематическое фигура способа измерения уровней ROS у эмбрионов данио рерио. Данио рерио взрослых перешли в соответствующих селекционных танков. Оплодотворенных яиц затем собирают в чашки и хранили при 28 ° С, чтобы позволить эмбрион для полного развития. Индукция окислительного стресса может быть достигнуто различными способами, либо фармацевтического лечения или генетическими или физических инсультов. С другой стороны, в случае генетический мутант анализируемого, можно пропустить эту инкубации и двигаться вперед. В этот момент можно продолжить после двух различных методов. Согласно «целой мСпособ р а ф РОС-обнаружение "(слева), данио эмбрионов немедленно инкубировали с флуоресцентной РОС-чувствительного датчика (1), а затем анализировали с флуоресценции или конфокальной микроскопии (2). В методе "один клеток ROS обнаружения" (справа), данио эмбрионов диссоциируют на отдельные клетки (1), инкубировали с флуоресцентной РОС-чувствительного зонда (2) и анализировали с помощью FACS для обнаружения и количественного флуоресцентного (3). Хотя метод "вся гора-РОС обнаружения" позволяет обнаружить окислительный стресс в живых эмбрионов, прежде всего, как качественного анализа, "одноклеточного основе" метода грантов как качественных и количественных измерений окислительных уровня стресса.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результаты метода крепления РОС-обнаружения всей. A) Эмбрионы рыбок данио в 72 часов после оплодотворения были подвергнутычтобы ранив как описано Niethammer ранее соавт., 2009 39. Представительства конфокальные изображения показывают про-окислительные видов (АФК) накопление (стрелки) на краю раны раненого хвостового плавника. Окислительные видов были обнаружены с родовым ROS зонда (CellROX; 2,5 мкМ) через 20 мин после раны было сделано. Шкала бар 20 мкм. Б) Представительства конфокальные изображения, показывающие раны запас эмбрионов данио при 72 часов после оплодотворения. Эмбрионы предварительно обрабатывали VAS2870 (20 мкМ) или ДМСО в течение 90 мин до того, как рана была сделана. АФК были обнаружены с общим РОС-чувствительной зонда (CellROX; 2,5 мкм) 20 мин после ранения. Шкала бар 20 мкм. C) Все тело изображение, показывающее Ротенон-индуцированного окислительного стресса у эмбрионов данио рерио. Окислительный стресс настоятельно обнаружен в хвостовой части эмбрионов, как показано на панели D). Ротенон является мощным ингибитором митохондриальной ETC распространяется в основном SkelЭтал мышечные клетки у рыбок данио. Шкала бар, 180 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Характерные результаты отдельных клеток методом РОС-обнаружение.) Представитель СУИМ график, показывающий типичный образец эмбрионов данио диссоциирован на отдельные клетки. Живые клетки закрытого в R1 регионе в соответствии с FSC-Н и SSC-H параметров. SSC-H: 539 (напряжение), 1,0 (AmpGain), режим: линейная; FSC-H:. E00 (напряжение), 2,1 (AmpGain) B) представитель FACS график, показывающий типичный образец эмбрионов данио рерио диссоциирует на отдельные клетки. Перед анализом FACS, образец был инкубировали с пропидийиодидом (PI; 1 мкг / мл) в течение 5 мин. Мертвые клетки закрытого на R2 регионе в соответствии с П. И. флуоресценции (FL2-H канала). FSC-H: E00 (напряжение), 2,1 (AmpGain), режим: линейная, SSC-H: 539 (напряжение), 1,0 (AmpGain), режим: литийрядом. Напряжение каналы: FL-2:. 613 Вход в) представитель FACS участки, показывающие диссоциирован эмбрионов рыбок данио, подвергнутых лечению прооксидантного (H 2 O 2) и соответствующих органов управления. Эндотелиальные клетки визуализировали с помощью GFP канала. FACS участки представляют все клетки, пострадавших от окислительного стресса (ROS) на UL и UR. Отрицательные клетки нанесены на нижних квадрантах (LL и LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 эмбрионы рыбок данио в 48hpf инкубировали с H 2 O 2 (2 мм) или H 2 O в качестве контроля в течение 10 мин. Перед анализом FACS, эмбрионы обрабатывают, как описано в протоколе. Клетки, пострадавших от окислительного стресса обнаруживаются с помощью общего РОС-чувствительный флуоресцентный зонд (CellROX; 2,5 мкм). Образец не выдерживают с РОС-чувствительной зонда был включен в качестве отрицательного контроля. Сравнение образец подвергают обработке прооксидантного с соответствующим контролем, количество клеток нанесены на верхних квадрантов (UL + UR) гораздо выше. СУИМ AcquisНастройки ition были следующими: каналы Напряжение: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Вход D) Гистограмма, показывающая процент клеток (UL + UR), пострадавших от окислительного стресса в H 2 O 2-обработанные эмбрионов и соответствующие управления. Измерения связаны с образцами, показанных на C. Клетки, пострадавших от окислительного стресса обнаруживаются с помощью общего РОС-чувствительный флуоресцентный зонд (CellROX; 2,5 мкм). Результаты представляют собой среднее из п = 2 различных биологических повторяет ± SD. Е) гистограмму, показывающую процент эндотелиальных клеток (GFP +), пострадавших от окислительного стресса (РОС +) в H 2 O 2-обработанные эмбрионов и соответствующие управления. Измерения связаны с образцами, показанных на C. Результаты представляют собой среднее от N = 2 различных биологических повторяет ± SD. F) гистограмму, показывающую процент клеток, пострадавших от окислительного стресса (РОС +) в nrf2a морфантов (nrf2a МО) и соответствующих органов управления(Ctrl МО) при 24 часов после оплодотворения. Результаты представляют собой среднее из п = 2 различных биологических повторяет ± SD G) гистограмму, показывающую процент клеток, пострадавших от митохондриальной окислительного стресса в обработанных эмбрионов (Ротенон;. 10 мкм) и соответствующие элементы управления (Ctrl; ДМСО) при 72 часов после оплодотворения. После диссоциации эмбрионов на отдельные клетки, митохондриальный окислительный стресс (митохондриальный ROS +) измеряли с помощью митохондриального специфического зонда (MitoSOX, 5 мкМ). Результаты представляют собой среднее из п = 3 различных биологических повторяет ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги

Порядок окислительного обнаружении напряжения у эмбрионов рыбок данио, описанных здесь, включает в себя два различных метода. Весь метод крепления РОС-обнаружения в основном качественный анализ для РОС-обнаружения, а метод РОС-обнаружение одной клетки позволяет более конкретные количественные измерения (рис. 1). Оба метода предлагают быстрый и простой способ для оценки в естественных условиях Рос-обнаружение на эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, они оба представляют некоторые важные шаги.

Критические шаги, относящиеся к методу I

Первый метод для всей горе РОС-обнаружения имеет большое преимущество, чтобы легко обнаружить окислительный стресс во всех тканях живых эмбрионов (рис. 2). Однако есть три важных критические аспекты, которые необходимо учитывать, и может повлиять на исход анализа: 1) проницаемость зонда для эмбриона тканей, 2) токсичность зонд и 3)-йэ чувствительность датчика к низкой концентрации АФК.

Первый аспект, непосредственно относящиеся к естественных условиях применения в метода 42. "Клеток-проницаемость" собственностью РОС-чувствительной зонда является существенным признаком для достижения этого анализа. В идеале, все водорастворимые химические вещества являются оптимальными для поставки в живых эмбрионов данио рерио; Однако большинство реагентов для окислительного обнаружения напряжения нерастворимы в воде. Таким образом, как правило, рекомендуется использовать зонды, которые растворимы в ДМСО (диметилсульфоксид).

Есть возможных токсических эффектов на эмбрионах, связанных с концентрацией зонда ROS. Побочные эффекты, как правило, представлена ​​повреждения тканей (т.е. некроза) или ускоренного метаболизма зонда. Длинные инкубации (дней) из эмбрионов данио рерио с hydroethidine зонд вызывают эмбриональной гибели в то время как высокие дозы 5 - (и-6)-карбокси-2 ,7-диацетат дихлорфлуоресцеина результаты в пна конкретных накопление флуоресценции в кишечнике (неопубликованные данные). Чтобы преодолеть эту проблему, важно контролировать эмбрионов при инкубации с зондом. Испытания нескольких концентраций и времени инкубации с тем же зондом было бы полезно также. Оптимальное время инкубации позволяет доставка и окисление молекулярного зонда без поверхностного повреждения тканей. Время инкубации с использованием химических зондов (0,5-10 мкм) может быть обычно закреплены в диапазоне 10-30 мин и не должно превышать 1 часа. Это условие может быть довольно сложно настроить особенно когда количество окислительного видов близка к физиологических уровней, или когда она ограничена внутренними эмбриональных тканей. В самом деле, когда весь организм инкубируют с РОС-обнаружения химического зонда, самые поверхностные ткани (т.е. кожа, глаза, и сердце) находятся там, где зонд основном окисляется и становится люминесцентные. Позже, зонд постепенно доставлен внутренних органов, печень или веssels. Как следствие, подходящее время для инкубации эмбрионов данио рерио с РОС-детектирования датчика является критическим для обнаружения окислительного стресса во всех тканях.

Наконец, при использовании этого метода важно рассмотреть чувствительность в до уровня окислительного стресса, выраженного тканей. Большинство коммерчески доступных зондов не точно охарактеризовать их чувствительности, а это означает, что оптимальный зонд для конкретных приложений должны быть определены эмпирически. Все РОС-чувствительные датчики обычно обнаружить высокие уровни окислительного стресса, но большинство из них не чувствительны к минимальным сдвигов окислительных уровней напряжения 43.

Для того чтобы ограничить этот недостаток и позволит более подробный и точный анализ предлагается применять второй метод, основанный на обнаружении отдельных клеток окислительного стресса.

Критические шаги, относящиеся к методу II

СИнгл-клеток метод РОС-обнаружение представляет некоторые важные шаги. Они в основном определяется: 1) Эффективность эмбрионального диссоциации клеток и на 2) типа РОС-чувствительной зонда, связанного с анализом.

Диссоциация эмбрионов на отдельные клетки была заимствована из предыдущих протоколов для рыбок данио анализа клеток с помощью проточной цитометрии 44 и представляет две критические аспекты, которые сильно повлиять на исход всей процедуры. Первый аспект касается метода, используемого для диссоциации эмбрионов, а второй связан с восстановлением диссоциированных клеток.

Диссоциации эмбрионов на отдельные клетки в основном под контролем концентрации диссоциации реагентов (т.е. P коллагеназы и трипсина). Тем не менее, следует учитывать, что эффективность ткани диссоциации зависит от количества зародышей и их инкубировали стадии развития. Эмбрионы рыбок данио на ранних стадиях развития (24 HPF-48 после оплодотворения) более чувствительны к диссоциации реагентов, чем личинок (96 HPF-120 HPF) из-за прогрессивных тканей роста 45. Таким образом, коррективы в процедуры диссоциации требуется при работе с данио эмбрионов на разных стадиях развития, чем 72 часов после оплодотворения. Чрезмерное инкубация с реагентами вызывает гибель клеток, в то время как снижение концентрации реагентов лишь частично диссоциирует эмбрионов. Как важно правильно разбивку тканей, не менее важно, чтобы собрать и сохранить отдельные клетки. Важным моментом является температура, при которой клетки извлекают после разделения ткани. Важно поддерживать клетки на льду или при 4 ° С во время центрифугирования, чтобы ограничить окислительный стресс вторичной по отношению к механическое разрушение тканей или процедур обработки.

Второй важный шаг в отношении соответствующего зонда связан с анализом на определенной интересующей ткани. Самый простой способ для обнаружения мобильного ПопольAtion у рыбок данио предлагает широкий спектр трансгенных линий, которые были созданы в последние десятилетия 46,47. Однако флуоресценция выбранного трансгенной линии должны быть совместимы с РОС-детектирования датчика. Очень важно, чтобы избежать перекрестных помех между фоновым ткани флуоресценции и низкий, но конкретного, флуоресценции сигнала, излучаемого зонда.

Применение настоящего Протокола

Учитывая оба метода предлагают простой и экономически эффективный анализ для измерения окислительного стресса в естественных условиях, можно применять этот протокол для нескольких условий:

Измерения окислительного стресса в различных генетических (например, патологических) Условия

Окислитель и антиоксидантные гены могут быть легко модулируется у эмбрионов данио рерио путем инъекции Morpholinos (с потерей функции) или мРНК (усиления из-функции). Недавно сообщалось эксперименты генной нокдаун и microinпроекция ограничен мРНК у эмбрионов данио рерио установили различные роли для антиоксидантных Nrf2a и Nrf2b генов в защите клеток от окислительного стресса в процессе разработки. Подходы экспрессии генов модуляции оценивается эволюционный консервативный ось между млекопитающих и рыбок данио, чтобы ответ гипоксии и окислительного стресса в нервных клетках 38,48. Кроме того, это прекрасная возможность для изучения окислительного стресса предлагают несколько рыбок данио мутантных линий. Например, данио ducttrip (DTP) мутант представляет собой интересный пример для характеризации окислительного стресса по отношению к патологическим состоянием. DTP мутант несет дефицит для S-аденозилгомоцистеин гидролазы (ahcy) гена и его характеристика показали, что потеря Ahcy деятельности вызывает дегенерацию печени, влияя на уровни ROS 49. Это равносильно тому, данио мутант Nrf2 fh318, неся потери от-устойчивую работун мутация транскрипции гена Nrf2 фактора, стала рассматриваться с большим интересом изучить защитную роль этого антиоксиданта гена в низших позвоночных 50.

Измерения окислительно-восстановительное состояние вызвано фармацевтических соединений

Лечение эмбрионов рыбок данио с маленькими препаратов могут ингибировать или активировать окислительный стресс. Мы недавно показывают, что лечение статинами эмбрионов данио рерио индуцированного окислительного стресса, которые могут быть извлечены с помощью CoQ10 лечения 51. С другой стороны, анализ окислительного стресса в данио животной модели для человека RYR1 связанных миопатиях подчеркнул роль антиоксидантной НАК наркотиков (N-ацетил цистеин) в качестве потенциального терапевтического подхода для мышц болезни 52.

Крупномасштабная Скрининг малых молекул и наркотикам, чтобы охарактеризовать их окислительного Свойства

Данио является устоявшихся животных модэль для крупного химического скрининга. Недавнее химического скрининга малых молекул, выполненных в данио определенных антиоксидантов в качестве модуляторов выживание допаминергических нейронов, который сильно влияет на млекопитающих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона 53. Этот метод может быть использован для скрининга новых молекул про-или анти-окислителя в естественных условиях.

Значение и ограничения

Известность как "вся гора» и «одноклеточных» методов РОС-обнаружения зависит от способности выполнять в измерениях естественных условиях окислительного стресса с помощью простых лабораторных методов и основное оборудование. Применение данио в качестве животной модели в сочетании с РОС-детектирующих датчиков позволяет не только лишь раскрытие окислительного стресса, но и его обнаружение в контексте живого организма и количественного на уровне отдельных тканей. Важно, что эти анализы могут бытьосуществляется с коммерчески доступных инструментов и не требуют специальных знаний, чтобы быть реализована. Кроме того, оба метода не отнимает много времени процедуры и могут быть применены с соответствующей времени больших объемов образцов. Все вместе эти практические преимущества делают эти методы особое значение для улучшения окислительного анализ напряжения в естественных условиях.

Однако эти анализы показывают также некоторые ограничения. В целом, большинство РОС-чувствительные датчики теперь имеющиеся в продаже не ценится за тонкой качественного и количественного анализа окислительных уровня стресса в живых клетках. Обычно используется hydroethidine и MitoSOX зонды были сконструированы для зондирования супероксида (O 2 -.), Но в последнее время беспокойство по поводу их специфичности были подняты, особенно при использовании флуоресценции на основе анализов 54. Аналогично в некоторых докладах расширенный сомнения в дихлорфлуоресцеина диацетатом (DCFH-DA) для эксклюзивного H 2 2 чувствуя 55,56. Кроме того, эти окислительно-восстановительной активностью флуоресцентные зонды характеризуются частичной неспецифической активации (т.е. ткань авто-флуоресценции) и не обратимым после окисления. После того, как флуоресцентный зонд окисляется АФК она не может вернуться к своей нефлуоресцентного восстановленном состоянии. Следовательно, обнаружение АФК флуктуации с временным разрешением ограничена применения таких химических зондов 43.

Значительное ограничение этой области представлено отсутствием зондов для обнаружения исключительной RNS. Недавно протеомные основе методологии показали, что RNS вызвать белковые изменения, которые рассматриваются как биомаркеров нитрозо-активных стресса и могут быть оценены с помощью иммуноблоттинга анализов с помощью специфических антител к окислению белка / нитрования (например, анти-SNO-цистеин, анти-3- нитротирозина) 22,23. Тем не менее, все эти анализы только косвенные измерения окислительного Streсс вызвано RNS и в большинстве случаев они требуют клеточные экстракты, а это означает, что они не применимы к живых клеток или живых эмбрионов данио.

Реальной альтернативой обычных зондов представлена ​​генетически кодируемых окислительно-восстановительных чувствительных флуоресцентных белков. Основными составляющими этой группы являются: roGFP, полученный из зеленых флуоресцентных белков, rxYFP и cpYFP, ​​как происходит от желтого флуоресцентного белка и зондом гипер, определенной Н 2 О 2 люминесцентный зонд 57. Все эти инженерных окислительно-восстановительных зондов, созданных флуоресцирующих белков позволяет основанным на флуоресценции логометрических количественными и возможности более высокой временное разрешение (от нескольких секунд до нескольких минут), чем химических датчиков 58. В естественных условиях применение этих биосенсоров также возможно, как показано на данио трансгенной линии, экспрессирующей Hyper в режиме реального времени зондирования эндогенного H 2 O 2 уровнях 39,59. Яmplementing данио с генетически кодируемых сенсоров предлагает оптимальную систему для расследования окислительный стресс, но требует создания трансгенной линии животных и соответствующие инструменты визуализации. Процедура окислительного обнаружения напряжений в данио рерио представлены здесь является менее точным, чем генетических методов, но быстро и обеспечивает первичный анализ для обнаружения в естественных условиях высоких уровней про-окислительных видов. Точное измерение индивидуального химически активного кислорода и / или азотных в настоящее время является пределом этой области исследований. В будущем, ближайшие наноразмерных окислительно-восстановительные-датчики могут помочь решить эту проблему. Успешное применение редокс-датчиков наночастицы и нанотрубки на основе была испытана в нескольких исследованиях в пробирке, но не доступен как в естественных условиях анализов до сих пор 60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Биология развития выпуск 89, Эмбрионы рыбок данио эндотелиальные клетки состояние окислительно-восстановительный анализ обнаружение окислительный стресс, FACS (флуоресценция активируется клеточный сортер) молекулярные зонды
Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter