Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) قد يسبب تغييرا في دولة الأكسدة الخلوية نحو حالة الاكسدة. يسبب هذا الوضع أكسدة الجزيئات (الدهون والحمض النووي، والبروتين)، ويؤدي إلى موت الخلية. الاكسدة كما يؤثر على تطور العديد من الحالات المرضية مثل مرض السكري، retinopathies، تنكس عصبي، والسرطان. وبالتالي، فمن المهم تحديد الأدوات اللازمة لتحقيق ظروف الإجهاد التأكسدي ليس فقط على مستوى الخلايا واحد ولكن أيضا في سياق الكائنات كلها. هنا، ونحن نعتبر الجنين الزرد باعتبارها مفيدة في نظام الجسم الحي لأداء مثل هذه الدراسات وتقديم بروتوكول لقياس الإجهاد التأكسدي في الجسم الحي. الاستفادة من الفلورسنت تحقيقات ROS وخطوط الفلورسنت المعدلة وراثيا الزرد، ونحن نطور طريقتين مختلفتين لقياس الاكسدة في الجسم الحي: ط) و"الجنين كله طريقة ROS-كشف" لقياس النوعية من الاكسدة والثاني) ل"وحيدة الخلية ROS طريقة الكشف "عن القياسات الكمية من الاكسدة. هنا، علينا أن نظهر مدى فعالية هذه الإجراءات عن طريق زيادة الاكسدة في الأنسجة من قبل وكلاء أكسدة والأساليب الفسيولوجية أو وراثية. هذا البروتوكول هو قابلة للشاشات الوراثية إلى الأمام، وسوف تساعدك العلاقات عنوان السبب والنتيجة من ROS في النماذج الحيوانية من الأمراض المرتبطة الاكسدة مثل الاضطرابات العصبية والسرطان.

Introduction

يتم تعريف الاكسدة تحديدا كشرط التي تنتج من الأكسدة الخلوية دولة غير متوازن. في تفاعلات الأكسدة والاختزال التي تحدث بشكل روتيني معقدة داخل الخلايا تحديد للدولة الأكسدة الخلوية. تتكون تفاعلات الأكسدة والاختزال لجميع التفاعلات الكيميائية التي تتكون في نقل الإلكترونات بين الذرات من الجزيئات البيولوجية المنتجة والحد من أكسدة الجزيئات (أي تفاعلات الأكسدة والاختزال). وحفزت هذه التفاعلات حسب الأنواع تفعيلها إلكترونيا (أي الأنواع الموالية للأكسدة)، والتي تتميز عدم الاستقرار الهيكلي المدقع وتفعيل عفوية من الإلكترونات غير متوازن التي تتبادل مع الجزيئات الحيوية المجاورة. ردود الفعل هذه غير منتظمة يؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتين كرسلة، وأكسدة الدهون، ويؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا 1. وقد ارتبطت زيادة مستويات الاكسدة مع الشيخوخة والتقدم من مختلف الحالات المرضية 2. الاكسدة لهاتم الإبلاغ عن أن تكون مسؤولة عن التعديلات الأوعية الدموية في مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية 3،4. إنها تلعب أيضا دورا حاسما في تنكس الخلايا العصبية في مرض الزهايمر ومرض باركنسون 5. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت الاكسدة باعتبارها عاملا حاسما في تطور سرطان تنظم والأحداث النقيلي 6،7. بالإضافة إلى ذلك، قد الالتهاب والاستجابات المناعية انتزاع والإجهاد التأكسدي 8 مزيد من الدعم.

في الخلايا الحية، وتستمد الأنواع الموالية للأكسدة من الأكسجين (ROS؛ أنواع الاكسجين التفاعلية) أو النيتروجين (RNS؛ الأنواع النيتروجين التفاعلي). ROS تشمل شق الهيدروكسيل، وأنيون الفائق (OH) (O 2 -)، وبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). وRNS الأساسي هو أكسيد النيتروز (NO). يمكن إنشاء سلسلة من الأنواع رد الفعل الثانوي بحلول التفاعلات عفوية بين:ن ROS وRNS أو المعادن الحرة أيونات 9. على سبيل المثال، وأنيون الفائق يتفاعل مع أكسيد النيتروز لتشكيل peroxynitrate (ONOO -)، في حين H 2 O 2 التفاعل مع الحديد 2 + يولد جذور الهيدروكسيل. ، وذلك بسبب قدرتها على التفاعل مع العديد من الجزيئات الحيوية، تعتبر ROS وRNS تهديدا خطيرا للحفاظ على الدولة الأكسدة الفسيولوجية 10. للحفاظ مجهزة الخلايا الدولة الأكسدة مع سلسلة من الجزيئات إزالة السموم المضادة للأكسدة والانزيمات. وديسموتاز الفائق (الاحمق)، كتالاز، الجلوتاثيون البيروكسيداز وPeroxiredoxins تشكل أساسا مضادة للأكسدة الأنزيمية-الترسانة الخلوية التي توفر الحماية من الأنواع الموالية للأكسدة بما في ذلك H 2 O 2، OH وOONO - 11. أيضا الجزيئات المضادة للأكسدة مثل فيتامين C و E، البوليفينول وCoenzymeQ10 (CoQ10) هي ذات أهمية حاسمة لإرواء ROS وخطيرة رفع أسمائهمrivatives 12،13. ومع ذلك، والإنتاج المفرط للROS وRNS، أو اختلال وظيفي في النظام المضاد للأكسدة، وينقل للدولة الأكسدة الخلوية نحو 14 الاكسدة.

إلى جانب دلالة سلبية، ويمكن ROS تلعب مختلف الأدوار الفسيولوجية في خلايا المنشأ مختلفة. الخلايا تنتج عادة ROS كما يشير الجزيئات البيولوجية للتوسط الأحداث العادية مثل دفاع المضيف وإصلاح الجرح 15-17. ويتم إنتاج أنواع رد الفعل عادة في الخلايا عن طريق الانزيمات داخل الخلايا مثل أكاسيد النيتروجين (NADPH أوكسيديز) وXO (Xantine أوكسيديز) استجابة لعوامل إشارة، عوامل النمو، وتقلبات داخل الخلايا لمستويات الكالسيوم 18،19. وقد أفيد أن ROS قد تعدل تفاضلي النشاط من العوامل النووية الهامة مثل البروتين p53 أو المكونات الخلوية مثل ATM-كيناز، وهو المنظم الرئيسي للاستجابة لأضرار الحمض النووي 20. بالقياس ROS تؤثر بشدة الإشارات الخلوية عن طريق التوسط عشره الأكسدة وتثبيط البروتين phosphatases التيروزين (PTPs)، التي أنشئت كما المنظمين الحرجة من نقل الإشارة 21. وعلاوة على ذلك، ومنهجيات البروتين على أساس إثبات أن RNS مسؤولة أيضا عن التعديلات والتغييرات بروتين معين من الإشارات الجزيئية. RNS تتفاعل مع مجموعات ثيول السيستين تعديلها إلى S-nitrothiols (SNO) واثار المسارات الجزيئية يصاحب ذلك مع الحالات المرضية مثل أمراض المناعة الذاتية والتهابات 22،23.

منذ تجارب زراعة الخلايا تتكاثر إلا جزئيا في العديد من العوامل التي تعمل في الجسم الحي، هو ذات أهمية كبيرة لإجراء دراسات الأكسدة في النماذج الحيوانية 24،25. لتحقيق هذا، وقد اعتبر الزرد نموذج حيواني الفقاريات مناسبة لدراسة ديناميات الاكسدة 26. الزرد هو نظام النموذج الجديد الذي يمنح العديد من المزايا لدراسة الأحداث الخلوية والجينية خلال الفقاريات ديفelopment والمرض. يمكن أن تتولد مجموعات كبيرة من الأجنة والمتاحة لتلبية الاحتياجات الأسبوعية التجريبية. وعلاوة على ذلك وضوح بصرية غير عادية من الأجنة الزرد، وكذلك صغر حجمها، وتمكن التصوير خلية واحدة وتتبع دينامية في الكائنات كلها 27. في العقد الماضي، تم إنشاء عدد كبير من المسوخ الزرد لنموذج الإنسان الحالات المرضية مثل السرطان والأمراض الوراثية 28-31. الأهم من ذلك، وقد تم إنتاج العديد من خطوط المعدلة وراثيا للسماح فرص واسعة من التلاعب الجيني والبيولوجي 32. على سبيل المثال، تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا الأنسجة محددة بانتظام لفي الدراسات المجراة. هذه السطور التعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة المروج المحدد، توفر القدرة على تحديد الخلايا واحد في الجسم الحي، فضلا عن التركيب التشريحي أنهم يشكلون.

وقد استخدمت العديد من الدراسات السمية بالفعل رانه الزرد لتقييم تأثير المواد الكيميائية في الجسم الحي من على التوازن الأكسدة، مما يشير إلى مدى ملاءمة هذا الفقاريات بمثابة نموذج حيواني لمجال اكتشاف الأدوية والاكسدة 33-35. على الرغم من أن قد تم اختبارها بعض تحقيقات الفلورسنت لرصد الاكسدة في اليرقات الزرد 36،37، لا توجد فحوصات أنشئت لكشف وقياس مستويات الاجهاد التأكسدي في الأنسجة والخلايا الحية الزرد. نحن هنا وصف الإجراء لفي الجسم الحي الكمي الاكسدة في الخلايا من الأجنة الزرد الحية. أدوات التصوير، FACS الفرز، تحقيقات الفلورسنت والظروف المؤيدة للأكسدة يتم الجمع بين جميع لتوليد مقايسة بسيطة للكشف وتقدير من الأنواع المؤكسدة في الأجنة والأنسجة الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد أدوات وحلول العامل

  1. إعداد الحل أسماك المياه. جعل حل الأسهم عن طريق إذابة 2 غرام من أملاح البحر "المحيط الفوري" في 50 مل من الماء المقطر. إضافة 1.5 مل من الماء الأسماك الأسهم إلى 1 L الماء المقطر لإعداد جاهزة للاستخدام أسماك المياه (60 ميكروغرام / مل تركيز أملاح البحر النهائي). الأوتوكلاف جاهزة للاستخدام أسماك المياه قبل الاستخدام. يستخدم هذا الحل كما الزرد المتوسطة الجنين.
  2. إعداد لميثيل الجنين في تصاعد مستمر. حل 1.5 غرام من ميثيل في 50 مل من الماء الأسماك العقيمة. تسهيل حل باستخدام المغناطيس على طبق من ضجة. قد تتطلب حل كاملة من مسحوق عدة ساعات. تحقق من الحل بالنسبة الوضوح وقسامة في أنابيب صغيرة. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر وذوبان الجليد من aliquots في الاستخدام. أجهزة الطرد المركزي في 950 x ج ميثيل في لمدة 5 دقائق قبل استخدام. تجنب تجميد أذاب دورات من مأخوذة.
  3. إعداد 50 مل من تريكين / إيثيل 3 أمينوبنزوات مالملح ethanesulphonate (محلول المخزون) عن طريق إذابة 200 ملغ من تريكين في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام تريس، حمض الهيدروكلوريك 1 M (الرقم الهيدروجيني 9). تخزين هذا السهم عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 يوما. تنبيه: تريكين سامة. استخدام فقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة.
  4. حمل الاكسدة في الأجنة الزرد
    1. إعداد الحل أكسدة لعام الحث الاكسدة: جعل 50 مل من محلول أكسدة بإضافة H 2 O 2 حل الأسهم (بيروكسيد الهيدروجين؛ 100 ملم) لأسماك المياه. استخدام H 2 O 2 من تركيز النهائي بين 2 مم و 100 ميكرومتر. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة. الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. لا تقم بتخزين هذا الحل. تنبيه: H 2 O 2 أمر خطير، وضار عن طريق الإستنشاق وإن بلع. اتصال مع المواد القابلة للاحتراق قد يسبب الحريق. التعامل تحت غطاء الدخان وارتداء بيرس المناسبةمعدات الوقاية اونال.
    2. يعد حل للأكسدة المستمدة من الميتوكوندريا الاكسدة الاستقراء: جعل حل الأسهم أكسدة (5 ملم) عن طريق إذابة 3.9 ملغ من روتينون في 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). إبقاء هذا الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      1. حل روتينون محلول المخزون إلى 10 مل من الماء الأسماك لجعل جاهزة للاستخدام الحل. استخدام روتينون بتركيز بين 5-50 ميكرومتر. لا تستخدم روتينون بتركيزات أعلى من 100 ميكرومتر. بتركيزات مناسبة، وهذا الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. تنبيه: روتنون سامة وخطرة. التعامل مع البيانات التحذيرية وفقا المناسبة.
    3. حمل الاكسدة عن طريق الجينات تدق إلى أسفل: تدق إلى أسفل nrf2a التعبير الجيني في الأجنة الزرد بواسطة morpholino حقن مكروي كما ذكرت سابقا من قبل Timme-Laragy A. وآخرون، 2012 38.
    4. حمل OXIDاطر النسبية الإجهاد بعد تلف الأنسجة: توليد هامش الجرح في زعنفة الذيل من الأجنة الزرد في 72 HPF كما هو موضح سابقا من قبل Niethammer وآخرون، 2009 39.
  5. إعداد 5 مل من محلول ROS-الكشف عن خلية واحدة طريقة ROS-الكشف:
    1. الحل لعام كشف ROS: ذوب التحقيق الجزيئية ROS-الحساسة عامة في HBSS (محلول الملح المتوازن هانكس و) من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر). يجب أن يكون مستعدا هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة.
    2. الحل للكشف محددة ROS الناجمة عن الميتوكوندريا: قبل الاستخدام بفترة وجيزة، حل مسبار ROS-الحساسة الميتوكوندريا مع DMSO صنع محلول المخزون 5 ملم. حل حل الأسهم في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (مجموعة تركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر).
      ملاحظة: تجنب الضوء والأكسجين تعرض حلول العمل ROS-كشف والحلول الأوراق المالية الخاصة بكل منها. حماية أنبوب من الضوء باستخدامورقائق الألومنيوم. لا تخزن أو تحقيقات إعادة استخدام الذائبة في HBSS. تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة شهر.
      تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية وDMSO تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة.
  6. إعداد 5 مل من محلول ROS-كشف لكامل طريقة جبل ROS-الكشف: ذوبي عام ROS-الحساسة محلول المخزون التحقيق (استقرت في DMSO) في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2.5-5 ميكرومتر). تجنب الضوء والتعرض للاكسجين. حماية أنبوب من الضوء. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام. لا تخزن أو إعادة استخدام هذا الحل. تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة.
  7. جعل 25 مل من وقف الحل بإضافة 10 مل من مصل بقري جنيني إلى 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحفاظ على محلول معقم. تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية. مطلوب هذا الحل الوحيد لخلية واحدة - ROS طريقة الكشف.
  8. تعيين حاضنة الهواء الزرد في 28 و# 176؛ C.
  9. تعيين أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لخلية واحدة طريقة ROS-الكشف.

2. التزاوج من أسماك الكبار واختيار الأجنة الزرد

  1. يعبر انشاء الكبار الزوج الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية 40. حدد الخط المعدلة وراثيا المناسبة وفقا للاحتياجات المحددة التجريبية.
  2. جمع البيض ووضعها في طبق 90 ملم مع أسماك المياه / الجنين المتوسط. الحفاظ على البيض عند 28 درجة مئوية حتى الأجنة وسوف تتطور وتنمو إلى مرحلة المرجوة التنموية (على سبيل المثال، 48 HPF، 72 HPF؛ HPF: التسميد آخر ساعة).
  3. شاشة لتطوير الأجنة. استبعاد كل بويضة غير مخصبة أو الأجنة المتخلفة.
  4. تخدير الأجنة عن طريق إضافة 1 مل من تريكين (محلول المخزون) في 50 مل من الماء الأسماك.
  5. حدد تيراغرام الأجنة الفلورسنت تحت stereomicroscope.

3. معالجة الأجنة مع مؤكسد عامل

  1. استخدام لا يقل عن 30 الأجنة بين 48 ساعةالجبهة الوطنية و72 HPF في حالة مختلفة. غسل الأجنة مرتين مع المياه العذبة الأسماك من أجل إزالة تريكين.
  2. تقسيم الأجنة الفلورسنت إلى ثلاثة أطباق. وضع ما لا يزيد عن 30 الأجنة / الطبق.
  3. إزالة حل الغسيل وإضافة 10 مل من محلول أكسدة أو 10 مل من الماء الأسماك كحل السيطرة.
  4. احتضان الأجنة لمدة 10 دقيقة إلى 1 ساعة عند 28 درجة مئوية. فترة الحضانة يعتمد من مستوى الإجهاد التأكسدي للأن يتسبب في أنسجة معينة. فترات قصيرة هي أفضل ما تتأثر الخلايا الاكسدة الخضوع تدريجيا موت الخلية.
  5. نقل الأجنة في طبق جديدة تحتوي على HBSS والأجنة يغسل يحوم. HBSS قبل دافئ عند 28 درجة مئوية.

4. الجامع جبل ROS طريقة الكشف

  1. جمع الأجنة بعد العلاج أكسدة ووضع ما لا يزيد عن 10 الأجنة في أنبوب صغير. شطف مع HBSS قدر الإمكان. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  2. إضافة 1 مل من محلول ROS-الكشف عنكل أنبوب.
  3. احتضان الأجنة في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية لتجنب التعرض للضوء.
  4. خلال فترة حضانة إعداد شريحة زجاجية لتحليل الجنين كله. وضع 300 ميكرولتر من ميثيل على "الاكتئاب" شريحة زجاجية وانتشاره على سطح الزجاج مع تلميح ماصة. تجنب فقاعات في حين الافراج عن ميثيل.
  5. في نهاية فترة حضانة، وإزالة فورا الحل ROS-كشف ويغسل مرتين مع 2 مل من HBSS. غسل الأجنة عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. لا ماصة أو الدوامة.
  6. الأجنة نضح يصل الى ماصة باستير الزجاج. الأجنة موقف قرب افتتاح ماصة بلطف وإخراج لهم في ميثيل. توجيه الأجنة بشكل مناسب مع خط النايلون غرامة.
  7. مقارنة مضان الأجنة التحكم مع الأجنة المعالجة. بدلا من ذلك، وتحديد معالم stereomicroscope مضان أو متحد البؤر المجهر بحيث يتم تصوير جميع الأجنة باستخدام نفسإعدادات التصوير.

5. وحيد الخلية الطريقة ROS-الكشف

  1. نبدأ من الخطوة: 3.5. تأكد من أن يكون لا يقل عن 35 الأجنة لكل حالة.
  2. نقل الأجنة في طبق جديد. إزالة أسماك المياه قدر الإمكان. إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS 1X و 400 ميكرولتر من مثبطات البروتياز كوكتيل. dechorionate يدويا الأجنة مع ملقط وإزالة كيس الصفار مع إبرة رفيعة. ملاحظة: إزالة صفار كيس يضمن عينات نظيفة لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية التالية. ويمكن تجنب هذه الخطوة وفقا لنظام مراقبة الأصول الميدانية الصك.
  3. نقل-yolked دي الأجنة في 24 لوحة جيدا multiwell (15 / الأجنة أيضا)، وإزالة جميع المياه الأسماك.
  4. إضافة 300 ميكرولتر من HBSS، 30 ميكرولتر كولاجيناز P، 50 ميكرولتر التربسين EDTA-في كل بئر.
  5. التجانس الأجنة بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا مع طرف ماصة ضيق (1،000 ميكرولتر).
  6. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والتجانس العينات بواسطة pipetting كل 5 دقائق.
  7. تحقق disr الأنسجةuption من خلال مراقبة قسامة من جناسة في المجهر المركب. تسهيل تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting. لا احتضان الأجنة لأكثر من 30 دقيقة.
  8. وقف رد الفعل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من وقف الحل. مزيج من قبل pipetting بلطف.
  9. نقل تعليق الخلية في أنبوب قبل المبردة مع أسفل ضيقة. الحفاظ على أنبوب على الجليد وتجنب التعرض للضوء.
  10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية.
  11. إزالة المرحلة العليا واعادة تعليق الخلايا مع الجليد الباردة HBSS بواسطة pipetting بلطف.
  12. عد الخلايا وتأكد أن لديك نفس العدد من الخلايا في كل من العينات الخاصة بك. لا تستخدم أقل من 2 × 10 6 خلايا.
  13. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية.
  14. إزالة طاف ووقف بيليه مع 1 مل من الجليد برود HBSS تحتوي التحقيق ROS-حساسة.
  15. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق في الظلام. تختلف فترة حضانة وفقا لمستوى الاكسدة ولرانه حساسية من التحقيق.
  16. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS. إبقاء الأنابيب على الجليد وتجنب التعرض للضوء قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  17. فرز الخلايا مع خلية فارز مضان تنشيط (نظام مراقبة الأصول الميدانية). مجموعة موجات وفقا تيراغرام مضان الأنسجة (على سبيل المثال، GFP) وأطياف الإثارة / الانبعاثات من التحقيق الجزيئية المستخدمة للكشف عن ROS (على سبيل المثال، تحقيقات محددة ROS-الحساسة الميتوكوندريا، تحقيقات عامة ROS-الحساسة).
  18. لكل حالة، وقياس جميع العينات ضمن نفس الدورة التجريبية خلال تطبيق إعدادات نظام مراقبة الأصول الميدانية نفسها. حساب النسبة المئوية للخلايا الفلورسنت مثل متوسط ​​مكررات البيولوجية المختلفة. تحليل اثنين على الأقل مكررات لكل حالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من خلال تطبيق الأسلوب هنا وصفها، ويمكن قياس بسهولة وكشف الاكسدة (ومستويات ROS) في الأنسجة الجنينية الزرد. بعد عبور الزرد الكبار، يتم جمع البيض ويسمح لتطوير عند 28 درجة مئوية إلى 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). من أجل حمل الاكسدة، نقترح نهجين مختلفين: 1) معالجة الأجنة مع الكواشف قوية مؤيدة للأكسدة أو 2) تشجيع تشكيل ROS بعد إصابة الأنسجة.

في النهج الأول، قمنا بتوظيف اثنين من الكواشف مختلفة وفقا للاحتياجات المحددة: بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2)، حيث أن عام الخلوية وكيل ROS تشكيل، وروتينون، والسائق محددة ROS الميتوكوندريا. روتنون هو المانع من أنا معقدة من غيرها، والتي هي المسبب deregulations الاكسدة 41.

في النهج الثاني، ونحن يسببها تراكم ROS من خلال خلق الجرح في زعنفة الذيل من جنين الزرد39. بدلا من ذلك، يمكن تعزيز ظروف الاكسدة في الأنسجة الزرد بواسطة هدمت مع حقن morpholino في Nrf2 المسار استجابة للأكسدة التي هي الدفاع الخلوية الأولية من الآثار السامة للخلايا الاكسدة 38.

بمجرد يسببها الإجهاد التأكسدي في الأجنة الزرد، وتراكم أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) يمكن قياسها باستخدام تحقيقات ROS-حساسة معينة عامة أو الميتوكوندريا، والتي أصبحت الفلورسنت على تفعيل (أي أكسدة).

ويمكن تحليل الأجنة المعالجة باستخدام طريقة كله جبل ROS-كشف أو من خلال تطبيق واحد خلية ROS طريقة الكشف على النحو الموجز في الشكل 1. اختيار بين أساليب تعتمد على الحاجة لإجراء قياس النوعية أو الكمية من الاكسدة. وتتمثل النتائج ممثل كلا الأسلوبين في الشكل 2 والشكل 3.

كله طرق جبل ROS-الكشف

ويبين الشكل 2 تطبيق أسلوب كله جبل ROS-الكشف عن التصوير في الجسم الحي من الاكسدة. على وجه الخصوص، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لمتابعة كل من "قوية" الاكسدة الناتجة عن العلاجات الموالية للأكسدة الخارجية فضلا عن "منخفض" الاكسدة المتولدة عن أكثر الظروف الفسيولوجية مثل الإصابات الجرح أو حذف الجينات.

وبفعل المستويات الفسيولوجية الأنواع المؤكسدة عن طريق توليد اصابة في الدقيقة أو الجرح واسعة في زعنفة الذيل من جنين الزرد حية في 72 HPF. وقد ثبت أنه بعد الإصابة، H 2 O 2 يتراكم في الجرح هامش 20 دقيقة بعد الجرح 39. من أجل تصور تراكم الاكسدة على هامش الجرح، وحضنت الأجنة مع عامالتحقيق ROS-حساسة وتصويرها في 20 دقيقة بعد اصابة 39. من خلال مقارنة زعانف الذيل سليمة مع ذيول جرح، فمن الممكن التمييز بين تراكم التحقيق الفلورسنت على هامش الجرح (الشكل 2A). تم الكشف غير محددة إشارة ضعيفة مضان في جميع أنحاء الأنسجة زعنفة الذيل في كل الظروف.

من أجل التحقق من صحة تراكم محددة من التحقيق ROS-الحساسة على هامش الجرح، وH 2 O 2 المستويات الجرح تم تخفيضها عن طريق نهج الدوائية. منذ أن ثبت أن هامش الجرح H 2 O 2 تراكم حساس للغاية لVAS2870 DUOX-39 المانع، والأجنة ما قبل المعالجة مع هذا المانع قبل اصابة. مقارنة بين مضان من التحقيق ROS-حساسة، من VAS الأجنة ما قبل المعالجة والضوابط منها، يشير إلى أن الإشارة تعتمد على تراكم ROS (أي H 2 O 2) (الشكل 2B).

بالإضافة إلى ذلك، نحن في تولد مستويات عالية من الأنواع المؤكسدة في الأنسجة الزرد عن طريق علاج الأجنة الزرد مع روتينون. وحضنت الأجنة المعالجة روتنون والضوابط مع لجنة التحقيق ROS تراعي عامة للكشف عن الأنواع ROS تحديدا. بعد ذلك، تم غسلها لجنة التحقيق من وتم تصوير الأجنة تحت المجهر مضان ستيريو. تم الكشف عن الإجهاد التأكسدي في الجسم كله من الأجنة (الشكل 2C). صور عالية التكبير تظهر المناطق التشريحية حيث يتم استقلاب التحقيق بنجاح (الشكل 2D). صور حقل مشرق (لوحات العلوي) تميز الهياكل التشريحية، بينما الصور مضان (لوحات أقل) تشير الخلايا ROS-الإيجابية. كما يتضح من الصور الفلورسنت النتائج هي أساسا تقرير النوعي للكشف الاكسدة، الذي يتحقق من خلال مقارنة التحكم مع الأجنة المعالجة.

خلية واحدة-ROS طريقة الكشف

الرقم 3 تقارير FACS ممثل المؤامرات وتقدير من الاكسدة عن طريق تطبيق خلية واحدة ROS طريقة الكشف. وقد تم تكييف هذه الطريقة لقياس مستويات الاكسدة في الخلايا الزرد التي تعرضت لظروف الموالية للأكسدة كما ورد في البروتوكول ومفصلة في الأساطير الرقم. كما وصفها، وقد تم قياس الاكسدة التي يحتضنها الأنسجة الزرد فصلها في الخلايا واحد مع لجنة التحقيق الجزيئية ROS-حساسة. منذ الإجراء تفارق ونظام مراقبة الأصول الميدانية في حد ذاته قد يسبب تلف الخلايا، يتطلب تحليل العينات التي فقط "الخلايا الحية" تعتبر لالتأكسدي الكميات الإجهاد. وفقا لذلك، ويتم تحليل الخلايا تنفصل عن طريق اختيار جزء من الخلايا تظهر "الخلية الحية" المعلمات المادية (الشكل 3A) واستبعاد الخلايا الميتة (الشكل 3B). وبالتالي، يتم quantitated العينات لمستويات الاكسدة وفقا لمضان من التحقيق ROS-الحساسة ومبديا مضان الذاتية مثل الإيجابية لGFP (الشكل 3C). ينبغي أن تدرج عينة السيطرة السلبية لتحقيق ROS-الحساسة من أجل تقييم الاكسدة الناجمة عن التعامل مع والإجراءات الفنية (الشكل 3C؛ وحة تحكم -). نظام مراقبة الأصول الميدانية النسبية مؤامرة الكمي تظاهروا في رسوم بيانية تبين قياسات مكررات البيولوجية المختلفة (الشكل 3D-E).

إلى جانب مستوى الإجهاد التأكسدي الكميات على العلاجات بيروكسيد الهيدروجين، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب ل quantitate مستويات الاكسدة في الظروف الفسيولوجية مثل لنا في morphants nrf2a والضوابط منها (الشكل 3F).

علاوة على ذلك، من خلال الجمع بين وحيدة الخلية طريقة الكشف ROS مع تحقيقات ROS-حساسة معينة مثل لنا الميتوكوندريا ريال عمانيتحقيقات-S الحساسة، فمن الممكن أيضا لقياس الاكسدة في سياق العلاجات الموالية للأكسدة التي تستهدف الميتوكوندريا محددة (الشكل 3G).

الشكل 1

الشكل 1. الشكل التخطيطي لطريقة لقياس مستويات ROS في الأجنة الزرد. وعبرت البالغين الزرد في خزانات تربية المناسبة. ثم يتم جمع البويضات المخصبة في الأطباق وتخزينها في 28 درجة مئوية للسماح للجنين لتطوير كامل يمكن تحقيقه. تحريض الاكسدة بطرق مختلفة، إما عن طريق العلاجات الدوائية أو عن طريق الشتائم وراثية أو المادية. بدلا من ذلك، في حالة تحليل متحولة الوراثية، فمن الممكن لتخطي هذه الحضانة والمضي قدما. عند هذه النقطة، فمن الممكن المضي قدما التالية طريقتين مختلفة. وفقا لصحيفة "كله مount ROS-الكشف عن "أسلوب (يسار)، وحضنت الأجنة الزرد فورا مع التحقيق الفلورسنت ROS-الحساسة (1) ومن ثم تحليلها مع مضان المجهر متحد البؤر أو (2). في "خلية واحدة ROS-الكشف عن" أسلوب (يمين)، وفصل الأجنة الزرد في الخلايا واحد (1)، حضنت مع الفلورسنت التحقيق ROS-الحساسة (2) وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية للكشف عن مضان وتحديد الكميات (3). في حين أن طريقة "جبل بأكمله-ROS كشف" يسمح الكشف الاكسدة في الأجنة الحية في المقام الأول باعتباره الفحص النوعي "خلية واحدة على أساس" منح الأسلوب على حد سواء القياسات الكمية من مستويات التوتر التأكسدي والنوعية.

الرقم 2
وتعرض الشكل 2. نتائج ممثل كله طريقة جبل ROS-الكشف. A) الأجنة الزرد في 72 HPFلاصابة كما هو موضح سابقا من قبل Niethammer آخرون، 2009 39. تظهر الصور مبائر الممثل الأنواع الموالية للأكسدة (ROS) تراكم (رأس السهم) على هامش الجرح من الزعنفة الذيلية الجرحى. تم الكشف عن الأنواع المؤكسدة مع ROS التحقيق عام (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر) 20 دقيقة بعد الجرح قد أحرز. شريط النطاق 20 ميكرون. B) وصور تبين مبائر الممثل هامش الجرح الأجنة الزرد في 72 HPF. كانت سابقة التجهيز الأجنة مع VAS2870 (20 ميكرومتر) أو DMSO لمدة 90 دقيقة قبل أحرز الجرح. تم الكشف عن ROS مع لجنة التحقيق العامة ROS-الحساسة (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر) 20 دقيقة بعد الجرح. شريط النطاق 20 ميكرون. C) صورة الجسم كله يظهر الاكسدة التي يسببها روتينون في الأجنة الزرد. تم الكشف عن الاكسدة بقوة في المنطقة الذيلية من الأجنة كما هو موضح في لوحة D). روتنون هو المانع من امكانات ETC الميتوكوندريا التي تؤثر بشكل رئيسي skelخلايا العضلات ETAL في الزرد. شريط النطاق، 180 ميكرون.

الرقم 3
الشكل 3. نتائج ممثل الخلايا واحد طريقة ROS-الكشف. أ) الممثل FACS مؤامرة تظهر عينة نموذجية من الأجنة الزرد نأت إلى الخلايا واحد. هي بوابات الخلايا الحية في المنطقة وفقا R1 مع FSC-H وSSC-H المعلمات. SSC-H: 539 (الجهد)، 1.0 (AmpGain)، الوضع: الخطية؛ FSC-H: E00 (الجهد)، 2.1 (AmpGain) B) الممثل FACS مؤامرة تظهر عينة نموذجية من الأجنة الزرد نأت إلى الخلايا واحد. قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وقد حضنت العينة مع يوديد propidium (PI؛ 1 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق. هي بوابات الخلايا الميتة على المنطقة وفقا R2 مع PI مضان (FL2-H قناة). FSC-H: E00 (الجهد)، 2.1 (AmpGain)، الوضع: الخطية، SSC-H: 539 (الجهد)، 1.0 (AmpGain)، الوضع: لىالقريب. قنوات الجهد: FL-2: 613 دخول C) FACS المؤامرات الممثل تظهر فصل الأجنة الزرد تعرض لمعاملة الموالية للأكسدة (H 2 O 2) والضوابط المعنية. وتصور الخلايا البطانية التي كتبها قناة GFP. المؤامرات FACS تمثل جميع الخلايا المتأثرة الاكسدة (ROS) على UL وUR. يتم رسم الخلايا سلبي على أقل الأرباع (LL وLR). TG (Kdrl: GFP) وحضنت الأجنة الزرد s843 في 48hpf مع H 2 O 2 (2 ملم) أو H 2 O عن السيطرة لمدة 10 دقيقة. قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، تتم معالجة الأجنة كما هو موضح في البروتوكول. تم الكشف عن الخلايا المتضررة من الاكسدة باستخدام مسبار عام ROS-الحساسة الفلورسنت (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر). وقد شملت عينة لا المحتضنة مع التحقيق ROS-حساسة مثل السيطرة السلبية. مقارنة العينة تعرضوا لمعاملة الموالية للأكسدة مع التحكم الخاصة، وتآمر على عدد من الخلايا على الأرباع العليا (UL + UR) هو أعلى من ذلك. FACS المكتسباتكانت إعدادات ition على النحو التالي: قنوات الجهد: FL-1: 582 دخول؛ FL-4: 410 دخول D) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا (UL + UR) تتأثر الاكسدة في H 2 O 2 الأجنة المعاملة والسيطرة منهما. ترتبط القياسات لعينات هو مبين في C. تم الكشف عن الخلايا المتضررة من الاكسدة باستخدام مسبار عام ROS-الحساسة الفلورسنت (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر). النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD. E) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا البطانية (GFP +) تتأثر الاكسدة (ROS +) في H 2 O 2 الأجنة المعاملة والسيطرة منهما. ترتبط القياسات لعينات هو مبين في C. النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD. F) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا المتضررة من الاكسدة (ROS +) في morphants nrf2a (nrf2a MO) والضوابط المعنية(السيطرة MO) في 24 HPF. النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD G) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا المتضررة من الاكسدة الميتوكوندريا في الأجنة المعالجة (روتنون؛ 10 ميكرومتر) والضوابط المعنية (السيطرة؛ DMSO) في 72 HPF. بعد تفكك خلايا الأجنة في واحد، وقد تم قياس الاكسدة الميتوكوندريا (الميتوكوندريا ROS +) مع لجنة التحقيق الميتوكوندريا محددة (MitoSOX؛ 5 ميكرومتر). النتائج هي متوسط ​​ن = 3 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات حاسمة

ويتألف الإجراء للكشف الاكسدة في الأجنة الزرد الموصوفة هنا طريقتين مختلفتين. كلها طريقة التحميل ROS-الكشف هو أساسا فحص النوعية لROS-كشف، في حين يسمح للخلية واحدة طريقة ROS-كشف القياسات الكمية أكثر تحديدا (الشكل 1). كلتا الطريقتين توفر وسيلة سريعة وسهلة للتقييم في الجسم الحي ROS-الكشف على الأجنة الزرد. ومع ذلك، وكلاهما يقدم بعض الخطوات الحاسمة.

خطوات حاسمة ذات صلة إلى الأسلوب الأول

الأسلوب الأول لكامل الجبل ROS-كشف ديه ميزة كبيرة للكشف بسهولة الاكسدة في جميع أنسجة الأجنة الحية (الشكل 2). ولكن هناك ثلاثة جوانب أساسية الهامة التي يجب النظر فيها ويمكن أن تؤثر على نتائج الاختبار: 1) نفاذية التحقيق إلى أنسجة الجنين، 2) السمية التحقيق و3) اله مسبار الحساسية للتركيز منخفض ROS.

ويرتبط الجانب الأول على وجه التحديد في الجسم الحي تطبيق طريقة 42. "خلية النفاذية" ممتلكات التحقيق ROS-الحساسة هو سمة أساسية لتحقيق هذا الاختبار. من الناحية المثالية، جميع المواد الكيميائية القابلة للذوبان في الماء هي الأمثل للتسليم في الأجنة الزرد حي؛ ولكن معظم من الكواشف للكشف عن الاكسدة هي غير قابلة للذوبان في الماء. وبالتالي عادة ما ينصح باستخدام المجسات التي هي قابلة للذوبان في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل).

هناك آثار السامة المحتملة على الأجنة مرتبطة تركيز التحقيق ROS. وتتمثل الآثار الجانبية عادة تلف الأنسجة (أي نخر) أو التمثيل الغذائي تسارع لجنة التحقيق. حضانات طويلة (أيام) الأجنة الزرد مع hydroethidine التحقيق سبب الوفاة الجنين بينما جرعات عالية من 5 - (و6) كربوكسي-2 '، 7'-Dichlorofluorescein نتائج ثنائي الأسيتات في نعلى محددة تراكم مضان في القناة الهضمية (بيانات غير منشورة). للتغلب على هذه المشكلة فمن المهم رصد الأجنة أثناء الحضانة مع التحقيق. أن اختبارات عدة مرات وتركيزات من الحضانة مع نفس التحقيق أن تكون مفيدة أيضا. فترة حضانة الأمثل يسمح التسليم وأكسدة التحقيق الجزيئية دون ضرر الأنسجة السطحية. مرات الحضانة باستخدام المجسات الكيميائية (0.5-10 ميكرومتر) يمكن ان تكون ثابتة عموما في حدود 10-30 دقيقة، ويجب أن لا تتجاوز 1 ساعة. هذا الشرط يمكن أن تكون خادعة جدا لاقامة وخصوصا عندما كمية من الأنواع المؤكسدة هي قريبة من المستويات الفسيولوجية أو عندما يقتصر على الأنسجة الجنينية الداخلية. في الواقع، عندما يتم تحضين كائن كامل مع التحقيق الذي تجريه الكيميائية ROS-الكشف، والأنسجة الأكثر سطحية (أي الجلد، والعينين، والقلب) هي حيث يتأكسد بشكل رئيسي التحقيق ويصبح الفلورسنت. في وقت لاحق، يتم تسليم التحقيق تدريجيا إلى الأعضاء الداخلية والكبد أو هاءssels. ونتيجة لذلك، وهو الوقت المناسب للحضانة الأجنة الزرد مع التحقيق ROS-كشف أمر بالغ الأهمية للكشف عن الاكسدة في جميع الأنسجة.

أخيرا، عند استخدام هذا الأسلوب فمن المهم النظر في حساسية التحقيق إلى مستوى الاكسدة التي أعربت عنها الأنسجة. لا تتميز معظم تحقيقات المتاحة تجاريا ناعما لحساسيتها وهذا يعني أن التحقيق الأمثل لتطبيقات محددة يجب أن تحدد تجريبيا. جميع تحقيقات ROS-الحساسة كشف عموما مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي، ولكن معظمها ليست حساسة للتحولات الحد الأدنى لمستويات الاكسدة 43.

من أجل الحد من هذا العيب والسماح لتحليل أكثر تفصيلا ودقة ويقترح لتطبيق الطريقة الثانية تقوم على الكشف عن الخلايا واحد من الاكسدة.

خطوات حاسمة ذات صلة إلى الطريقة الثانية

لياليتقدم إنجل خلايا طريقة ROS-كشف بعض الخطوات الحاسمة. انهم مصممون أساسا عن طريق 1) كفاءة الخلايا الجنينية التفكك و2) نوع من التحقيق ROS-الحساسة المرتبطة الفحص.

وقد تم تكييف التفكك من الأجنة في خلايا واحد من البروتوكولات السابقة للتحليل الخلية الزرد عبر التدفق الخلوي 44 ويعرض اثنين من الجوانب الحاسمة التي تؤثر بشدة على نتائج الإجراء بأكمله. الجانب الأول يتعلق الطريقة المستخدمة لفصل الأجنة، في حين يرتبط ثانية واحدة لاستعادة خلايا فصلها.

يتم التحكم في التفكك من الأجنة في خلايا مفردة أساسا من تركيز الكواشف تفارق (أي كولاجيناز P والتربسين). ومع ذلك، يجب اعتبار أن كفاءة تفارق الأنسجة يعتمد على عدد من الأجنة حضنت ومرحلة نموهم. الأجنة الزرد في مراحل النمو السابقة (24 HPF-48 HPF) هي أكثر عقلانية لالكواشف تفارق من اليرقات (96 HPF-120 HPF) بسبب الأنسجة التدريجي النمو 45. وبالتالي، يتعين على التعديلات في الإجراء تفارق عند العمل مع الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة من 72 HPF. حضانة المفرط مع الكواشف يسبب موت الخلايا، في حين خفض تركيز الكواشف تنأى جزئيا فقط الأجنة. كما أنه من المهم تفصيل الأنسجة بشكل صحيح، من المهم أيضا لجمع وحفظ الخلايا واحد. أحد الاعتبارات الهامة هي درجة الحرارة التي يتم استردادها بعد تقسيم الخلايا الأنسجة. فمن المهم للحفاظ على الخلايا على الجليد أو على 4 درجات مئوية خلال الطرد المركزي من أجل الحد من الاكسدة الثانوي إلى اضطراب الميكانيكية للأنسجة أو إجراءات المناولة.

ويرتبط الخطوة الحاسمة الثانية بشأن التحقيق المرتبطة التحليل على نسيج معين من الفائدة. أسهل طريقة للكشف عن الخلية بوبوليتم تقديم أوجه في الزرد من قبل مجموعة واسعة من خطوط المعدلة وراثيا التي تم وضعها في العقود الأخيرة 46،47. ولكن مضان من خط المعدلة وراثيا اختيارها يجب أن تكون متوافقة مع التحقيق للكشف عن ROS. فمن الأهمية بمكان لتجنب عبر الحديث بين الخلفية مضان الأنسجة ومنخفضة، ولكن محددة، إشارة مضان المنبعثة من التحقيق.

تطبيقات هذا البروتوكول

النظر في كلتا الطريقتين تقدم الفحص فعالة سهلة والتكلفة لقياس الاكسدة في الجسم الحي، فمن الممكن تطبيق هذا البروتوكول لعدة شروط:

قياسات الاكسدة في مختلف الوراثية (على سبيل المثال، المرضية) شروط

أكسدة والمضادة للأكسدة الجينات يمكن التضمين بسهولة في الأجنة الزرد من قبل حقن morpholinos (الخسارة من وظيفة) أو مرنا (مكسب من وظيفة). تجارب ذكرت مؤخرا من الجينات تدق إلى أسفل وmicroinjection من توج مرنا في الأجنة الزرد تحديد أدوار مختلفة لمضادات الأكسدة Nrf2a وNrf2b الجينات في حماية الخلايا من الاكسدة خلال التنمية. النهج في التعبير الجيني التشكيل تقييم محور الحفظ تطورية بين الثدييات والزرد للاستجابة نقص الأكسجة والاكسدة في الخلايا العصبية 38،48. بالإضافة إلى أنه يتم تقديم فرصة عظيمة لدراسة الاكسدة عن طريق عدة خطوط متحولة الزرد. على سبيل المثال، ducttrip الزرد (DTP) متحولة يمثل نموذجا للاهتمام لتوصيف الاكسدة بالنسبة إلى الحالة المرضية. متحولة النشر المكتبي يحمل نقص لهيدرولاز S-adenosylhomocysteine ​​كشفت (ahcy) الجينات وتوصيف من أن فقدان النشاط Ahcy يسبب تنكس الكبد من خلال التأثير على مستويات ROS 49. مكافئ، وfh318 nrf2 متحولة الزرد، يحمل functio الخسارة من و، فقد كان ينظر ن تحور في جين عامل النسخي nrf2 باهتمام كبير للتحقيق في دور وقائي من هذا الجين المضادة للأكسدة في أقل الفقاريات 50.

قياسات الأكسدة الدولة سببها المركبات الدوائية

علاج الأجنة الزرد مع أدوية صغيرة يمكن أن تمنع أو تنشيط الاكسدة. علينا أن نظهر مؤخرا أن علاج ستاتين الأجنة الزرد التي يسببها الاكسدة التي يمكن استردادها من قبل CoQ10 العلاج 51. بدلا من ذلك، سلط الضوء على تحليل الاكسدة في نموذج حيواني الزرد عن الاعتلالات العضلية المرتبطة RYR1 الإنسان دور NAC المخدرات المضادة للأكسدة (N-أسيتيل السيستين) كنهج العلاجية المحتملة لمرض العضلات 52.

على نطاق واسع فحص الجزيئات الصغيرة وأدوية لوصف خصائصها مؤكسد

الزرد هو وزارة الدفاع الحيوان راسخةش لفحص المواد الكيميائية واسع. والفحص الكيميائي الأخيرة من جزيئات صغيرة أجريت في الزرد المواد المضادة للاكسدة التي تم تحديدها كما جهري بقاء الخلايا العصبية الدوبامين، والذي يتأثر بشدة في الأمراض العصبية الثدييات مثل مرض باركنسون 53. هذه الطريقة يمكن استخدامها للكشف عن جزيئات الموالية للأو المضادة للأكسدة في الجسم الحي الجديد.

أهمية والقيود

بروز كل من "جبل بأكمله" و "وحيدة الخلية" طرق الكشف عن ROS يعتمد على القدرة على أداء في القياسات المجراة من الاكسدة باستخدام التقنيات المخبرية بسيطة والمعدات الأساسية. تطبيق الزرد كنموذج للحيوانات بالاشتراك مع ROS-الكشف عن تحقيقات يسمح ليس فقط مجرد الوحي من الاكسدة، ولكن أيضا الكشف في سياق كائن حي والكمي على مستوى الأنسجة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن أن تكون هذه المقايساتيؤديها مع الأدوات المتاحة تجاريا ولا تتطلب خبرة محددة لتنفيذها. بالإضافة إلى ذلك، كل من الأساليب ليست الإجراءات تستغرق وقتا طويلا ويمكن تطبيقها مع الوقت المناسب لمجموعات كبيرة من العينات. كل هذه المزايا معا عملية جعل هذه الطرق أهمية خاصة لتحسين تحليل الاكسدة في الجسم الحي.

ولكن هذه المقايسات تظهر أيضا بعض القيود. بشكل عام، فإن معظم تحقيقات ROS-الحساسة الآن متاحة تجاريا لا قيمة للتحليل نوعي وكمي غرامة من مستويات التوتر التأكسدي في الخلايا الحية. تم تصميم hydroethidine استخداما وتحقيقات MitoSOX للاستشعار من الفائق (O 2 -)، لكن في الآونة الأخيرة قد أثيرت مخاوف بشأن خصوصيتها، وخاصة عند استخدام المقايسات القائم على مضان 54. بالقياس بعض التقارير الشكوك حول ثنائي الأسيتات dichlorofluorescein (DCFH-DA) لH الحصري 2 متقدمة 2 الاستشعار 55،56. وعلاوة على ذلك تتميز هذه التحقيقات الفلورسنت الأكسدة الفعالة من جانب تفعيل غير محددة جزئية (أي نسيج لصناعة السيارات في مضان) وليس عكسها بعد أكسدة. مرة واحدة يتأكسد التحقيق الفلورسنت التي كتبها ROS أنه لا يمكن أن يعود إلى انخفاض حالته غير الفلورسنت. وبالتالي الكشف عن تقلبات ROS مع القرار الزماني محدود بسبب تطبيق هذه المجسات الكيميائية 43.

ويمثل وجود قيود كبيرة من هذا المجال بسبب عدم وجود تحقيقات للكشف RNS الحصرية. مؤخرا، أظهرت منهجيات البروتين على أساس أن RNS لحث على التعديلات البروتين التي تعتبر من المؤشرات الحيوية الإجهاد النتروز نشطة ويمكن تقييمها عن طريق فحوصات immunoblotting باستخدام الاجسام المضادة المحددة لبروتين الأكسدة / نترتة (على سبيل المثال، ومكافحة SNO السيستين، ومكافحة-3- Nitrotyrosine) 22،23. ومع ذلك، كل هذه القياسات ليست فقط القياسات غير المباشرة لتعزيز بنية الشع التأكسديق ق الناجمة عن RNS وفي معظم الحالات التي تتطلب مقتطفات الخلوية، مما يعني أنها لا تنطبق على الخلايا الحية أو يعيشون الأجنة الزرد.

يتم تمثيل بديل صالح لتحقيقات التقليدية من خلال ترميز وراثيا الأكسدة البروتينات الفلورية الحساسة. المكونات الرئيسية لهذه المجموعة هي: roGFP، والمستمدة من البروتينات الفلورية الخضراء، rxYFP وcpYFP، سواء المستمدة من بروتين فلوري الصفراء والتحقيق المفرط، وH 2 O محددة تراعي 2 التحقيق الفلورسنت 57. كل هذه التحقيقات الأكسدة المهندسة التي أنشأتها البروتينات الفلورية تسمح القائم على مضان quantifications ratiometric وتمكين دقة أعلى الزمنية (من ثواني إلى دقيقة) من تحقيقات الكيميائية 58. المجراة تطبيق هذه أجهزة الاستشعار من الممكن أيضا كما يتبين من خط المعدلة وراثيا الزرد التعبير عن فرط في الوقت الحقيقي الاستشعار من H 2 O 2 الذاتية مستويات 39،59. أناmplementing الزرد مع أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يوفر النظام الأمثل لتحقيق الاكسدة، ولكن يتطلب إنشاء خط الحيوانية المعدلة وراثيا وأدوات التصوير المناسبة. إجراءات الكشف الاكسدة في الزرد المقدمة هنا هي أقل دقة من الأساليب الوراثية، ولكن هو سريع ويوفر الفحص الأولية لفي الجسم الحي الكشف عن مستويات عالية من الأنواع الموالية للأكسدة. قياس دقيق لالاكسجين التفاعلية الفردية و / أو الأنواع النيتروجين حاليا الحد من هذا المجال البحثي. في المستقبل، يمكن أن المقبلة النانو الأكسدة أجهزة استشعار تساعد على حل هذه المسألة. وقد تم اختبار التطبيق الناجح للجسيمات متناهية الصغر وأنابيب مقرها الأكسدة وأجهزة الاستشعار في العديد من الدراسات في المختبر، ولكن لا تتوفر كما هو الحال في الجسم الحي المقايسات حتى الآن 60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 89،
تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter