Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo's

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS) kan een verandering van cellulaire redox toestand naar oxidatieve stress situatie veroorzaken. Deze situatie veroorzaakt oxidatie van moleculen (lipiden, DNA, eiwit) en leidt tot celdood. Oxidatieve stress ook invloed op de progressie van verscheidene pathologische aandoeningen zoals diabetes, retinopathieën, neurodegeneratie, en kanker. Derhalve is het belangrijk om instrumenten te definiëren oxidatieve stress condities te bestuderen niet alleen op het niveau van individuele cellen, maar ook in de context van hele organismen. Hier beschouwen we de zebravis embryo als een nuttig in vivo systeem om dergelijke studies uit te voeren en presenteren een protocol om in vivo oxidatieve stress te meten. Profiteren van fluorescerende probes ROS en zebravis transgene fluorescerende lijnen, ontwikkelen we twee verschillende methodes om oxidatieve stress te meten in vivo: i) een "hele embryo ROS-detectiemethode" voor de kwalitatieve meting van oxidatieve stress en ii) een "eencellige ROS detectiemethode "voor kwantitatieve metingen van oxidatieve stress. Hierin tonen we de werkzaamheid van deze procedure door het verhogen oxidatieve stress in weefsels door oxyderende agens en fysiologische of genetische methoden. Dit protocol is vatbaar voor voorwaartse genetische screens en het zal adres oorzaak-gevolg relaties van ROS helpen in diermodellen van oxidatieve stress-gerelateerde ziekten zoals neurologische aandoeningen en kanker.

Introduction

Oxidatieve stress is specifiek gedefinieerd als een aandoening die het gevolg van een onevenwichtige cellulaire redox toestand. Het complex redoxreacties die routinematig gebeuren in cellen bepalen de cellulaire redox-toestand. Redoxreacties omvatten alle chemische reacties die bestaan ​​uit de overdracht van elektronen tussen de atomen van biologische moleculen produceren reductie en oxidatie van moleculen (bijvoorbeeld redoxreacties). Deze reacties worden gekatalyseerd door elektronische sturing soorten (pro-oxidatieve deeltjes), die worden gekenmerkt door een extreme structurele instabiliteit en spontane activatie van onevenwichtige elektronen die uit met naburige biomoleculen. Deze onregelmatige reacties resulteren in DNA-schade, eiwit carboxylatie en vetverbranding, en uiteindelijk leiden tot celdood 1. Verhoogde niveaus van oxidatieve stress zijn geassocieerd met veroudering en de progressie van verschillende pathologische toestanden 2. Oxidatieve stress heeftgerapporteerd verantwoordelijk voor vasculaire veranderingen in diabetes en cardiovasculaire aandoeningen 3,4 te zijn. Het speelt ook een cruciale rol in neuronale degeneratie bij de ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Bovendien is oxidatieve stress is aangetoond als een kritieke factor in het bestuur van de progressie van kanker en metastatische gebeurtenissen 6,7. Bovendien kan ontsteking en immuunreacties en verdere steun oxidatieve stress 8.

In levende cellen, worden pro-oxidatieve deeltjes afkomstig uit zuurstof (ROS, reactieve zuurstofspecies) of stikstof (RNS, reactieve stikstof species). ROS zijn de hydroxylgroep, de superoxide anion (OH.) (O 2 -) en waterstofperoxide (H 2 O 2). De primaire RNS is stikstofoxide (NO.). Een reeks van secundaire reactieve species kunnen worden gegenereerd door spontane interactie between ROS en RNS of vrije metalen ionen 9. Bijvoorbeeld, het superoxide anion reageert met lachgas te peroxynitraat (ONOO -) vorm, terwijl H 2 O 2 reageren met Fe2 + genereert hydroxylradicalen. ROS en RNS, vanwege hun vermogen om te reageren met verschillende biomoleculen, worden beschouwd als een gevaarlijke bedreiging voor het onderhoud van de fysiologische redox toestand 10. Handhaving van de redox toestand cellen zijn uitgerust met een reeks ontgiftende anti-oxidant moleculen en enzymen. Het superoxide dismutase (SOD), katalase, glutathion peroxidase en Peroxiredoxins wezen vormen de anti-oxidant enzymatische-arsenaal dat cellulaire bescherming biedt tegen pro-oxidatieve soorten, waaronder H 2 O 2, OH en OONO -. 11. Ook anti-oxidant moleculen zoals vitamine C en E, polyfenolen en CoenzymeQ10 (CoQ10) zijn van cruciaal belang voor ROS en de gevaarlijke de lessenderivaten 12,13. Echter, een overmatige productie van ROS en RNS, of disfunctie in de anti-oxidant systeem, verschuift de cellulaire redox-toestand naar oxidatieve stress 14.

Naast hun negatieve connotatie, kan ROS verschillende fysiologische rol spelen in de cellen van verschillende oorsprong. Cellen normaal produceren ROS als signaalmoleculen te bemiddelen normale biologische gebeurtenissen zoals afweer en wondheling 15-17. Reactieve species worden gewoonlijk geproduceerd in cellen door intracellulaire enzymen zoals NOx (NADPH oxidase) en XO (xanthine oxidase) in reactie op signalering factoren, groeifactoren, en intracellulaire schommelingen van calcium 18,19. Er werd gemeld dat ROS differentieel kan moduleren de activiteit van belangrijke nucleaire factoren zoals p53 of cellulaire componenten zoals de ATM-kinase, de regulering van de respons op DNA-schade 20. Analoog ROS beïnvloeden sterk cellulaire signalering door te bemiddelen the oxidatie en inactivering van eiwit tyrosine fosfatasen (PTP's), die zijn gevestigd als kritische regulatoren van signaaltransductie 21. Bovendien proteomics gebaseerde methoden tonen dat RNS ook verantwoordelijk zijn voor specifieke proteïne modificaties en veranderingen van moleculaire signalering. RNS reageren met de cysteine ​​thiolgroepen te wijzigen in S-nitrothiols (SNO) en triggering moleculaire wegen gelijktijdig met pathologische, zoals ontsteking en auto-immuunziekten 22,23.

Aangezien celcultuurexperimenten gedeeltelijk reproduceren veelheid van factoren handelen in vivo, is het van groot belang redox studies uitgevoerd in diermodellen 24,25. Hiertoe is de zebravis beschouwd als een geschikte gewervelde diermodel oxidatieve stress dynamiek 26 bestuderen. De zebravis is een nieuw model systeem dat geeft een aantal voordelen om te studeren cellulaire en genetische gebeurtenissen tijdens gewervelde development en ziekte. Grote clusters van embryo's kunnen worden gegenereerd en wekelijks beschikbaar voor experimentele behoeften. Bovendien is de buitengewone optische helderheid van zebravis embryo's, evenals hun kleine formaat, kan via een cell imaging en dynamisch volgen in een hele organismen 27. In de afgelopen tien jaar hebben een aanzienlijk aantal zebravismutanten gegenereerd te modelleren van de menselijke pathologische aandoeningen zoals kanker en genetische ziekten 28-31. Het belangrijkste is, is een veelheid van transgene lijnen geproduceerd om uitgebreide mogelijkheden van genetische en biologische manipulaties 32 mogelijk te maken. Zo worden transgene weefselspecifieke zebravislijnen regelmatig gebruikt voor in vivo studies. Deze lijnen drukken een fluorescent eiwit onder de controle van een geselecteerde promoter, die de mogelijkheid om enkele cellen in vivo te identificeren, evenals de anatomische structuur die zij bevatten.

Verschillende toxicologische studies hebben reeds gebruikt thij zebravis over het in vivo effect van chemische stoffen op redox homeostase evalueren, suggereert de geschiktheid van deze gewervelde als een diermodel voor het gebied van geneesmiddelen en oxidatieve stress 33-35. Hoewel sommige fluorescerende probes getest om te controleren oxidatieve stress in zebravis larven 36,37, er geen vaste bepalingen om de niveaus van oxidatieve stress in zebravis weefsels en levende cellen te detecteren en te meten. Hier beschrijven we een werkwijze voor in vivo kwantificatie van oxidatieve stress in levende cellen van de zebravis embryo. Imaging gereedschappen, FACS-sortering, fluorescente probes en pro-oxidatieve voorwaarden wordt gecombineerd tot een eenvoudige test voor de detectie en kwantificering van oxidatieve deeltjes in zebravis embryo's en weefsels genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van instrumenten en werkende oplossingen

  1. Bereid de vis water oplossing. Maak een voorraad oplossing door het oplossen van 2 g zeezout 'Instant Ocean' in 50 ml gedestilleerd water. Voeg 1,5 ml van de vis water tot 1 liter gedestilleerd water te bereiden klaar om vis water (60 ug / ml zeezout uiteindelijke concentratie) te gebruiken. Autoclaaf het klaar om te vissen water te gebruiken voor gebruik. Deze oplossing wordt gebruikt als zebravis embryo medium.
  2. Bereid methylcellulose voor embryo montage. Los op in 50 ml steriel vis water 1,5 g methylcellulose. Vergemakkelijken de ontbinding met behulp van een magneet op een roer plaat. De volledige oplossing van het poeder kan enkele uren in beslag. Controleer de oplossing op helderheid en hoeveelheid in kleine buisjes. Bewaren bij -20 ° C voor maanden en ontdooien fracties bij gebruik. Centrifugeer de methylcellulose bij 950 xg gedurende 5 minuten voor gebruik. Vermijd vries-dooi cycli van porties.
  3. Bereid 50 ml tricaïne / ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout (voorraadoplossing) door het oplossen van 200 mg tricaïne in 100 ml water en op pH 7,0 met Tris-HCl 1 M (pH 9). Bewaar deze voorraad bij 4 ° C voor niet meer dan 30 dagen. LET OP: tricaïne is giftig. Gebruiken in overeenstemming met adequate behandeling richtlijnen.
  4. Induceren van oxidatieve stress in de zebravis embryo's
    1. Bereid een oxidant oplossing voor generieke oxidatieve stress inductie: Maak 50 ml oxidant oplossing door toevoeging van H 2 O 2 stockoplossing (waterstofperoxide; 100 mM) om vis water. Gebruik H 2 O 2 van een uiteindelijke concentratie tussen 2 mM en 100 uM. Maak deze oplossing vlak voor gebruik. Het oxidatiemiddel oplossing kan worden toegepast op zowel gehele mount ROS-detectie en eencellige ROS-detectiemethoden. Mis deze oplossing niet bewaren. LET OP: H 2 O 2 is gevaarlijk en schadelijk bij inademing en opname door de mond. Contact met brandbaar materiaal kan brand veroorzaken. Behandel onder een afzuigkap en draag geschikte personale beschermingsmiddelen.
    2. Bereid een oxidant oplossing voor-mitochondriën afgeleide oxidatieve stress inductie: Maak een oxidant stockoplossing (5 mm) door het oplossen van 3,9 mg rotenone in 2 ml van dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur in het donker.
      1. Ontbinden rotenone stockoplossing aan 10 ml water om een ​​vis klaar te gebruiken oplossing te maken. Gebruik rotenon bij een concentratie van 5-50 uM. Gebruik geen rotenone in concentraties van meer dan 100 micrometer. Bij passende concentraties, kan dit oxidant oplossing worden toegepast op zowel hele mount ROS-detectie en single-cell ROS-detectiemethoden. LET OP: Rotenon is giftig en gevaarlijk. Behandel volgens gepaste voorzorgsmaatregelen.
    3. Induceren van oxidatieve stress door gen knock-down: Knock-down nrf2a genexpressie in zebravis embryo's door morpholino micro-injectie, zoals eerder gemeld door Timme-Laragy A. et al., 2012 38..
    4. Induceren oxidtieve spanning na weefselschade: het genereren van een wond marge op de staartvin van de zebravis embryo's in 72 hpf zoals eerder beschreven door Niethammer et al., 2009 39..
  5. Bereid 5 ml van ROS-detectie oplossing voor enkele cel ROS-detectiemethode:
    1. Oplossing voor algemene ROS detectie: Los het generieke ROS-gevoelige moleculaire probe in HBSS (Hanks gebalanceerde zoutoplossing) om een ​​werkoplossing (concentratiegebied: 2.5-10 pM) bereiden. Deze oplossing moet worden bereid vlak voor gebruik.
    2. Oplossing voor specifieke detectie ROS geïnduceerd mitochondria: Kort voor gebruik lossen een mitochondriale ROS-gevoelige probe met DMSO maken van een 5 mM voorraadoplossing. Los op voorraad oplossing in HBSS om een ​​werkende oplossing (concentratie range: 2.5-10 uM) te bereiden.
      OPMERKING: Vermijd licht en zuurstof blootstelling van ROS-detectie werkende oplossingen en hun respectievelijke voorraad oplossingen. Bescherm de buis van licht door het gebruik vanaluminiumfolie. Bewaar of hergebruik probes opgelost in HBSS. Bewaar de voorraad oplossingen bij -20 ° C voor een maand.
      LET OP: Behandel moleculaire probes en DMSO onder een zuurkast in een daartoe geëigende richtlijnen.
  6. Bereid 5 ml ROS-detectie oplossing voor de gehele mount ROS-detectiemethode: Los het generieke ROS-gevoelige probe stockoplossing (gestabiliseerd in DMSO) in HBSS om een ​​werkoplossing (concentratiegebied: 2,5-5 uM) te bereiden. Vermijd licht en belichting zuurstof. Bescherm de buis van licht. Bereid deze oplossing voor gebruik. Bewaar of hergebruiken van deze oplossing. LET OP: Behandel moleculaire probes onder een zuurkast in een daartoe geëigende richtlijnen.
  7. Voeg 25 ml stop oplossing door toevoeging van 10 ml foetaal runderserum 15 ml PBS 1x. Houd oplossing steriel. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C. Deze oplossing is alleen vereist voor enkele cel - ROS detectiemethode.
  8. Stel de zebravis lucht incubator bij 28 &# 176; C.
  9. Stel de centrifuge bij 4 ° C voor de cel ROS-detectiemethode.

2. Het koppelen van Adult Vissen en Selectie van zebravis embryo's

  1. Opstelling volwassen zebravissen paar kruisen volgens standaardprotocollen 40. Selecteer de juiste transgene lijn in overeenstemming met specifieke experimentele behoeften.
  2. Verzamel eieren en leg ze in een 90-mm schotel met vis water / embryo medium. Houd eieren bij 28 ° C tot embryo's ontwikkelen en te groeien naar de gewenste ontwikkelingsstadium (bv. 48 HPF, 72 HPF; HPF: uur na de bevruchting).
  3. Scherm voor het ontwikkelende embryo's. Sluiten alle onbevruchte eieren of onderontwikkelde embryo's.
  4. Verdoven van embryo's door het toevoegen van 1 ml tricaïne (voorraad-oplossing) in 50 ml water vissen.
  5. Selecteer Tg fluorescerende embryo's onder een stereomicroscoop.

3. Behandeling van embryo's met Oxidant Agent

  1. Gebruik minimaal 30 embryo's tussen 48 hpf en 72 HPF per andere toestand. Was embryo tweemaal met verse vis water om tricaïne verwijderen.
  2. Splits fluorescerende embryo's in drie gerechten. Zet niet meer dan 30 embryo's / schotel.
  3. Verwijder de wasvloeistof en voeg 10 ml van de oxidant oplossing of 10 ml van vis water als controle-oplossing.
  4. Incubeer embryo gedurende 10 minuten tot 1 uur bij 28 ° C. De incubatieperiode hangt van het niveau van oxidatieve stress geïnduceerd worden in bepaalde weefsels. Korte perioden zijn de beste als cellen beïnvloed door oxidatieve stress geleidelijk celdood ondergaan.
  5. Transfer embryo's in een nieuwe schotel met HBSS en wassen embryo's door zwenken. Pre-warm HBSS bij 28 ° C.

4. Hele Mount ROS Detectiemethode

  1. Verzamel embryo na behandeling oxidatiemiddel en zet niet meer dan 10 embryo's in een buisje. Spoelen met HBSS zoveel mogelijk. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie.
  2. Voeg 1 ml van ROS-detectie oplossing voorelke buis.
  3. Incubeer embryo's in het donker gedurende 15 minuten bij 28 ° C om blootstelling aan licht te vermijden.
  4. Tijdens de incubatietijd bereiden een glasplaatje voor de hele embryo analyse. Zet 300 ul van methylcellulose op een "depressie" glasplaatje en verdeel het over de glazen oppervlak met een pipet tip. Vermijd bellen tijdens het loslaten van de methylcellulose.
  5. Aan het einde van de incubatietijd, onmiddellijk de ROS-detectie-oplossing en tweemaal wassen met 2 ml HBSS. Was embryo door het buisje meerdere malen. Niet pipet of vortex.
  6. Aspireren embryo's up in een glas Pasteur pipet. Plaats embryo bij de opening van de pipet en voorzichtig werpen ze in de methylcellulose. Oriënteer de embryo's op de juiste wijze met een fijne nylon lijn.
  7. Vergelijk de fluorescentie van de controle embryo's met behandelde embryo. Alternatief parameters vaststellen van de fluorescentie stereomicroscoop of confocale microscoop zodat alle embryo's worden afgebeeld met dezelfdeimaging-instellingen.

5. Single Cell ROS-detectiemethode

  1. Start vanaf stap: 3.5. Zorg ervoor dat u ten minste 35 embryo's voor elke aandoening.
  2. Transfer embryo's in een nieuw gerecht. Verwijder vis water zoveel mogelijk. Voeg 10 ml ijskoude PBS 1x en 400 ul van proteaseremmers Cocktail. Handmatig dechorionate embryo's met een tang en verwijder de dooierzak met een fijne naald. Opmerking: Het verwijderen van dooierzak zorgt voor schone monsters voor de volgende FACS-analyse. Deze stap kan worden vermeden volgens FACS instrument.
  3. Transfer-de yolked embryo's in een 24-putjes multi-plaat (15 embryo's / putje) en verwijder alle vis water.
  4. Voeg 300 ul HBSS, 30 ui collagenase P, 50 pi trypsine-EDTA in elk putje.
  5. Homogeniseren embryo's door de pipet voorzichtig op en neer met een strakke pipet tip (1000 pl).
  6. Incubeer bij 28 ° C gedurende 20 min en homogeniseren monsters pipetteren elke 5 minuten.
  7. Controleer weefsel DISRuption door het observeren van een monster van homogenaat in de samengestelde microscoop. Vergemakkelijken enkele celsuspensie door pipetteren. Niet embryo incubeer gedurende meer dan 30 minuten.
  8. Stop de reactie door toevoeging van 200 pl stopoplossing. Meng door pipetteren voorzichtig.
  9. Breng celsuspensie in een vooraf gekoelde buis met strak laag. Houd buis op ijs en vermijd blootstelling aan licht.
  10. Centrifugeer gedurende 5 min bij 250 xg bij 4 ° C.
  11. Verwijder de bovenste fase en opnieuw te schorten cellen met ijskoude HBSS door voorzichtig pipetteren.
  12. Tellen cellen en zorg ervoor dat je hetzelfde aantal cellen in al uw monsters. Gebruik niet minder dan 2 x 10 6 cellen.
  13. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 250 xg bij 4 ° C.
  14. Verwijder supernatant en het pellet schorsen 1 ml ijs gekoeld HBSS bevattende ROS-gevoelige probe.
  15. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 min in het donker. Variëren incubatietijd volgens het niveau van oxidatieve stress en tHij gevoeligheid van de probe.
  16. Overdracht cellen om een ​​FACS buis. Houd buizen op ijs en blootstelling aan licht te vermijden voor het FACS-analyse.
  17. Cellen te sorteren met een fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder (FACS). Set golflengten volgens Tg weefsel fluorescentie (bijv. GFP) en de excitatie / emissie spectra van de moleculaire probe voor ROS detectie (bv. specifieke mitochondriale ROS-gevoelige probes generieke ROS-gevoelige probes).
  18. Voor elke aandoening, meten alle monsters binnen dezelfde experimentele sessie door toepassing van dezelfde FACS instellingen. Bereken het percentage fluorescerende cellen als het gemiddelde van verschillende biologische herhalingen. Analyseer tenminste twee replica voor elke conditie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Door toepassing van de hier beschreven methode, kunnen we gemakkelijk meten en detecteren oxidatieve stress (en ROS levels) in de zebravis embryonale weefsels. Na het oversteken volwassen zebravissen worden eieren verzameld en kunnen ontwikkelen bij 28 ° C tot 72 uur na bevruchting (HPF). Om oxidatieve stress induceren, stellen we twee verschillende benaderingen: 1) de behandeling van embryo's met sterke pro-oxidant reagentia of 2) het bevorderen van ROS vorming na weefselbeschadiging.

In de eerste benadering, gebruikten we twee verschillende reagentia volgens de specifieke behoeften: waterstofperoxide (H 2 O 2), als generieke cellulaire ROS vormende stof en rotenon, de specifieke mitochondriale ROS driver. Rotenon is een remmer van complex I van de ETC, die deregulering zijn veroorzaker van oxidatieve stress 41.

In de tweede benadering, we geïnduceerde accumulatie van ROS door een wond op de staartvin van een zebravis embryo39. Alternatief, oxidatieve stress omstandigheden kunnen worden in de zebravis weefsels bevorderd door kloppen neer met morfolino injectie de Nrf2 antioxidant respons route die de primaire cellulaire verdediging tegen de cytotoxische effecten van oxidatieve stress 38.

Zodra de oxidatieve stress wordt geïnduceerd in zebravis embryo, kan de accumulatie van reactieve zuurstofspecies (ROS) worden gemeten met generieke of specifieke mitochondriale ROS-gevoelige probes die fluorescent na activering (bijvoorbeeld oxidatie) worden.

Behandelde embryo kan worden geanalyseerd door het gehele mount ROS-detectiemethode of door de cel-ROS detectiemethode zoals samengevat in figuur 1. De keuze van werkwijzen gebaseerd op de noodzaak om kwalitatieve of kwantitatieve meting van oxidatieve stress voeren. Representatieve resultaten van beide methoden weergegeven in figuur 2 Figuur 3.

Whole Mount ROS-detectiemethode

Figuur 2 toont de toepassing van het gehele mount ROS-detectiemethode voor in vivo beeldvorming van de oxidatieve stress. In het bijzonder is deze werkwijze is toegepast voor "sterke" oxidatieve stress opgewekt door exogene pro-oxidant behandelingen en "lage" oxidatieve stress die door meer fysiologische omstandigheden zoals wond of letsel gendeletie volgen.

Fysiologische niveaus van oxidatieve soorten worden geïnduceerd door het genereren van een micro-verwonding of een breed wond op de staartvin van een live zebravis embryo op 72 hpf. Het is aangetoond dat na verwonding, H 2 O 2 accumuleert op wondrand 20 minuten na de wond 39. Om de ophoping van oxidatieve spanning bij de wondrand visualiseren, werden embryo's geïncubeerd met een generiekeROS-gevoelige probe en afgebeeld op 20 minuten na verwonding 39. Door het vergelijken intact staart vinnen gewonden staart, is het mogelijk om een opeenstapeling van de fluorescente probe onderscheiden in de wondranden (Figuur 2A). Niet-specifieke zwakke fluorescentie wordt gedetecteerd hele staartvin weefsel in beide condities.

Om de specifieke accumulatie van ROS-gevoelige sonde de wondrand, H 2 O 2 niveau op de wond te valideren zijn verlaagd door een farmacologische benadering. Aangezien is aangetoond dat de wondrand H 2 O 2 accumulatie uiterst gevoelig voor de DUOX-remmer VAS2870 39, embryo's werden voorbehandeld met deze remmer voor verwonding. Vergelijking van de fluorescentie van het ROS-gevoelige probe van VAS voorbehandelde embryo en de respectieve controles aan dat het signaal afhankelijk is van ROS accumulatie (dwz H 2 O 2) (Figuur 2B).

Bovendien genereerden wij hoge oxidatieve deeltjes in zebravis weefsels door behandeling zebravis embryo's met rotenon. Rotenon-behandelde embryo's en controles werden geïncubeerd met een generieke ROS-gevoelige probe specifiek ROS soorten sporen. Daarna werd de probe uitgewassen en de embryo's werden afgebeeld onder een fluorescentie-stereomicroscoop. De oxidatieve stress werd gedetecteerd in het gehele lichaam van de embryo (figuur 2C). Sterke vergroting beelden tonen anatomische gebieden waar de sonde met succes wordt gemetaboliseerd (figuur 2D). Helderveld beelden (bovenste panelen) onderscheiden anatomische structuren, terwijl fluorescentiebeelden (onderste panelen) geven ROS-positieve cellen. Zoals blijkt uit de fluorescentiebeelden de resultaten zijn vooral een kwalitatief verslag van oxidatieve stress detectie, die wordt verkregen door vergelijking met controle behandelde embryo.

Single Cell-ROS Detectiemethode

Figuur 3 rapporten representatieve FACS plots en kwantificering van oxidatieve stress door het toepassen van de enkele cel ROS detectiemethode. Deze werkwijze is aangepast aan oxidatieve stress in zebravis cellen die werden blootgesteld aan pro-oxidant voorwaarden zoals vermeld in het protocol en opgenomen in figuurlegendas meten. Zoals beschreven, is de oxidatieve stress gemeten door incubatie zebravis weefsels gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met een ROS-gevoelige moleculaire probe. Aangezien de dissociatie procedure en de FACS zelf celschade kunnen veroorzaken, de analyse van monsters vereist dat alleen de "levende cellen" worden beschouwd voor oxidatieve stress kwantificatie. Dienovereenkomstig worden gedissocieerde cellen geanalyseerd door het selecteren van de fractie van cellen met "levende cellen" fysische parameters (figuur 3A) en zonder dode cellen (Figuur 3B). Zo zijn de monsters gekwantificeerd vooroxidatieve stress volgens de fluorescentie van het ROS-gevoelige probe en die een endogene fluorescentie zoals positiviteit voor GFP (Figuur 3C). Een negatief controlemonster voor het ROS-gevoelige probe worden opgenomen om de oxidatieve stress veroorzaakt door behandeling en technische procedures geëvalueerd (Figuur 3C; panel: Controle -). Relatieve FACS plot kwantificering aangetoond in histogrammen tonen metingen van verschillende biologische herhalingen (figuur 3D-E).

Naast oxidatieve stress niveau kwantificatie bij waterstofperoxide behandelingen, heeft deze methode toegepast op oxidatieve stress te kwantificeren binnen fysiologische omstandigheden zoals ons in nrf2a morphants en bijbehorende controles (figuur 3F).

Bovendien, door het combineren van de eencellige ROS detectiemethode specifieke ROS-gevoelige probes zoals ons mitochondriale ROS-gevoelige probes, is het ook mogelijk om oxidatieve stress te meten in de context van specifieke mitochondriën gerichte pro-oxidant behandelingen (Figuur 3G).

Figuur 1

Figuur 1. Schematische afbeelding van de methode voor het meten van ROS levels in de zebravis embryo's. Zebravissen volwassenen gekruist in de juiste kweekbakken. Bevruchte eitjes worden vervolgens in gerechten verzameld en bewaard bij 28 ° C om embryo volledig ontwikkelen. Inductie van oxidatieve stress kan worden bereikt op verschillende manieren, hetzij door farmaceutische behandelingen of door genetische of fysieke beledigingen. Alternatief, indien een genetische mutant wordt geanalyseerd, is het mogelijk om deze incubatie slaan en vooruit. Op dit punt is het mogelijk over te gaan van twee verschillende methoden. Volgens de "gehele monteer ROS-detectie "methode (links), worden zebravis embryo direct geïncubeerd met fluorescerende ROS-gevoelige sonde (1) en vervolgens geanalyseerd met fluorescentie of confocale microscoop (2). In de "single cell ROS-detectie" methode (rechts), worden zebravis embryo's gedissocieerd in enkelvoudige cellen (1), geïncubeerd met een fluorescent ROS-gevoelige probe (2) en door FACS geanalyseerd op fluorescentie detectie en kwantificering (3). Terwijl de "hele mount-ROS detectie" methode laat oxidatieve stress detectie in levende embryo's in de eerste plaats als een kwalitatieve analyse, "single-cell-based" subsidies zowel kwalitatieve als kwantitatieve metingen van oxidatieve stress methode.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten van de ganse berg ROS-opsporingsmethode. A) zebravis embryo's bij 72 hpf werden onderworpenom verwonding zoals eerder beschreven door Niethammer et al.., 2009 39. Vertegenwoordiger confocale beelden tonen pro-oxidatieve deeltjes (ROS) accumulatie (pijlpunt) bij de wondrand van de gewonden staartvin. Oxidatieve deeltjes zijn gedetecteerd met de algemene ROS probe (CellROX, 2,5 uM) 20 minuten na de wond werd gemaakt. Schaalbalk 20 urn B.) Vertegenwoordiger confocale beelden die wond marge van zebravis embryo's bij 72 hpf. Embryo's werden voorbehandeld met VAS2870 (20 uM) of DMSO gedurende 90 minuten voordat de wond werd gemaakt. ROS zijn gedetecteerd met een generieke ROS-gevoelige sonde (CellROX; 2,5 uM) 20 minuten na wond. Image Schaalbalk 20 micrometer. C) Gehele lichaam showing-rotenone oxidatieve stress in de zebravis embryo's. Oxidatieve stress is sterk gedetecteerd in het caudale deel van het embryo zoals getoond in paneel D). Rotenone is een krachtige remmer van mitochondriale ETC die vooral skeletal spiercellen in de zebravis. Schaal bar, 180 micrometer.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve resultaten van de afzonderlijke cellen ROS-opsporingsmethode. A) Vertegenwoordiger FACS plot toont een typisch voorbeeld van de zebravis embryo's gescheiden om enkele cellen. Levende cellen zijn gated in R1 regio volgens de FSC-H en SSC-H parameters. SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (stroomversterking), Mode: lineair; FSC-H:. E00 (Voltage), 2.1 (stroomversterking) B) Vertegenwoordiger FACS plot toont een typisch voorbeeld van de zebravis embryo's gescheiden om enkele cellen. Voor FACS analyse, is het monster werd geïncubeerd met propidiumjodide (PI, 1 ug / ml) gedurende 5 minuten. Dode cellen zijn gated op R2 regio volgens met PI fluorescentie (FL2-H kanaal). FSC-H: E00 (Voltage), 2.1 (stroomversterking), Mode: lineair, SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (stroomversterking), Mode: libuurt. Voltage kanalen: FL-2:. 613 houtblok C) Vertegenwoordiger FACS plots tonen los zebravis embryo's die zijn pro-oxidant behandeling (H 2 O 2) en bijbehorende controles. Endotheliale cellen worden gevisualiseerd door GFP kanaal. FACS plots vertegenwoordigen alle cellen beïnvloed door oxidatieve stress (ROS) op UL en UR. Negatieve cellen worden uitgezet op een lagere kwadranten (LL en LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 zebravis embryo's in 48hpf geïncubeerd met H 2 O 2 (2 mM) of H2O als controle gedurende 10 minuten. Voor FACS analyse worden embryo verwerkt zoals beschreven in het protocol. Cellen die door oxidatieve stress worden gedetecteerd door een algemene ROS-gevoelige fluorescente probe (CellROX, 2.5 uM). Een monster niet geïncubeerd met het ROS-gevoelige probe werd opgenomen als negatieve controle. Vergelijking van de onderworpen pro-oxidant behandeling met de controlemonster, het aantal cellen uitgezet op de bovenste kwadranten (UL + UR) groter. FACS acquisvulle instellingen waren als volgt: Voltage kanalen: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Log D) histogram dat het percentage cellen (UL + UR) die door oxidatieve stress in H 2 O 2 behandelde embryo's en bijbehorende besturing. Metingen zijn gerelateerd aan getoond in C monsters. Cellen die door oxidatieve stress worden gedetecteerd door een algemene ROS-gevoelige fluorescente probe (CellROX, 2.5 uM). Resultaten zijn het gemiddelde van n = 2 verschillende biologische herhalingen ± SD. E) Histogram met het percentage endotheelcellen (GFP +) beïnvloed door oxidatieve stress (ROS +) in H 2 O 2 behandelde embryo's en bijbehorende besturing. Metingen zijn gerelateerd aan getoond in C monsters. Resultaten zijn het gemiddelde van n = 2 verschillende biologische herhalingen ± SD. F) histogram dat het percentage cellen die door oxidatieve stress (ROS +) in nrf2a morphants (nrf2a MO) en bijbehorende controles(Ctrl MO) op 24 hpf. Resultaten zijn het gemiddelde van n = 2 verschillende biologische herhalingen ± SD G) histogram dat het percentage cellen die door mitochondriale oxidatieve stress in behandelde embryo (Rotenon;. 10 uM) en de respectieve controles (Ctrl, DMSO) en 72 hpf. Na dissociatie van embryo's in afzonderlijke cellen werd mitochondriale oxidatieve stress (mitochondriale ROS +) gemeten met een mitochondriale specifieke probe (MitoSOX, 5 uM). Resultaten zijn het gemiddelde van n = 3 verschillende biologische herhalingen ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritische stappen

De procedure voor oxidatieve stress detectie in zebravis embryo hierin beschreven omvat twee verschillende methoden. De hele mount ROS-detectiemethode is vooral een kwalitatieve test voor ROS-detectie, terwijl de cel ROS-detectie methode is de specifieke kwantitatieve metingen (figuur 1). Beide methoden bieden een snelle en eenvoudige manier om in vivo ROS-detectie in zebravis embryo's te beoordelen. Maar ze beiden presenteren een aantal kritische stappen.

Kritische stappen naar methode I Related

De eerste methode voor het gehele mount ROS-detectie heeft het grote voordeel dat de oxidatieve stress gemakkelijk gedetecteerd in alle weefsels van levende embryo's (Figuur 2). Er zijn echter drie belangrijke kritische aspecten die moeten worden overwogen en kunnen de resultaten van de test beïnvloeden: 1) de permeabiliteit van de sonde naar embryoweefsels, 2) de toxiciteit sonde en 3) ee sondegevoeligheid laag ROS concentratie.

Het eerste aspect is specifiek betrekking op de in vivo toepassing van de werkwijze 42. De "cel-doorlaatbaarheid" eigendom van de ROS-gevoelige sonde is een essentieel kenmerk voor de verwezenlijking van deze test. Idealiter alle in water oplosbare stoffen zijn optimaal voor levering in levende zebravis embryo's; maar de meeste van de reagentia voor oxidatieve stress detectie zijn onoplosbaar in water. Aldus wordt meestal aanbevolen om probes die oplosbaar in DMSO (dimethylsulfoxide) gebruikt.

Er zijn mogelijk toxische effecten op embryo verband met de concentratie van ROS probe. Bijwerkingen worden gewoonlijk voorgesteld door weefselbeschadiging (bijvoorbeeld necrose) of versnelde metabolisme van de sonde. Lange incubaties (dagen) van zebravis embryo's met de sonde hydroethidine oorzaak embryosterfte terwijl hoge doses van 5 - (en-6)-carboxy-2 ', 7'-dichloorfluoresceïne diacetaat leidt non-specifieke accumulatie van de fluorescentie in de darm (ongepubliceerde gegevens). Om dit probleem te overwinnen is het belangrijk om embryo volgen tijdens de incubatie met de probe. Testen van verscheidene concentraties en tijd van incubatie met dezelfde probe zou gunstig zijn ook. De optimale incubatietijd maakt levering en oxidatie van de moleculaire sonde zonder oppervlakkige weefsels beschadigen. Incubatietijden met chemische probes (0,5-10 pM) kunnen in het algemeen worden vastgesteld in het traject van 10-30 minuten en niet meer dan 1 uur. Deze voorwaarde kan heel lastig op te zetten in het bijzonder wanneer de hoeveelheid oxidatieve deeltjes dicht bij fysiologische niveaus of wanneer het wordt beperkt tot interne embryonale weefsels. Inderdaad, als een geheel organisme wordt geïncubeerd met een ROS-chemische detectie probe, de meest oppervlakkige weefsels (bijvoorbeeld huid, ogen en hart) zijn wanneer de sonde hoofdzakelijk geoxideerd en wordt fluorescentie. Later wordt de sonde geleidelijk geleverd inwendige organen, lever of vessel. Bijgevolg een geschikte tijd voor de incubatie van zebravis embryo's met de ROS-detectie probe is cruciaal voor oxidatieve stress te detecteren in alle weefsels.

Tenslotte, bij gebruik van deze methode is het belangrijk om de gevoeligheid van de sonde naar het niveau van oxidatieve stress bij weefsels uitgesproken heeft. De meeste van de commercieel beschikbare probes niet fijn gekarakteriseerd voor hun gevoeligheid en dit betekent dat de optimale probe voor specifieke toepassingen empirisch worden bepaald. Alle ROS-gevoelige sondes algemeen detecteren hoge niveaus van oxidatieve stress, maar de meeste van hen zijn niet gevoelig voor minimale verschuivingen van oxidatieve stress 43.

Om dit nadeel te beperken en biedt een meer gedetailleerde en nauwkeurige analyse is voorgesteld de tweede methode van enkelvoudige cellen detectie van oxidatieve stress toepassing.

Kritische stappen naar methode II Related

De sIngle-cel ROS-detectiemethode presenteert een aantal kritische stappen. Ze worden voornamelijk bepaald door 1) de efficiëntie van embryonale cel dissociatie en 2) het type ROS-gevoelige probe gekoppeld aan de assay.

De dissociatie van embryo's in afzonderlijke cellen is aangepast voorgaande protocollen zebravis celanalyse via flowcytometrie 44 en weer twee belangrijke aspecten die sterk beïnvloeden het resultaat van de hele procedure. Het eerste aspect betreft de methode om embryo dissociëren, terwijl de tweede is verbonden met het herstel van gedissocieerde cellen.

De dissociatie van embryo's in afzonderlijke cellen wordt voornamelijk bepaald door de concentratie van dissociatie reagentia (bijvoorbeeld collagenase P en trypsine). Er moet echter worden aangenomen dat de efficiëntie van weefsel dissociatie is afhankelijk van het aantal embryo's geïncubeerd en hun ontwikkelingsfase. Zebravis embryo's in vroegere ontwikkelingsstadia (24 HPF-48 HPF) zijn meer gevoelig voor dissociatie reagentia dan larven (96 HPF-120 HPF) vanwege progressieve weefsels groei 45. Zo worden aanpassingen in de dissociatie procedure nodig bij het werken met de zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia dan 72 HPF. Overmatige incubatie met reagentia celdood veroorzaakt door de verlaagde concentratie van reagentia gedeeltelijk dissocieert het embryo. Omdat het belangrijk is om weefsels correct splitsen, is het even belangrijk om te verzamelen en te bewaren enkele cellen. Een belangrijke overweging is de temperatuur waarbij cellen worden gewonnen na weefsel deling. Het is belangrijk om cellen op ijs of bij 4 ° C te houden tijdens het centrifugeren om de oxidatieve stress secundair aan mechanische verbreking van weefsels of behandelingsprocedures beperken.

De tweede kritische stap over de bijbehorende sonde is verbonden met de analyse van een specifiek weefsel van belang. De gemakkelijkste manier om een ​​mobiele Popul detecterenatie in de zebravis wordt aangeboden door het brede scala van transgene lijnen die de afgelopen decennia 46,47 hebben vastgesteld. Maar de fluorescentie van de geselecteerde transgene lijn moet zijn met de ROS-detectie sonde. Het is cruciaal om overspraak tussen weefsel achtergrond fluorescentie en het lage, maar specifieke fluorescentie signaal uitgezonden door de sonde te voorkomen.

Toepassingen van dit protocol

Aangezien beide methoden bieden een eenvoudige en kosteneffectieve assay oxidatieve stress in vivo te meten, is het mogelijk dit protocol is voor verscheidene voorwaarden:

Metingen van oxidatieve stress in verschillende genetische (bijv. pathologische) Voorwaarden

Oxidant en anti-oxidant genen kunnen gemakkelijk worden gemoduleerd in zebravis embryo's door de injectie van morpholinos (verlies-van-functie) of mRNA (gain-of-function). Meldde onlangs experimenten van gen knock-down en microinprojectie van de afgetopte mRNA in zebravis embryo's opgericht verschillende rollen voor de antioxidant Nrf2a en Nrf2b genen in cellen beschermt tegen oxidatieve stress tijdens de ontwikkeling. Benaderingen van genexpressie modulatie onderzocht een evolutionair sterk geconserveerde as tussen zoogdieren en zebravis hypoxie response en oxidatieve stress in neuronale cellen 38,48. Daarnaast is een grote kans om de oxidatieve stress te bestuderen aangeboden door verschillende zebravis mutant lijnen. Bijvoorbeeld, de zebravis ducttrip (DTP) mutant vertegenwoordigt een interessant voorbeeld voor de karakterisering van oxidatieve stress in verband met een pathologische aandoening. DTP mutant draagt ​​een deficiëntie voor de S-adenosylhomocysteïne hydrolase (ahcy) gen en de karakterisering blijkt dat het verlies van activiteit Ahcy lever degeneratie veroorzaakt door beïnvloeding ROS levels 49. Equivalent, de zebravis mutant Nrf2 fh318, het dragen van een functio verlies-van-n mutatie van de transcriptiefactor Nrf2 gen, werd gezien met een groot belang voor de beschermende rol van dit gen antioxidant lagere vertebraten 50 onderzoeken.

Metingen van Redox staat Veroorzaakt door farmaceutische verbindingen

Behandeling van zebravis embryo's met kleine drugs kunnen remmen of activeren van oxidatieve stress. We tonen onlangs dat statine behandeling van zebravis embryo oxidatieve stress die kan worden hersteld door CoQ10 behandeling 51. Ook de analyse van oxidatieve stress in de zebravis diermodel voor humaan-RYR1 gerelateerde myopathieën gewezen op de rol van de antioxidant geneesmiddel NAC (N-acetylcysteïne) als potentiële therapeutische benadering voor spierziekte 52.

Grootschalige screening van kleine moleculen en drugs om hun oxidatieve eigenschappen karakteriseren

De zebravis is een gevestigde dier model voor grote chemische screening. Een recente chemische screening van kleine moleculen uitgevoerd in zebravis die antioxidanten als modulatoren van dopaminerge neuronen overleven, die ernstig beïnvloed in zoogdierlijke neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson 53. Deze methode kan worden gebruikt voor het screenen van nieuwe pro-of anti-oxidant moleculen in vivo.

Betekenis en beperkingen

De aandacht van zowel "whole mount" en "single-cell" ROS-detectiemethoden gebaseerd op de mogelijkheid om te presteren in vivo metingen van oxidatieve stress door eenvoudige laboratoriumtechnieken en basisuitrusting. De toepassing van de zebravis als diermodel in combinatie met ROS detecterende probes kan niet alleen de enkele openbaring van oxidatieve stress, maar ook de detectie in de context van een levend organisme en kwantificatie op het niveau van afzonderlijke weefsels. Belangrijk is, kunnen deze assaysuitgevoerd met commercieel beschikbare hulpmiddelen en geen specifieke kennis te realiseren vereisen. Daarnaast zijn beide methoden niet tijdrovende procedures en kan worden toegepast met de juiste tijd om grote series monsters. Alles bij elkaar deze praktische voordelen maken deze methoden van bijzonder belang voor oxidatieve stress analyse in vivo te verbeteren.

Maar deze assays tonen ook enkele beperkingen. In het algemeen worden de meeste ROS-gevoelige probes nu in de handel verkrijgbaar niet gewaardeerd om fijne kwalitatieve en kwantitatieve analyse van oxidatieve stress in levende cellen. De meest gebruikte hydroethidine en MitoSOX probes werden ontworpen voor het meten van de superoxide (O 2 -.), Maar onlangs zorgen over hun specificiteit zijn gerezen, vooral bij gebruik van fluorescentie-gebaseerde assays 54. Analoog sommige rapporten gevorderd twijfels over de dichloorfluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) voor de exclusieve H 2 2 sensing 55,56. Bovendien zijn deze redox-actieve fluorescerende probes worden gekenmerkt door een gedeeltelijke niet-specifieke activatie (dwz weefsel auto-fluorescentie) en zijn niet reversibel na oxidatie. Zodra de fluorescente probe wordt geoxideerd door ROS kan niet terug naar de niet-fluorescerende gereduceerde toestand komen. Dus ook de detectie van ROS fluctuaties met temporele resolutie wordt beperkt door toepassing van dergelijke chemische probes 43.

Een belangrijke beperking van dit veld wordt vertegenwoordigd door het ontbreken van probes voor exclusieve RNS detectie. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden aangetoond dat RNS induceren eiwit modificaties die als biomarkers voor nitroso-actieve stress en via immunoblotting testen kunnen worden geëvalueerd door specifieke antilichamen tegen eiwit oxidatie / nitratie (bijvoorbeeld anti-SNO-cysteïne, anti-3- nitrotyrosine) 22,23. Echter, al deze assays zijn alleen indirecte metingen van oxidatieve stress veroorzaakt door RNS en in de meeste gevallen cellulaire extracten vereisen, wat betekent dat ze niet voor levende cellen of levende zebravis embryo.

Een goed alternatief voor conventionele sondes wordt vertegenwoordigd door genetisch-gecodeerde redox-gevoelige fluorescente proteïnen. De belangrijkste bestanddelen van deze groep zijn: roGFP, afkomstig is van groen fluorescerende eiwitten, rxYFP en cpYFP, ​​beide afgeleid van het geel fluorescerend proteïne en HyPer probe een specifiek H 2 O 2-gevoelige fluorescente probe 57. Al deze gemanipuleerde redox probes door fluorescente proteïnen mogelijk fluorescentie gebaseerde ratiometrische kwantificering en mogelijk hogere temporele resolutie (van seconden tot minuten) dan chemische probes 58. In vivo toepassing van deze biosensoren is ook mogelijk zoals blijkt uit de zebravis transgene tot expressie HyPer voor real-time detectie van endogene H 2 O 2 verdiepingen 39,59. IkENUITVOERLEGGING de zebravis met genetisch gecodeerde sensoren biedt een optimaal systeem om oxidatieve stress te onderzoeken, maar vereist het opzetten van een transgeen dier lijn en geschikt imaging-tools. De procedure voor oxidatieve stress detectie in zebravis hier gepresenteerde is minder nauwkeurig dan genetische methoden, maar is snel en verschaft een primaire test voor in vivo detectie van hoge niveaus van pro-oxidatieve deeltjes. Nauwkeurige meting van afzonderlijke reactieve zuurstof en / of stikstof soort nog een limiet van dit onderzoeksgebied. In de toekomst kan aanstaande nanoschaal redox-sensoren helpen om dit probleem op te lossen. De succesvolle toepassing van nanodeeltjes en nanobuis gebaseerde redox-sensoren is getest in verschillende in vitro studies, maar niet beschikbaar is als in vivo testen tot nu toe 60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Developmental Biology , Zebravis embryo's endotheelcellen redoxtoestand analyse oxidatieve stress detectie, moleculaire probes
Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo's
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter