Summary
Protokoll detaljer ges för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller med andra harmoniska genererar nanopartiklar. Metoder för hESC utredning av flera foton mikroskopi och deras differentiering i hjärt kluster presenteras också.
Abstract
I detta visualiseras experimentet protokoll uppgifter tillhandahålls för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller (hESC) med andra harmonisk generation nanopartiklar (HNPs). De senare är en ny familj av sönder som nyligen införts för att märka biologiska prover för multifotonavbildning. HNPs är kapabla att fördubbla frekvensen av excitationsljus genom den icke-linjära optiska processen för andra harmoniska generationen utan någon begränsning av den exciteringsvåglängden.
Multi-foton-baserade metoder för hESC differentiering till hjärt-kluster (hållna som långsiktiga luft vätska kulturer) presenteras i detalj. Framför allt är bevis på hur man maximerar den intensiva andra övertonen (SH) emission av isolerade HNPs under 3D-övervakning av att slå hjärtvävnad i 3D visas. Analysen av de resulterande bilderna för att hämta 3D förskjutningsmönster är också beskrivet.
Introduction
Nonlinear mikroskopi system, tack vare deras inneboende tredimensionella sektione kapacitet, har alltmer utlöst efterfrågan på fotostabila fluoroforer med två-photon absorptionsband i det nära infraröda. Endast i de senaste åren, som komplement till utvecklingen av fluorescensbaserade etiketter (färgämnen, kvantprickar, upp-konvertering av nanopartiklar), en annan avbildningsmetod har varit att utnyttja användningen av en ny familj av inneboende olinjära nanopartiklar som markörer, det vill säga harmoniska nanopartiklar (HNPs) som har utvecklats speciellt för multi-foton mikroskopi. Dessa etiketter, som bygger på oorganiska centrosymmetrisk kristaller, utöva optiska kontrast genererar SH av exciteringsfrekvens: till exempel genom att omvandla en del av nära infrarött pulsad excitation ljus (λ = 800 nm) till synligt blått ljus (λ / 2 = 400 nm) . Flera författare under den senaste tiden har testat olika material, bland annat järn iodate Fe (IO
I detta visualiseras experimentet protokoll uppgifter tillhandahålls för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller (hESC) med ofunktionaliserade HNPs. Det syntes och beredning av kolloidala suspensioner beskrivs i en tidigare publikation och referenser däri 16 och är utanför ramen för detta arbete. Metoder för hESC utredning av flera foton mikroskopi och deras differentiering i hjärt-kluster (hållna som långsiktiga luft vätska kulturer) presenteras. Human ESK kan låta att skilja inom så kallade embryoidkroppar (EBS) på två olika sätt, antingen genom EB bildandet av kolonifragment i suspension eller alternativt tvingas aggregering av enskilda celler i EBS använder Aggrewell plattan, som visas i figur 1 A . Odling slå kluster av hjärt-celler på polytetrafluoretylen (PTFE) porösa filter facilitates deras långsiktiga underhållet för fortsatta studier (t.ex. elektrofysiologiska mätningar av aktionspotentialer).
Den exciteringskälla av avsökningsmikroskop bör kunna avge ultrakorta pulser (med en pulsvaraktighet som är mindre än 300 fsec hos provet) för att uppnå den maximala kraft som behövs för att utföra andra harmoniska avbildning av HNPs. Till exempel den vanligaste fsec-källa som används för avbildning är avstämbara Ti: Sapphire lasrar. Alternativt kan andra ultrasnabba lasrar användas, till exempel erbium ion 17, krom forsterit 18 eller Ti: safir pumpas infraröda optiska parametriska oscillatorer. Mikroskopet kan utrustas med ett objektiv med företrädesvis en relativt hög numerisk apertur. Mycket viktigare, innan mätningar, och varje gång målet skall ersättas, är det obligatoriskt att minimera dispersionen närvarande i set-up (linser) genom att optimera inställningarna för laserpulsen pre-kompressor vid arbetselektrodenvåglängd av val. Detta förfarande, som beskrivs i protokollet, ser till att laserpulsen är så nära som möjligt till den trans begränsad varaktighet (dvs. kortast möjliga) på fokalplanet och maximerar prov olinjär respons.
Målet med bildanalysen beskrivs i slutet av protokollet är att identifiera och spåra i 3D HNPs rörelser i samband med de rytmiska sammandragningar av att slå hjärt kluster. Spårningsnanopartiklar i bildplanet är helt enkelt realiseras genom att identifiera sina positioner i successiva filmrutor. För att extrahera information om axiell rörelse, är en tidigare kalibrering av den icke-linjära intensitetssvaret som en funktion av axiell förskjutning obligatorisk. Observera att för långtidsmätningar, en aktiv interferometriskt reglering av provtagnings axiella läge krävs för att upprätthålla giltigheten av kalibreringskurvan i närvaro av termiska och / eller mekaniska drivor.
De HNPs används här för att trace slå celler i aggregat är baserade på kalium niobate oxid (KNbO 3), men andra tillgängliga olinjära nanomaterial granskas i detalj i arbetet med Staedler et al 16.
De icke-linjära optiska effektivitet på de flesta av de nanomaterial som undersökts hittills är mycket jämförbara. Valet för KNbO 3 var i huvudsak motiveras av den goda stabiliteten i kolloidal lösning och dess god biokompatibilitet, testats på flera humana cellinjer även vid relativt hög koncentration och långa utställningstider 16.
Med tanke på att nanomaterial används för detta arbete är de viktigaste egenskaperna för HNPs jämfört med fluorescerande / självlysande Biomarkörer visas i en kort ursprungliga datorn video animation realiseras av författarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur och Utbyggnad av mänskliga ESC
- Förbered cellförökningsmediet (kallad PM) innehållande Knockout DMEM kompletterat med 20% Knockout Serum, 1% MEM icke-essentiella aminosyror, 1% L-glutamin 200 mM, 1% penicillin-streptomycin och 3,5 | il β-merkaptoetanol.
- Tina humant ESC (hESC) i 8 ml PM-medium och centrifugera dem 5 min vid 115 xg för att kassera DMSO-kompletterat frysmedium.
- Tillsätt 1 ml PM-medium innehållande 10 mM Rock inhibitor för att förhindra apoptos och förbättra cellöverlevnad vid tining (24 hr endast inkubation).
- Lägg basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) till PM vid den önskade koncentrationen (4-10 ng / ml) under upprätthållande av pluripotens.
- Plåt hESC på bestrålad human förhud matarceller (γHFF) (figur 1 A), som tidigare på platta vid en koncentration av 2 x 10 4 celler / cm 2.
- Ändra medel dagligen och, vid behov, ta bort delar av colonies börjar att differentiera genom aspiration med användning av en långsträckt skarpt skära pasteurpipett.
- En gång i veckan, passage kolonier enzymatiskt:
- Ta medium och tvätta kolonier med 2 ml PBS.
- Avlägsna PBS och inkubera dem med 0,5 ml per brunn av varm kollagenas IV vid 1 mg / ml i 10 min vid 37 ° C, 5% CO2.
- Samla kolonifragment i 2 ml nytt PM och centrifugera vid 115 xg under 3 min.
- Alternativt kan kolonier passe mekaniskt genom att skrapa:
- Ta medium och tvätta kolonier med 2 ml PBS.
- Skrapa manuellt kolonier med hjälp av StemPro EZPassage rullskrapverktyget (Figur 1B).
- Samla kolonifragment och centrifugera sedan i 3 min vid 115 xg för att avlägsna supernatanten.
- Plåt fragment på γHFF eller bearbeta dem för differentiering till embryoidkroppar (EBS).
2. Human ESC differentieringProtokoll
- Förbered differentieringsmedium (DM) med användning av Knockout DMEM kompletterat med 2% Hyclone serum, 1,0% MEM icke-essentiella aminosyror, 1,0% L-glutamin 200 mM, 1% penicillin-streptomycin, 3,5 | il β-merkaptoetanol.
- Ta medium och tvätta kolonier med 2 ml PBS.
- EB bildandet av kolonifragment i suspension:
- Avlägsna PBS och inkubera dem med 0,5 ml per brunn av varm kollagenas IV vid 1 mg / ml i 10 min vid 37 ° C, 5% CO2.
- Samla kolonifragment i 2 ml nytt DM och centrifugera vid 115 x g under 3 min.
- Kultur dem i suspension i ultralåg fastsättning 6-brunnsplattor (2 ml per brunn) under 4 dagar (Figur 1C).
- Samla och plattan de nybildade EB på 0,1% gelatinbelagda 24-brunnars plattor (omkring 3 EB / brunn) (figur 1D).
- Alternativt tvingade aggregering av enskilda celler i EBS använder Aggrewell plattan:
- Ta bort PBS ochdissociera kolonier i enstaka celler med användning av Accutase (0,5 ml / brunn).
- Centrifugera och återsuspendera cellerna i DM på 1.2 x 10 6 / ml.
- Tillsätt 2 ml per Aggrewell kammare för 1 dag (Figur 1B).
- Samla nybildade EBS (figur 1C ") och plattan dem på 0,1% gelatinbelagda 24-brunnars plattor (omkring 3 EB / brunn).
- Ändra DM var 2-3 dagar tills utseende slå kluster av hjärtmuskelceller (15-30 dagar).
3. Luft flytande 3D Kulturer av Beating Kluster och märkning med HNPs
- Identifiera och manuellt dissekera kluster av slå cardiomyocytes (figur 1D), som normalt uppträder efter 2-4 veckor av kultur, med hjälp av en långsträckt skarpt skära pasteurpipett.
- Deposit 4 PTFE filter per insats som kommer att ställas på en 6-brunnar (Figur 1F).
- Tillsätt 1 ml DM medium på toppen av EACh också.
- Lägg en dissekeras slå kluster på varje PTFE-filter (figur 1E), maximal 4/well, dvs 24 aggregat per platta (Figur 1F).
- Ändra DM mediet var 2-3 dagar.
- Att märka kluster, ta bort PTFE filtret med stryk klustret och lägga den på 3,5 cm glas nedre skålen (170 ìm tjock).
- Tillsätt 1 ml HNP i en koncentration av 50 | ig / ml under 30 min.
4. Icke-linjär optisk avbildning
- Provberedning. Efter HNP märkning (se steg 3.6), överför antingen hela skiljer tidiga HeBS eller hjärt beating kluster (dissekeras på kontraktion utseende) på PTFE-filter över en 170 nm tjockt glas-nedre skålen kompatibel med arbetsavståndet för höga numeriska mål bländare. Alternativt, tillämpa en direkt beläggning av att slå kluster till glas nedre skålen pre-belagd med 0,1% gelatin.
- Överför prover till ettallt-i-ett mikroskop utrustat med inkubation kammare garanterar stabil temperatur, fuktighet och CO2 kontroll över längre tidsperioder.
- Efter första besiktning, bild provet via brett fält avbildning under vitt ljus belysning för att identifiera strukturer av intresse inom differentierade EB eller aktiva beating kluster som kommer att väljas ut för fortsatta undersökningar.
- Om cell autofluorescens från NADH och SH från HNPs måste samtidigt förvärvas, ange en kortare laserexcitation våglängd (dvs 720 nm) för att matcha den molekylabsorption. Använd ett smalt bandpass spektralfilter centrerat vid halv excitationsvåglängden (dvs λ = 360 ± 10 nm) för att detektera SH, och en annan en för att detektera autofluorescens.
- För det första gör en snabb, låg upplösning, tredimensionell scan för att återuppbygga den övergripande morfologin av hjärt klustret och välj ett bildplan inom klustret volymen med flera synliga HNPer.
- Om det behövs ändrar excitationsvåglängden fritt att bäst matcha provets optiska egenskaper, eller för att undvika fotoblekning, fotoskador och bild djupare in i vävnader med en IR våglängd (dvs 790 nm) och byt ut den andra harmoniska filtret därefter (dvs., 395 nm ). Optimera inställningarna för laserpulsen före kompressor vid arbetsvåglängd i valet genom att maximera den andra harmoniska signalen av HNPs deponeras på provet.
- Om du vill övervaka i realtid hjärtkluster sammandragningar, ställa mikroskopet optiska skannern i det snabbaste läget såsom resonansläge, vilket gör att hög hastighet förvärv av tvådimensionella bilder.
- Välj inställningarna som bästa kompromissen mellan bildkontrast och förvärvs hastighet, till exempel:
- Scan medelvärdes: 4
- Pixel uppehållstid: 0.1 xsek
- Bildhastighet: 3.75 bilder per sekund (fps)
- Lasereffekt justeras enligt fokalpunkten size och skanningshastighet. 50 mW (mätt vid ingången av målet) är ett typiskt värde för 0,1 isek pixel uppehållstid och Plan APO 20X NA 0,75 mål bevara cellernas livskraft.
5. Bildanalys
- Axiell kalibreringen. Välj en HNP deponeras på en kal substrat. Justera fokus (dvs. den axiella positionen för nanopartiklar) för maximering av SH intensitet. Variera på ett kontrollerat sätt det axiella läget för mikroskopets objektbord för att erhålla kalibreringskurvan som avser SH intensiteten som en funktion av den HNP förskjuten från fokalplanet. Utgången av denna kalibreringsförfarande för Plan APO 20X NA 0,75 mål redovisas i figur 4C.
- Markera HNPs som finns i alla bildrutor och bestämma deras periodiska rörelser. Detta förfarande kan lätt automatiseras, till exempel genom en egen kod som söker för maximal signalintensitet fläckar i ett definierat område av intresse ochansluter dem bland olika ramar (ett exempel kod skriven i Matlab R2009 b med funktionen "region rekvisita" i bildbehandling Toolbox presenteras).
- Bedöma kvantifiering av out-of-planet förskjutningar, i samband med icke-kontinuerlig spår HNPs rör sig längs den optiska axeln, genom att omvandla deras intensitetsmoduleringar under olika ramar i axiell förskjutning med hjälp av kalibreringskurvan bestämmas i steg 5.1. Notera att denna procedur ger tillgång till axiella rörelser, men kan inte användas för att bestämma den absoluta riktningen (uppåt eller nedåt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före bedömningen av misshandeln aktivitet genom konfokal avbildning, var en noggrann karakterisering av den olinjära optiska respons av PTFE-filter utförs, antingen ensam eller i närvaro av HNPs vid hög koncentration (1 mg / ml). Det var till att: i) den nakna substratet två-foton glada fluorescens är mycket svag och kan inte hindra att mäta de relevanta biologiska prover, och ii) utsläpp SH från isolerade HNPs kan lätt förvärvas genom avbildning genom substratet i epi avkänningsläge (Figur 2). Målet var att få referenskontroller för kvantifiering av 3D-förskjutning.
I fig. 3 är HNP-märkta hjärtstrukturer och EB visas. Den röda (figur 3A), gul (figurerna 3B och 3C), och, grön (Figur 3D) färgerna motsvarar NADH autofluorescens, medan den intensiva blå SH fläckar härrör från isolerade HNP. Det är intressant att point i den utomordentliga optiska kontrast uppnås med denna teknik och den relativt glesa märkning jämfört med andra nanopartiklar-baserade metoder, såsom kvantprickar eller upp-konvertering nanopartiklar. I den aktuella studien, som har mycket intensiva isolerade etiketter var fördelaktigt för att spåra flera oberoende enskilda partikelrörelser och rekonstruera kollektiv av stamcellsderiverade strukturer.
Figur 3B visar en bit av en HNP-märkt hjärt stryk kluster. Sådana 3D-strukturer kan sedan spelas in med hög hastighet för att övervaka kontraktion mönster i cell HNP aggregat som redovisas i film 1. I det här fallet, för att hålla en hög förvärvs hastighet takt för att lösa NP-rörelsen, den totala förvärvs känsligheten var inte tillräckligt för registrering av cell autofluorescens tillsammans med SH emission från HNPs.
Tillämpningen av bildanalys som beskrivs i avsnitt 5 i protocol tillämpas ensemblen av bildrutor i filmen gör att extrakt av information om enskilda HNP rörelse (riktning, i planet och ut-ur-planet förskjutning, frekvens). Resultatet av denna analys (figur 4) visar att, inom samma hjärt kluster, är konstanta frekvensen för in-och ur-plan rörelse (se Fouriertransformen i figur 4B) och förskjutningar är av storleksordningen några få mikrometer (längderna av de pilar som anger de exemplifierande förskjutningar av fem NP i Figur 4A motsvarar den maximala töjning av svängningarna).
Figur 1. Differentiering av hESC till hjärt beating kluster och märkning med HNPs nanopartiklar för andra harmoniska imaging mikroskopi. Undifferentiated hESC kolonier (A) var antingen 1) skärs i mindre bitar med användning av StemPro EZPassage verktyget (B) och låt i suspensionen för att bilda oregelbundna EBS (C), eller 2) dissocieras till enskilda celler och reclustered använda Aggrewell systemet (B ') för att bilda regelbundna EBS (C'). Båda typerna av EBS (C eller C ') odlades under två dagar i suspension och därefter vidhäftas till gelatinbelagda rätter. Seger kluster av kardiomyocyter (D) var sedan manuellt dissekerades med användning av en skalpell och odlades på PTFE-filter (E) avsatt på skären för att tillåta luft-vätske-3D-kulturer (F och F "). (Skala barer för paneler A, B, B ' , C och C ': 100 nm; för panelerna D och E:. 250 um) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. PTFE-substrat optisk karakterisering. (A) Bright fält bild av enbart PTFE-filter. (B) Två-foton bild av PTFE-filtret, som visar en svag fluorescens jämfört med den ganska höga laserintensitet ansökt om denna kontrollmätning (13 mW). (C och D) När du har lagt till den nakna substratet en vattendroppe som innehåller HNPs vid 1 mg / ml koncentration, deras SH utsläpp kan lätt förvärvas genom filtret vid jämförelsevis låg laser intensitet (2 mW). I D, är en 3D-bild av nanopartiklar sprids på filtret visas. (skala barer: 50 mikrometer).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
Figur 3. Multi avbildning av HNP märkt hjärt strukturer och EBS. (A) De två-photon fluorescens signal om stryk kluster visas i rött och SH-signalen från HNPs visas i blått. Färgerna motsvarar intensiteten mätt av de fyra nondescanned fotomultiplikatorer utrustade med olika spektrala filter. (Blå 395 ± 11 nm, grön 485 ± 20 nm, gul 531 ± 40 nm, och röd 607 ± 70 nm). Detta kluster avbildades direkt genom det porösa PTFE-filter med en 10X mål med en excitationsvåglängd av 720 nm och en medeleffekt på 8,8 mW. (B) En del av en HNP märkt hjärt struktur heras från ett z-stack. (C) En EB avbildas genom de PTFE (skal barer för A, B och C: 100 | im). (D) En 3D-bild av en EB märkt med HNPs, rekonstrueras från z-skanningar med hjälp av en apochromatic 40X NA 1.25 nedsänkning i vatten mål (skala bar: 50 pm). De HNPs är väl spridda runt hela EB och hjärt-klustret, vilket gör att analysen rörelsen.
Figur 4. (A) Individuell bildruta i filmen med misshandeln klustret och vektoranalys av i-planet HNPs förskjutningar (SH signal som visas i svart). Längderna av pilarna motsvara den maximala töjningen av oscillationerna. (B) Fouriertransformen av NPS oscillationer visar att inom samma hjärt kluster, är frekvensen konstant för in-(svart linje) och out-of-plan rörelse (orange streckad linje) och motsvarar 0,4 Hz. (C) Kalibreringskurva som används för att omvandla HNP intensitet i axiell förskjutning (se avsnitt 5 i protocol). Cirklar: experimentella datapunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpningen av nanoteknik för att stamcellsforskning är en relativt ny men snabbt växande område. Som påpekats av olika översiktsartiklar i ämnet, kan tillämpas på användning av nanopartiklar för att utföra olika forskningsuppgifter, som sträcker sig från cell tracking (både in vitro och in vivo), till intracellulär leverans av proteiner och gener, inte minst skapandet av biomimetiska cellulära miljöer för företrädesrätt stimulering / hämning av specifik differentiering spridningsvägar 19,20. Den metod som beskrivs i detta protokoll är begränsad till optisk spårning och även möjligheten att använda infraröd excitation leder till ökad penetrationsdjup i förhållande till fluorescens baserade tekniker; optisk avbildning kan inte utsträckas till hela kroppen och därför bör kompletteras med magnetisk detektion 21. Tidigare publicerade arbete visade flera metoder för att utvärdera struktur och rörelse av hjärtcellskluster, isive märkning med fluorescerande färger 22, kvantprickar 23,24, nanopartiklar superparamagnetiska järnoxid 25, och upp-konvertering fluorescerande partiklar 26-28. Fördelarna med HNPs avseende dessa nanoprobes är förknippade med avsaknad av blekning över utsträckta tidsperioder, ökad avbildningspenetration, våglängd avstämbarhet för ökad kontrast med avseende på autofluorescens. Den säregna gles cellmärkning (dvs. i figur 3D vi räknar cirka 160 NP i en um sida kub 100) som erhålls genom denna metod visar sig vara mycket väl lämpad att spåra cell sammandragningar i 3D humana ESC-härledda hjärt kluster med hög rumslig upplösning.
Valet av nanomaterialet är inte begränsat till PEG-belagda KNbO 3, men kan omfatta en rik familj av nanopartiklar som uppvisar centrosymmetrisk kristallstrukturer, som eventuellt kan införliva andra functionalities (magnetiska, radioaktiva) möjliggör multimodal upptäckt. Vidare kan sådana PEG-belagda HNPs ytterligare funktionaliseras för att vara specifikt riktade mot epitoper eller bindningsproteiner för att selektivt inrikta sig på specifika cellpopulationer. Å andra sidan, den avbildningsteknik som föreslås här kräver en avsökande mikroskop utrustat med en ultrasnabb laserkälla. En naturlig uppföljning som kan förutses från detta arbete är att övervaka integreringen av märkta celler i 3D biomaterial och ställningar strukturer in vitro och vidare in i naturliga vävnader, för att följa bildandet och funktionen av transplanterade celler under längre perioder.
En fördel med att använda PTFE-filter som bär 3D-aggregat, som i vårt fall, är möjligheten att utföra flera mätningar över dagar och veckor, som filter kan återställas tillbaka på sin insats stöder utan risk för föroreningar. Ännu viktigare, PTFE-filter möjliggör också den repetitiva bedömning av de åtgärder pottentials använder multi-elektrod arrayer.
Cellskadetrösklar för flera foton-excitation i det nära infraröda tidigare har bestämts till mindre än 1 TW / cm 2 av König et al 29. I vår studie, med användning av en 0,75 NA 20x objektiv, förblir den anbringade intensiteten under TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2) och den korta pixel uppehållstid (0,1 ^ sek) jämfört med König arbete (80 ^ sek) säkerställer möjligheten att bevara provet vid liv och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för den delfinansiering från Europeiska FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010 till 246.479, http://www.namdiatream.eu) och Interreg IV Frankrike-Schweiz NAOMI-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H.
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
