Summary
-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.
Abstract
Om nieuwe inzichten in de dynamiek van exocytose krijgen onze richt zich op de veranderingen in de lipide bilaag vorm die bij de fusie van vesicles en plasmamembranen nauwkeurig te worden geregeld. Deze snelle, gelokaliseerde veranderingen worden bereikt door dynamische interacties tussen lipiden en gespecialiseerde eiwitten die membraan kromming controleren. Het ontbreken van dergelijke interacties zou niet alleen verwoestende gevolgen voor vesikel fusie, maar een groot aantal andere cellulaire functies die de controle over membraan vorm betrekken. De afgelopen jaren is de identiteit van een aantal eiwitten met membraan vormgeving eigenschappen bepaald. Wat overblijft ontbreekt is een roadmap van wanneer, waar en hoe ze handelen als fusie en inhoud vrijlating vooruitgang.
Ons begrip van de moleculaire gebeurtenissen die membraan remodeling in staat is historisch beperkt door een gebrek aan analytische methoden die gevoelig membraan kromming of hebben de temporele resolutie te track snelle veranderingen. PTIRFM voldoet aan beide criteria. We bespreken hoe pTIRFM wordt uitgevoerd om te visualiseren en te interpreteren snelle, submicron veranderingen in de oriëntatie van chromaffiene celmembranen tijdens dichte kern blaasje (DCV) fusie. De chromaffinecellen we gebruiken zijn geïsoleerd van runderen bijnieren. Het membraan wordt gekleurd met een lipofiele carbocyanine kleurstof, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chloorbenzeensulfonaat, of deed. DiD intercalates in het membraan vlak met een "vaste" oriëntatie en derhalve gevoelig voor de polarisatie van het verdwijnende veld. De DID gebeitst celmembraan is sequentieel enthousiast met orthogonale polarisaties van een 561 nm laser (p-pol, s-pol). Een 488 nm laser wordt gebruikt om vesicle bestanddelen en tijd zichtbaar het moment van fusie. Exocytose wordt veroorzaakt door lokaal perfuseren cellen met een KCl depolariserende oplossing. Analyse wordt uitgevoerd met behulp van offline-maat geschreven software om te begrijpen hoe heeftemissie-intensiteit wijzigingen hebben betrekking op fusie porie dilatatie.
Introduction
De goede uitvoering van exocytose vereist extreme veranderingen in de membraan dubbellaag vorm precies worden georkestreerd. Voorafgaand aan fusie lokale buiging van de plasmamembraan plaatsvindt onder de korrel, deels om de energiebarrière interactie van bilagen verminderen. Later, membranen fuseren, gebieden van hoge kromming worden gegenereerd en worden gestabiliseerd. Ten slotte moet gesmolten membranen worden gebogen uit hun oorspronkelijke vorm aan de fusie porie uitbreiden en in staat inhoud vrijlating 1. Omdat membranen alleen waarschijnlijk zulke dramatische en gecoördineerde veranderingen ondergaan, eiwitten noodzakelijk gebeurtenissen bemiddelen. Maar hoe ze handelen op veranderingen in membraantopologie beïnvloeden tijdens het fusieproces blijft zeer de vraag.
Uitstekend in vitro modellen bestaan om membraan kromming visualiseren. Het gebruik van negatieve vlek EM, bijvoorbeeld, is belangrijk geweest voor het vormgeven van de huidige moleculaire modellen voor de acties van twee hoofdroutes proteins - synaptotagmin en dynamin (voor overzichten, zie Chapman 2 en Henshaw 3). De meeste real-time analyses van exocytose niet kromming direct detecteren. In plaats daarvan wordt de kromming afgeleid uit testen die rapporteren over de kinetiek van lumenale lading vrijlating 4-8 of veranderingen in membraanoppervlak 9-11. PTIRFM overbrugt de kloof tussen in vivo en in vitro studies doordat directe, real-time metingen van veranderingen in de membraan micromorfologie.
PTIRFM, in een nonimaging modus, is ontwikkeld door Axelrod en collega's om de oriëntatie van NPD-PE opgenomen in een model membraan 12 meten. De techniek werd vervolgens aangebracht op dynamische veranderingen in levende cellen gekenmerkt met Dil en FM1-43 13-18 visualiseren. In pTIRFM worden twee verdwijnende veld polarisaties gebruikt om sequentieel exciteren van een membraan ingebedde probe: p-polarisatie (in het vlak van inval) en s-polarisatie (loodrecht op het vlak van inval). Voorafgaand aan beeldvorming, de sonde - in casu heeft - kort toegevoegd aan het extracellulaire medium en mag intercaleren in het plasma membranen van de cellen te onderzoeken. In regio's waar het membraan is niet evenwijdig aan het dekglaasje (zoals in een membraan ruches of inspringen), het deed ook nonparallel zijn. Bij dergelijke gebieden prikkelbaar de p-pol balk. De p-pol beam minder effectief prikkelen deed in membraan gebieden die meestal parallel aan de dekglaasje. Pixel-to-pixel verhouding images (P / S) de rapportage over de uitstoot van een sequentiële p-en s-pol excitatie van DID zal daarom specifiek benadrukken gebieden van membraan vervorming. In theorie, de P / S-verhouding afbeeldingen zijn gevoelig voor zelfs kleine hoeken plasmamembraan afwijking van het dekglaasje met de amplitude van de veranderingen voorspeld door computersimulaties 18. P / S afbeeldingen zijn ook onafhankelijk van fluorofoor van het dekglaasje oppervlak lokale fluorofoorconcentratie. Lokale fluorofoor concentratie plaats door beelden rapportage over de pixel-voor-pixel som van de P-emissie en 2 maal de emissie S (P 2 S). De P 2 S meting is gevoelig voor de exacte geometrie van de inspringing, met enkele, weinig of geen verandering mogelijk. Dit kan worden aangetoond door computersimulaties dat model overgangen van een fusie-porie van een vroege (dwz met een smalle nek) naar een later stadium 16,18. De P 2 S uit een gefuseerd blaasje bevestigd aan het plasmamembraan via een smalle hals (en meer DID nabij de interface) wordt voorspeld groter bijvoorbeeld dan een gefuseerd blaasje met een veel grotere poriën (waarbij de DID is binnen het zwakste deel van het verdwijnende veld).
In dit artikel bespreken we hoe pTIRFM wordt geïmplementeerd en gebruikt om de snelle, gelokaliseerde veranderingen in de membraan vorm die optreden tijdens fusie porie dilatatie bestuderen. Terwijl slechts een aanvraag is expliciet discussed, de methoden generalizable een verscheidenheid van andere celbiologische processen die direct of indirect betrokken membraan remodeling.
Protocol
1. PTIRF Systeeminstellingen
De pTIRFM techniek is gebaseerd op een omgekeerde microscoop platform. Laserstralen worden geleid via een zij-verlichting poort en een niet-polariserende zijdelings gerichte filter kubus, en dan gericht op de achterkant brandvlak van een 60X 1,49 NA TIRF doelstelling. Twee extra lenzen (1,6 x en 2x) in de emissie-pad tussen de microscoop en EMCCD camera geven een laatste pixelgrootte van ongeveer 80 nm. Laserstralen worden geleid met behulp van software gecontroleerd galvanometer spiegels voor snelle omschakeling tussen epi-en totale interne reflectie (TIR) verlichting. Het hieronder beschreven protocol veronderstelt dat optiek voor TIRF al staan de lucht tafel in de optimale posities voor fluorofoor excitatie en beeldvorming. Het beschrijft hoe polarisatie optiek wordt toegevoegd aan een bestaande TIRF microscoop opgezet om beeldvorming van celmembraan vervormingen mogelijk. Een schema van ons laboratorium optische set-up voor het genereren van zowel TIR en polarization-gebaseerde TIR wordt getoond in figuur 1A. Het protocol gaat uit van het gebruik van een 488-nm laser voor excitatie van fluorescerende blaasje eiwitten en een 561 nm laser voor de beeldvorming van de carbocyanine kleurstof, deed.
- Schakel alle microscoop onderdelen, lasers, en computers.
- Direct een straal van 488 nm laser om de achterkant brandvlak (BFP) van 1,49 NA lens zoals getoond in figuur 1A. Als de laserstraal wordt gericht op de BFP, wordt gecollimeerd ontstaan en verschijnen als kleine goed gedefinieerde vlek op het plafond boven de doelstelling.
- Stel de X galvanometerspiegel (de spiegel in de gelijkwaardige steekproef vliegtuig) zodat laserstraal wordt buiten de as verplaatst en komt voort uit de doelstelling om geleidelijk steiler haaks op de doelstelling normaal.
- Controleer vervolgens of TIR wordt bereikt. Voeg 10 ul van fluorescerende microbolletjes een 1 ml volume PSS in een glazen onderste schaal. Slechts fluorescentie van microsferen op de bodem of de schotel, het dichtst bij het TIR-koppelvlak, worden gedetecteerd. Detectie van drijvende microsferen aangeeft dat de hoek tussen het invallende licht en objectieve normale onvoldoende.
De volgende paragraaf beschrijft de set-up van de optische componenten die nodig zijn voor polarisatie gebaseerde beeldvorming. - Met behulp van de lijn 488 nm balk als een gids, stel de positie van de ruwe 561 nm laserstraal dus het is reizen langs een identieke optische pad. De 561 nm laser zal worden gebruikt voor de beeldvorming van de carbocyanine kleurstof, deed.
- Plaats een divergerende lens en spiegels stroomafwaarts van de 561 nm laser. Met behulp van de spiegels, past u de balk, zodat het wordt coaligned met de 488 nm balk en de plek is scherpgesteld op het plafond als de galvanometer spiegels zijn in de stand "0".
- Center Een kwartgolfplaat (QW) in de bundel pad onmiddellijk stroomafwaarts van de laser opening. Gebruik een QW die ofwel achromatisch of afgestemd op de excitatiegolflengte.Een QW zal circulair polariseren elke lineair gepolariseerd licht dat binnenkomt op een hoek van 45 ° met de optische as. Sommige optische componenten, zoals de polarisatie kubussen hebben een demping voorkeur voor een as van polarisatie. De QW kan worden gedraaid om te compenseren voor deze bias. Deze aanpassing leidt tot een elliptisch gepolariseerde bundel. Een QW is nodig omdat de laserstraal zelf sterk lineair gepolariseerd (verticaal) zoals blijkt uit de opening.
- Plaats een polarisatie kubus (PC1) stroomafwaarts van de elliptisch gepolariseerde bundel. De polarisatie kubus geeft de verticale (y) component van het elektrisch veld en geeft de horizontale (x) component. De polarisatie kubus is geplaatst op een kleine vertalen podium om latere aanpassing van polarisatie bundel paden vergemakkelijken.
- Gebruik een tweede polariserende kubus (PC2) en spiegels (figuur 1A) aan de balken recombineren.
- Plaats een sluiter tussen de eerste polarisatie kubus (PC1) en de verticale component spiegel. Plaats een tweede sluiter tussen de horizontale component spiegel en tweede polarisatie kubus (PC2). Deze luiken worden gecontroleerd door de imaging software zodat de gebruiker snel kiezen tussen balk polarisaties.
- Gebruik een polarisatiefilter het elektrische veld oriëntatie, in elk stralengang. Een polarisatiefilter zal alleen overdracht toestaan in lijn met as van het filter.
- Controleer of de verticale en horizontale componenten van de laserbundel zijn uitgelijnd met elkaar en het 488 nm licht. Maak de nodige wijzigingen. De drie balken moeten allemaal gericht op de BFP en komen gecollimeerd van de doelstelling naar dezelfde plek op het plafond. This plek kan door een X gemarkeerd om toekomstige u gemakkelijker.
- Breng een druppel immersie olie op het doel. Zet de schaal met fluorescente microsferen (zie stap 4 hierboven) aan de doelstelling.
- Voer TIR door het bewegen van de X galvanometerspiegel. In TIR, de verticale gevelelementent van de balk is de s-pol en de horizontale component van de straal is nu de p-pol. Stel de relatieve intensiteit van de bundels door aan de QW plaat. Bekijk elke gepolariseerd verdwijnende veld met een rodamine monster, dat wordt voorspeld willekeurig georiënteerd. Draai de QW plaat om de gemiddelde pixel intensiteiten overeenkomen. Voeg eventueel een filter met neutrale dichtheid in een gepolariseerde bundel pad naar de intensiteit verminderen.
2. Chromaffin celisolatie
Een werkwijze voor het isoleren gezonde chromaffinecellen van het kalf bijnier hieronder. Het is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen Wick, Senter, et al.. 19 en O'Connor, Mahata et al.. 20 Na isolatie cellen elektroporatie met plasmide (s) plaats met een elektroporatie systeem. Dit systeem resulteert in 20-30% van de cellen die de gewenste fluorescerende eiwitten. Typisch, 70% van de cellen overleven de uitverkorenenroporation proces. Details van de PSS en media componenten worden in de tabellen 2, 3 en 4.
- Twee dagen voordat de cel prep, behandel 35 mm optische kwaliteit glazen bodem (0,17 mm dik) schalen met 1 ml poly-D-lysine (0,1 mg / ml), gevolgd door 1,25 ml collageen. Zonder vaten aan de lucht drogen in weefselkweek kap.
- Verkrijgen runderen bijnieren van het slachthuis. Houd de klieren op het ijs terwijl ze worden vervoerd naar het lab. De runderen bijnieren kan worden ingepakt in een dikke laag vet. Gebruik chirurgische schaar om overtollig vet te verwijderen en de bijnier ader opening bloot. Perfuse de ader met prep-PSS totdat de klier wordt gezuiverd van bloed.
- Vervolgens langzaam pipet 2 ml TH-PSS oplossing in de ader opening totdat de klier zwelt. Incubeer de opgeblazen klieren bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Herhaal de TH-PSS behandeling en incubeer opnieuw.
- Knip de buitenste bijnierschors rond de rand van de klier met scissors en schil de klier uit elkaar om het merg bloot. Gebruik een scalpel om voorzichtig schrapen en scheiden het merg uit de corticale weefsel.
- Hak de medulla een paar mesjes gedurende 5-10 minuten.
- Een laatste digestie stap moeten individuele chromaffine cellen te isoleren. Giet het gehakt celsuspensie in een spinfles. Gedeeltelijk vul de kolf met een 02:01 verhouding van TH-PSS (30 ml) tot TL-PSS (15 ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder draaien bij ongeveer 100 rpm.
- Scheid de individuele chromaffinecellen van onverteerd weefsel door te filteren door middel van een 400 um mesh. Verzamel het filtraat. Centrifugeer bij 200 xg om de cellen te pelleteren en resuspendeer in ijskoude PSS.
- Filter de cellen door middel van een 250 um mesh, pellet, en uiteindelijk opnieuw in suspensie in elektroporatie buffer (zie stap 2.9).
- Tellen cellen met een hemocytometer en bereid voor transfectie.
- Transfecteren cellen met elektroporatie volgensaanbevelingen van de fabrikant. De precieze voorwaarden voor elektroporatie moet empirisch worden bepaald. Opmerking: De instellingen die de beste balans tussen transfectie-efficiëntie en celoverlevingssnelheid voor dit preparaat van runderen chromaffinecellen leveren zijn 1100 V, 40 msec, en 1 puls. Wij schatten dat deze voorwaarden, 20-30% van de cellen worden getransfecteerd. Ongeveer 30% van de cellen overleven de elektroporatie proces.
- Plaat cellen zachtjes op poly-D-lysine en collageen behandeld schotels in 1 ml verwarmd electroporating media.
- Plaats gerechten in een 37 ° C incubator (5% CO 2). Voeg 1 ml van 2 x antibioticum media elk gerecht na 6 uur. Verander de media om normale media de volgende dag.
- Chromaffinecellen worden gewoonlijk afgebeeld 2-5 dagen na elektroporatie.
3. pTIRF Image Acquisition
- Voeding aan imaging-systeem en start acquisitie software.
- Controleer of lasers zijn uitgelijnd. Controleer evanescentveld profiel met behulp van microsferen.
- Bereid de globale en lokale perfusie systeem. Clean-oplossing reservoirs met gefilterd gedeïoniseerd H 2 O en vul met basale en stimulerende PSS-oplossingen.
- Voordat beeldvorming chromaffinecellen, controleert u of de p-pol en s-pol excitaties verlichten dezelfde regio van het gebied bekijken en dat de verlichting intensiteiten zijn ongeveer gelijk. Om dit te doen, vul een glazen bodem schaal met 2 ml van PSS met rodamine bij een uiteindelijke concentratie van 10 mM. Opeenvolgend prikkelen de rodamine monster met p-pol en s-pol licht en de beelden vast te leggen. In de praktijk P en S emissies deed zijn genormaliseerd om het gemiddelde van de P en S rhodamine emissies. Zie de beeldanalyse en discussie voor nadere bijzonderheden.
- Nu overgaan tot het kleuren van runderen chromaffinecellen met DID. Spoel cultuur media uit het schaaltje met de chromaffinecellen en te vervangen door 2 ml van basale-PSS. Voeg 10 ul van 10 mM DID (verdund in ethanol)direct aan het schaaltje met de cellen. Schud voorzichtig gerecht voor 2-10 seconden en verwijder de DID + PSS oplossing.
- Was de schaal 3-4x met basale-PSS te verwijderen eventueel resterende deed. De cellen worden nu gekleurd en klaar voor gebruik.
- Voeg een druppel immersie olie aan de doelstelling. Plaats schaaltje met DID-gekleurd chromaffinecellen op de top van de doelstelling.
- Bekijk de schotel hetzij door de doelstelling of van de camera vindt een cel die is getransfecteerd met het eiwit van belang en gekleurd met DID. Een goed gekleurd cel vertoont een P-uitstoot die levendig benadrukt de randen van de cel; S emissie moet ongeveer uniform over de cel voetafdruk (dwz het gebied van de cel die is gehecht aan het glas en afgebeeld in TIRF).
- Plaats de lokale perfusie naald zodat het ongeveer 100 urn afstand van de cel.
- Focus op de celmembraan en activeer de autofocus hardware direct voor celstimulatie / image acquisitie. </ Li>
- Begin beeldopname. Perfuseren cellen gedurende 10 seconden met een basale oplossing en vervolgens gedurende 60 seconden met 56 mM KCl depolariserende oplossing. Acquire beelden terwijl snel bekisting tussen 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (op veranderingen in P en S emissie van onvoldoende toezicht) en 488 nm excitatie (op de foto om de getransfecteerde blaasje sonde). Voorbeelden van beelden verkregen bij experimenten zijn weergegeven in figuur 2 en figuur 3.
4. Beeldanalyse
Berekeningen voor beeldverwerking worden uitgevoerd met ImageJ, maar gebruik scripts flexibel programmeertaal zoals IDL of Matlab kan verhogen analyse doorvoer door het automatiseren van de taak. Twee soorten beelden moet worden berekend om topologische informatie te verkrijgen van emissiebeelden rauw -. De P / S en P 2 S P / S rapporteert over lokale membraan vervormingen, terwijl de P 2 S som rapporteert over de totale membraan kleurstof in een bepaalde regiovan het veld.
- Alle afbeeldingen moeten achtergrond worden afgetrokken. Kies een off-cel ROI meet de gemiddelde pixelintensiteit het ROI en vervolgens af te trekken die waarde van alle pixels in de afbeelding stapel.
- Berekenen P / S, verdelen elk emissie lijst "P" door de latere "S" emissie frame (pixel naar pixel). P / S varieert met de relatieve intensiteiten van de p-en s-pol excitaties, systematische fouten in de optisch systeem, en interferentie franjes. Om deze effecten te verminderen, normaliseert de P / S verhouding van verkregen DID emissie naar de resultaten verkregen met een oplossing die 10 mM rhodamine 18 verhouding.
- Exocytose individuele DCVS blijkt uit een plotselinge verandering in intensiteit van fluorescerend vesikel eiwit, zoals synaptotagmin-1 pHluorin (Figuur 2B). Veranderingen in P / S en P 2 S bepalen van het gemiddelde van de pixels in een 240 nm straal ROI gecentreerd op gelokaliseerde verhoging van de P / Sverhouding op plaatsen van exocytose. Bij fusie plaatsvindt zonder een duidelijke toename P / S, wordt de ROI gecentreerd over het gebied van de fuser DCV.
- Computersimulaties kunnen worden uitgevoerd interpreteren P / S en P 2 S membraan intensiteit veranderingen qua eenvoudige geometrieën van verwijden fusie porie. Voor details van de simulaties, zie Anantharam et al.. 18
Representative Results
Conventionele en gepolariseerde TIRFM beeldvormende technieken worden uitgevoerd op dezelfde lucht tafel. De configuratie van de optische elementen is vergelijkbaar met het grote verschil dat het excitatie licht gepolariseerd (Figuur 1A). Gepolariseerd licht bij voorkeur prikkelt fluoroforen met absorptie dipolen in de polarisatierichting. Zo pTIRFM effectief ter controle membraan topologische veranderingen, de probe die gebruikt moet inlassen in het membraan met een vaste oriëntatie. De fluorescerende carbocyanine kleurstoffen (DII, DID) intercaleren in lipidedubbellagen in een georiënteerde wijze met transitiedipolen in het membraan vlak (Figuur 1B). -P gepolariseerd verlichting (figuur 1C) van DID-gelabelde membranen selectief opwindt dekglaasje-schuine fluoroforen (RED in de figuren 1B en 1D).
Uitbundige membraan etikettering van chromaffinecellen wordt bereikt na abRief incubatie met DID. Figuur 2A toont een voorbeeld van een celmembraan die goed is gekleurd. Een gezonde, hechtende cel zal vertonen duidelijke verschillen in P en S-emissies. Het beeld P emissie toont een helderder celrand met betrekking tot de rest van de cel. Het beeld S emissie toont ruwweg uniform fluorescentie over de cel voetafdruk. Berekend pixel-voor-pixel P / S en P 2 S beelden gevoelig membraan kromming en kleurstofconcentratie, respectievelijk. De chromaffine cel getoond is ook getransfecteerd met synaptotagmin-1 pHluorin (Syt-1) tot secretorische blaasjes (figuur 2B) label.
De chromaffine cel gestimuleerd met 56 mM KCl aan het celmembraan depolariseren en activeren exocytose. Een aantal fel fluorescerende Syt-1 pHluorin plekken ineens duidelijk als DCVS zekering (Figuur 2B, rechter paneel) geworden. Een witte doos is getekend rond een fusie event (Figuur 2B, rechter paneel). Deze fusie evenement is gespecificeerd in de figuren 2C en 2D. figuur 2C toont beeld-voor-beeld veranderingen in Syt-1-pHluorin, P / S, en P 2 imago S intensiteiten. Fluorescentie intensiteit Syt-1 snel daalt naarmate het eiwit diffundeert van het fusie (figuur 2D). De insprong die de gefuseerde blaasje / plasmamembraan complex vermindert bij een relatief lagere snelheid (NB grafieken in figuur 2D). De illustratie (figuur 2E) geeft een interpretatie van deze metingen.
De snelle, gelokaliseerde membraan vervormingen figuur 2 is een gevolg van stimulus opgewekte Ca2 + influx. Dit wordt getoond in figuur 3A. Een chromaffin cel wordt getransfecteerd met de genetische Ca 2 +-indicator GCaMP5G 21,22 en gestimuleerd met 56 mM KCl. Membraan depolarisatie veroorzaakt een aanzienlijke toename van fluorescentie GCaMP5G (
/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
Figuur 1. Illustraties voor de pTIRFM techniek. A) Een schema voor het combineren met conventionele polarizatiegebaseerde TIRF beeldvorming weergegeven. Een kwart-golf (QW) plaat wordt geplaatst voor een 561-nm saffier laser om elliptisch polariseren de laserstraal. Een polariserende cube (PC1) wordt gebruikt om polarisaties scheiden in lineaire verticale (V) en horizontale (h) componenten. De verticale en horizontale componenten wordt de p-en s-pol pol excitatie balken, respectievelijk op het TIR oppervlak. De p-pol en s-pol paden onafhankelijk luiken (S1 en S2). Ze worden opnieuw gecombineerd met spiegels en een tweede polariserende kubus (PC2). Zij voegen zich bij de 488 nm straal (ook onafhankelijk luiken, S3) via een bundelbesturing element bestaande uit een spiegel en niet-polariserende dichroïsche spiegel (DC). Lenzen (L) worden gebruikt ter aanvulling en concentreren de balken. Gecombineerde 488-nm en 561 nm balken worden gestuurd naar een kant verlichting poort van de microscoop via galvanometer spiegels (GM). Zij richten zich naar de achterkant brandvlak (BFP) van de doelstelling. Fotonen uit fluoforen vastgelegd worden op een EMCCD camera aangesloten op een PC. B) DiD etikettering wordt uitgevoerd door kort incuberen cellen met de kleurstof en wassen herhaaldelijk om overtollige te verwijderen. DiD intercalates in het membraan met transitiedipoolmomenten ongeveer in het membraan vlak. C) Het invallende licht gepolariseerd in het vlak van inval (p-pol) creëert een verdwijnende veld dat voornamelijk gepolariseerd loodrecht op het grensvlak, zoals afgebeeld. D) verlichting van een DID-gelabeld membraan met p-gepolariseerd licht selectief degenen fluoroforen die coverglass-schuin (RED) prikkelen. Als dit een s-gepolariseerde verdwijnende veld zouden deze fluoroforen die evenwijdig aan het dekglaasje zijn plaats worden opgewekt (zwart).
Figuur 2. trong> Monitoring celmembraan vervormingen met pTIRFM. A) emissiebeelden Raw P en S, samen met de berekende P / S en P 2 S emissie beelden worden getoond. Schaal bar, 3,2 micrometer B.) Een chromaffin cel die Syt-1 pHluorin gedepolariseerd met KCl. Een aantal fel fluorescerende vlekken (rechter paneel) geven de fusie van individuele DCVS. Schalingsbalk 3.2 micrometer. C) Frame-by-frame beelden van een fuseren Syt-1 pHluorin DCV. Times (boven afbeeldingen) zijn in seconden. Tijd 0 duidt aan voordat fusie van de DCV. Overeenkomstige P / S en P 2 S emissiebeelden worden ook getoond. . Schaal bar is 1 micrometer D) Grafieken voor afbeeldingen in C. De gestippelde lijn is op tijdstip 0 -. De fusie kader E) Een mogelijke interpretatie van de resultaten in C en D wordt getoond. blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vervormingen zijn het gevolg van stimulus opgewekte Ca2 + influx. A) Een chromaffin cel getransfecteerd met GCaMP5G gedepolariseerd met 56 mM KCl. De daaruit voortvloeiende toename van GCaMP5G fluorescentie betekent een toename in subplasmalemmal Ca 2 + niveaus. B) Frame-by-frame beelden van 30 x 20 pixel gebied van cel in A. Times bovenstaande beelden zijn in seconden. Witte pijlpunten wijzen op een gebied van P / S verhoging en P 2 S daling. Cytosolische GCaMP5G eiwit uit de regio wordt uitgesloten door de fusing DCV. Schaal bar, 1 micrometer. C) Grafieken voor de afbeeldingen in B. D) Een mogelijke interpretatie van de resultaten in B en C weergegeven.3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 omgekeerde microscoop | Olympus | Zijkant gemonteerde FILTERCUBE Vergadering | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Afstembaar tot 488 nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Samenhangend | 561 nm | |
| Scannen Galvo Mirror Systeem | Thorlabs | GVS102 | |
| VC 3 Channel Focus perfusiesysteem | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | <td>|
| 10 psi drukregelaar | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Gemonteerd Achromatic kwartgolfplaat | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680 nm Polarisatie beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Zes Station Neutral Density Wiel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper motor aangedreven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Sluit zich aan bij 488 nm en 561 nm balken |
| Gecoate platholle Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Divergeert 488 nm straal | Gecoate platholle Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Divergeert 561 nm straal |
| Gecoate Plano-bolle lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Richt zich beide bundels |
| Gecoate Plano-bolle lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Gecementeerd om kubus montage filteren |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | FILTERCUBE dichroic |
| z488/561_TIRF Emissiefilter | Chroma | z488/561m_TIRF | FILTERCUBE emissie |
| UIS2 60X Doelstelling | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon transfectiesysteem | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| Dii Membraan Dye | Invitrogen | V-22885 | Voor Alignment Doeleinden |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV van runderen | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Visser | 0267110 | |
| DiD Membraan Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| 0,22 pm Membraan Spuit Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatische Red microsferen | Polysciences | 19507 | 0,5 um |
| Immersion Oil Sigma | 56.822 | ||
| LabVIEW | National Instruments | Controles galvo spiegels | |
| Centrifugekolf | Bellco | 1965-00250 |
Tabel 1. pTIRF Microscopie apparatuur.
| Inhoud | Prep-PSS | Basaal-PSS | Stim-PSS |
| NaCl | 145 mM | 145 mM | 95 mm |
| KCl | 5,6 mM | 5,6 mM | 56 mM |
| MgCl2 | - | 0,5 mM | 0,5 mM |
| CaCl2 | - | 2,2 mM | 5 mM |
| HEPES | 15 mM | 15 mM | 15 mM |
| pH | 7.4 | 7.4 | 7.4 |
| Glucose | 2,8 mM | 5,6 mM | 5,6 mM |
| Pen-Strep | 1x | - | - |
Tabel 2. Perfusie en chromaffin cel prep oplossingen.
| Inhoud | Electroporating Media | Normaal Plating Media | 2x antibiotica Media |
| 1x DMEM/F-12 | 1 ml / plaat | 2 ml / plaat | 1 ml / plaat |
| FBS | 10% | 10% | 10% |
| Cytosine arabinofuranoside (CAF) | - | 1 ul / ml van 10 mM voorraad | - |
| Penicilline | - | 100 eenheden / ml 200 eenheden / ml | |
| Streptomycine | - | 100 ug / ml | 200 ug / ml |
| Gentamycin | - | 25 ug / ml | 50 ug / ml |
Tabel 3. Chromaffine cel media.
| Inhoud | TH-PSS | TL-PSS |
| Liberase TH | 2 ml | - |
| Liberase TL | - | 0,85 ml |
| Prep-PSS | 98,0 ml | 84,0 ml |
| DNase | 8.75 mg | 7.4 mg |
Tabel 4. TH-PSS en TL-PSS Solutions.
Discussion
-Polarisatie gebaseerde TIRFM detecteert snelle, submicroscopische veranderingen in de membraan topologie. De uitvoering van de techniek is relatief eenvoudig, vooral als TIRF optiek zijn al aanwezig. Alles wat nodig is is een kwartgolfplaat, twee polariserende kubussen, en luiken aan p-pol en s-pol verlichting paden scheiden. De exacte positie van deze componenten op de tafel wordt gewoonlijk bepaald door de beschikbare ruimte.
Om membraan topologische informatie te verkrijgen, moet de fluorescerende gebruikt intercaleren met vaste of bekende oriëntatie. De techniek, zoals beschreven in dit artikel wordt uitgegaan van carbocyanine kleurstoffen maar andere kleurstoffen, FM1-43 14, kunnen eveneens worden gebruikt. Het membraan kleuring procedure zelf is eenvoudig. Gekweekte cellen vereisen slechts een zeer korte blootstelling (minder dan 10 seconden) om een kleine hoeveelheid van DII / deed om uitbundige etikettering van het membraan te verkrijgen. Het toevoegen van overtollige kleurstof leidt tot lichtverstrooiing aggregates op het glas die de beeldkwaliteit verminderen. Over-incubatie cellen met kleurstof leidt tot internalisatie die nadelige gevolgen voor de beeldkwaliteit en eventueel levensvatbaarheid van de cellen heeft verven. Als een cel is goed gekleurd, zal er duidelijk onderscheid in de emissiebeelden P en S. Zoals getoond in figuur 2A, zal de P-emissie levendig lichte delen van het membraan die schuin dekglaasje (de randen van de cel footprint) terwijl de S emissie-intensiteit ongeveer uniform over de cel footprint is. Als een duidelijk onderscheid tussen P en S blijkt niet, dan is het mogelijk dat de cel slecht is gehecht aan het substraat of de celmembraan is niet gezond, en de cel wordt niet gebruikt voor experimenten.
Onze vorige studies beschrijven pTIRFM gebruikt DII als de fluorescente membraan sonde. Hier gebruiken we het deden omdat het geschikt is voor dual-color imaging experimenten die in dienst GFP / pHluorin als de andere fluorofoor. We prikkelen DiD wie een 561 nm laser dan 640 nm laser (die dichter bij de excitatie piek) omdat de fluorofoor bleekmiddelen sneller bij 640 nm. Ondanks dat de 561 nm laser is op de staart van DID gepubliceerd excitatie, fluorescentie efficiënt uitgezonden. Een ander voordeel van de 561 nm laser is dat het prikkelt zowel DII en deed waardoor we dezelfde polarisatie setup voor beide sondes gebruiken. Merk op dat de oriëntatie van de fluorofoor in het membraan de uitlegging van membraan topologie beïnvloeden. Als bijvoorbeeld een fluorofoor werden georiënteerd met transitiedipolen loodrecht op het membraan vlak (in plaats van parallel of nagenoeg parallel, zoals het geval is met Dil of hoe) en niet-vlakke membraan gebieden zullen gemakkelijker gemarkeerd door de S dan wel P emissie.
We hebben ook beschreven voor isolatie en elektroporatie van runderen adrenale chromaffine cellen. De runderen chromaffin cel is een uitstekende secretory model. Het heeft de voordelen dat het gemakkelijk in kweek, in reactie op een verscheidenheid van secretogogues te onderhouden en bezit grote secretorische blaasjes die gemakkelijk worden gevisualiseerd met conventionele lichtmicroscopie. Om fluorescerende eiwitten tot expressie worden de cellen geëlektroporeerd in suspensie voorafgaand aan plating op de collageen-behandelde cultuur gerechten. In onze ervaring, expressie rendement is veel hoger met elektroporatie dan met ofwel Ca 2 +-fosfaat of Lipofectamine reagentia. Het nadeel van elektroporatie is dat het meer cellen (zo veel overleven de werkwijze) en dure commerciële reagentia. Om redenen die niet duidelijk zijn voor ons, niet elke membraan bevat deed. Bovendien, slechts een fractie van de cellen op de schaal getransfecteerd. Het vinden van cellen die zijn getransfecteerd en zijn goed gekleurd met DID kan tijdrovend zijn en daarom het optimaliseren van de voorwaarden voor het kleuren en elektroporatie is de moeite waard.
Kortom, dit eenArtikel beschrijft hoe pTIRFM wordt geïmplementeerd om de snelle en gelokaliseerde membraan vervormingen die optreden tijdens de fusie van dichte kern blaasjes bij runderen chromaffinecellen bewaken. Hoewel slechts een toepassing wordt besproken, is de techniek zeer geschikt voor de studie van andere biologische processen die veranderingen in het membraan is, zoals endocytose, cytokinese, en celmotiliteit betrekken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door een Nationaal Scientist Development Grant (13SDG14420049) naar AA van de American Heart Association en start-up fondsen van Wayne State University. Wij zijn dank verschuldigd aan Dr Ronald W. Holz en dr. Mary Bittner voor het verstrekken van advies over de runder-bijnier voorbereidingen en dr. Daniel Axelrod voor hulp bij de pTIRFM set-up en behulpzaam commentaar op het manuscript. Syt-1 pHluorin werd gebruikt met toestemming van Dr Gero Miesenböck (University of Oxford). GCAMP5G werd verkregen door middel van Addgene. We danken James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman en Praneeth Katrapti met hulp op het optimaliseren van de verschillende stappen van de beschreven procedures.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
References
- Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).
- Chapman, E. R. How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release. Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).
- Hinshaw, J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).
- Lang, T., et al. Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy. Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).
- Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388, 474-478 (1997).
- Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).
- Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy. J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2. Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).
- Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).
- Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells. Neuron. 16, 369-376 (1996).
- Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination. Biophys. J. 46, 739-747 (1984).
- Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells. Neuron. 35, 1085-1097 (2002).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion. J. Neurochem. , 10-1111 (2012).
- Anantharam, A., et al. A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion. Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion. Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).
- Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J. Cell. 188, 415-428 (2010).
- Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells. J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).
- O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
