Summary
편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.
Abstract
세포 외 유출의 역학에 새로운 통찰력을 얻기 위해, 우리 그룹은 정확하게 소포 및 플라즈마 세포막의 융합 동안 규제해야 지질 이중층 형태의 변화에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 신속하고 국부적 변화는 지질과 막 곡률을 제어하는 전문화 된 단백질 사이의 동적 상호 작용에 의해 달성된다. 이러한 상호 작용의 부재는 소포 융합 치명적인 결과를 가지고 있지만, 막 형상의 제어를 포함하는 다른 세포 기능의 호스트 않을 것이다. 최근, 막 - 형성 특성을 갖는 단백질의 개수의 아이덴티티가 결정되었다. 무엇 실종 유지하는 것은 언제, 어디서, 어떻게 그들이 융합 콘텐츠 릴리스 진행 역할의 로드맵이다.
막 리모델링을 활성화하는 분자 사건에 대한 우리의 이해는 역사적으로 막 곡률에 민감하거나 시간적 해상도가 TRAC 할 분석 방법의 부족에 의해 제한되었다급격한 변화를 K. PTIRFM는 이러한 기준을 모두 만족시킨다. 우리는 pTIRFM가 조밀 한 핵심 소포 (DCV) 융합 동안 크롬 친화 세포 세포막의 방향으로 신속, 서브 미크론의 변화를 시각화하고 해석하는 구현 방법에 대해 설명합니다. 우리가 사용하는 크롬 친화 세포는 소 부신에서 격리됩니다. 막은 친 지성 carbocyanine 염료, 1,1 '- 디 옥타 데실 -3,3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 - 클로로 벤젠으로 염색하거나, DID된다. "고정"방향으로 막 비행기에서하게 인터를하고 사라져가는 필드의 편광에 따라서 구분합니다. 염색 않았다 세포막은 561 nm의 레이저 (P-POL, S-POL)의 직교 편파로 순차적으로 기쁘게 생각합니다. 488 nm의 레이저 융합의 순간 소포 성분과 시간을 시각화하는 데 사용됩니다. 세포 외 유출은 로컬 탈분극의 KCl 용액으로 세포를 관류에 의해 트리거됩니다. 분석은 어떻게했는지 이해하기 위해 사용자가 작성한 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 수행된다발광 강도의 변화는 융합 기공의 팽창과 관련이있다.
Introduction
세포 외 유출의 적절한 실행을 정밀하게 조율 할 수 막 이중층 형태의 극단적 인 변화가 필요합니다. 종래 융합, 과립 하에서 세포막의 로컬 굽힘은 이중층의 상호 작용을위한 에너지 장벽을 줄이기 위해 부분적으로 발생한다. 막 병합으로 나중에 높은 곡률의 영역이 생성되고 안정화되어야한다. 마지막으로, 융합 세포막 융합 모공을 확장 및 콘텐츠 릴리스 1을 사용하려면 초기 모양에서 구부릴 수 있어야합니다. 혼자 막 같은 극적인 협조 변화를 겪을 가능성이 있기 때문에, 단백질은 이벤트를 중재 할 필요합니다. 그러나 그들이 어떻게 융합 과정에서 막 토폴로지의 변화에 영향을 미치는 역할을하는 것은 매우 의문 남아있다.
체외 모델에서 우수한 멤브레인 곡률을 시각화하기 위해 존재한다. 부정적인 얼룩 EM의 사용은, 예를 들어, 두 가지 주요 인신 매매 (P)의 행동에 대한 현재의 분자 모델을 형성에 중요했다roteins - synaptotagmin과에 dynamin은 (리뷰를 채프먼 2 Henshaw 3 참조). 세포 외 유출의 대부분의 실시간 분석이 직접 곡률을 감지하지 않습니다. 대신, 곡률 내강화물 릴리스 4-8 또는 막 면적 9-11 변화의 역학에 대한 보고서 분석에서 유추됩니다. PTIRFM 멤브레인 micromorphology의 변동에 직접, 실시간 측정을 가능하게함으로써 생체 내와 생체 외 연구에 간의 격차를.
PTIRFM는 nonimaging 모드에서, 모델 막 (12) 내에 내장 NPD-PE의 방향을 측정하는 악셀로드 및 동료에 의해 개척되었다. 이 기술은 다음 DII 및 FM1 - 43 13-18으로 표시 살아있는 세포의 역동적 인 변화를 시각화하기 위해 적용되었다. P-편광 (입사 평면)과 (입사면에 수직 인) S-편광 : pTIRFM에서,이 에바 네 센트 필드 편광 순차 막 내장 프로브를 여기 시키는데 사용. 종래 이미징 프로브 -이 경우, DID - 간단히 세포 외 배지에 첨가하고 공부 될 세포의 원형질막에 층간 삽입시킨다. 막 (멤브레인 주름 또는 들여 쓰기 등) 커버 글라스에 대한 비평이다 지역에서, 또한 평행하지 않은 것입니다 않았다. 따라서, 이러한 영역은 P-POL 빔에 의해 흥분 될 것입니다. P-POL 빔은 덜 효율적으로 대부분 커버 글라스에 평행 막 지역에서 한 흥분됩니다. 픽셀 대 픽셀 비율 이미지 (P / S), 따라서 구체적으로 막 변형의 영역을 강조 할 것입니다 DID의 연속 P-및 S-POL 여기에서 배출에 대한보고. 이론적으로, P / S 비율 이미지 민감한 컴퓨터 시뮬레이션 (18)에 의해 예측 된 변화의 진폭 커브 글라스로부터 세포막 편차, 심지어 작은 각도이다. P / S 이미지는 또한 커버 글라스의 표면으로부터 형광 거리 독립적이며 지역 형광농도. 로컬 형광 농도 대신 P 방출의 픽셀 대 픽셀 화는 2 회 S 방출 (P +2 S)에보고하는 이미지에 의해 제공된다. P +2 S 측정은 몇 가지 가능한 거의, 또는 전혀 변화, 들여 쓰기의 정확한 구조에 민감합니다. 이 컴퓨터 시뮬레이션으로 표시 할 수 나중에 상태 (16, 18)에 (좁은 목 예) 초기의 융합 기공의 모델로 전환됩니다. P 좁은 목을 통해 세포막에 부착 융합 소포의 +2 S (및 더 인터페이스 부근 DID) (훨씬 넓은 공극을 가진 융합 된 소포보다도, 예를 들어 큰 것으로 예상되는 위치 DID)는 사라져가는 필드의 가장 어두운 부분에 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 pTIRFM 구현 및 융합 기공 팽창 중에 발생하는 막 모양의 급속한 현지화 변화를 연구하기 위해 사용되는 방법에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램은 명시 적으로 디 동안scussed, 방법은 직접 또는 간접적으로 막 리모델링을 포함하는 다른 세포 생물 학적 과정의 다양한 일반화되어 있습니다.
Protocol
1. PTIRF 시스템 설치
pTIRFM 기술은 거꾸로 현미경 플랫폼에 내장되어 있습니다. 레이저 광선은 조사 측 포트와 nonpolarizing 측방 필터 큐브를 통해 전달하고 60X 1.49 NA TIRF 목적의 초점면에 초점을 맞추고있다. 현미경과 EMCCD 카메라 사이의 배출 경로에 두 개의 추가 렌즈 (1.6 배 및 2 배)가 약 80 nm의 최종 픽셀 크기를 제공합니다. 레이저 빔 에피과 내부 전반사 (TIR) 조명 사이의 빠른 전환을위한 소프트웨어 제어 검류계 거울을 사용하여 유도된다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 TIRF에 대한 광학이 이미 형광의 여기 및 이미징을위한 최적의 위치에 공기 테이블에 위치하는 것으로 가정합니다. 이 편광 광학가 세포막 변형의 이미지를 사용하려면 기존의 TIRF 현미경 셋업에 추가하는 방법을 설명합니다. TIR 및 polarizat 모두를 생성하기위한 실험실의 광학 셋업의 개략도이온 기반의 TIR은 그림 1A에 표시됩니다. 프로토콜 carbocyanine 염료의 이미징을위한 소포 형광 단백질의 여기를위한 488 nm의 레이저의 사용과 561 nm의 레이저를 가정했다.
- 모든 현미경 부품, 레이저, 그리고 컴퓨터의 전원을 켭니다.
- 488 nm의 레이저에서 그림 1A에 도시 된 바와 같이 1.49 NA 렌즈의 초점면 (BFP)에 빔을 연출합니다. 레이저 빔이 BFP에 집중되는 경우에, 시준 등장 직접 대물 상기 천장에 작은 잘 정의 된 지점을 표시한다.
- X의 갈바 노 미러 (등가 샘플 평면에 거울)을 조절되도록 레이저 빔은 오프 - 축 이동 대물 정상으로 점진적으로 더 가파른 각도로 대물에서 나온다된다.
- 다음으로, TIR이 달성되어 있는지 확인합니다. 유리 바닥 접시에 PSS의 1 ml의 볼륨에 형광 마이크로의 10 μl를 추가합니다. O 바닥에 마이크로에서만 형광요리 F를, TIR 인터페이스에 가장 가까운 감지해야합니다. 부동 미소 구의 검출 입사광과 대물 법선 사이의 각도가 불충분 한 것을 나타낸다.
아래 부분은 편광 기반 이미징에 필요한 광학 구성 요소의 설정을 설명한다. - 그것은 동일한 광로를 따라 진행되도록 가이드로 정렬 된 488 nm의 빔을 이용하여, 원료 561 nm의 레이저 빔의 위치를 조정한다. 561 nm의 레이저 carbocyanine 염료의 영상에 사용됩니다했다.
- 561 nm의 레이저의 하류 발산 렌즈와 거울을 삽입합니다. , 미러를 사용하여이 488 nm의 빔 coaligned되도록 빔을 조정하고 갈바 노 미러가 "0"위치에있을 때 스폿 천장에 초점입니다.
- 레이저 개구의 바로 하류 빔 경로에 4 파장 판 (QW)을 중심. 무색 또는 여기 파장에 동조 하나입니다 QW를 사용합니다.QW는 원형으로 광학 축과 45 ° 각도로 진입하는 선형 편광 된 빛을 편광됩니다. 이러한 편광 큐브와 같은 일부 광 성분은, 편광의 한 축을 향해 감쇠 바이어스있다. QW이 바이어스를 보상하기 위해 회전 될 수있다. 이 조정은 타원 편광 빔 발생합니다. 이 개구부로부터 빠져 나오는 레이저 빔 자체는 매우 직선 (수직)으로 편광되기 때문에 QW가 필요하다.
- 타원 편광 빔의 다운 스트림 편광 큐브 (PC1)를 놓습니다. 편광 큐브는 전계의 수직 (Y) 성분을 반사하고, 수평 (x) 성분을 통과한다. 편광 큐브 편광 빔 경로의 후속 정렬을 용이하게하기 위해 작은 병진 스테이지 상에 배치된다.
- 빔을 재결합하는 제 2 편광 큐브 (PC2)와 거울 (그림 1A)를 사용합니다.
- 제 1 편광 큐브 (PC1) 및 수직 공동 사이에 셔터를 배치mponent 거울. 수평 성분 미러 및 제 2 편광 큐브 (PC2) 사이에 제 셔터를 놓습니다. 이러한 셔터는 급속 빔 편광 선택하는 데 사용자를 가능 이미징 소프트웨어에 의해 제어된다.
- 각 빔 경로에 전계 방향을 확인 편광 필터를 사용한다. 편광 필터는 필터의 축에 맞춰 전송을 허용합니다.
- 레이저 빔의 수직 및 수평 구성 요소가 서로 488 nm의 광선과 정렬되어 있는지 확인한다. 필요에 따라 조정합니다. 3 개의 빔이 모든 BFP에 초점을 맞추고 천장에 같은 자리에 목적에서 평행 등장한다. 이 자리는 미래의 정렬을 용이하게하기 위해 X로 표시 할 수 있습니다.
- 목적에 침지 기름 한 방울을 넣습니다. 목적에 형광 마이크로 스피어를 포함하는 요리를 (위의 4 단계 참조) 놓습니다.
- X의 갈바 노 미러를 이동하여 TIR을 입력합니다. TIR, 수직 componen에서보의 t는의 폴 빔의 수평 구성 요소가 이제 P-POL입니다. QW 판을 회전하여 빔의 상대 강도를 조절합니다. 무작위로 지향 할 것으로 예상되는 로다 민 샘플, 각 편광 소멸 필드를 볼 수 있습니다. 평균 픽셀 강도와 일치하도록 QW 판을 돌립니다. 필요하다면, 그것의 강도를 감쇠시키는 하나의 편광 빔 경로에 감광 필터를 추가한다.
2. 크롬 친화 세포 격리
송아지 부신에서 건강한 크롬 친화 세포를 분리하기위한 절차는 아래와 같습니다. 그것은 윅, SENTER, 등. 19 오코너에 의해 이전에 발행 된 프로토콜에서 적응, Mahata 등. (20) 분리 후, 세포는 일렉트로 시스템을 사용하여 관심의 플라스미드 (들)과 일렉트로됩니다. 원하는 형광 단백질을 발현하는 세포의 20 ~ 30 %에서이 시스템은 결과. 일반적으로, 세포의 70 %가 차기 생존roporation 과정. PSS 및 미디어 구성 요소의 세부 사항은 표 2, 3 및 4에 제공된다.
- 이틀 셀 준비하기 전에, 1.25 ㎖의 소 콜라겐 다음에 1 ㎖ 폴리 - D - 라이신 (0.1 ㎎ / ㎖)와 35-mm 광학 품질의 유리 바닥 (두께 0.17 mm) 요리를 취급합니다. 조직 문화 후드에서 건조한 공기에 요리를 둡니다.
- 도살장에서 소 부신를 얻습니다. 그들은 실험실로 다시 전송하는 동안 얼음에 분비를 유지합니다. 소 부신 지방의 두꺼운 층에서 넣어 수 있습니다. 여분의 지방을 제거하고 부신 정맥 구멍을 노출 수술 가위를 사용합니다. 선이 피 제거 될 때까지 반복적으로 준비 - PSS과 정맥을 Perfuse.
- 그 다음, 천천히 선 팽창까지 정맥 개구부에 TH-PSS 용액 2 ㎖를 피펫. 15 분 동안 37 ° C에서 비정상적 분비를 품어. TH-PSS 치료를 반복하고 다시 품어.
- 의와 선 (腺)의 가장자리 주위에 외부 부신 피질을 잘라틈새 가위 및 수질을 노출 떨어져 선을 벗긴다. 부드럽게 긁어 대뇌 피질의 조직에서 골수를 분리하기 위해 메스를 사용합니다.
- 5 ~ 10 분 동안 메스 블레이드 한 쌍의 수질을 말하다.
- 최종 소화 단계는 개별 크롬 친화 세포를 분리 할 필요가있다. 스피너 플라스크에 다진 세포 현탁액을 붓고. 부분적으로 TL-PSS (15 ㎖)에 TH-PSS (30 ㎖)을 2:1 비율로 플라스크를 채우고 약 100 rpm으로 회전하는 동안 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
- 400 μm의 메쉬를 필터링하여 소화되지 않은 조직에서 개인의 크롬 친화 세포를 분리합니다. 여과 액을 수집합니다. 200 펠릿 세포 XG, 얼음 차가운 PSS에 재현 탁에서 원심 분리기.
- 250 μm의 메쉬, 펠렛을 통해 세포를 필터, 마지막 (단계 2.9 참조) 일렉트로 버퍼에 재현 탁.
- 혈구를 사용하여 세포를 세어 형질 전환을 준비하고 있습니다.
- 에 따라 일렉트로 시스템으로 세포를 형질제조업체의 권장 사항. 전기 충격에 대한 정확한 조건은 경험적으로 결정해야합니다. 참고 : 소 크롬 친화 세포의 이러한 준비를위한 형질 전환 효율 및 세포 생존율 사이의 최적의 균형을 제공하는 설정은 1100입니다 V, 40 밀리 초, 1 펄스. 우리는 이러한 조건으로, 세포의 20 ~ 30 %가 형질 전환되는 것으로 추정된다. 세포의 약 30 %가 전기 천공 과정을 생존하지 않는다.
- 부드럽게 폴리 - D - 라이신과 콜라겐 접시에 세포를 따뜻하게 electroporating 미디어의 1 ml의 요리를 취급.
- 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다 (5 % CO 2). 6 시간 후 각각의 접시에 2 배 항생제 미디어 1 ML을 추가합니다. 다음날 일반 미디어로 미디어를 변경합니다.
- 크롬 친화 세포는 일반적으로 2-5일 일렉트로 후 몇 군데 있습니다.
3. pTIRF 이미지 획득
- 영상 시스템의 전원을 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 레이저가 정렬되어 있는지 확인합니다. 소멸을 확인마이크로 스피어를 사용하여 필드의 프로필.
- 글로벌 및 지역 관류 시스템을 준비합니다. 클린 솔루션 여과 탈의 H 2 O와 저수지 및 기초 및 PSS 솔루션을 자극 채우기.
- 크롬 친화 세포 이미징 전에 P-POL과의 폴 음원 정보가보기 필드의 같은 지역을 조명 및 조명의 강도가 거의 동일하다는 것을 확인합니다. 이를 위해, 10 mM의 최종 농도에 로다 민을 함유 PSS 2 ㎖와 함께 유리 - 바닥 접시 채우기. 순차적으로 P-폴과의 폴 라이트와 로다 민 샘플을 자극하고 이미지를 캡처합니다. 실제로, DID에서 P와 S 배출량은 P와 S 로다 민 배출량의 평균으로 정규화됩니다. 더 자세한 사항은 이미지 분석 및 토론 섹션을 참조하십시오.
- 지금 DID와 소 크롬 친화 세포를 염색로 진행합니다. 크롬 친화 세포를 포함하는 접시에서 배양 배지를 씻어 기초-PSS 2 ㎖로 대체합니다. 10 mm의 10 μl를 추가합니다 (에탄올에 희석) DID직접 세포를 포함하는 접시. 부드럽게 2-10 초 동안 요리를 선동하고 DID + PSS 솔루션을 제거합니다.
- 잔여했던 제거하는 기초-PSS와 접시 3 배를 씻으십시오. 세포는 이제 염색 사용할 준비가되어 있습니다.
- 대물에 침지 기름 방울을 추가. 목표의 상단에 DID 염색 크롬 친화 세포를 포함하는 접시를 놓습니다.
- 목표를 통해 또는 카메라를 하나 접시를보기, 관심의 단백질로 형질 및 DID로 염색 된 세포를 찾을 수 있습니다. 잘 더러워 셀 선명 셀의 가장자리를 강조 P 방출을 나타낸다; S 방출 셀 면적에 걸쳐 대략 균일하게한다 (유리에 부착하고 TIRF에 이미징되는 셀의 영역 즉,).
- 그것은 약 100 μm의 거리 세포에서되도록 지역 관류 바늘을 배치합니다.
- 세포막에 초점 즉시 세포 자극 / 이미지 수집하기 전에 자동 초점 하드웨어를 활성화합니다. </ 리>
- 이미지 수집을 시작합니다. 탈분극 56 밀리미터의 KCl 용액을 60 초 후 기초 솔루션과 함께 10 초 동안 세포를 Perfuse. 빠른 속도로 561 nm의 P-POL 사이에 셔터를 닫는 동안 이미지를 획득, 561 nm의 S-POL (P 변화와 DID의 S 배출량을 모니터링) 및 (이미지 형질 소포 프로브) 488 nm의 여기. 실험 기간 동안 획득 된 영상의 예는 그림 2와 그림 3에 나타낸다.
4. 이미지 분석
화상 처리를위한 계산은 ImageJ에 수행 될 수도 있지만, 그러한 IDL이나 Matlab을 같은가요 프로그램 언어 이용하는 스크립트 크게 작업을 자동화하여 분석 처리량을 증가시킬 수있다. 이미지의 두 가지 유형의 원시 방출 이미지에서 토폴로지 정보를 얻기 위해 계산해야합니다 -. P / S와 P +2 S P +2 S의 합이 특정 지역에서 총 막 염료에보고있는 동안 P / S 지역 막 변형에보고필드의.
- 모든 이미지는 배경 차감해야한다. , 오프 셀 ROI를 선택 ROI의 평균 픽셀 강도를 측정 한 다음 이미지 스택의 모든 픽셀에서 그 값을 뺀.
- , P / S를 계산 이후의 "S"방출 프레임 (픽셀 대 픽셀)에 의해 각각의 "P"방출 프레임을 분할 할 수 있습니다. P / S는 P-및 S-POL 음원 정보의 상대적 강도,의 편견에 따라 달라집니다 광학계, 및 간섭 줄무늬. 이러한 효과를 감소 10mM의 로다 민 (18)을 포함하는 용액으로 수득 비율 않았다 발광으로부터 얻어진로부터 P / S 비율을 정상화.
- 개별 DCVs의 세포 외 유출은 Synaptotagmin -1 pHluorin (도 2B)과 같은 형광 소포 단백질의 강도의 급격한 변화로부터 분명하다. P / S의 지역화 증가 위에 중심 240 nm의 반경 투자 수익 (ROI)의 픽셀을 평균하여 P / S와 P +2 S의 변화를 결정세포 외 유출의 사이트에서 비. 융합은 P / S에서 명백한 증가없이 발생하는 경우, ROI는 융착 DCV의 영역 위에 중심된다.
- 컴퓨터 시뮬레이션 넓혀서 융합 모공의 단순한 형상의 관점에서 P / S 및 P +2 S 막 강도의 변화를 해석하기 위해 수행 될 수있다. 시뮬레이션에 대한 자세한 내용은 Anantharam 등. 18를 참조하십시오
Representative Results
기존의 편광 TIRFM 이미징 기술은 같은 공기 테이블에 구현된다. 광학 소자의 구성은 상기 여기 광이 편광 큰 차이 (도 1a)와 유사하다. 편광 광은 우선적으로 편광 방향의 흡수 쌍극자와 형광체를 여기시킨다. pTIRFM은 막 위상의 변화를 모니터링하는데 효과적이기 위해서는 따라서, 사용되는 프로브는 고정 된 방향으로 막에 층간 삽입한다. 형광 carbocyanine 염료 (DII는 DID) 막 평면 (그림 1B)의 전이 쌍극자와 지향 방식의 지질 이중층에 층간 삽입. 표지 DID 세포막의 P-편광 조명한다 (그림 1C)을 선택적으로 커버 슬립 - 경사 형광 (그림 1B의 RED와 1D)를 자극.
크롬 친화 세포의 무성한 막 라벨은 AB 후에 이루어집니다않았다.도 2a와 rief 인큐베이션 잘 더러워 세포막의 예를 나타낸다. 건강, 자기편 세포는 P와 S 배출 뚜렷한 차이를 전시 할 예정이다. P 방출 콘텐츠 셀의 나머지 부분에 대해서 밝게 셀 테두리를 나타낸다. S 방출 콘텐츠 셀 면적에 걸쳐 대략 균일하게 형광을 나타낸다. 계산 된 픽셀 간 P / S와 P +2 S 이미지는 각각 막 곡률 및 염료 농도에 민감합니다. 표시된 크롬 친화 세포는 분비 소포 (그림 2B)를 레이블 Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT를-1)로 형질되었습니다.
크롬 친화 세포는 세포막을 탈분극 및 세포 외 유출을 유발하는 56 mM의 KCl을 자극한다. 밝은 형광 SYT를 1 pHluorin 명소의 숫자가 갑자기 DCVs 퓨즈 (그림 2B, 오른쪽 패널)로 분명하게. 흰색 상자는 하나의 퓨전 이벤트 (그림 2B, 오른쪽 패널)의 주위에 그려집니다. 이 융합 이벤트 나도 2C 및 2D 분석들.도 2c는 SYT를-1-pHluorin, P / S, 및 P +2 S 이미지 강도의 프레임 별 변화를 보여줍니다. 단백질 융합 사이트 (도 2d)으로부터 멀리 확산으로 SYT를-1의 형광 강도는 빠르게 감소한다. 융합 소포 / 세포막 복합체를 나타내는 들여 쓰기는 상대적으로 느린 속도 (그림 2 차원 그래프 참고)에서 감소. 그림 (그림 2E)이 측정 한 해석을 보여줍니다.
도 2에 도시 된 신속하고 국부적 멤브레인의 변형이 자극 유발 칼슘 2 + 유입의 결과이다. 이 그림의 (a)에 표시됩니다. 크롬 친화 세포는 유전 칼슘 2 + 표시 GCaMP5G (21, 22)로 형질과 56 mM의 KCl을 자극한다. 막 탈분극은 (GCaMP5G 형광의 상당한 증가가 발생
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그림 1. pTIRFM 기술에 대 한 그림입니다. A) 편파 기반 TIRF 영상과 기존의 결합 회로도가 표시됩니다. 4 파장 (QW) 판 타원 레이저 빔을 편광하는 561-nm의 사파이어 레이저의 전면에 배치됩니다. 편광 큐브 (PC1)는 선형 수직 (V) 및 수평 (H) 구성 요소에 편광을 분리하는 데 사용됩니다. 수직 및 수평 구성 요소는 TIR 표면에, 각각, P-및 S-POL POL 여기 빔이된다. P-POL과의 폴 경로는 독립적으로 (S1 및 S2)를 닫았됩니다. 그들은 거울 및 제 2 편광 큐브 (PC2)과 재결합. 그들은 거울로 구성된 다이크로 익 미러 (DC)를 nonpolarizing 빔 스티어링 요소를 통해 488 nm의 빔 (독립적으로 S3, 닫았을)에 가입. 렌즈 (L)은 빔을 확장하고 집중하는 데 사용됩니다. 합산 488 ㎚, 561 ㎚의 광선은 갈바 통해 현미경의 조명 측 포트에 스티어링 아르미터 미러 (GM). 그들은 목적의 초점면 (BFP)에 초점을 맞추고있다. 형광 물질에서 방출되는 광자) PC. B에 연결 EMCCD 카메라에서 캡처하는 DID 표시 간단히 과잉을 제거하기 위해 반복적으로 염료 및 세척으로 세포를 배양하여 수행됩니다. DID 대략 그림과 같이 발생 빈도 (P-POL)의 평면 편광 입사광, 인터페이스에 일반 주로 편광입니다 사라져가는 필드를 만들고 막 비행기. C)에서의 전이 쌍극자 모멘트와 막의하게 인터. D) P-편광 된 빛을 가진 표지 않은 막의 조명을 선택적으로 커버 글라스 - 경사 (RED)입니다 그 형광 물질을 자극 할 것이다. 이 s 편광 소멸 필드면, 커버 글라스에 평행하는 형광 대신 (BLACK)을 흥분 될 것이다.
그림 2. trong> pTIRFM와 모니터링 세포막의 변형. A) 계산 된 P / S와 P +2 S 방출 이미지와 함께 원시 P와 S 방출 이미지가 표시됩니다. 스케일 바, 3.2 μm의. B) SYT를 1 pHluorin을 표현하는 크롬 친화 셀의 KCl과 탈 편광된다. 밝은 형광 반점 (오른쪽 패널)의 숫자는 개별 DCVs의 융합을 나타냅니다. 스케일 바, 융합 SYT를 1 pHluorin DCV 3.2 μm의. C) 프레임 별 이미지. (사진 위) 시간은 초 단위입니다. 시간 0 DCV의 융합 전에 프레임을 지정합니다. 해당 P / S와 P +2 S 방출 이미지도 표시됩니다. .. 융합 프레임 E) C와 D의 결과를 하나의 가능한 해석이 표시됩니다 - 스케일 바는 1 μM이다 D) 그래프 C. 점선의 이미지에 시간이 0에 있습니다. "빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 변형은 자극 유발 칼슘 2 + 유입의 결과입니다. A) GCaMP5G로 형질 크롬 친화 세포는 56 mM의 KCl을 함께 탈 편광된다. GCaMP5G 형광의 증가는 결과적 이미지 위의 A. 타임즈 세포의 30 × 20 픽셀 영역의 프레임 별 이미지 초에 subplasmalemmal의 증가 칼슘 2 + 수준. B)를 의미한다. 화이트 화살촉은 P / S 증가 및 P +2 S 감소의 영역을 나타냅니다. 세포질 GCaMP5G 단백질 정착 DCV하여 지역에서 제외됩니다. B.에 표시된 이미지의 스케일 바, 1 μm의. C) 그래프 D)는 B와 C의 결과를 하나의 가능한 해석은 표시됩니다.3highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| iXon3 EMMCD 카메라 | 도르 | 897 | |
| IX81 거꾸로 현미경 | 올림푸스 | 측면 장착 Filtercube 회의 | |
| 43 시리즈 아르곤 이온 레이저 | CVI 밀레 Griot 레이저 광학 | 543-AP-A01 | 488 nm의 파장 가변 |
| 561 LP 다이오드 레이저에게 사파이어 | 코 히어 런트 | 561 nm의 | |
| Galvo에 하중 초과 미러 시스템 스캔 | THORLABS | GVS102 | |
| VC 3 채널 초점 관류 시스템 | ALA 과학 기기 | ALA VC3X4PP | |
| QMM 석영 MicroManifold | ALA 과학 기기 | ALA QMM-4 | <TD>|
| 10 PSI 압력 조절기 | ALA 과학 기기 | ALA PR10 | |
| 조작하는 사람 | 버 | TS 5000-150 | |
| 장착 무색 4 파장 판 | THORLABS | AQWP05M-600 | |
| 420-680 nm의 편광 빔 스플리터 큐브 | THORLABS | PBS201 | |
| 여섯 역 중성 농도 휠 | THORLABS | FW1AND | |
| 스테퍼 모터 구동 SmartShutter | 서터 악기 | IQ25-1219 | |
| HQ412lp 이색 필터 | 채도 | NC255583 | 488 nm의 561 nm의 빔을 조인 |
| 코팅 플레이 노 - 오목 렌즈 | 에드먼드 광학 | PCV 100 ㎜ VIS 0 | 488 nm의 광을 발산 | 코팅 플레이 노 - 오목 렌즈 | 에드먼드 광학 | PCV의 250mm VIS 0 | 561 nm의 광을 발산 |
| 코팅 컨벡스 렌즈 | 에드먼드 광학 | PCX 125mm VIS 0 | 두 빔 초점을 맞 춥니 다 |
| 코팅 컨벡스 렌즈 | 에드먼드 광학 | PCX 50mm의 VIS 0 | 큐브 어셈블리를 필터링하는 시멘트 |
| z488/561rpc 이색 | 채도 | z488/561rpc | Filtercube 이색 |
| z488/561_TIRF 배출 필터 | 채도 | z488/561m_TIRF | Filtercube 방출 |
| UIS2 60X 목표 | 올림푸스 | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| 네온 형질 시스템 | 인비 트 로젠 | MPK 5000 | |
| Metamorph의 이미징 소프트웨어 | 분자 장치 | ||
| DII 막 염료 | 인비 트 로젠 | V-22885 | 정렬 목적을위한 |
| TH Liberase | 로슈 | 5401135001 | |
| TL Liberse | 로슈 | 5401020001 | |
| 소에서 DNA 분해 효소의 I 유형 IV | 시그마 | D5025 | |
| 혈구 | 어부 | 0267110 | |
| 막 염료에게 DID | 인비 트 로젠 | D-7757 | |
| 로다 민 | 인비 트 로젠 | R634 | |
| 0.22 μm의 주사기 멤브레인 필터 단위 | 소동 | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite 다색 레드 마이크로 스피어 | Polysciences | 19507 | 0.5 μm의 |
| 침수 오일 시그마 | 56822 | ||
| LabVIEW를 | 내쇼날 인스트루먼트 | 컨트롤 거울 갈보 | |
| 스피너 플라스크 | Bellco | 1965-00250 |
표 1. pTIRF 현미경 장비.
| 내용 | 준비 - PSS | 기초-PSS | STIM-PSS |
| 염화나트륨 | 145 밀리미터 | 145 밀리미터 | 95 mM의 |
| 의 KCl | 5.6 mM의 | 5.6 mM의 | 56 mM의 |
| MgCl2를 | - | 0.5 ㎜ | 0.5 ㎜ |
| 염화칼슘 | - | 2.2 mM의 | 5 mM의 |
| HEPES | 15 mM의 | 15 mM의 | 15 mM의 |
| pH를 | 7.4 | 7.4 | 7.4 |
| 포도당 | 2.8 mM의 | 5.6 mM의 | 5.6 mM의 |
| 펜 연쇄상 | 1X | - | - |
표 2. 살포 및 크롬 친화 세포 준비 솔루션을 제공합니다.
| 내용 | Electroporating 미디어 | 일반 도금 미디어 | 배 항생제 미디어 |
| 1X DMEM/F-12 | 1 ㎖ / 판 | 2 ㎖ / 판 | 1 ㎖ / 판 |
| FBS | 10 % | 10 % | 10 % |
| 사이토 신 아라 비노 (CAF) | - | 10 mM의 주식 1 μL / ㎖ | - |
| 페니실린 | - | 100 단위 / 밀리리터 200 단위 / 밀리리터 | |
| 스트렙토 마이신 | - | 100 ㎍ / ㎖의 | 200 ㎍ / ㎖의 |
| 겐타 마이신 | - | 25 ㎍ / ㎖의 | 50 ㎍ / ㎖의 |
표 3. 크롬 친화 세포 미디어.
| 내용 | TH-PSS | TL-PSS |
| TH Liberase | 2 ㎖ | - |
| Liberase TL | - | 0.85 ML |
| 준비 - PSS | 98.0 ML | 84.0 ML |
| DNA 분해 효소 | 8.75 MG | 7.4 MG |
표 4. TH-PSS 및 TL-PSS 솔루션.
Discussion
편광 기반 TIRFM는 막 토폴로지의 급속한, 현미경적인 변화를 감지합니다. 기술을 구현 TIRF 광학이 이미 특히 경우, 상대적으로 간단합니다. 필요한 모든 것은 4 파장 판, 두 개의 편광 큐브 및 P-폴과의 폴 조명 경로를 분리하는 셔터이다. 테이블에 이러한 구성 요소의 정확한 위치는 일반적으로 사용 가능한 공간에 의해 결정됩니다.
막의 위상 정보를 획득하기 위해 사용될 형광 프로브는 고정되거나 알려진 방향으로 층간 삽입한다. 기술은,이 문서에서 설명하는 바와 같이, 이러한 FM1-43 (14)도 사용될 수있다 같은 carbocyanine 염료 그러나 다른 염료의 사용을 가정한다. 막 염색 절차 자체는 간단합니다. 배양 된 세포는 세포막의 풍부한 라벨을 얻기 위해 DID DII / 소량 만 아주 짧은 노출 (이하 10 초)이 필요합니다. 여분의 염료를 추가 광산란 aggreg로 연결이미지 품질을 감소 유리 ATES. 염료로 오버 배양 세포는 이미지 품질과 가능성이 세포 생존에 해로운 영향이 내면화를 염색하는 리드. 셀이 잘 더러워지면, P와 S 방출 이미지에 명확한 구별이있을 것이다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, P 방출 선명 S의 발광 강도는 셀 풋 프린트 위에 대략 균일 할 것 인 동안 (셀 풋 프린트의 가장자리, 즉) 커버 슬립 비스듬한 아르 멤브레인의 영역을 강조한다. P와 S 사이에 명확한 구별이 명확하지 않은 경우, 그것은 셀이 저조한 기판에 접착 또는 세포막은 건강하지 않고, 셀이 실험에 사용 가능하지 않다 것이 가능하다.
pTIRFM를 설명하는 우리의 이전 연구는 형광 막 프로브로 DII를 이용했다. 그것은 다른 형광으로 GFP / pHluorin을 사용 듀얼 컬러 이미징 실험에 적합하기 때문에 여기에서, 우리는 DID 활용합니다. 우리는 DID 위스콘신 흥분561 nm의 레이저가 아니라 (그것의 여기 피크에 가까운) 640 nm의 레이저를 토륨 때문에 640 nm에서 더 빠르게 형광 표백제. 561 nm의 레이저의 발행 여기 스펙트럼이 형광을 효율적으로 방출되는 DID의 꼬리에 있다는 사실에도 불구하고. 561 nm의 레이저의 또 다른 장점은 모두 DII을 자극하고 두 프로브 같은 편광 설정을 사용하는 밑거름 않은 것입니다. 막에서 형광의 방향이 막 토폴로지의 해석에 영향을 미칠 수 있음을주지하십시오. DII (또는 DID 경우처럼, 오히려 평행 또는 거의 평행보다) 형광 물질은 막 평면에 수직 인 그 전이 쌍극자 배향 된 경우 예를 들어, 비평면 멤브레인 영역은보다 용이 S 의해 강조 아닌 것 P 방출.
우리는 또한 소 부신 크롬 친화 세포의 분리 및 일렉트로 기술에 대해 설명했다. 소 크롬 친화 세포는 우수한 s의ecretory 모델. 그것은 분비 촉진의 다양한 반응 문화에 유지 관리가 용이되고, 그리고 쉽게 기존의 광학 현미경으로 시각화 큰 분비 소포를 소유의 이점이있다. 형광 단백질을 표현하는 세포는 이전에 콜라겐 처리 된 배양 접시에 도금에 정지에 일렉트로됩니다. 우리의 경험에서, 표현의 효율은 칼슘 + 인산 또는 리포 펙 타민 시약 어느 때보 일렉트로 훨씬 높다. 일렉트로 포 레이션의 단점은 더 많은 세포를 요구 (다양한 프로세스로 생존하지 않고) 비싼 상업적인 시약이다. 우리에게 불분명 한 이유로, 아니 모든 막은 않았다 통합. 또한, 접시에 세포의 일부만이 형질. 형질 전환하고 DID 잘 염색되는 세포를 발견하는 것은 염색과 일렉트로는 노력이 가치가있다 조건을 최적화하는 이유입니다 시간이 소요될 수 있습니다.
요약하면, 본인 rticle는 pTIRFM이 소 크롬 친화 세포의 밀도가 핵심 소포의 융합 과정에서 발생하는 신속하고 지역화 막 변형을 모니터링 할 구현 방법에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램 만이 논의되었지만, 그 기술은 이상적으로 엔도 시토 시스, 세포질 및 세포 운동성 포함한 막 형상의 변화를 포함하는 다른 생물학적 과정의 연구를 위해 적합하다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 연구는 웨인 주립 대학에서 미국 심장 협회 (American Heart Association) 및 창업 자금에서 AA로 국가 과학자 개발 그랜트 (13SDG14420049)에 의해 지원된다. 우리는 pTIRFM가 설정 및 원고에 도움이 의견에 대한 지원 소 부신 준비 및 박사 다니엘 악셀에 관한 조언을 제공 박사 로널드 W. HOLZ 박사 메리 BITTNER에게 빚을 졌네. SYT를 1 pHluorin가 함께 사용되었다 닥터 게로 Miesenbock (옥스포드 대학)의 허가. GCAMP5G는 Addgene을 얻었다. 우리는 설명 된 절차의 여러 단계를 최적화에 도움 제임스 T. 테일러, Tejeshwar 라오, 레이첼 L. Aikman 및 Praneeth Katrapti 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
References
- Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).
- Chapman, E. R. How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release. Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).
- Hinshaw, J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).
- Lang, T., et al. Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy. Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).
- Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388, 474-478 (1997).
- Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).
- Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy. J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2. Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).
- Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).
- Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells. Neuron. 16, 369-376 (1996).
- Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination. Biophys. J. 46, 739-747 (1984).
- Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells. Neuron. 35, 1085-1097 (2002).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion. J. Neurochem. , 10-1111 (2012).
- Anantharam, A., et al. A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion. Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion. Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).
- Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J. Cell. 188, 415-428 (2010).
- Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells. J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).
- O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
