Summary
Поляризация на основе полном внутреннем отражении флуоресцентной микроскопии (pTIRFM) позволяет обнаруживать в реальном времени динамики клеточных мембран. Эта статья описывает реализацию pTIRFM для изучения мембранной ремоделирования во время регулируемого экзоцитоза. Методика распространены на другие процессы в клеточной биологии, которые прямо или косвенно связаны с изменениями в форме мембраны.
Abstract
Чтобы получить новые проливает свет на динамику экзоцитоза, наша группа основное внимание уделяется изменениям в липидном форме двухслойной, которые должны быть точно регулируемых во время слияния везикул и плазматических мембран. Эти быстрые и локализованные изменения достигаются динамического взаимодействия между липидов и специализированных белков, которые контролируют мембраны кривизну. Отсутствие таких взаимодействий не только иметь разрушительные последствия для слияния пузырьков, но целый ряд других клеточных функций, которые включают контроль формы мембраны. В последние годы, идентичность ряда белков с мембранами формировании свойств была определена. То, что остается хватает, так это дорожная карта, когда, где и как они действуют как слияния и прогресса выпуска содержимого.
Наше понимание молекулярных событий, которые позволяют мембраны ремоделирования исторически были ограничены отсутствием аналитических методов, которые чувствительны к мембранной кривизны или имеют временное разрешение на TracК быстрые изменения. PTIRFM удовлетворяет обоим этим критериям. Мы обсудим, как pTIRFM реализуется визуализировать и интерпретировать быстрые, изменения субмикронных в ориентации хромаффинных клеточных мембран во время плотного ядра пузырька (DCV) синтеза. Хромаффинных клетки, которые мы используем изолированы от крупного рогатого надпочечников. Мембрана окрашивали с липофильным карбоцианиновым красителем, 1,1 '-диоктадецил-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-хлорбензолсульфонат, или сделал. DiD интеркалирует в плоскости мембраны с "фиксированной" ориентации и поэтому чувствительны к поляризации затухающих области. Сделал окрашенных клеточная мембрана последовательно волнует ортогональных поляризаций 561 нм лазера (р-пол, с-Pol). 488 нм лазер используется для визуализации везикул составляющие и время момент слияния. Экзоцитоз запускается локально перфузии клеток с деполяризующего раствора KCl. Анализ проводится форума с помощью пользовательского написанный программного обеспечения, чтобы понять, как сделализменения интенсивности излучения относятся к термоядерной пор расширения.
Introduction
Надлежащее исполнение экзоцитоза требуется экстремальные изменения мембранного бислоя форме, чтобы быть точно организовал. До синтеза, местный изгиб плазматической мембраны под гранул происходит, в частности, чтобы уменьшить энергетический барьер для взаимодействия бислоев. Позже, когда слияние мембраны, области высокой кривизны генерируются и должна быть стабилизирована. Наконец, слитые мембраны должны быть согнуты из их первоначальной форме, чтобы расширить поры слияния и позволяют контента освобождение 1. Потому что одни мембраны вряд ли претерпит такие драматические и скоординированных изменений, белки необходимы в качестве посредника события. Но как они действуют влиять изменения мембранного топологии в процессе слияния остается очень открытым.
Отлично в пробирке моделей существуют визуализировать мембраны кривизну. Использование отрицательной пятна EM, например, имело важное значение для формирования текущих молекулярные модели за действия двух основных торговли рroteins - синаптотагмин и динамин (см. обзоры Чепмен 2 и Хеншо 3). Большинство в режиме реального времени анализы экзоцитоза не обнаружить кривизну напрямую. Вместо этого, кривизна выводится из анализов, которые сообщают о кинетике просвета грузов выпуска 4-8 или изменения в площадь мембраны 9-11. PTIRFM устраняет разрыв между в естественных условиях и в пробирке исследования, позволяя прямые, в режиме реального времени измерения изменений в мембранной микроморфологии.
PTIRFM, в режиме nonimaging, был впервые Аксельрода и коллегами для измерения ориентации NPD-PE включены в модельной мембраны 12. Техника была затем применяется для визуализации динамические изменения в живых клетках, меченных Dii и FM1-43 13-18. В pTIRFM, два мимолетных поляризации поля используются для последовательно возбуждают мембранный встраиваемый зонд: р-поляризации (в плоскости падения) и S-поляризации (перпендикулярно плоскости падения). До обработки изображений, зонд - в этом случае сделали - кратко добавлен в внеклеточной среде и допускается к интеркаляции в плазматических мембранах клеток для изучения. В регионах, где мембрана непараллельны к покровного стекла (как в мембранный суеты и отступы), сделал также будет непараллельны. Поэтому такие регионы будет возбудимы по р-Pol луча. Р-пол пучка будет менее эффективно возбуждают сделал в мембранных регионах, которые в основном параллельны покровного стекла. Соотношение пиксель-в-пиксель изображения (P / S) отчетности по эмиссии из последовательного р-и S-POL возбуждения сделал будет поэтому специально выделить регионы деформации мембраны. В теории, соотношение изображения P / S чувствительны даже к небольшим углом плазмы отклонения мембраны от покровного стекла, с амплитудой изменения прогнозируемых с помощью компьютерного моделирования 18. P / S изображения также не зависят от флуорофора расстоянии от поверхности покровного стекла и местный флуорофоромконцентрация. Концентрация Часовой флуорофор вместо обеспечивается изображений отчетности по сумме пиксель в пиксель излучения P и 2 раза S излучения (P +2 S). P +2 измерения S чувствительна к точной геометрии отпечатка, с некоторыми, мало, или совсем не изменились возможного. Это можно показать с помощью компьютерного моделирования, что модель переходы поры слияния с раннего (т.е. с узким горлышком) на более поздний государства 16,18. P 2 S из плавленого пузырька, прикрепленной к плазматической мембране через узким горлышком (и с более сделал близко к границе раздела) по прогнозам, будет больше, например, чем у плавленого пузырька с гораздо более широкой поры (где сделал это в темному части затухающих области).
В этой статье мы рассмотрим, как pTIRFM реализуется и используется для изучения быстрых, локализованные изменения в форме мембраны, которые происходят во время слияния пор расширения. В то время как только одна заявка явно диscussed, эти методы распространены на различных других биологических процессов клеток, которые прямо или косвенно создают мембраны ремоделирования.
Protocol
1. Настройка PTIRF система
Техника pTIRFM построен на перевернутой столик микроскопа. Лазерные лучи направлены через боковую освещения портом и nonpolarizing боковой стороне фильтра куба, а затем фокусируется на задней фокальной плоскости объектива 60X 1,49 NA TIRF. Два дополнительных линз (1.6x и 2x) на пути излучения между микроскопом и EMCCD камеры дать окончательный размер пикселя около 80 нм. Лазерные лучи направляются с помощью программных контролируется гальванометрическими зеркала для быстрого переключения между эпи-и полного внутреннего отражения (ПВО) освещения. Протокол, описанный ниже, предполагает, что оптика для TIRF уже расположены на столе воздуха в оптимальных позиций для флуорофора возбуждения и визуализации. Он описывает, как поляризационной оптике добавляются к существующему TIRF микроскопа настройке, чтобы позволить визуализации клеточных мембран деформаций. Схема оптической настройки нашей лаборатории для создания обеих книжках и polarizatионный основе МДП показано на рисунке 1а. Протокол предполагает использование 488 нм лазера для возбуждения флуоресцентных белков везикул и 561 нм лазер для визуализации в карбоцианиновым красителя, сделал.
- Включение всех компонентов микроскопа, лазеров и компьютеров.
- Направлени луча от 488 нм лазера на задней фокальной плоскости (BFP) линзы 1,49 NA, как показано на фиг.1А. Если лазерный луч фокусируется на ДЦ, он появится коллимируется и отображаются в виде небольших четко определенную точку на потолке прямо над целью.
- Отрегулируйте X гальванометра зеркало (зеркало находится в эквивалентной плоскости образца), так что лазерный луч перемещается от оси и выходит из цели в прогрессивно более крутых углах, чтобы цель нормально.
- Далее, убедитесь, что МДП достигается. Добавить 10 мкл флуоресцентных микросфер до объема 1 мл PSS в со стеклянным дном блюда. Только флуоресценции из микросфер на дне ое блюдо, близкий к интерфейсу МДП, должны быть обнаружены. Обнаружение плавающих микросфер указывает, что угол между падающим светом и цель нормальный недостаточна.
Следующий раздел описывает настройку оптических компонентов, необходимых для работы с изображениями поляризации основе. - Использование выровненного 488 нм луч в качестве ориентира, отрегулировать положение сырьевого лазерного луча 561 нм, так что путешествует по идентичным оптического пути. 561 нм лазер будет использоваться для работы с изображениями в карбоцианиновым красителя, сделал.
- Вставьте рассеивающей линзы и зеркала вниз по течению от 561 нм лазера на. Использование зеркал, отрегулируйте луч так, чтобы он coaligned с 488 нм луча и пятно находится в фокусе на потолке, когда гальванометра зеркала в положение "0".
- Сосредоточьте четвертьволновой пластины (КЯ) на пути луча непосредственно после лазерного отверстия. Используйте QW, который является либо ахроматические или настроен на длине волны возбуждения.КЯ будет циркулярно поляризовать любые линейно поляризованный свет, который поступает под углом 45 ° с оптической осью. Некоторые оптические компоненты, такие как кубы поляризации, имеют уклон в направлении ослабления одной оси поляризации. КЯ может поворачиваться для компенсации этого смещения. Эта регулировка приведет к эллиптически поляризованной луча. QW необходимо, поскольку сам лазерный луч сильно линейно поляризованной (по вертикали) как он выходит из апертуры.
- Поместите куб поляризации (PC1) ниже по течению от эллиптически поляризованного луча. Куб поляризация отражает вертикальном (у) компонента электрического поля и проходит горизонтальный компонент (X). Куб поляризация находится на небольшом этапе переводческой для облегчения последующего выравнивание дорожек поляризации пучка.
- Используйте второй поляризационный куб (PC2) и зеркала (рис. 1А) для рекомбинации балки.
- Поместите затвор между первым куба поляризации (PC1) и вертикальной соmponent зеркало. Поместите второй затвор между горизонтальным зеркалом компонентов и второй куб поляризации (PC2). Эти жалюзи управляются ПО для обработки изображений, позволяющей пользователю быстро выбрать между поляризацией пучка.
- Используйте поляризационный фильтр для проверки ориентацию электрического поля в каждом пути луча. Поляризационный фильтр только позволит передачу в соответствии с оси фильтра.
- Убедитесь, что вертикальные и горизонтальные компоненты лазерного луча совмещены друг с другом и с 488 нм луча. Вносить коррективы по мере необходимости. Три балки все должны быть сосредоточены на ДЦ и выйти Коллимированный от цели на то же место на потолке. Это место может быть отмечен X с целью облегчить будущую выравнивание.
- Поместите каплю иммерсионного масла на цели. Место блюдо, содержащее флуоресцентные микросферы (см. шаг 4 выше) на цели.
- Введите TIR, перемещая X гальванометра зеркало. В МДП, вертикальной Componenт из пучка S-пол и горизонтальный компонент пучка в настоящее время является р-пол. Регулировка относительную интенсивность между лучами, вращая QW пластину. Просмотрите каждый поляризованный мимолетную поле с родамина образца, по прогнозам, будет случайным образом ориентированные. Поверните КЯ пластину, чтобы соответствовать средние интенсивности пикселов. При необходимости добавьте фильтр нейтральной плотности в одном поляризованного пути луча для ослабления ее интенсивности.
2. Хромаффинных изоляторе
Процедура для выделения здоровых хромаффинных клеток из телячьей надпочечников, приводится ниже. Он адаптирован из ранее опубликованных протоколов по Вика, Senter и соавт. 19 и O'Connor, махата соавт. 20 После выделения клетки подвергали электропорации с плазмидой (ами), представляющие интерес с использованием системы электропорации. Эта система приводит к 20-30% клеток, экспрессирующих желаемый флуоресцентные белки. Как правило, 70% клеток выжить избранныхroporation процесс. Подробная информация о PSS и СМИ компонентов приведены в таблицах 2, 3 и 4.
- За два дня до клеточной стадии подготовки, лечения 35-мм оптических качества стеклянным дном (толщиной 0,17 мм) блюда с 1 мл поли-D-лизина (0,1 мг / мл), а затем 1,25 мл бычьего коллагена. Оставьте блюда высохнуть на воздухе в капот культуры ткани.
- Получить крупного рогатого надпочечники от скотобойни. Держите желез на льду, пока они будут транспортироваться обратно в лабораторию. Крупного рогатого скота надпочечники могут быть заключены в толстым слоем жира. Используйте хирургические ножницы, чтобы удалить лишний жир и разоблачить надпочечников открытие вены. Заливать вену с препаративной PSS несколько раз, пока сальник не будет удален из крови.
- Затем медленно пипетки 2 мл раствора TH-PSS в отверстие вен до сальника набухает. Инкубируйте завышенные желез при 37 ° С в течение 15 мин. Повторите лечение TH-PSS и инкубировать снова.
- Вырезать через внешнюю коры надпочечников вокруг края железы с Scissors и очистить железу на части, чтобы разоблачить мозговое вещество. Используйте скальпель, чтобы мягко очистить и отделить костный мозг от корковой ткани.
- Фарш костный мозг с парой лезвий скальпеля в течение 5-10 мин.
- Последний шаг пищеварения необходимо выделить отдельные хромаффинных клетки. Вылейте фарш клеточной суспензии в вращающейся колбе. Частично заполнить колбу с соотношением 2:01 ТД-PSS (30 мл) к TL-PSS (15 мл) и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С при вращении на уровне приблизительно 100 оборотов в минуту.
- Отдельные индивидуальные хромаффинных клетки от непереваренной ткани фильтрованием через мкм сетки 400. Сбор фильтрата. Центрифуга при 200g для осаждения клеток, и ресуспендируют в ледяной PSS.
- Фильтр клеток через 250 мкм сетки, гранул, и, наконец ресуспендируют в буфере для электропорации (см. шаг 2.9).
- Граф клеток с помощью гемоцитометра и подготовиться к трансфекции.
- Трансфекции клеток с системой электропорации в соответствии срекомендации изготовителя. Конкретные условия для электропорации должны быть определены эмпирически. Примечание: Настройки, которые обеспечивают наилучший баланс между эффективностью трансфекции и скорости клеточного выживания для этого подготовки рогатого хромаффинных клеток 1100 В, 40 мс, и 1 импульс. По нашим оценкам, с этими условиями, 20-30% клеток трансфицируют. Примерно 30% клеток не выживают процесс электропорации.
- Пластина клеток осторожно поли-D-лизина и коллагена обрабатывали блюда в 1 мл обогреваемых электропорации массовой информации.
- Поместите посуду в инкубаторе 37 ° C (5% СО 2). Добавьте 1 мл 2x антибиотикам СМИ к каждому блюду после 6 часов. Измените СМИ к нормальным СМИ на следующий день.
- Хромаффинных клетки обычно изображается через 2-5 дней после электропорации.
3. pTIRF Приобретение изображения
- Включение системы визуализации и начать приобретение программного обеспечения.
- Убедитесь, что лазеры выравниваются. Проверьте EVANESCENTполя профиля с использованием микросфер.
- Подготовьте глобальной и локальной системы перфузии. Чистые водоемы решение с фильтрованной деионизированной Н 2 О и залейте базальных и стимулирования PSS решения.
- Перед визуализации хромаффинных клетки, убедитесь, что р-Pol и с-Pol возбуждения осветить тот же участок поля зрения и, что интенсивности освещения примерно эквивалентны. Чтобы сделать это, заполнить со стеклянным дном блюдо с 2 мл, содержащих PSS родамин при конечной концентрации 10 мМ. Последовательно возбуждения образца родамин с р-пол и с-Pol света и захвата изображений. На практике, выбросы P и S от DID нормированы на среднее значение P и S выбросов родаминовых. См. анализ изображения и обсуждение разделы для получения дополнительной информации.
- Теперь приступаем к окрашиванию крупного рогатого хромаффинных клетки с сделал. Промыть питательных сред из чашки с хромаффинных клетки и заменить 2 мл базальной-PSS. Добавить 10 мкл 10 мМ сделал (разбавленный в этаноле)непосредственно в чашку, содержащую клетки. Аккуратно агитировать блюдо в течение 2-10 секунд и снимите сделал решение + PSS.
- Вымойте блюдо 3-4x с базально-PSS, чтобы удалить остатки сделал. Клетки сейчас окрашенных и готов к использованию.
- Добавить каплю иммерсионного масла к цели. Поместите чашку, содержащую сделал-окрашенных клеток хромаффинных на верхней части объектива.
- Просмотр блюдо либо через объектив или камеру, найти ячейку, которая трансфицированная интересующего белка и окрашивали сделал. Хорошо окрашенных клеток проявляет P эмиссию, что ярко выделяет края ячейки; S излучение должно быть примерно одинаковым по всей клеточной след (т.е. области клетки, которые приклеивают к стеклу и отображаемого в TIRF).
- Установите местного перфузионного иглы так, чтобы она примерно 100 мкм от клетки.
- Сосредоточьтесь на клеточной мембране и включения автофокусировки оборудования непосредственно перед приобретением стимуляция клеток / изображения. </ Li>
- Начните сканирование изображения. Заливать клетки в течение 10 сек с базальной решения, а затем в течение 60 секунд с деполяризующего 56 мМ раствора KCl. Получение изображений в то время как быстро опалубка между 561 нм р-Pol, 561 нм с-пол (для мониторинга изменений в P и S эмиссию сделали) и 488 нм возбуждения (к изображению трансфектированную пузырек зонда). Примеры изображений, полученных в ходе экспериментов показаны на рисунках 2 и 3.
4. Анализ изображений
Вычисления для обработки изображений может быть выполнено с ImageJ, но использующие сценарии в гибком языке программирования, таких как IDL или Matlab может значительно увеличить пропускную способность анализа за счет автоматизации этой задачи. Два типа изображений должны быть рассчитаны для получения топологической информации из необработанных изображений выбросов -. P / S и P +2 S P / S отчеты о локальных деформаций мембранных а P +2 S сумма сообщает от общего мембранного красителя в данном регионеполя.
- Все изображения должны быть фон вычитается. Выберите вне клеток ROI, измерить среднюю интенсивность пикселя в ROI, а затем вычитанием этого значения из всех пикселей в стеке изображения.
- Для расчета P / S, разделить каждую "P" кадр выбросов на последующем кадре выбросов "S" (пиксель в пиксель). P / S изменяется с относительной интенсивности р-и с-Pol возбуждений, погрешностей в оптическая система, и интерференционных полос. Чтобы уменьшить эти эффекты, нормализовать соотношение P / S от, полученных из сделал излучения на формат, полученный с раствором, содержащим 10 мМ родамин 18.
- Экзоцитоз отдельных DCVS видно из резкого изменения интенсивности флуоресцентного пузырьков белка, такие как Synaptotagmin-1 pHluorin (рис. 2В). Определить изменения в P / S и P 2 S путем усреднения пикселей в 240 нм радиуса ROI центром по локализованным увеличивается в P / SКоэффициент на участках экзоцитоза. Когда происходит слияние без очевидного увеличения P / S, ROI сосредоточена по области термозакрепления DCV.
- Компьютерное моделирование может быть выполнена интерпретировать 2 S изменения интенсивности мембранные P / S и P с точки зрения простых геометрий расширение поры слияния. Более подробную информацию о моделировании см. Anantharam др. 18.
Representative Results
Обычные и поляризованные методы визуализации TIRFM реализованы на том же столе воздуха. Конфигурация оптических элементов аналогична, с основным отличием, что возбуждающий свет поляризован (рис. 1А). Поляризованный свет преимущественно волнует флуорофоры с диполей поглощения в направлении поляризации. Таким образом, для pTIRFM, чтобы быть эффективным при мониторинге мембранные топологические изменения, зонд, который используется должны интеркаляции в мембране с фиксированной ориентацией. Флуоресцентные красители карбоцианиновых (DII, сделал) интеркалируют в липидного бислоя в ориентированном моды с переходной диполей в плоскости мембраны (рис. 1В). P-поляризованного освещения (рис. 1С) из DID-меченых мембран избирательно возбуждает покровное-косой флуорофоры (RED в фиг.1В и 1D).
Буйный мембрана маркировка хромаффинных клеток достигается после ABРиф инкубации с сделал. фиг.2А показан пример клеточной мембраны, которая окрашенных хорошо. Здоровый, приверженцем ячейка будет проявлять явные различия в выбросах P и S. Изображение P излучение показывает яркую границы клеток по отношению к остальной части клетки. Образ S выбросов показывает примерно равномерное свечение через клеточную след. Рассчитано пиксель-в-пиксель P / S и P 2 S изображения чувствительны к мембранной кривизны и концентрации красителя, соответственно. Хромаффинных клеток показали также трансфицировали Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) для обозначения секреторные везикулы (рис. 2б).
Хромаффинных клеток стимулировали 56 мМ KCl деполяризовать клеточную мембрану и вызывать экзоцитоз. Ряд ярко люминесцентных Syt-1 pHluorin пятен вдруг стало очевидно, как DCVS предохранителем (рис. 2В, правая панель). Белая коробка обращается вокруг одного слияния случае (рис. 2В, правая панель). Это я событием фьюжны проанализированы на рисунках 2C и 2D. 2С показывает кадр за кадром изменения в SYT-1-pHluorin, P / S и P 2 интенсивностей S изображений. Интенсивность флуоресценции из SYT-1 быстро уменьшается по мере белок диффундирует от места слияния (рис. 2D). Углубление представляющий слитый пузырек / плазменный мембраны комплекс уменьшается при относительно медленными темпами (Примечание графики в рисунке 2D). На рисунке (Рисунок 2E) изображает одну интерпретацию этих измерений.
Стремительные и локализованные мембранные деформации показано на рисунке 2, являются результатом стимула-вызвали Са 2 + притока. Это показано на фигуре 3А. Хромаффинных трансфицируют генетического Са 2 + индикатор GCaMP5G 21,22 и стимулировали 56 мм KCl. Деполяризации мембраны вызывает значительное увеличение флуоресценции GCaMP5G (
/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Иллюстрации к технике pTIRFM. А) Схематическое для объединения обычных с поляризацией на основе TIRF визуализации показан. Четвертьволновая (КЯ) пластина помещается перед сапфирового лазера на 561 нм в эллиптически поляризовать лазерный луч. Поляризационный куб (PC1) используется для разделения поляризации в линейные вертикальные (V) и горизонтальный (H) компонентов. Вертикальные и горизонтальные компоненты стать р-пол и балки возбуждения с-Pol, соответственно, на поверхности МДП. В р-Pol и с-Pol пути независимо ставнями (S1 и S2). Они объединяют с зеркалами и второй поляризационный куб (PC2). Они присоединяются к 488 нм луч (также независимо ставнями, S3) через луч рулевого элемента, состоящей из зеркала и nonpolarizing дихроичное зеркало (DC). Объективы (L) используются для расширения и сосредоточиться лучи. Комбинированные 488-нм и 561-нм лучи, направляя к боковой подсветки порту микроскопом через гальванометр зеркала (GM). Они сосредоточены в задней фокальной плоскости (ДЦ) объектива. Фотоны, излучаемые флуорофорами захватываются на EMCCD камеры, подключенной к компьютеру. B) DiD маркировка выполняется кратко инкубации клеток с красителем и промывки несколько раз, чтобы удалить излишки. DiD интеркалирует в мембране с его дипольных моментов перехода примерно в плоскости мембраны. C) Падающий свет поляризован в плоскости падения (р-Pol) создает затухающих волн, который является преимущественно поляризованного нормали к границе, как показано. D) Освещение в DID-меченого мембраны с р-поляризованного света будет селективно возбуждать те флуорофоры, которые покровного стекла-косой (RED). Если бы это было с-поляризованного затухающих поле, эти флуорофоры, параллельные покровного стекла будет возбуждаться вместо (черный).
Рисунок 2. Чонг> Мониторинг сотовые деформации мембраны с pTIRFM. А) эмиссионные изображения сырье P и S вместе с рассчитанной P / S и P 2 изображений S выбросов показаны. Шкала бар, 3,2 мкм. Б) хромаффинных клеток выражая SYT-1 pHluorin деполяризуется с KCl. Ряд ярко люминесцентных пятен (правая панель) указывают на слияние отдельных DCVS. Шкала бар, 3,2 мкм. C) кадр за кадром изображения плавящимся Syt-1 pHluorin DCV. Времена (выше изображений) в секундах. Время 0 обозначает рамку до слияния DCV. 2 эмиссионные изображения S-корреспондент P / S и P также показаны. . Шкала бар составляет 1 мкм D) Графики для изображений в С. пунктирная линия в момент 0 -. Слияние кадров Е) Один из возможных интерпретаций результатов в С и D показано. пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Деформации являются результатом стимула-вызвали Са 2 + притока. А) хромаффинных клеток трансфецировали GCaMP5G деполяризуется с 56 мм KCl. В результате увеличение флуоресценции GCaMP5G означает увеличение subplasmalemmal Са 2 + уровня. B) кадр за кадром изображения 30 х 20 пикселя области ячейки в А. раза выше Изображения в секундах. Белые стрелки указывают на область увеличения P / S и P 2 S снижения. Цитозольного GCaMP5G белок исключается из региона путем термического закрепления DCV. Шкала бар, 1 мкм. C) Графики для изображений, показанных на B. D) Один из возможных интерпретаций результатов в В и С показана.3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| iXon3 EMMCD камеры | Андор | 897 | |
| IX81 Инвертированный микроскоп | Олимп | Боковые FILTERCUBE Ассамблея | |
| 43 серии Ар-ионный лазер | CVI Milles Griot Оптика лазеров | 543-AP-A01 | Легкая настройка на 488 нм |
| Sapphire 561 ЗО диодного лазера | Когерентный | 561 нм | |
| Сканирование Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC 3 Канал Фокусное перфузии система | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| ЧММ Кварц MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA ЧММ-4 | <TD>|
| 10 фунтов на квадратный дюйм Регулятор давления | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Манипулятор | Берли | TS 5000-150 | |
| Установленный Ахроматический четвертьволновую пластинку | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680 нм поляризационный Светоделитель Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Шесть станция нейтральной плотности колеса | Thorlabs | FW1AND | |
| Шаговым двигателем приводной SmartShutter | Саттер инструменты | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Дихроичный фильтр | Цветность | NC255583 | Играя 488 нм и 561 нм лучи |
| С покрытием Плано-вогнутой линзы | Эдмунд Оптика | ПВХ 100 мм ВИС 0 | Расходится нм луч 488 | С покрытием Плано-вогнутой линзы | Эдмунд Оптика | ПВХ 250 мм ВИС 0 | Расходится нм луч 561 |
| С покрытием Плано-выпуклой линзы | Эдмунд Оптика | PCX 125 ВИС 0 | Ориентирован оба луча |
| С покрытием Плано-выпуклой линзы | Эдмунд Оптика | PCX 50мм ВИС 0 | Цементированный для фильтрации куба сборку |
| z488/561rpc Дихроичный | Цветность | z488/561rpc | FILTERCUBE дихроичное |
| z488/561_TIRF выбросов фильтр | Цветность | z488/561m_TIRF | Выбросов FILTERCUBE |
| UIS2 60X Цель | Олимп | UPLSAPO 60XO | Н.А. 1,37 |
| Неон Трансфекцию система | Invitrogen | МПК 5000 | |
| MetaMorph обработки изображений | Molecular Devices | ||
| DiI Мембрана краска | Invitrogen | V-22885 | Для выравнивания целей |
| TH Liberase | Рош | 5401135001 | |
| TL Liberse | Рош | 5401020001 | |
| ДНКазы я Тип IV от крупного рогатого скота | Сигма | D5025 | |
| Гемоцитометра | Рыбак | 0267110 | |
| DiD мембраны красителя | Invitrogen | D-7757 | |
| Родамин | Invitrogen | R634 | |
| 0,22 мкм мембранный фильтр шприца Единица | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite полихроматического Красные микросферы | Polysciences | 19507 | 0,5 мкм |
| Погружение нефти Сигма | 56822 | ||
| LabVIEW | National Instruments | Управление Galvo зеркала | |
| Spinner Настой | Bellco | 1965-00250 |
Таблица 1. pTIRF микроскопия оборудование.
| Содержание | ОРГ-PSS | Базальная-PSS | Стим-PSS |
| NaCl | 145 мм | 145 мм | 95 мм |
| KCl | 5,6 мМ | 5,6 мМ | 56 мм |
| MgCl 2 | - | 0,5 мМ | 0,5 мМ |
| CaCl 2 | - | 2,2 мм | 5 мм |
| HEPES | 15 мм | 15 мм | 15 мм |
| рН | 7.4 | 7.4 | 7.4 |
| Глюкоза | 2,8 мм | 5,6 мМ | 5,6 мМ |
| Пен-Strep | 1x | - | - |
Таблица 2. Перфузии и хромаффинных решения клеток подготовительные.
| Содержание | Электропорации Медиа | Нормальная Покрытие Медиа | 2x Антибиотик Медиа |
| 1x DMEM/F-12 | 1 мл / пластина | 2 мл / плита | 1 мл / пластина |
| FBS | 10% | 10% | 10% |
| Цитозин арабинофуранозида (CAF) | - | 1 мкл / мл с 10 мМ маточного | - |
| Пенициллин | - | 100 единиц / мл 200 ед / мл | |
| Стрептомицин | - | 100 мкг / мл | 200 мкг / мл |
| Гентамицин | - | 25 мкг / мл | 50 мкг / мл |
Таблица 3. Хромаффинных Сотовый Медиа.
| Содержание | TH-PSS | TL-PSS |
| Liberase TH | 2 мл | - |
| Liberase TL | - | 0,85 мл |
| ОРГ-PSS | 98,0 мл | 84,0 мл |
| ДНКаза | 8,75 мг | 7.4 мг |
Таблица 4. TH-PSS и TL-PSS решения.
Discussion
Поляризация основе TIRFM обнаруживает быстрые, субмикроскопические изменения мембранного топологии. Реализация метода является относительно простым, особенно если TIRF оптика уже на месте. Все, что необходимо, так это четвертьволновой пластинки, два поляризационный куб, и жалюзи, чтобы отделить р-Pol и с-пол освещения пути. Точное положение этих компонентов на столе обычно диктуется пространства.
Для того чтобы получить мембраны топологической информации, флуоресцентный зонд использовали должны интеркаляции с фиксированным или известной ориентации. Методика, как описано в этой статье, предполагает использование карбоцианиновых красителей, но и другие красители, такие как FM1-43, 14 также могут быть использованы. Сама процедура окрашивания мембраны проста. Искусственный клетки требуют лишь небольшого экспозиции (менее 10 сек) в небольшом количестве Dii / DID для получения буйный маркировки мембраны. Добавление избыток красителя приводит к легкой Aggreg рассеянияАтеш на стекле, которые умаляют качество изображения. Более-инкубации клеток с красителем приводит красить интернационализации, которая оказывает негативное воздействие на качество изображения и, возможно, жизнеспособности клеток. Если ячейка окрашивается хорошо, будет четкое различие в образах выбросов P и S. Как показано на фиг.2А, излучение P будет ярко выделить области мембраны, которые покровное косой (т.е. краев клеток след), а интенсивность излучения S будет примерно одинаковым по клеточной след. Если четкое различие между Р и S не являются очевидными, то вполне возможно, что клетка слабо привязаны к подложке или клеточная мембрана не здоров, и ячейка не используется для экспериментов.
Наши предыдущие исследования, описывающие pTIRFM использованы Dii как флуоресцентного мембранного зонда. Здесь мы используем сделал, потому что он подходит для экспериментов с изображениями двухцветными, которые используют GFP / pHluorin как другой флуорофором. Мы возбуждают сделал шй 561 нм лазер, а не нм лазер 640 (который ближе к своему пику возбуждения), потому что флуорофорные отбеливатели быстрее при 640 нм. Несмотря на то, что нм лазер 561 находится на хвосте сделал Опубликовано спектр возбуждения, флуоресценция эффективно испускается. Еще одно преимущество нм лазер 561 является то, что она возбуждает обе Dii и сделал позволяет нам использовать те же установки поляризации для обоих зондов. Следует отметить, что ориентация флуорофора в мембране будет влиять на интерпретацию мембранной топологии. Например, если флуорофор были ориентированы своими переходных диполей перпендикулярно к плоскости мембраны (а не параллельно или почти параллельно, как в случае с DII или же), то неплоских областей мембраны будет более легко выделены с помощью S, а не P выбросов.
Мы также описали методы для выделения и электропорации крупного рогатого надпочечников хромаффинных клеток. Бычьего хромаффинных клеток является отличным сecretory модель. Он имеет преимущества быть легко поддерживать в культуре, в ответ на различных secretogogues, и обладающие большими секреторных везикул, которые легко визуализируются с обычной световой микроскопии. Чтобы выразить флуоресцентные белки, клетки электропорации в суспензии до высева на коллагеновых обработанных чашек для культивирования. По нашему опыту, эффективность выражение намного выше с электропорации, чем с любой Ca 2 +-фосфата или Lipofectamine реагентов. Недостатком электропорации является то, что он требует больше клеток (как многие не выживают процесс) и дорогие коммерческие реагенты. По причинам, которые для нас неясным, не каждый мембрана включает сделал. Кроме того, только часть из клеток на блюдо трансфецируют. Поиск клетки, которые трансфицированными И окрашиваются хорошо с DID может занять много времени, поэтому оптимизация условий для окрашивания и электропорации хорошо стоит затраченных усилий.
Таким образом, этотСтатья описывает, как pTIRFM реализуется следить за быстрые и локализованные мембранных деформаций, возникающих при синтезе плотных основных пузырьков в бычьих хромаффинных клеток. Хотя только одно приложение обсуждается, метод идеально подходит для изучения других биологических процессов, которые включают изменения в форме мембраны, в том числе эндоцитоза, цитокинеза и подвижности клеток.
Disclosures
Авторы не имеют никакого отношения к раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование опирается на национальный Грант Ученый развития (13SDG14420049) до АА от Американской ассоциации сердца и пуско-наладочных средств из Wayne State University. Мы в долгу перед доктором Рональда Holz и д-р Мэри Биттнер за предоставление консультаций по вопросам рогатого надпочечников препаратов и д-р Даниэль Аксельрода о помощи с pTIRFM настройке и полезные замечания по рукописи. Syt-1 pHluorin был использован с разрешение доктора Геро Miesenbock (Оксфордский университет). GCAMP5G был получен через Addgene. Мы благодарим Джеймса Т. Тейлор, Tejeshwar Рао, Рэйчел Л. Aikman и Praneeth Katrapti с помощью на оптимизации различных этапов процедур, описанных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
References
- Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).
- Chapman, E. R. How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release. Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).
- Hinshaw, J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).
- Lang, T., et al. Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy. Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).
- Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388, 474-478 (1997).
- Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).
- Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy. J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2. Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).
- Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).
- Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells. Neuron. 16, 369-376 (1996).
- Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination. Biophys. J. 46, 739-747 (1984).
- Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells. Neuron. 35, 1085-1097 (2002).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion. J. Neurochem. , 10-1111 (2012).
- Anantharam, A., et al. A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion. Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion. Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).
- Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J. Cell. 188, 415-428 (2010).
- Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells. J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).
- O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
