Summary
Polarisering baserat total intern reflektion fluorescens mikroskopi (pTIRFM) möjliggör realtidsdetektion av cellmembrandynamik. Denna artikel beskriver genomförandet av pTIRFM för studier av membran ombyggnad under reglerad exocytos. Tekniken är generaliserbart till andra processer i cellbiologi som direkt eller indirekt involverar förändringar i membranform.
Abstract
För att få nya insikter om dynamiken i exocytos, fokuserar vår grupp på förändringarna i membranet form som måste noggrant angivna villkor vid fusion av vesikler och plasmamembran. Dessa snabba och lokala förändringar uppnås genom dynamiska interaktioner mellan lipider och specialiserade proteiner som styr membran krökning. Avsaknaden av sådana interaktioner skulle inte bara få förödande konsekvenser för vesikelfusion, men en mängd andra cellulära funktioner som innebär kontroll av membranform. Under senare år har identiteten av ett antal proteiner med membranformningsegenskaper bestämts. Det som återstår saknas är en färdplan för när, var och hur de agerar som fusion och innehåll frigör framsteg.
Vår förståelse av de molekylära händelser som gör att membran ombyggnad har historiskt varit begränsad av brist på analysmetoder som är känsliga för membran krökning eller har den temporala upplösningen till Track snabba förändringar. PTIRFM uppfyller båda dessa kriterier. Vi diskuterar hur pTIRFM implementeras för att visualisera och tolka snabba, förändringar submikrona i orientering kromaffina cellmembran under tät kärna vesikler (DCV) fusion. De kromaffinceller vi använder isoleras från nötkreatur binjurarna. Membranet är färgade med en lipofil karbocyaninfärgämnet, 1,1 '-dioktadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorbensensulfonat, eller gjorde. DiD interkalerar i membranplanet med en "fast"-orientering och är därför känslig för polariseringen av det evanescenta fältet. DID-färgade cellmembranet är sekventiellt glada med ortogonala polariseringar i en 561 nm laser (p-pol, s-pol). En 488 nm laser används för att visualisera vesikler beståndsdelar och tid tidpunkten för fusionen. Exocytos utlöses av lokalt perfusion celler med en depolariserande KCl-lösning. Analys utförs offline använder anpassade skrivna program för att förstå hur gjordeintensitetsförändringar utsläpps avser fusion por utvidgning.
Introduction
Ett korrekt genomförande av exocytos kräver extrema förändringar i membranbiskiktet form för att vara exakt iscensatt. Före fusion, lokal böjning av plasmamembranet under granul inträffar, delvis för att minska den energibarriär för interaktion av dubbelskikt. Senare, som membran samman, områden med hög krökning genereras och måste stabiliseras. Slutligen måste sammansmälta membran böjas ut ur sin ursprungliga form för att bygga fusions por och göra det möjligt för innehållsfrigör 1. Eftersom enbart membran är osannolikt att genomgå sådana dramatiska och samordnade förändringar, proteiner är nödvändiga för att förmedla händelser. Men hur de agerar för att påverka förändringar i membrantopologin under fusionsprocessen är fortfarande väldigt mycket en öppen fråga.
Excellent in vitro-modeller finns för att visualisera membran krökning. Användning av negativa-bets EM, till exempel, har varit viktigt för att forma nuvarande molekylära modeller för åtgärder av två stora handel proteins - synaptotagmin och dynamin (för recensioner, se Chapman 2 och Henshaw 3). De flesta realtidsanalyser av exocytos inte upptäcka krökning direkt. Istället krökning utläsas analyser som rapporterar på kinetiken för lumenal last frigör 4-8 eller förändringar i membranområdet 9-11. PTIRFM överbryggar gapet mellan in vivo och in vitro-studier genom att möjliggöra direkta, realtidsmätningar av förändringar i membran Mikromorfologi.
PTIRFM, i en icke-avbildande läge, var uppfunnen av Axelrod och kollegor för att mäta riktningen på NPD-PE ingå i en modellmembran 12. Tekniken applicerades sedan för att visualisera dynamiska förändringar i levande celler märkta med Dil och FM1-43 13-18. I pTIRFM är två evanescent fält polarisationerna används för att sekventiellt excitera ett membraninbäddade prob: p-polarisering (i infallsplanet) och s-polarisation (vinkelrätt mot infallsplanet). Före bildbehandling, sonden - i det här fallet gjorde - är kortvarigt till den extracellulära mediet och får inskjuta i plasmamembran hos celler som skall studeras. I regioner där membranet är icke-parallell med täckglas (som i en membran ruffle eller indrag), det gjorde också vara icke-parallella. Därför kommer sådana regioner vara exciterbara av p-pol stråle. Den p-pol stråle kommer mindre effektivt hetsas gjorde i membranregioner som oftast parallella med coverglass. Pixel-till-pixel ratio bilder (P / S) rapportering om utsläpp från sekventiell p-och s-pol excitation av DID kommer därför att särskilt belysa områden av membran deformation. I teorin, P / S-tal bilder är känsliga för även små vinklar av plasmamembran avvikelse från coverglass, med amplituden av de förändringar förutspåtts av datorsimuleringar 18. P / S-bilder är också oberoende av fluoroforen avstånd från coverglass ytan och lokal fluoroforkoncentration. Lokal fluoroforen koncentration istället tillhandahålls av bilder som rapporterar på pixel-till-pixel summan av P-utsläpp och 2 gånger S-utsläpp (P 2 S). P 2 S mätningen är känslig för den exakta geometrin i inbuktningen, med viss, liten, eller ingen förändring möjlig. Detta kan visas genom datorsimuleringar som modell övergångar av en fusion por från en tidig (dvs. med en smal hals) till ett senare tillstånd 16,18. P 2 S av en kondenserad vesikel fäst till plasmamembranet via en smal hals (och med mer gjorde nära gränsytan) förutspås att vara större, till exempel, än den hos en kondenserad vesikel med ett mycket större porer (där gjorde är inom dimmest del av den evanescenta fältet).
I denna artikel diskuterar vi hur pTIRFM implementeras och utnyttjas för att studera snabba, lokaliserade förändringar i membranform som uppstår under fusion por utvidgning. Även om endast en ansökan är uttryckligen discussed är metoderna generaliserbar till en variation av andra cell biologiska processer som direkt eller indirekt involverar membranet remodeling.
Protocol
1. PTIRF Systeminstallation
Den pTIRFM teknik bygger på ett inverterat mikroskop plattform. Laserstrålar riktas genom en sidobelysning port och en nonpolarizing sidovända filterkuben och sedan fokuseras på det bakre fokalplanet för en 60X 1,49 NA TIRF mål. Två extra objektiv (1,6 x och 2x) i emissionsvägen mellan mikroskopet och EMCCD kamera ger en slutlig pixelstorlek på ca 80 nm. Laserstrålar styrs med hjälp av mjukvarustyrda galvanometerspeglar speglar för snabb växling mellan epi-och total inre reflektion (TIR) belysning. Protokollet som beskrivs nedan förutsätter att optik för TIRF redan är positionerade på luftbordet i optimala lägen för fluorofor excitation och avbildning. Den beskriver hur polariserings optik läggs till en befintlig TIRF mikroskop set-up för att möjliggöra avbildning av cellmembran deformationer. En schematisk bild av vårt laboratorium optiska set-up för att generera både TIR och polarizatjon-baserad TIR visas i figur 1A. Protokollet förutsätter användning av en 488-nm laser för excitation av fluorescerande vesikler proteiner och en 561 nm laser för avbildning av karbocyaninfärgämnet, gjorde.
- Slå på alla mikroskop komponenter, lasrar och datorer.
- Rikta en stråle från 488 nm laser för att den bakre fokalplan (BFP) av 1,49 NA-lins som illustreras i figur 1A. Om laserstrålen är fokuserad på BFP, kommer det att dyka upp kollimerad och visas som liten väldefinierad plats på taket omedelbart ovanför målet.
- Justera X galvanometerspegel (spegeln ligger i motsvarande provplanet) så att laserstrålen flyttas off-axeln och kommer ut från målet vid progressivt brantare vinkel till målet normala.
- Därefter kontrollera att TIR uppnås. Tillsätt 10 pl av fluorescerande mikrosfärer till en 1 ml volym av PSS i en glasbottnad skål. Endast fluorescens från mikrosfärer på botten of skålen, närmast till TIR-gränssnitt, bör upptäckas. Detektion av flytande mikrosfärer tyder på att vinkeln mellan det infallande ljuset och objektiv normalt är otillräcklig.
Avsnittet nedan beskriver uppsättningen av de optiska komponenter som krävs för polarisering baserad avbildning. - Med hjälp av linje 488 nm stråle som guide, justera läget för den råa 561 nm laserstråle så att den färdas längs en identisk optisk väg. Den 561 nm laser kommer att användas för avbildning av karbocyaninfärgämnet, gjorde.
- Sätt i en divergerande lins och speglar nedströms 561 nm laser. Med hjälp av speglar, justera strålen så att den coaligned med 488 nm balken och platsen är i fokus i taket när galvanometerspeglar speglarna är i läge "0".
- Centrera en kvartsvågsplatta (QW) i strålgången omedelbart nedströms laseröppningen. Använd en QW som antingen är akromatisk eller inställda på excitationsvåglängden.En QW kommer cirkulärt polarisera något linjärt polariserat ljus som kommer in i 45 ° vinkel med den optiska axeln. Vissa optiska komponenter, såsom polariserings kuber, har en dämpnings bias mot en axel av polarisation. Den QW kan vridas för att kompensera för denna bias. Denna justering kommer att resultera i en elliptiskt polariserad stråle. En QW är nödvändigt eftersom laserstrålen i sig är mycket linjärt polariserad (lodrätt) när den kommer ut från öppningen.
- Placera en polarisering kub (PC1) nedströms elliptiskt polariserade strålen. Polariseringen kuben reflekterar den lodräta (y) komponent av det elektriska fältet och passerar den horisontella (x) komponent. Den polarisering kuben är placerad på en liten översätta skede för att underlätta efterföljande inriktning av polarisering balkbanor.
- Använd en andra polariserande kub (PC2) och speglarna (Figur 1A) att rekombinera balkarna.
- Placera en slutare mellan den första polariseringskuben (PC1) och vertikal component spegel. Placera en andra slutare mellan den horisontella komponenten spegeln och andra polarise kub (PC2). Dessa luckor styrs av bildbehandlingsprogram som gör det möjligt för användaren att snabbt välja mellan balkpolariseringar.
- Använd ett polariserande filter för att kontrollera den elektriska fältorientering i varje strålgång. Ett polariserande filter tillåter endast överföring i enlighet med filtrets axel.
- Kontrollera att de vertikala och horisontella komponenterna av laserstrålen är i linje med varandra och den 488 nm stråle. Justera efter behov. De tre strålar alla bör fokuseras på BFP och fram parallellt från målet till samma plats på taket. Denna plats kan markeras med ett X för att underlätta framtida inriktning.
- Placera en droppe immersionsolja på målet. Placera skålen med fluorescerande mikrosfärer (se steg 4 ovan) på målet.
- Ange TIR genom att flytta X galvanometerspegel. I TIR, den vertikala component av balken är S-pol och den horisontella komponenten av strålen är nu den p-pol. Justera den relativa intensiteten mellan balkarna genom att rotera QW plattan. Visa varje polariserad försvinnande fält med en rodamin prov, som spås bli slumpmässigt orienterade. Rotera QW plattan för att matcha de genomsnittliga pixelintensiteter. Om det behövs, tillsätt en neutral densitet filter i en polariserad strålens väg för att dämpa dess intensitet.
2. Kromaffina Cell Isolation
Ett förfarande för att isolera friska kromaffinceller från kalven binjuren finns nedan. Den är anpassad från tidigare publicerade protokoll av Wick, Senter et al. 19 och O'Connor, Mahata et al. 20 Efter isolering celler electroporated med plasmid (er) av intresse med användning av en elektroporeringssystem. Detta system resulterar i 20-30% av celler som uttrycker de önskade fluorescerande proteiner. Vanligtvis 70% av cellerna överlever de utvaldaroporation processen. Detaljer av PSS och mediakomponenter tillhandahålls i tabellerna 2, 3 och 4.
- Två dagar före cell prep, behandla 35-mm optisk kvalité glasbotten (0,17 mm tjock) rätter med 1 ml poly-D-lysin (0,1 mg / ml) följt av 1,25 ml bovint kollagen. Lämna disk lufttorka i vävnadskultur huva.
- Skaffa nötkreatur binjurarna från slakteriet. Håll körtlar på is medan de transporteras tillbaka till labbet. De nötkreatur binjurarna kan vara inneslutna i ett tjockt lager av fett. Använd kirurgisk sax för att ta bort överflödigt fett och exponera adrenal ven öppningen. BEGJUTA venen med prep-PSS tills körteln rensas av blod.
- Därefter långsamt pipett 2 ml TH-PSS-lösning i venen öppningen tills körtel sväller. Inkubera uppblåsta körtlar vid 37 ° C under 15 min. Upprepa TH-PSS behandling och inkubera igen.
- Skär genom den yttre binjurebarken runt kanten av körteln med scissors och skala körteln isär för att exponera märgen. Använd en skalpell för att försiktigt skrapa och separera märgen från den kortikala vävnaden.
- Finhacka medulla med ett par av skalpellblad för 5-10 min.
- En slutlig digere steg är nödvändigt för att isolera enskilda kromaffinceller. Häll det malda cellsuspension i en spinnkolv. Delvis fylla kolven med ett 2:1 förhållande av TH-PSS (30 ml) för att TL-PSS (15 ml) och inkubera under 30 min vid 37 ° C medan spinning vid ungefär 100 varv per minut.
- Separera de enskilda kromaffincellerna från osmält vävnad genom filtrering genom en 400 ìm mesh. Samla filtratet. Centrifugera vid 200 x g för att pelletera cellerna och återsuspendera i iskall PSS.
- Filtrera cellerna genom en 250 ìm mesh, pellets, och slutligen resuspendera i elektroporation buffert (se steg 2.9).
- Räkna celler med en hemocytometer och förbereda för transfektion.
- Transfektera celler med elektroporation system enligttillverkarens rekommendationer. De exakta villkoren för elektroporation måste bestämmas empiriskt. Anm: De inställningar som ger den bästa balansen mellan transfektion effektivitet och cell överlevnad för denna beredning av nötkreatur kromaffinceller är 1100 V, 40 ms, och 1 puls. Vi uppskattar att dessa villkor, är 20-30% av celler transfekterade. Om 30% av cellerna överlever inte elektroporation processen.
- Tavla celler försiktigt på poly-D-lysin och kollagen behandlade rätter i 1 ml uppvärmda electroporating media.
- Placera skålarna i en 37 ° C inkubator (5% CO2). Tillsätt 1 ml 2x antibiotika media till varje maträtt efter 6 timmar. Byt till normala media nästa dag.
- Kromaffinceller är oftast avbildas 2-5 dagar efter elektroporation.
3. pTIRF Image Acquisition
- Sätt på bildsystem och börja förvärvs programvara.
- Kontrollera att lasrar är i linje. Kontrollera evanescentfält profil med mikrosfärer.
- Förbered global och lokal perfusion systemet. Rengör lösningsreservoarer med filtrerat avjoniserat H2O och fyll med basal och stimulerande PSS lösningar.
- Innan avbildning kromaffinceller, kontrollera att p-pol och s-pol excitationer belysa samma område av fältet visning och att belysningsintensitet är ungefär likvärdiga. För att göra detta, fyller ett glas-bottom skålen med 2 ml PSS innehållande Rhodamine vid en slutlig koncentration av 10 mM. Sekventiellt excitera rodamin provet med p-pol och s-pol ljus och ta bilderna. I praktiken kan de P-och S-utsläpp från DID är normaliserade till medelvärdet av P-och S-rodamin utsläpp. Se Bild analys och diskussion avsnitt för ytterligare information.
- Nu vidare till färgning nötkreatur kromaffinceller med gjorde. Skölj odlingsmedia från skålen innehåller kromaffincellerna och ersätta med 2 ml av basal-PSS. Tillsätt 10 | il av 10 mM gjorde (utspädd i etanol)direkt till skålen som innehåller cellerna. Skaka försiktigt skålen för 2-10 sek och ta DID + PSS-lösning.
- Tvätta skålen 3-4x med basal-PSS för att ta bort eventuella gjorde. Cellerna är nu färgas och klar att använda.
- Lägg en droppe immersionsolja till målet. Placera skålen med DiD-färgade kromaffinceller ovanpå målet.
- Viewing skålen antingen genom objektiv eller på kameran, hitta en cell som är transfekterad med det intressanta proteinet och färgades med gjorde. En väl färgades cell uppvisar en P utsläpp som livligt belyser kanterna av cellen; S-utsläppen bör vara ungefär likformig över cell fotavtryck (dvs. regionen av cellen som är fäst vid glaset och avbildas i TIRF).
- Placera lokal perfusion nålen så att den är ungefär 100 ^ m bort från cellen.
- Fokus på cellmembranet och aktivera autofokus hårdvara omedelbart före cellstimulering / bildtagning. </ Li>
- Börja bilden förvärvet. BEGJUTA celler för 10 sek med en basal lösning och sedan under 60 sekunder med en depolariserande 56 mM KCl-lösning. Hämta bilder samtidigt snabbt form mellan 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (för att övervaka förändringar i P och S utsläpp av gjorde) och 488 nm excitation (till bild den transfekterade vesikler sonden). Exempel på bilder som förvärvats under experimenten visas i fig 2 och fig 3.
4. Bildanalys
Beräkningar för bildbehandling kan utföras med ImageJ, men använder skript i ett flexibelt programmeringsspråk såsom IDL eller Matlab kan öka analys genomströmning genom att automatisera uppgiften. Två typer av bilder måste beräknas för att erhålla topologisk information från råutsläppsbilder -. P / S och P 2 S P / S rapporter om lokala membran deformationer medan P +2 S summan rapporter om den totala membran färgämnet i en viss regionav fältet.
- Alla bilder ska bakgrund subtraheras. Välj en off-cell ROI, mäter den genomsnittliga pixelintensiteten i ROI, och sedan subtrahera detta värde från alla pixlar i bilden stacken.
- För att beräkna P / S, dela upp varje "P" emissionsramen av den efterföljande "S" emissionsramen (pixel-till-pixel). P / S varierar med de relativa intensiteterna av p-och s-pol excitationer, fördomar i optiskt system, och interferensfransar. För att minska dessa effekter, normalisera P / S-förhållanden från erhållna från DID utsläpp till det förhållande som erhålls med en lösning innehållande 10 mM rodamin 18.
- Exocytos enskilda DCVs framgår av en plötslig förändring i intensitet av en fluorescerande vesikel protein, såsom Synaptotagmin-1 pHluorin (Figur 2B). Bestäm förändringar P / S och P 2 S som genomsnittet av pixlarna i en 240 nm radie ROI centrerad över lokala ökningar av P / Suppgick vid platser för exocytos. När fusion sker utan en tydlig ökning av P / S, är ROI centrerad över regionen fixerings DCV.
- Datorsimuleringar kan utföras för att tolka P / S och P 2 S membranintensitetsförändringar i termer av enkla geometrier i ett utvidgande fusion por. För detaljer om simuleringarna, se Anantharam et al. 18
Representative Results
Konventionella och polarise TIRFM avbildningstekniker genomförs på samma luftbordet. Konfigurationen av de optiska elementen är liknande, med den stora skillnaden att excitationsljuset är polariserat (Figur 1A). Polariserat ljus hetsar företrädesvis fluoroforer med absorption dipoler i polariseringsriktningen. Sålunda pTIRFM att vara effektiv på att övervaka membran topologiska förändringar måste proben som används inskjuta i membranet med en fast orientering. De fluorescerande karbocyaninfärgämnen (DII, gjorde) inskjuta i lipidbiskikt i ett orienterat sätt med övergångs dipoler i membranplanet (Figur 1B). P-polariserad belysning (Figur 1C) av DiD-märkta membran hetsar selektivt täck-sned fluoroforer (RED i figurerna 1B och 1D).
Exuberant membranmärkning av kromaffinceller uppnås efter abrief inkubation med gjorde. Figur 2A visar ett exempel på ett cellmembran som färgas väl. En frisk, anhängare cell uppvisar tydliga skillnader i P-och S-utsläpp. Bilden P utsläpp visar en ljusare cellkantlinje i förhållande till resten av cellen. Bilden S utsläpp visar ungefär jämn fluorescens över cell fotavtryck. Beräknat pixel-till-pixel P / S och P 2 S-bilder är känsliga för membran krökning och färgämneskoncentrationen, respektive. Kromaffina visade cellen har också transfekteras med Synaptotagmin-1 pHluorin (Syt-1) för att märka sekretoriska vesiklar (Fig. 2B).
Kromaffina cell stimuleras med 56 mM KCl för att depolarisera cellmembranet och utlösa exocytos. Flera ljust fluorescerande Syt-1 pHluorin fläckar plötsligt blivit uppenbart som DCVs säkring (Figur 2B, högra panelen). En vit ruta ritas runt en fusionshändelse (Figur 2B, högra panelen). Denna fusion händelse is analyseras i figurerna 2C och 2D. Figur 2C visar frame-by-frame förändringar i Syt-1-pHluorin, P / S och P 2 S bildintensiteter. Fluorescens intensitet Syt-1 minskar snabbt som det protein diffunderar bort från fusionsstället (figur 2D). Indraget representerar den sammansmälta vesikler / plasmamembran komplex minskar i relativt långsam takt (Notera diagram i figur 2D). Illustrationen (Figur 2E) skildrar en tolkning av dessa mätningar.
De snabba och lokaliserade membran deformationer som visas i figur 2 är ett resultat av stimulus-framkallade Ca2 + inflöde. Detta visas i figur 3A. En kromaffin cell transfekteras med den genetiska Ca 2 + indikator GCaMP5G 21,22 och stimulerades med 56 mM KCl. Membrandepolarisering orsakar en signifikant ökning i GCaMP5G fluorescens (
/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
Figur 1. Illustrationer för pTIRFM tekniken. A) En schematisk för att kombinera konventionell med polarisering baserade TIRF avbildning visas. En fjärdedel-våg (QW) Plattan placeras framför en 561-nm safir laser för att elliptiskt polarisera laserstrålen. Ett polariserande kub (PC1) används för att separera statens kulturråd i linjära vertikala (v) och horisontellt (h) komponenter. De vertikala och horisontella komponenter blir p-pol och S-pol excitations balkar, respektive, hos TIR-ytan. De p-pol och S-pol vägar är oberoende slutare (S1 och S2). De rekombineras med speglar och en andra polariserande kub (PC2). De går med 488 nm stråle (även oberoende slutare, S3) via en strålstyrning del som består av en spegel och nonpolarizing dikroisk spegel (DC). Linser (L) används för att utöka och koncentrera strålarna. Kombinerad 488-nm och 561 nm balkar styrs till en sidobelysning hamn i mikroskop via galvaniskmeter speglar (GM). De fokuserar på baksidan fokalplan (BFP) av målet. Fotoner som avges från fluoroforer fångas på en EMCCD kameran ansluten till en dator. B) DiD märkning utförs genom att kort inkubera celler med färg och tvätta flera gånger för att avlägsna överskott. DiD interkalerar i membranet med dess övergång dipolmoment ungefär i membranplanet. C) Det infallande ljuset är polariserat i infallsplanet (p-pol) skapar ett evanescent fält, som är huvudsakligen polariserat vinkelrätt mot gränsytan, såsom visas. D) Belysning av en DiD-märkt membran med p-polariserat ljus kommer att selektivt excitera de fluoroforer som är coverglass-sned (RED). Om detta var en s-polariserad evanescent fält, skulle dessa fluoroforer som är parallella med coverglass exciteras stället (BLACK).
Figur 2. trong> Övervakning cellmembran deformationer med pTIRFM. A) Raw P och S utsläpps bilder tillsammans med beräknat P / S och P 2 S utsläppsbilder visas. Skala bar, 3,2 um. B) En kromaffin cell som uttrycker Syt-1 pHluorin är depolarized med KCl. Flera ljust fluorescerande fläckar (höger panel) indikerar fusion av enskilda DCVs. Skala bar, 3,2 um. C) Frame-by-frame bilder av en fusing Syt-1 pHluorin DCV. Times (bilderna ovan) är i sekunder. Tid 0 betecknar ram före fusion av DCV. Motsvarande P / S och P 2 S utsläppsbilder visas också. . Skala bar är 1 mikrometer D) Grafer för bilder i C. Prickad linje är vid tiden 0 -. Fusionsramen E) En möjlig tolkning av resultaten i C och D visas. blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Deformationer är ett resultat av stimulus-evoked Ca 2 + inflöde. A) En kromaffin cell transfekterad med GCaMP5G är depolariserad med 56 mM KCl. Den resulterande ökningen i GCaMP5G fluorescens innebär en ökning subplasmalemmal Ca2 +-nivåer. B) Frame-by-frame bilder på 30 x 20 pixlar område cell i A. Times bilderna ovan är i sekunder. Vita pilar indikerar en region av P / S ökar och P 2 S minskning. Cytosoliskt GCaMP5G protein utesluts från området genom fixerings DCV. Skala bar, 1 mikrometer. C) Grafer för bilder som visas i B. D) En möjlig tolkning av resultaten i B och C visas.3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| iXon3 EMMCD Kamera | Andor | 897 | |
| IX81 inverterat mikroskop | Olympus | Sidomonterad FILTERCUBE Assembly | |
| 43-serien Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Avstämbara till 488 nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Sammanhängande | 561 nm | |
| Scanning galvanometerspegeln System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC 3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | <td>|
| 10 psi tryckregulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Monterad Achromatic kvartsvågsplattan | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680 nm Polarizing stråldelaren Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Sex Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motordriven SmartShutter | Sutter Instrument | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Fogar 488 nm och 561 nm strålar |
| Belagd Plano-konkav lins | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Divergerar 488 nm balk | Belagd Plano-konkav lins | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Divergerar 561 nm stråle |
| Belagd plankonvex lins | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Fokuserar både balkar |
| Belagd plankonvex lins | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Hård att filtrera kub montering |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | FILTERCUBE dikroisk |
| z488/561_TIRF emissionsfilter | Chroma | z488/561m_TIRF | FILTERCUBE utsläpps |
| UIS2 60X Syfte | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1,37 |
| Neon Transfektion System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| Metamorfa Imaging Software | Molecular Devices | ||
| Dil Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | För Alignment ändamål |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAs I typ IV från bovin | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rodamin | Invitrogen | R634 | |
| 0,22 | im membran Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic röda Mikrosfärer | Polysciences | 19507 | 0,5 | im |
| Nedsänkning Olja Sigma | 56822 | ||
| LabVIEW | National Instruments | Kontroller galvo speglarna | |
| Spinnerflaska | Bellco | 1965-00250 |
Tabell 1. pTIRF Mikroskopi utrustning.
| Innehåll | Prep-PSS | Basal-PSS | Stim-PSS |
| NaCl | 145 mM | 145 mM | 95 mM |
| KCl | 5.6 mM | 5.6 mM | 56 mM |
| MgCl2 | - | 0,5 mM | 0,5 mM |
| CaCl2 | - | 2,2 mM | 5 mM |
| HEPES | 15 mM | 15 mM | 15 mM |
| pH | 7,4 | 7,4 | 7,4 |
| Glukos | 2.8 mM | 5.6 mM | 5.6 mM |
| Pen-Strep | 1x | - | - |
Tabell 2. Perfusion och kromaffina cell prep lösningar.
| Innehåll | Electroporating Media | Normal Plating Media | 2x Antibiotikum Media |
| 1x DMEM/F-12 | 1 ml / platta | 2 ml / platta | 1 ml / platta |
| FBS | 10% | 10% | 10% |
| Cytosin arabinofuranosid (CAF) | - | 1 | il / ml från 10 mM stam | - |
| Penicillin | - | 100 enheter / ml 200 enheter / ml | |
| Streptomycin | - | 100 | ig / ml | 200 | ig / ml |
| Gentamycin | - | 25 | ig / ml | 50 | ig / ml |
Tabell 3. Kromaffina Cell Media.
| Innehåll | TH-PSS | TL-PSS |
| Liberase TH | 2 ml | - |
| Liberase TL | - | 0,85 ml |
| Prep-PSS | 98,0 ml | 84,0 ml |
| DNas | 8,75 mg | 7,4 mg |
Tabell 4. TH-PSS och TL-PSS-lösningar.
Discussion
Polarisationsoberoende based TIRFM identifierar hastiga, submikroskopiska changes i membran topologi. Genomförandet av tekniken är relativt enkelt, särskilt om TIRF optik är redan på plats. Allt som behövs är en kvartsvågsplatta, två polariserande kuber, och fönsterluckor för att åtskilja p-pol och s-pol belysningsbanor. Den exakta positionen av dessa komponenter på bordet vanligen dikteras av utrymme.
För att erhålla membran topologisk information bör den fluorescerande sond som används inskjuta med en fast eller känd orientering. Tekniken, som beskrivs i denna artikel förutsätter användning av karbocyaninfärgämnen men andra färger, t.ex. FM1-43 14, kan också användas. Färgningsförfarandet membranet självt är okomplicerad. Odlade celler kräver endast en mycket kort exponering (mindre än 10 sek) för att en liten kvantitet av Dil / gjorde ingen sprudlande märkning av membranet. Lägga överskottsfärg leder till ljusspridning aggregates på glaset som försämra bildkvaliteten. Över inkubera celler med färgämne leder till färga interna som har negativa effekter på bildkvalitet och möjligen cellernas livskraft. Om en cell är färgade väl, kommer det att finnas klar skillnad i P och S emissionsbilder. Såsom visas i fig. 2A, kommer P emissions livligt belysa områden av membranet som är täck sned (dvs kanterna på cell fotavtryck) medan intensiteten S utsläpp blir ungefär likformig över cellen fotavtryck. Om en klar skillnad mellan P och S inte är uppenbart, så är det möjligt att cellen är dåligt vidhäftade till substratet eller cellmembranet är inte hälsosamt och cellen inte används för experiment.
Våra tidigare studier som beskriver pTIRFM utnyttjas DII som den fluorescerande membran-prob. Här använder vi gjorde eftersom den är lämplig för dubbla färg imaging experiment som använder GFP / pHluorin som den andra fluoroforen. Vi excitera gjorde with ett 561 nm laser istället för 640 nm laser (som ligger närmare dess excitation topp) eftersom fluoroforen blekmedel snabbare vid 640 nm. Trots det faktum att den 561 nm laser är på svansen på DID publicerade excitationsspektrum fluorescensen effektivt avges. En annan fördel med 561 nm laser är att den väcker både Dil och gjorde det möjligt för oss att använda samma polarisering setup för båda sonderna. Observera att orienteringen av fluoroforen i membranet kommer att påverka tolkningen av membrantopologin. Till exempel, om en fluorofor var orienterade med sina övergångs dipoler vinkelrätt mot membranplanet (i stället för parallella, eller nästan parallella, vilket är fallet med Dil eller gjorde), då icke-plana membranregionerna kommer att lättare markeras av S i stället för P-utsläpp.
Vi har också beskrivit metoder för isolering och elektroporation av nötkreatur adrenal kromaffinceller. Nötkreaturs kromaffin cellen är en utmärkt secretory modell. Det har fördelarna med den är lätt att upprätthålla på kultur, som svarar på en mängd olika sekretogoger, och att besitta stora utsöndrings vesiklar som lätt visualiseras med konventionell Ijusmikroskopi. För att uttrycka fluorescerande proteiner, celler elektroporerades i suspensionen före utstrykning på kollagenbehandlade odlingsskålar. Enligt vår erfarenhet är uttryck effektivitet mycket högre med elektroporation än med antingen Ca2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Nackdelen med elektroporation är att det krävs flera celler (så många inte överlever processen) och dyra kommersiella reagens. Av skäl som är oklara för oss, innehåller inte varje membran gjorde. Dessutom används endast en bråkdel av cellerna på skålen transfekteras. Att hitta celler som är transfekterade och är färgade väl med DID kan vara tidskrävande och det är därför att optimera förutsättningarna för färgning och elektroporation är väl värt ansträngningen.
I sammanfattning, detta är enArtikel beskriver hur pTIRFM är implementerad för att övervaka de snabba och lokaliserade membran deformationer som inträffar under fusion av tät kärna vesiklar i bovina kromaffinceller. Även om endast en tillämpning diskuteras är tekniken idealiskt lämpade för studier av andra biologiska processer som involverar förändringar i membranform, däribland endocytos, cytokines, och cellernas motilitet.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av en nationell Scientist utveckling Grant (13SDG14420049) till AA från American Heart Association och nystartade fonder från Wayne State University. Vi står i tacksamhetsskuld till Dr Ronald W. Holz och Dr Mary Bittner för att ge råd om de nötkreatur adrenal förberedelser och Dr Daniel Axelrod om hjälp med pTIRFM uppsättning och hjälp kommentarer på manuskriptet. Var Syt-1 pHluorin används med tillåtelse av Dr Gero Miesenbock (universitetet i Oxford). GCAMP5G erhölls genom Addgene. Vi tackar James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, och Praneeth Katrapti med hjälp för att optimera olika steg av de förfaranden som beskrivs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
References
- Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).
- Chapman, E. R. How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release. Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).
- Hinshaw, J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).
- Lang, T., et al. Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy. Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).
- Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388, 474-478 (1997).
- Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).
- Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy. J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2. Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).
- Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).
- Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells. Neuron. 16, 369-376 (1996).
- Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination. Biophys. J. 46, 739-747 (1984).
- Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells. Neuron. 35, 1085-1097 (2002).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion. J. Neurochem. , 10-1111 (2012).
- Anantharam, A., et al. A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion. Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion. Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).
- Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J. Cell. 188, 415-428 (2010).
- Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells. J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).
- O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
