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Biology

PTIRFM साथ इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली विरुपणों

Published: April 2, 2014 doi: 10.3791/51334
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

Summary

ध्रुवीकरण आधारित कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (pTIRFM) कोशिका झिल्ली गतिशीलता के वास्तविक समय का पता लगाने में सक्षम बनाता है. यह लेख विनियमित एक्सोसाइटोसिस दौरान झिल्ली remodeling के अध्ययन के लिए pTIRFM के कार्यान्वयन का वर्णन करता है. तकनीक प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से झिल्ली आकार में परिवर्तन शामिल है कि कोशिका जीव विज्ञान में अन्य प्रक्रियाओं को generalizable है.

Abstract

एक्सोसाइटोसिस की गतिशीलता में उपन्यास अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, हमारे समूह ठीक पुटिका और प्लाज्मा झिल्ली के विलय के दौरान विनियमित किया जाना चाहिए कि लिपिड bilayer आकार में परिवर्तन पर केंद्रित है. ये तेजी और स्थानीय परिवर्तन लिपिड और झिल्ली वक्रता कि नियंत्रण विशेष प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. ऐसी बातचीत का अभाव ही पुटिका संलयन के लिए विनाशकारी परिणाम हो, लेकिन झिल्ली आकार का नियंत्रण शामिल है कि अन्य सेलुलर कार्यों के एक मेजबान नहीं होता. हाल के वर्षों में, झिल्ली को आकार देने के गुणों के साथ प्रोटीन की एक संख्या की पहचान निर्धारित किया गया है. क्या लापता रहता है जब, जहां, और कैसे वे फ्यूजन और सामग्री रिहाई प्रगति के रूप में कार्य की एक योजना है.

झिल्ली remodeling सक्षम है कि आणविक घटनाओं की हमारी समझ ऐतिहासिक झिल्ली वक्रता के प्रति संवेदनशील हैं या अस्थायी समाधान Trac करने के लिए है कि विश्लेषणात्मक तरीकों की कमी के द्वारा सीमित किया गया हैतेजी से बदलाव k. PTIRFM इन मानदंडों में से दोनों को संतुष्ट करता है. हम pTIRFM घने कोर पुटिका (DCV) फ्यूजन दौरान क्रोमाफिन कोशिका झिल्ली के उन्मुखीकरण में तेजी, submicron परिवर्तन कल्पना और व्याख्या करने के लिए लागू किया गया है कि कैसे पर चर्चा की. हम उपयोग क्रोमाफिन कोशिकाओं गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों से अलग कर रहे हैं. झिल्ली एक lipophilic carbocyanine डाई, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate के साथ दाग, या किया जाता है. एक "निर्धारित" अभिविन्यास के साथ झिल्ली विमान में intercalates था और क्षणभंगुर क्षेत्र का ध्रुवीकरण करने के लिए इसलिए संवेदनशील है. सना हुआ था कोशिका झिल्ली एक 561 एनएम लेजर (P-पीओएल, S-पीओएल) के orthogonal polarizations साथ क्रमिक रूप से उत्साहित है. एक 488 एनएम लेजर संलयन के पल पुटिका घटक और समय कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक्सोसाइटोसिस स्थानीय स्तर पर एक depolarizing KCl समाधान के साथ कोशिकाओं perfusing से शुरू हो रहा है. विश्लेषण किया कि कैसे को समझने के लिए कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऑफ़लाइन किया जाता हैउत्सर्जन तीव्रता में परिवर्तन संलयन ताकना फैलाव से संबंधित हैं.

Introduction

एक्सोसाइटोसिस के समुचित निष्पादन ठीक करवाया जा झिल्ली bilayer आकार में चरम परिवर्तन की आवश्यकता है. पिछले संलयन के लिए, दाना तहत प्लाज्मा झिल्ली की स्थानीय झुकने bilayers की बातचीत के लिए ऊर्जा अवरोध को कम करने के लिए भाग में होता है. झिल्ली के रूप में मर्ज बाद में, उच्च वक्रता के क्षेत्रों उत्पन्न कर रहे हैं और स्थिर हो जाना चाहिए. अंत में, जुड़े झिल्ली संलयन ताकना विस्तार और सामग्री जारी 1 सक्षम करने के लिए अपने प्रारंभिक आकार तुला बाहर किया जाना चाहिए. अकेले झिल्ली ऐसी नाटकीय और समन्वित परिवर्तन से गुजरना की संभावना नहीं है, क्योंकि प्रोटीन की घटनाओं में मध्यस्थता करने के लिए आवश्यक हैं. लेकिन वे कैसे संलयन की प्रक्रिया के दौरान झिल्ली टोपोलॉजी में परिवर्तन को प्रभावित करने के कार्य बहुत ज्यादा एक खुला प्रश्न बना हुआ है.

इन विट्रो मॉडल में उत्कृष्ट झिल्ली वक्रता कल्पना करने के लिए मौजूद हैं. नकारात्मक दाग EM का उपयोग करते हैं, उदाहरण के लिए, दो प्रमुख तस्करी पी के कार्यों के लिए वर्तमान आणविक मॉडल को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण हो गया हैroteins - synaptotagmin और dynamin (समीक्षा के लिए, फेरीवाला 2 और Henshaw 3 देखें). एक्सोसाइटोसिस के अधिकांश वास्तविक समय assays सीधे वक्रता का पता नहीं लगा. इसके बजाय, वक्रता lumenal माल रिहाई 4-8 या झिल्ली क्षेत्र 9-11 में परिवर्तन के कैनेटीक्स पर रिपोर्ट कि assays से inferred है. PTIRFM झिल्ली micromorphology में परिवर्तन का सीधा, वास्तविक समय माप सक्षम द्वारा vivo में इन विट्रो अध्ययन में बीच की खाई को पुल.

PTIRFM, एक nonimaging मोड में, एक मॉडल झिल्ली 12 में शामिल NPD पीई के उन्मुखीकरण को मापने के लिए एक्सेरोल्ड और उनके सहयोगियों ने बीड़ा उठाया है. तकनीक तो DII और FM1-43 13-18 के साथ लेबल जीवित कोशिकाओं में गतिशील परिवर्तन कल्पना करने के लिए लागू किया गया था. पी ध्रुवीकरण (घटना के विमान में) और (घटना के विमान को सीधा) एस ध्रुवीकरण: pTIRFM में, दो क्षणभंगुर क्षेत्र polarizations क्रमिक रूप से एक झिल्ली एम्बेडेड जांच उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इमेजिंग के लिए पहले, जांच - इस मामले में, था - संक्षेप कोशिकी माध्यम से जोड़ा जाता है और अध्ययन किया जा कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में intercalate की अनुमति दी है. झिल्ली (एक झिल्ली व्याकुल या खरोज के रूप में) coverglass को nonparallel है जहां क्षेत्रों में भी nonparallel हो जाएगा था. इसलिए, ऐसे क्षेत्रों P-पीओएल बीम से उत्तेजनीय हो जाएगा. P-पीओएल बीम कम प्रभावी ढंग से ज्यादातर coverglass समानांतर हैं कि झिल्ली क्षेत्रों में किया था उत्तेजित होगा. पिक्सेल करने वाली पिक्सेल अनुपात छवियों (पी / एस) इसलिए विशेष रूप से झिल्ली विरूपण के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा था की अनुक्रमिक पी और एस पीओएल उत्तेजना से उत्सर्जन पर रिपोर्टिंग. सिद्धांत रूप में, पी / एस अनुपात छवियों संवेदनशील हैं कंप्यूटर सिमुलेशन 18 ने भविष्यवाणी परिवर्तन के आयाम के साथ coverglass से प्लाज्मा झिल्ली विचलन, का भी छोटे कोण करने के लिए. पी / एस छवियाँ भी coverglass सतह से फ्लोरोफोरे दूरी से स्वतंत्र हैं और स्थानीय फ्लोरोफोरेएकाग्रता. स्थानीय fluorophore एकाग्रता के बजाय पी उत्सर्जन की पिक्सेल करने वाली पिक्सेल राशि और 2 बार उत्सर्जन (पी 2 एस) पर रिपोर्टिंग छवियों द्वारा प्रदान की जाती है. पी 2 एस माप कुछ संभव है, थोड़ा है, या कोई परिवर्तन के साथ, खरोज के सटीक ज्यामिति के प्रति संवेदनशील है. इस कंप्यूटर सिमुलेशन द्वारा दिखाया जा सकता है कि एक बाद राज्य 16,18 के लिए (एक संकीर्ण गर्दन के साथ आईई) एक जल्दी से एक संलयन ताकना के मॉडल बदलाव. पी एक संकीर्ण गर्दन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी एक दूसरे से जुड़ने पुटिका के दो एस (और साथ अधिक अंतरफलक के करीब था) (एक बहुत व्यापक ताकना के साथ एक दूसरे से जुड़ने पुटिका की तुलना में, उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक होने की भविष्यवाणी की है, जहां था) क्षणभंगुर क्षेत्र की dimmest भाग के भीतर है.

इस अनुच्छेद में, हम pTIRFM कार्यान्वित और संलयन ताकना फैलाव के दौरान होने वाले झिल्ली आकार में तेजी, स्थानीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि कैसे पर चर्चा की. केवल एक ही आवेदन में स्पष्ट रूप से दी हैscussed, तरीकों को प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से झिल्ली remodeling शामिल है कि अन्य सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म को generalizable हैं.

Protocol

1. PTIRF सिस्टम सेटअप

pTIRFM तकनीक एक औंधा माइक्रोस्कोप मंच पर बनाया गया है. लेजर बीम एक ओर रोशनी बंदरगाह और एक nonpolarizing पक्ष का सामना करना पड़ फिल्टर क्यूब के माध्यम से निर्देशित है, और फिर एक 60X 1.49 एनए TIRF उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप और EMCCD कैमरे के बीच उत्सर्जन पथ में दो अतिरिक्त लेंस (1.6x और 2x) लगभग 80 एनएम के अंतिम पिक्सेल आकार दे. लेजर बीम महामारी और कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​रोशनी के बीच तेजी से बदलने के लिए सॉफ्टवेयर नियंत्रित बिजली की शक्ति नापने दर्पण का उपयोग निर्देशित कर रहे हैं. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल TIRF के लिए प्रकाशिकी पहले से ही fluorophore उत्तेजना और इमेजिंग के लिए इष्टतम स्थिति में हवा की मेज पर तैनात कर रहे हैं कि मान लिया गया. यह ध्रुवीकरण प्रकाशिकी कोशिका झिल्ली विकृतियों की इमेजिंग सक्षम करने के लिए एक मौजूदा TIRF माइक्रोस्कोप सेट अप करने के लिए जोड़ रहे हैं कैसे करें. TIR और polarizat दोनों पैदा करने के लिए हमारी प्रयोगशाला की ऑप्टिकल सेट अप का एक योजनाबद्धआयन आधारित TIR चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. प्रोटोकॉल carbocyanine डाई की इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट पुटिका प्रोटीन की उत्तेजना के लिए एक 488 एनएम लेजर का उपयोग और एक 561 एनएम लेजर मानता है, था.

  1. सभी माइक्रोस्कोप घटकों, लेज़रों, और कंप्यूटर पर पावर.
  2. 488 एनएम लेजर से चित्रा 1 ए में सचित्र के रूप में 1.49 एनए लेंस के पीछे फोकल प्लेन (BFP) को एक किरण प्रत्यक्ष. लेजर बीम BFP पर ध्यान केंद्रित किया गया है, तो यह collimated उभरने और सीधे उद्देश्य के ऊपर छत पर के रूप में छोटे अच्छी तरह से परिभाषित जगह दिखाई देगा.
  3. एक्स गैल्वेनोमीटर दर्पण (समकक्ष नमूना विमान में स्थित दर्पण) को समायोजित इतना है कि लेजर बीम बंद अक्ष में ले जाया गया है और उद्देश्य सामान्य करने के लिए उत्तरोत्तर steeper कोण पर उद्देश्य से उभर रहा है.
  4. अगला, TIR से हासिल की है कि सत्यापित. एक गिलास नीचे पकवान में पीएसएस के एक 1 एमएल मात्रा को फ्लोरोसेंट microspheres की 10 μl जोड़ें. ओ तल पर microspheres से केवल प्रतिदीप्तिडिश च, tir इंटरफेस के लिए निकटतम, पता लगाया जाना चाहिए. चल microspheres की जांच घटना प्रकाश और उद्देश्य सामान्य के बीच कोण अपर्याप्त है कि इंगित करता है.

    नीचे खंड ध्रुवीकरण आधारित इमेजिंग के लिए आवश्यक ऑप्टिकल घटकों का सेट अप का वर्णन करता है.
  5. यह एक समान ऑप्टिकल मार्ग के किनारे यात्रा कर रहा है तो एक गाइड के रूप में गठबंधन 488 एनएम बीम का उपयोग करना, कच्चे 561 एनएम लेजर बीम की स्थिति को समायोजित. 561 एनएम लेजर carbocyanine डाई की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, था.
  6. 561 एनएम लेजर के बहाव अपसारी लेंस और दर्पण डालें. , दर्पण का उपयोग यह 488 एनएम किरण के साथ coaligned इतना है कि किरण को समायोजित करने और बिजली की शक्ति नापने दर्पण "0" स्थिति में हैं जब मौके छत पर फोकस में है.
  7. लेजर एपर्चर के तुरंत नीचे की ओर किरण पथ में एक चौथाई लहर प्लेट (QW) केंद्र. बिना रंग या उत्तेजना तरंगदैर्ध्य से परिचित है जो या तो एक QW का प्रयोग करें.एक QW चक्राकार ऑप्टिकल अक्ष के साथ एक 45 डिग्री के कोण पर प्रवेश करती है जो किसी भी रैखिक ध्रुवीकरण प्रकाश फूट डालना होगा. ऐसे ध्रुवीकरण क्यूब्स के रूप में कुछ ऑप्टिकल घटकों,, ध्रुवीकरण की एक धुरी की दिशा में एक क्षीणन पूर्वाग्रह है. QW इस पूर्वाग्रह के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए घुमाया जा सकता है. इस समायोजन एक elliptically polarized किरण का परिणाम देगा. यह एपर्चर से उभर के रूप में लेजर बीम ही अत्यधिक रैखिक (खड़ी) polarized है क्योंकि एक QW आवश्यक है.
  8. Elliptically polarized बीम के नीचे की ओर एक ध्रुवीकरण घन (PC1) रखें. ध्रुवीकरण घन बिजली क्षेत्र की खड़ी (वाई) घटक को दर्शाता है और क्षैतिज (x) घटक गुजरता है. ध्रुवीकरण घन ध्रुवीकरण किरण पथ के बाद संरेखण की सुविधा के लिए एक छोटा सा अनुवाद मंच पर रखा गया है.
  9. मुस्कराते हुए recombine के लिए एक दूसरे ध्रुवीकरण घन (PC2) और दर्पण (चित्रा 1 ए) का प्रयोग करें.
  10. पहले ध्रुवीकरण घन (PC1) और ऊर्ध्वाधर सह के बीच एक शटर रखेंmponent दर्पण. क्षैतिज घटक दर्पण और दूसरा ध्रुवीकरण घन (PC2) के बीच एक दूसरे शटर रखें. ये दरवाज़े तेजी किरण polarizations के बीच चयन करने के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम इमेजिंग सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं.
  11. प्रत्येक किरण पथ में बिजली क्षेत्र उन्मुखीकरण सत्यापित करने के लिए एक polarizing फिल्टर का प्रयोग करें. एक polarizing फिल्टर ही फिल्टर की धुरी के साथ लाइन में प्रसारण की अनुमति देगा.
  12. लेजर बीम के ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज घटकों एक दूसरे के और 488 एनएम किरण के साथ गठबंधन कर रहे हैं की जाँच करें. आवश्यक के रूप में समायोजन करें. तीन मुस्कराते हुए सभी BFP पर ध्यान केंद्रित किया और छत पर एक ही जगह पर उद्देश्य से collimated उभरने की जानी चाहिए. इस मौके भविष्य संरेखण की सुविधा के लिए एक एक्स द्वारा चिह्नित किया जा सकता है.
  13. उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखें. उद्देश्य पर फ्लोरोसेंट microspheres युक्त पकवान (ऊपर चरण 4 देखें) रखें.
  14. एक्स गैल्वेनोमीटर दर्पण ले जाकर TIR दर्ज करें. TIR, खड़ी componen मेंकिरण के टी एस पीओएल और किरण की क्षैतिज घटक अब P-पीओएल है. QW थाली घूर्णन द्वारा बीम के बीच रिश्तेदार तीव्रता को समायोजित. बेतरतीब ढंग से उन्मुख होने की भविष्यवाणी की है जो एक rhodamine नमूना, साथ प्रत्येक polarized क्षणभंगुर क्षेत्र देखें. औसत पिक्सेल तीव्रता मैच के लिए QW प्लेट घुमाएँ. यदि आवश्यक हो, इसकी तीव्रता attenuate करने के लिए एक polarized किरण पथ में एक तटस्थ घनत्व फिल्टर जोड़ने.

2. क्रोमाफिन सेल अलगाव

बछड़ा अधिवृक्क ग्रंथि से स्वस्थ क्रोमाफिन कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रक्रिया नीचे प्रदान की जाती है. यह बाती, Senter, एट अल. 19 और ओ 'कॉनर द्वारा पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है, Mahata एट अल. 20 अलगाव के बाद, कोशिकाओं एक electroporation प्रणाली का उपयोग ब्याज की प्लाज्मिड (एस) के साथ electroporated कर रहे हैं. वांछित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की 20-30% में इस प्रणाली का परिणाम है. आमतौर पर, कोशिकाओं के 70% के चुनाव जीवित रहते हैंroporation प्रक्रिया. पी एस एस और मीडिया घटकों के विवरण टेबल्स 2, 3, और 4 में प्रदान की जाती हैं.

  1. दो दिन सेल तैयार करने का इससे पहले, 1.25 मिलीग्राम गोजातीय कोलेजन द्वारा पीछा 1 मिलीलीटर पाली डी lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 35 मिमी ऑप्टिकल गुणवत्ता गिलास नीचे (मोटी 0.17 मिमी) व्यंजन का इलाज. टिशू कल्चर हुड में शुष्क हवा बर्तन छोड़ दें.
  2. वधशाला से गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों प्राप्त करते हैं. वे प्रयोगशाला में वापस ले जाया जाता है, जबकि बर्फ पर ग्रंथियों रखें. गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथि वसा की मोटी परत में encased किया जा सकता है. अतिरिक्त चर्बी हटाने और अधिवृक्क नस खोलने का पर्दाफाश करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें. ग्रंथि रक्त के purged है बार बार जब तक तैयार करने का पीएसएस के साथ नस छिड़कना.
  3. अगला, धीरे धीरे ग्रंथि फूल जाती है जब तक नस खोलने में वें पीएसएस समाधान के 2 एमएल पिपेट. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फुलाया ग्रंथियों को सेते हैं. वें पीएसएस उपचार दोहराने और फिर सेते हैं.
  4. एस के साथ ग्रंथि के किनारे के आसपास बाहरी अधिवृक्क प्रांतस्था के माध्यम से कटcissors और मज्जा का पर्दाफाश करने के अलावा ग्रंथि छील. धीरे परिमार्जन और cortical ऊतक से मज्जा अलग करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें.
  5. 5-10 मिनट के लिए स्केलपेल ब्लेड की एक जोड़ी के साथ मज्जा क़ीमा.
  6. एक अंतिम पाचन कदम व्यक्तिगत क्रोमाफिन कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है. एक स्पिनर कुप्पी में कीमा बनाया हुआ सेल निलंबन डालो. आंशिक रूप TL-पीएसएस (15 मिलीलीटर) को वें पीएसएस (30 मिलीग्राम) की एक 2:1 के अनुपात के साथ फ्लास्क भरने और लगभग 100 rpm पर कताई, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. एक 400 माइक्रोन जाल के माध्यम से छान कर पचाया ऊतक से व्यक्तिगत क्रोमाफिन कोशिकाओं को अलग. छानना लीजिए. 200 गोली कोशिकाओं XG, और बर्फ के ठंडे पीएसएस में Resuspend पर अपकेंद्रित्र.
  8. एक 250 माइक्रोन जाल, गोली के माध्यम से कोशिकाओं तक, और अंत में यह (कदम 2.9 देखें) electroporation बफर में resuspend.
  9. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और अभिकर्मक के लिए तैयार करते हैं.
  10. के अनुसार electroporation प्रणाली के साथ कोशिकाओं Transfectनिर्माता की सिफारिशों. electroporation के लिए सटीक स्थितियां अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. नोट: गोजातीय क्रोमाफिन कोशिकाओं की इस तैयारी के लिए अभिकर्मक दक्षता और सेल जीवित रहने की दर के बीच बेहतरीन संतुलन प्रदान करते हैं जो सेटिंग्स 1,100 हैं वी, 40 मिसे, और 1 पल्स. हम इन शर्तों के साथ, कोशिकाओं के 20-30% ट्रांसफ़ेक्ट हैं कि अनुमान है. कोशिकाओं का लगभग 30% electroporation प्रक्रिया जीवित नहीं है.
  11. धीरे पाली-D-lysine और कोलेजन पर प्लेट कोशिकाओं गरम electroporating मीडिया के 1 मिलीलीटर में बर्तन का इलाज किया.
  12. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बर्तन प्लेस (5% सीओ 2). 6 घंटे के बाद प्रत्येक पकवान 2x एंटीबायोटिक मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें. अगले दिन सामान्य मीडिया के लिए मीडिया बदलें.
  13. क्रोमाफिन कोशिकाओं आम तौर पर 2-5 दिनों electroporation के बाद imaged हैं.

3. pTIRF छवि अधिग्रहण

  1. इमेजिंग सिस्टम पर पावर और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं.
  2. लेज़रों गठबंधन कर रहे हैं की जाँच करें. क्षणभंगुर जाँचेंmicrospheres का उपयोग क्षेत्र प्रोफाइल.
  3. वैश्विक और स्थानीय छिड़काव प्रणाली तैयार करें. स्वच्छ समाधान फ़िल्टर्ड विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ जलाशयों और बेसल और पी एस एस समाधान उत्तेजक से भरना.
  4. क्रोमाफिन कोशिकाओं इमेजिंग से पहले, P-पीओएल और S-पीओएल excitations देखने के क्षेत्र के एक ही क्षेत्र रोशन और रोशनी तीव्रता लगभग बराबर हैं, यह सत्यापित. ऐसा करने के लिए, 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में rhodamine युक्त पीएसएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक गिलास नीचे पकवान भरें. क्रमिक रूप से पी पीओएल और S-पीओएल प्रकाश के साथ rhodamine नमूना उत्तेजित और छवियों पर कब्जा. अभ्यास में किया था, से पी और एस उत्सर्जन पी और एस rhodamine उत्सर्जन का मतलब के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. अधिक जानकारी के लिए छवि विश्लेषण और चर्चा अनुभागों को देखें.
  5. अब था साथ गोजातीय क्रोमाफिन कोशिकाओं को धुंधला आगे बढ़ना. क्रोमाफिन कोशिकाओं से युक्त पकवान से संस्कृति मीडिया कुल्ला और बेसल पीएसएस के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें. 10 मिमी से 10 μl जोड़ें (इथेनॉल में पतला) थासीधे कोशिकाओं से युक्त डिश के लिए. धीरे 2-10 सेकंड के लिए पकवान आंदोलन और था + पी एस एस समाधान निकालने.
  6. किसी भी अवशिष्ट था दूर करने के लिए बेसल पीएसएस के साथ पकवान 3-4x धो लें. कोशिकाओं को अब दाग और उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं.
  7. उद्देश्य के लिए विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें. उद्देश्य के शीर्ष पर था दाग क्रोमाफिन कोशिकाओं से युक्त पकवान.
  8. उद्देश्य के माध्यम से या कैमरे पर या तो पकवान देखना, ब्याज की प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और था के साथ दाग है जो एक सेल लगता है. एक अच्छी तरह से दाग सेल ताजा सेल के किनारों पर प्रकाश डाला गया है कि एक पी उत्सर्जन दर्शाती है; एस उत्सर्जन सेल पदचिह्न भर में मोटे तौर पर एक समान होना चाहिए (कांच का पालन और TIRF में imaged है कि सेल के क्षेत्र आईई).
  9. यह मोटे तौर पर 100 मीटर की दूरी पर सेल से इतना है कि स्थानीय छिड़काव सुई की स्थिति.
  10. कोशिका झिल्ली पर ध्यान दें और तुरंत सेल उत्तेजना / छवि अधिग्रहण से पहले autofocus हार्डवेयर को सक्रिय करें. </ ली>
  11. छवि अधिग्रहण शुरू करो. एक depolarizing 56 मिमी KCl समाधान के साथ 60 सेकंड के लिए तो एक बेसल समाधान और के साथ 10 सेकंड के लिए कोशिकाओं छिड़कना. तेजी से 561 एनएम P-पीओएल के बीच शटरिंग जबकि छवियों का मोल, 561 एनएम S-पीओएल (पी में परिवर्तन और था के उत्सर्जन की निगरानी के लिए) और (छवि ट्रांसफ़ेक्ट पुटिका जांच करने के लिए) 488 एनएम उत्तेजना. प्रयोगों के दौरान अर्जित छवियों के उदाहरण चित्रा 2 और 3 चित्र में दिखाया गया.

4. छवि विश्लेषण

इमेज प्रोसेसिंग के लिए गणना ImageJ के साथ किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के आईडीएल या Matlab के रूप में एक लचीला प्रोग्रामिंग भाषा में उपयोग लिपियों बहुत कार्य स्वचालित द्वारा विश्लेषण throughput बढ़ा सकते हैं. छवियों के दो प्रकार के कच्चे उत्सर्जन छवियों से topological जानकारी प्राप्त करने के लिए गणना की जानी चाहिए. - पी / एस और पी 2 एस पी 2 एस राशि एक दिए गए क्षेत्र में कुल झिल्ली डाई की रिपोर्ट पर जबकि पी / एस स्थानीय झिल्ली विकृतियों पर रिपोर्टक्षेत्र की.

  1. सभी छवियों पृष्ठभूमि घटाया जाना चाहिए. , एक ऑफ सेल आरओआई चुनें आरओआई में औसत पिक्सेल तीव्रता को मापने, और तब छवि ढेर में सभी पिक्सल से उस मूल्य को घटाकर.
  2. , पी / एस गणना बाद में "एस" उत्सर्जन फ्रेम (पिक्सेल करने वाली पिक्सेल) द्वारा प्रत्येक "पी" उत्सर्जन फ्रेम को विभाजित करने के लिए. पी / एस पी और एस पीओएल excitations के रिश्तेदार तीव्रता में पूर्वाग्रहों के साथ बदलता रहता है ऑप्टिकल सिस्टम, और हस्तक्षेप किनारे. इन प्रभावों को कम 10 मिमी rhodamine 18 युक्त समाधान के साथ प्राप्त अनुपात करने के लिए किया था उत्सर्जन से प्राप्त से पी / एस अनुपात मानक के अनुसार करने के लिए.
  3. व्यक्तिगत DCVs की एक्सोसाइटोसिस ऐसे synaptotagmin -1 pHluorin (चित्रा 2 बी) के रूप में एक फ्लोरोसेंट पुटिका प्रोटीन की तीव्रता में अचानक परिवर्तन से स्पष्ट है. पी / एस में स्थानीय बढ़ जाती है पर केंद्रित एक 240 एनएम त्रिज्या आरओआई में पिक्सल के औसत से पी / एस और पी 2 एस में परिवर्तन का निर्धारणएक्सोसाइटोसिस की साइटों पर अनुपात. फ्यूजन पी / एस में एक स्पष्ट वृद्धि के बिना होता है, आरओआई fusing DCV के क्षेत्र पर केंद्रित है.
  4. कंप्यूटर सिमुलेशन एक विस्फारित संलयन ताकना की सरल geometries के मामले में पी / एस और पी 2 झिल्ली तीव्रता परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए किया जा सकता है. सिमुलेशन की जानकारी के लिए, Anantharam एट अल. 18 कृपया देखें

Representative Results

परम्परागत एवं ध्रुवीकरण TIRFM इमेजिंग तकनीक ही हवा मेज पर लागू कर रहे हैं. ऑप्टिकल तत्वों का विन्यास उत्तेजना प्रकाश polarized है कि मुख्य अंतर (चित्रा 1 ए) के साथ इसी तरह की है. ध्रुवीकृत प्रकाश preferentially ध्रुवीकरण दिशा में अवशोषण द्विध्रुव साथ fluorophores उत्तेजित. PTIRFM झिल्ली topological परिवर्तन की निगरानी में प्रभावी होने के लिए इस प्रकार,, प्रयोग किया जाता है कि जांच एक निश्चित उन्मुखीकरण के साथ झिल्ली में intercalate चाहिए. फ्लोरोसेंट carbocyanine रंजक (DII, था) झिल्ली विमान (चित्रा 1 बी) में संक्रमण द्विध्रुव साथ एक उन्मुख फैशन में लिपिड bilayers में intercalate. लेबल किया झिल्ली के पी polarized रोशनी (चित्रा 1C) चुनिंदा coverslip-तिरछा fluorophores (आंकड़े 1 बी में लाल और 1 डी) उत्तेजित.

क्रोमाफिन कोशिकाओं के विपुल झिल्ली लेबलिंग अटल बिहारी के बाद हासिल की हैथा. 2A चित्रा के साथ Rief ऊष्मायन अच्छी तरह से सना हुआ है कि एक कोशिका झिल्ली का एक उदाहरण दिखाता है. एक स्वस्थ, पक्षपाती सेल पी और एस उत्सर्जन में स्पष्ट मतभेद प्रदर्शन करेंगे. पी उत्सर्जन छवि सेल के आराम करने के लिए सम्मान के साथ एक उज्जवल सेल सीमा से पता चलता है. एस उत्सर्जन छवि सेल पदचिह्न भर में मोटे तौर पर वर्दी प्रतिदीप्ति पता चलता है. गणना पिक्सेल करने वाली पिक्सेल पी / एस और पी 2 एस छवियों क्रमशः झिल्ली वक्रता और डाई एकाग्रता, के प्रति संवेदनशील हैं. पता चला क्रोमाफिन सेल भी स्रावी vesicles (चित्रा 2 बी) लेबल करने synaptotagmin -1 pHluorin (Syt -1) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है.

क्रोमाफिन सेल कोशिका झिल्ली बिगाड़ना और एक्सोसाइटोसिस ट्रिगर करने के लिए 56 मिमी KCl के साथ प्रेरित कर रहा है. चमकीले फ्लोरोसेंट Syt -1 pHluorin स्थानों की एक संख्या अचानक DCVs फ्यूज (चित्रा 2B, सही पैनल) के रूप में स्पष्ट हो गया है. एक सफेद बॉक्स एक संलयन घटना (चित्रा 2B, सही पैनल) के चारों ओर खींचा है. इस संलयन घटना मैंआंकड़े -2 सी और 2 डी में विश्लेषण किया है. चित्रा -2 Syt-1-pHluorin, पी / एस, और पी 2 एस छवि तीव्रता में फ्रेम दर फ्रेम परिवर्तन दिखाता है. प्रोटीन संलयन साइट (चित्रा 2 डी) से दूर diffuses रूप Syt -1 की प्रतिदीप्ति तीव्रता जल्दी से कम हो. जुड़े हुए पुटिका / प्लाज्मा झिल्ली परिसर का प्रतिनिधित्व खरोज एक अपेक्षाकृत धीमी दर (चित्रा 2 डी में रेखांकन नोट) पर कम हो. चित्रण (चित्रा 2 ई) इन माप की व्याख्या करते हुए दर्शाया गया है.

चित्रा 2 में दिखाया तेजी और स्थानीय झिल्ली विकृतियों उत्तेजना पैदा सीए 2 + बाढ़ का परिणाम होते हैं. इस चित्रा 3 में दिखाया गया है. एक क्रोमाफिन सेल आनुवंशिक सीए 2 + सूचक GCaMP5G 21,22 साथ ट्रांसफ़ेक्ट और 56 मिमी KCl के साथ प्रेरित कर रहा है. झिल्ली विध्रुवण (GCaMP5G प्रतिदीप्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता है एनजी> 3 ए आंकड़े और 3 बी) subplasmalemmal में वृद्धि सीए 2 + स्तर वाचक. सेल के एक 30 x 20 पिक्सेल क्षेत्र चुना जाता है और GCaMP5G, पी / एस, और पी 2 एस पिक्सेल तीव्रता में फ्रेम दर फ्रेम परिवर्तन छवियों (3B चित्रा) और रेखांकन (चित्रा -3 सी) में दिखाया गया. टाइम "0" एक परिवर्तन एक पी / एस पहले फ्रेम designates (एक्सोसाइटोसिस से पहले यानी फ्रेम) स्पष्ट है. सफेद तीर झिल्ली विरूपण (पी / एस में वृद्धि) पी 2 उत्सर्जन में कमी के साथ है कि संकेत मिलता है. साइटोसोलिक GCaMP5G प्रोटीन जुड़े हुए DCV द्वारा क्षेत्र से बाहर रखा गया है. भी चित्रा -3 सी, बाएं पैनल में 0 समय GCaMP5G तीव्रता में अचानक कमी नोट. लंबे समय रहते पी / एस में वृद्धि हुई है और पी 2 एस में कमी धीरे धीरे (चित्रा 3 डी) फैल जाती है कि एक संलयन ताकना सुझाव देते हैं.

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चित्रा 1. PTIRFM तकनीक के लिए रेखांकन. ए) ध्रुवीकरण आधारित TIRF इमेजिंग के साथ परंपरागत संयोजन के लिए एक योजनाबद्ध दिखाया गया है. एक चौथाई लहर (QW) थाली elliptically लेजर बीम फूट डालना करने के लिए एक 561 एनएम नीलमणि लेजर के सामने रखा गया है. एक ध्रुवीकरण घन (PC1) रैखिक ऊर्ध्वाधर (वी) और क्षैतिज (ज) घटकों में polarizations अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज घटक TIR से सतह पर, क्रमशः, पी पीओएल और S-पीओएल उत्तेजना मुस्कराते हुए हो जाते हैं. P-पीओएल और S-पीओएल रास्तों स्वतंत्र (S1 और S2) बंद कर रहे हैं. वे दर्पण और एक दूसरे ध्रुवीकरण घन (PC2) के साथ recombined हैं. वे एक दर्पण से मिलकर और dichroic दर्पण (डीसी) nonpolarizing एक बीम स्टीयरिंग तत्व के माध्यम से 488 एनएम बीम (भी स्वतंत्र रूप S3, बंद) में शामिल हो. लेंस (एल) मुस्कराते हुए विस्तार और ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है. संयुक्त 488 एनएम और 561 एनएम मुस्कराते हुए GALVANO के माध्यम से माइक्रोस्कोप के एक तरफ रोशनी बंदरगाह के लिए चलाया रहे हैंमीटर दर्पण (जीएम). वे उद्देश्य के पीछे फोकल प्लेन (BFP) के लिए ध्यान केंद्रित. Fluorophores से उत्सर्जित फोटॉनों) एक पीसी. बी से जुड़ा एक EMCCD कैमरे पर कब्जा कर रहे हैं किया लेबलिंग संक्षेप अतिरिक्त हटाने के लिए बार बार डाई और कपड़े धोने के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा किया जाता है. था, मोटे तौर पर दिखाया गया है के रूप में हुई घटना (P-पीओएल) के विमान में polarized घटना प्रकाश, इंटरफ़ेस करने के लिए सामान्य मुख्य रूप से ध्रुवीकृत है कि एक क्षणभंगुर क्षेत्र बनाता झिल्ली विमान. सी) में इसके संक्रमण द्विध्रुवीय क्षणों के साथ झिल्ली में intercalates. डी) P-polarized प्रकाश के साथ एक लेबल किया झिल्ली की रोशनी चुनिंदा coverglass-तिरछा (लाल) कर रहे हैं कि उन fluorophores उत्तेजित होगा. यह एक एस polarized क्षणभंगुर क्षेत्र थे, coverglass के समानांतर हैं कि उन fluorophores बजाय (काला) उत्साहित किया जाएगा.

चित्रा 2
चित्रा 2. टुनिशिया> pTIRFM साथ मॉनिटरिंग सेल झिल्ली विकृतियों. ए) की गणना पी / एस और पी 2 उत्सर्जन छवियों के साथ कच्चे पी और एस उत्सर्जन चित्र दिखाया जाता है. स्केल बार, 3.2 माइक्रोन. बी) Syt -1 pHluorin व्यक्त क्रोमाफिन सेल KCl साथ depolarized है. चमकीले फ्लोरोसेंट धब्बे (सही पैनल) की संख्या व्यक्ति DCVs के विलय का संकेत मिलता है. स्केल बार, एक fusing Syt -1 pHluorin DCV के 3.2 माइक्रोन. सी) फ्रेम दर फ्रेम छवियों. (चित्र ऊपर) टाइम्स सेकंड में कर रहे हैं. 0 समय DCV के विलय से पहले फ्रेम designates. इसी पी / एस और पी 2 उत्सर्जन चित्र भी दिखाए जाते हैं. .. फ्यूजन फ्रेम ई) सी और डी में परिणाम का एक संभावित व्याख्या दिखाया गया है - स्केल बार 1 माइक्रोन है डी) रेखांकन सी. बिंदीदार रेखा में छवियों के लिए समय 0 पर है. "रिक्त> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. विरुपणों उत्तेजना पैदा सीए 2 + बाढ़ का परिणाम होते हैं. ए) GCaMP5G साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक क्रोमाफिन सेल 56 मिमी KCl साथ depolarized है. GCaMP5G प्रतिदीप्ति जिसके परिणामस्वरूप में वृद्धि छवियों ऊपर ए टाइम्स में सेल का 30 x 20 पिक्सेल क्षेत्र के फ्रेम दर फ्रेम छवियों सेकंड में कर रहे हैं subplasmalemmal में वृद्धि सीए 2 + स्तर. बी) का प्रतीक है. सफेद तीर पी / एस वृद्धि और पी 2 एस कमी का एक क्षेत्र से संकेत मिलता है. साइटोसोलिक GCaMP5G प्रोटीन fusing DCV द्वारा क्षेत्र से बाहर रखा गया है. बी में दिखाया छवियों के लिए स्केल बार, 1 माइक्रोन. सी) रेखांकन डी) बी और सी में परिणाम का एक संभावित व्याख्या दिखाया गया है.3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीडी> <टीआर>
iXon3 EMMCD कैमरा Andor 897
IX81 उलटा माइक्रोस्कोप ओलिंप साइड पर लगे Filtercube विधानसभा
43 श्रृंखला AR-आयन लेजर CVI Milles Griot लेजर ऑप्टिक्स 543-AP-A01 488 एनएम के लिए tunable
561 एल.पी. डायोड लेजर नीलम सुसंगत 561 एनएम
Galvo मिरर सिस्टम स्कैनिंग Thorlabs GVS102
कुलपति 3 चैनल फोकल छिड़काव प्रणाली ALA वैज्ञानिक उपकरण ALA VC3X4PP
QMM क्वार्ट्ज MicroManifold ALA वैज्ञानिक उपकरण ALA QMM-4
10 साई दबाव नियामक ALA वैज्ञानिक उपकरण ALA PR10
आपरेटर बर्ले टीएस 5000-150
घुड़सवार अवर्णी तिमाही लहर थाली Thorlabs AQWP05M-600
420-680 एनएम ध्रुवीकरण beamsplitter घन Thorlabs PBS201
छह स्टेशन तटस्थ घनत्व व्हील Thorlabs FW1AND
Stepper मोटर चालित SmartShutter Sutter उपकरण IQ25-1219
HQ412lp dichroic फिल्टर क्रोमा NC255583 488 एनएम और 561 एनएम मुस्कराते हुए जुड़ती
लेपित Plano-अवतल लेंस एडमंड प्रकाशिकी PCV 100mm विज़ 0 488 एनएम बीम diverges
लेपित Plano-अवतल लेंस एडमंड प्रकाशिकी PCV 250mm विज़ 0 561 एनएम बीम diverges
लेपित Plano उत्तल लेंस एडमंड प्रकाशिकी PCX 125mm विज़ 0 दोनों मुस्कराते हुए केंद्रित
लेपित Plano उत्तल लेंस एडमंड प्रकाशिकी PCX 50mm विज़ 0 घन विधानसभा फिल्टर करने के लिए एकजुट
z488/561rpc Dichroic क्रोमा z488/561rpc Filtercube dichroic
z488/561_TIRF उत्सर्जन फिल्टर क्रोमा z488/561m_TIRF Filtercube उत्सर्जन
UIS2 60x उद्देश्य ओलिंप UPLSAPO 60XO एनए 1.37
नियॉन अभिकर्मक प्रणाली Invitrogen MPK 5000
MetaMorph इमेजिंग सॉफ्टवेयर आण्विक उपकरण
DiI झिल्ली डाई Invitrogen वि 22,885 संरेखण प्रयोजनों के लिए
वें Liberase रॉश 5401135001
टीएल Liberse रॉश 5401020001
गोजातीय से DNase मैं प्रकार चतुर्थ सिग्मा D5025
Hemocytometer मछुआ 0267110
झिल्ली डाई किया Invitrogen D-7757
Rhodamine Invitrogen R634
0.22 माइक्रोन झिल्ली सिरिंज फिल्टर यूनिट Millipore SLGS033SS
Fluoresbrite अनेक रंगों लाल Microspheres Polysciences 19,507 0.5 माइक्रोन
विसर्जन के तेल सिग्मा 56,822
LabVIEW नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स नियंत्रण दर्पण galvo
स्पिनर फ्लास्क Bellco 1,965-00,250

तालिका 1. pTIRF माइक्रोस्कोपी उपकरण.

अंतर्वस्तु तैयार करने का पीएसएस बेसल पीएसएस Stim-पीएसएस
NaCl 145 मिमी 145 मिमी 95 मिमी
KCl 5.6 मिमी 5.6 मिमी 56 मिमी
2 MgCl - 0.5 मिमी 0.5 मिमी
2 CaCl - 2.2 मिमी 5 मिमी
HEPES 15 मिमी 15 मिमी 15 मिमी
पीएच 7.4 7.4 7.4
ग्लूकोज 2.8 मिमी 5.6 मिमी 5.6 मिमी
पेन Strep 1x - -

तालिका 2. छिड़काव और क्रोमाफिन सेल तैयार करने का समाधान.

अंतर्वस्तु Electroporating मीडिया सामान्य चढ़ाना मीडिया 2x एंटीबायोटिक मीडिया
1x DMEM/F-12 1 मिलीग्राम / प्लेट 2 मिलीग्राम / प्लेट 1 मिलीग्राम / प्लेट
FBS 10% 10% 10%
साइटोसिन arabinofuranoside (सीएएफ) - 10 मिमी शेयर से 1 μl / मिलीलीटर -
पेनिसिलिन - 100 इकाइयों / मिलीलीटर 200 इकाइयों / मिलीलीटर
स्ट्रेप्टोमाइसिन - 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Gentamycin - 25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर

तालिका 3. क्रोमाफिन सेल मीडिया.

अंतर्वस्तु वें पीएसएस TL-पीएसएस
वें Liberase 2 मिलीलीटर -
Liberase टीएल - 0.85 मिलीलीटर
तैयार करने का पीएसएस 98.0 मिलीलीटर 84.0 मिलीलीटर
DNase 8.75 मिलीग्राम 7.4 मिलीग्राम

तालिका 4. वें पीएसएस और टीएल-पीएसएस समाधान.

Discussion

ध्रुवीकरण आधारित TIRFM झिल्ली टोपोलॉजी में तेजी, submicroscopic परिवर्तन का पता लगाता है. तकनीक को लागू करने TIRF प्रकाशिकी जगह में पहले से ही कर रहे हैं, खासकर अगर अपेक्षाकृत सरल है. जरूरत है कि सभी एक चौथाई लहर प्लेट, दो ध्रुवीकरण क्यूब्स, और पी पी ओ एल और एस पीओएल रोशनी रास्तों को अलग करने के शटर है. मेज पर इन घटकों की सटीक स्थिति आमतौर पर उपलब्ध अंतरिक्ष से निर्धारित होता है.

झिल्ली topological जानकारी प्राप्त करने के लिए, प्रयोग किया फ्लोरोसेंट जांच एक निश्चित या ज्ञात उन्मुखीकरण के साथ intercalate चाहिए. तकनीक, इस आलेख में वर्णित के रूप में, इस तरह के FM1-43 14, भी इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में carbocyanine रंजक लेकिन अन्य रंगों का उपयोग करते हैं, मान लिया गया. झिल्ली धुंधला प्रक्रिया ही सीधा है. संवर्धित कोशिकाओं की झिल्ली विपुल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए किया था DII / की एक छोटी मात्रा के लिए केवल एक बहुत संक्षिप्त जोखिम (कम से कम 10 सेकंड) की आवश्यकता होती है. अतिरिक्त रंग जोड़ना प्रकाश बिखरने aggreg की ओर जाता हैछवि गुणवत्ता कम जो कांच पर Ates. डाई के साथ खत्म-incubating कोशिकाओं छवि गुणवत्ता और संभवतः सेल व्यवहार्यता पर हानिकारक असर पड़ता है जो internalization डाई की ओर जाता है. एक सेल अच्छी तरह से सना हुआ है, तो पी और एस उत्सर्जन छवियों में स्पष्ट अंतर हो जाएगा. चित्रा 2A में दिखाया गया है, पी उत्सर्जन ताजा उत्सर्जन तीव्रता सेल पदचिह्न से अधिक मोटे तौर पर एक समान हो जाएगा, जबकि (सेल पदचिह्न के किनारों आईई) coverslip परोक्ष हैं कि झिल्ली के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा. पी और एस के बीच एक स्पष्ट अंतर स्पष्ट नहीं है, तो यह सेल खराब सब्सट्रेट का पालन किया या कोशिका झिल्ली स्वस्थ नहीं है, और सेल प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है कि संभव है.

PTIRFM का वर्णन हमारे पिछले अध्ययनों फ्लोरोसेंट झिल्ली जांच के रूप में DII का उपयोग किया. यह अन्य फ्लोरोफोरे रूप GFP / pHluorin कि रोजगार दोहरी रंग इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त है क्योंकि यहां, हमने किया उपयोग. हम किया था वाई उत्तेजितएक 561 एनएम लेजर के बजाय (अपनी उत्तेजना शिखर के करीब है) 640 एनएम लेजर वें क्योंकि 640 एनएम पर और अधिक तेजी से फ्लोरोफोरे विरंजकों. 561 एनएम लेजर के प्रकाशित उत्तेजना स्पेक्ट्रम, प्रतिदीप्ति कुशलता से उत्सर्जित होता था की पूंछ पर है कि इस तथ्य के बावजूद. 561 एनएम लेजर का एक अन्य लाभ यह है कि यह दोनों DII उत्तेजित और दोनों जांच के लिए एक ही ध्रुवीकरण स्थापना का उपयोग करने के लिए हमें सक्षम किया है. झिल्ली में फ्लोरोफोरे के उन्मुखीकरण झिल्ली टोपोलॉजी की व्याख्या को प्रभावित करेगा कि ध्यान दें. (DII साथ या था मामला है, बल्कि समानांतर, या लगभग समानांतर से) एक fluorophore झिल्ली विमान को सीधा अपने संक्रमण द्विध्रुव साथ उन्मुख थे अगर उदाहरण के लिए, तो nonplanar झिल्ली क्षेत्रों में अधिक आसानी से एस से प्रकाश डाला बजाय होगा पी उत्सर्जन.

हम भी गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं के अलगाव और electroporation के लिए तकनीक का वर्णन किया है. गोजातीय क्रोमाफिन सेल एक उत्कृष्ट s हैecretory मॉडल. यह secretogogues की एक किस्म के लिए उत्तरदायी संस्कृति, में बनाए रखने के लिए आसान जा रहा है, और आसानी से पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना कर रहे हैं कि बड़े स्रावी vesicles रखने के फायदे हैं. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, कोशिकाओं पूर्व कोलेजन इलाज कल्चर व्यंजन पर चढ़ाना को निलंबन में electroporated कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, अभिव्यक्ति दक्षता सीए 2 + फॉस्फेट या Lipofectamine अभिकर्मकों के साथ या तो से electroporation के साथ काफी ज्यादा है. electroporation की खामी यह अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता है (कई के रूप में प्रक्रिया जीवित नहीं है) और महंगा वाणिज्यिक अभिकर्मकों है. हमारे लिए स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कि कारणों से नहीं, हर झिल्ली था शामिल किया गया. इसके अलावा, पकवान पर कोशिकाओं का एक अंश ही ट्रांसफ़ेक्ट हैं. ट्रांसफ़ेक्ट हैं और था के साथ अच्छी तरह से दाग रहे हैं कि कोशिकाओं ढूँढना धुंधला और electroporation प्रयास के लायक है के लिए शर्तों का अनुकूलन यही वजह है कि समय लगता हो सकता है.

संक्षेप में, यह एकrticle pTIRFM गोजातीय क्रोमाफिन कोशिकाओं में घने कोर vesicles के संलयन के दौरान हो कि तेजी और स्थानीय झिल्ली विकृतियों की निगरानी के लिए लागू किया जाता है कैसे करें. केवल एक ही आवेदन पर विचार विमर्श किया जाता है, तकनीक आदर्श endocytosis, cytokinesis, और सेल गतिशीलता सहित झिल्ली आकार में परिवर्तन, शामिल है कि अन्य जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुकूल है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध वेन स्टेट यूनिवर्सिटी से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन और शुरू हुआ धन से ए.ए. के लिए एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14420049) द्वारा समर्थित है. हम pTIRFM सेट अप और पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के साथ सहायता के लिए गोजातीय अधिवृक्क तैयारियों और डॉ. डैनियल एक्सेरोल्ड के बारे में सलाह प्रदान करने के लिए डॉ. रोनाल्ड डब्ल्यू Holz और डॉ. मैरी Bittner के लिए आभारी हैं. Syt -1 pHluorin के साथ इस्तेमाल किया गया था डॉ. Gero Miesenbock (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय) की अनुमति. GCAMP5G Addgene के माध्यम से प्राप्त हुई थी. हम वर्णित प्रक्रियाओं के विभिन्न चरणों के अनुकूलन पर मदद से जेम्स टी. टेलर, Tejeshwar राव, राहेल एल Aikman, और Praneeth Katrapti धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iXon3 EMMCD Camera Andor 897
IX81 Inverted Microscope Olympus Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser CVI Milles Griot Laser Optics 543-AP-A01 Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser Coherent 561nm
Scanning Galvo Mirror System Thorlabs GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System ALA Scientific Instruments ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold ALA Scientific Instruments ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator ALA Scientific Instruments ALA PR10
Manipulator Burleigh TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate Thorlabs AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube Thorlabs PBS201
Six Station Neutral Density Wheel Thorlabs FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter Sutter Instruments IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter Chroma NC255583 Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens Edmund Optics PCV 100mm VIS 0 Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens Edmund Optics PCV 250mm VIS 0 Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens Edmund Optics PCX 125mm VIS 0 Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens Edmund Optics PCX 50mm VIS 0 Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic Chroma z488/561rpc Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter Chroma z488/561m_TIRF Filtercube emission
UIS2 60x Objective Olympus UPLSAPO 60XO NA 1.37
Neon Transfection System Invitrogen MPK 5000
MetaMorph Imaging Software Molecular Devices
DiI Membrane Dye Invitrogen V-22885 For Alignment Purposes
TH Liberase Roche 5401135001
TL Liberse Roche 5401020001
DNAse I Type IV from bovine Sigma D5025
Hemocytometer Fisher 0267110
DiD Membrane Dye Invitrogen D-7757
Rhodamine Invitrogen R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit Millipore SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres Polysciences 19507 0.5 microns
Immersion Oil Sigma 56822
LabVIEW National Instruments Controlls galvo mirrors
Spinner Flask Bellco 1965-00250

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 86 क्रोमाफिन कोशिकाओं लिपिड bilayers माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण एक्सोसाइटोसिस झिल्ली TIRF pTIRF क्रोमाफिन ध्रुवीकरण पुटिका
PTIRFM साथ इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली विरुपणों
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Passmore, D. R., Rao, T. C., Peleman, A. R., Anantharam, A. Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM. J. Vis. Exp. (86), e51334, doi:10.3791/51334 (2014).

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