Summary
Vi har tidligere udviklet en teknik til implantering tetrode ledningerne i det centrale kompleks af kakerlak hjerner, der giver os mulighed for at overvåge aktiviteten i individuelle enheder af forankrede kakerlakker. Her præsenterer vi en modificeret version af denne teknik, der giver os mulighed for at også optage hjernens aktivitet i frit bevægelige insekter.
Abstract
Stigende interesse i rollen som hjernens aktivitet i insekt motorstyring kræver, at vi kunne kontrollere neurale aktivitet, mens insekter udføre naturlig adfærd. Vi har tidligere udviklet en teknik til implantering tetrode ledningerne i det centrale kompleks af kakerlak hjerner, der tillod os at optage aktivitet fra flere neuroner samtidigt mens en tøjret kakerlak vendte eller ændret ganghastighed. Mens et stort fremskridt, tøjrede præparater giver adgang til begrænsede adfærd og ofte mangler feedback-processer, der foregår i frit bevægelige dyr. Vi præsenterer nu en modificeret version af denne teknik, der giver os mulighed for at optage fra det centrale kompleks af frit bevægelige kakerlakker, som de går i en arena og beskæftige sig med barrierer ved at dreje, klatring eller tunneling. Kombineret med høj hastighed video og klynge skæring, kan vi nu relatere hjernens aktivitet til forskellige parametre for flytning af frit opfører insekter.
Introduction
Denne artikel beskriver et vellykket system til optagelse fra neuroner i det centrale kompleks (CC) af kakerlak, Blaberus discoidalis, som insektet vandreture i en arena og beskæftiger sig med genstande, der forårsager den til at dreje rundt, tunnel under eller klatre over forhindringer. Trådene kan også være forbundet til en stimulator at fremkalde aktivitet i den omgivende neuropil med deraf følgende adfærdsændringer.
I det seneste årti betydelig opmærksomhed har været rettet mod de roller, som de forskellige områder af hjernen med at kontrollere insekt adfærd spilles. Meget af dette fokus har været rettet mod midterlinjen hjernen neuropils der er kollektivt benævnt centrale kompleks (CC). Der er gjort fremskridt som et resultat af mange sorter af teknikker rettet mod spørgsmål om den rolle, som CC i adfærd. Disse teknikker spænder fra neurogenetic manipulationer, primært i Drosophila, kombineret med opføoral analyse 1-3, til elektrofysiologiske teknikker, der overvåger neurale aktivitet inden for CC og forsøg på at relatere denne aktivitet til adfærdsmæssigt relevante parametre.
Elektrofysiologiske teknikker omfatter intracellulær optagelse fra de enkelte identificerede neuroner 4-9 og ekstracellulære optagelse, ofte med multi-kanal sonder 10,11. Disse to teknikker er gratis. Intracellulær optagelse med skarpe elektroder eller hel celle patch giver meget detaljerede oplysninger om identificerede neuroner, men er begrænset til en eller to celler på en gang, kræver begrænset eller ingen bevægelse, og kan opretholdes i relativt korte perioder. Ekstracellulære optagelser kan nemt oprette, ikke kræver tilbageholdenhed, og kan opretholdes i timevis. Med multi-kanal tetrodes og klynge skæring, kan forholdsvis store populationer af neuroner analyseres samtidig 9,12. Mens helcelle PATCh har været anvendt med succes i tøjrede insekter 13, mener vi, at der også er et behov for teknikker, der tillader os at optage neurale aktivitet i hjernen i lange perioder i frit opfører insekter, som de beskæftiger sig med barrierer for bevægelse fremad.
Behovet for at optage som insekt bevæger sig og hopper op og ned skubbet os mod ekstracellulære optagelse metoder. Vi har haft god succes optagelse tilbageholdende præparater med kommercielt tilgængelige 16 kanaler silicium sonder 11, men den lille størrelse af selv store kakerlakker betyder, at sonderne skal monteres fra kroppen. Det, kombineret med delikatesse af sonden tænder, gjorde dem uegnede til en gratis walking forberedelse. I to tidligere projekter, vi brugte bundter af fine tråde, der danner en tetrode at udrette lignende optagelse egenskaber, men i en mere robust arrangement. Disse tetrode bundter tilladt os at optage fra tøjrede kakerlakker end relatere CC enhed aktivitet til ændringer i ganghastighed 14 og dreje adfærd som følge af antennal kontakt med en stang 10.
Så nyttige som disse tøjrede forberedelser har været og vil fortsat være, gør de præsentere nogle begrænsninger. Først, den adfærd, insektet kan udføre er begrænset til et plan. Det er, kunne vi let fremkalde ændringer i ganghastighed eller drejning, men klatring og tunneling handlinger ikke var muligt, i det mindste med den typiske tøjr arrangement. For det andet, vores tøjrede præparater "open loop". Det vil sige, at de ikke giver mulighed for en normal bevægelse i forbindelse feedback til systemet. Således som den kakerlak tændt vores tøjr, dens visuelle verden blev ikke ændret i overensstemmelse hermed. Det er muligt at bygge lukkede sløjfe tether systemer til at indføre denne form for feedback. Men de er begrænset af kompleksiteten af programmeringen og hardware simulerede visuelle miljø. Ikke desto mindre skals, vi følte, at vi kunne forbedre vores eksisterende tøjrede optagelse metoder ved at optage fra dyret, da det gik frit i en arena eller spor og stødte objekter, som det ville i sine naturlige omgivelser.
Selvom trådløse systemer til registrering af hjernens aktivitet 15 ville være ideelt, nuværende systemer har begrænsninger i antallet af optagekanaler, tidspunkt for dataopsamling, batterilevetid og vægt. Vi har derfor valgt at forsøge at tilpasse vor tøjret registreringssystem til brug i frit bevægelige præparater. Som bedre trådløse systemer bliver tilgængelige, kan denne teknik let kan tilpasses disse anordninger. Det system, der er beskrevet i denne artikel er lette vægt, virker meget godt og synes at have ringe skadelig virkning på kakerlak adfærd. Med en billig high speed kamera og klynge skæring software, kan aktivitet i individuelle hjerne neuroner være relateret til bevægelse. Her beskriver vi preparation af tetrode ledninger og deres implantation i insektets hjerne samt optagelse teknikker til elektrisk aktivitet og bevægelse, og hvordan disse data kan bringes sammen til efterfølgende analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af tetrode Wires
- Træk en meget tynd nichromtråd (12 um diameter, PAC belægning) på ca 1,1 m længde. Vedhæft et bånd tag til hver ende. Hæng wiren over en horisontal gevindstang således at de to ender er i samme højde nær stationære.
- Gentag trin 1.1 for en anden tråd, hvilket gør yderligere to ender til en total på 4, og placere det ved siden af den første tråd (ca. 1 cm i mellem).
- Holde de fire enderne sammen med et bånd-tag og vedhæfte tag til en motoriseret roterende snoede enhed. Denne enhed kan foretages fra en billig dc motor.
- Sno tetrode i én retning i 2 min (60 rpm) og slappe af det i den modsatte retning i 30 sek.
- Brug en varmepistol til at smelte ledningerne sammen. Rør ikke ved ledningerne med pistolen. Brug tre op og ned passerer fra skiftende retninger, hver passage tager omkring 10 sek.
- Skær top og bund af de viklede tråde. De fire ledninger snos end smeltet sammen i den ene ende, men adskilt i den anden.
- Tilføj bærerøret. Skær en længde 30 cm af polyethylen rør (diameter: indvendig 0,28 mm, uden 0,61 mm). Tråd tetrode meget langsomt og forsigtigt ind bærerøret så den ikke knækkes.
- Når smeltet ende vises ud på den anden side, træk den igennem, så der er en lige længde af tråd i begge ender af styrerøret.
- Grib den separate ende af hver ledning med en pincet. Brug bunden af flammen fra en gasbrænder, omhyggeligt brænde isolering fra den sidste 2 eller 3 mm fra hver ledning. Varm wiren, indtil den lyser, men ikke krøller.
- Slut tetrode med en mandlig-kvindelig IC socket adapter, der passer til din optageenhed. Sæt deinsulated enden af hver ledning i et andet stik på adapteren med en pincet. Stabiliser ledningen i stikkontakten med en lille messing pin. Brug en fin spids loddekolbe og fylde soklen med den smeltede loddetin. Vær omhyggelig med ikke at kontakteden skrøbelige ledning med loddekolben.
- Kontroller impedans på hver ledning, og den inter impedans af hvert par ledninger.
- Placer smeltet, snoede ende i en beholder med saltvand og tilslut en kobbertråd dirigent fra saltvand til ohm meter.
- Forbind den anden ende af apparatet til patronringen indeholder tråden. Impedansen af hver ledning skal være under 3 MOhm.
- Hvis ovennævnte værdier ikke opnås, reattempt de loddetilslutninger.
- Fjern ledningerne fra saltvand, skylles tips med vand, og teste inter wire impedans for hver parring (n = 6). Den inter impedans skal være over 5 MOhm.
- Hvis ovennævnte værdier ikke opnås, slice en lille mængde af spidsen af ved smeltet ende og teste igen.
- Kassér wire sæt, der ikke opfylder begge impedans krav for alle de ledninger.
- Fastgør tetrode.
- Fold et lille firkantet papir kasse lidt d.htly større end-adapter.
- Overfør adapteren ind i feltet med den mandlige side i bunden. Trænge ind i kassen, således at alle stifter af hansiden er uden for boksen, mens resten af adapteren er inde i boksen.
- Tape hjørnerne af kassen på ydersiden. Brug små stykker af dobbeltklæbende tape på indersiden af boksen for at stabilisere eventuelle individuelle dele af wire. Wiren skal fusioneres som det kommer ud af kassen.
- Bland hurtigt sæt 2 komponent epoxy og hæld ind i feltet for at fastgøre adapteren og alle ledningerne.
- Fastgør nær enden af føringen slangen til den ene side af boksen med dental voks men overlader slangen åbne, således at tetrode kan trækkes gennem frit i begge ender.
- Slib tetrode.
- Før hvert eksperiment, skære spidsen af tetrode med en skarp skalpel, ikke saks. Dette forhindrer knusning og splaying af trådenderne samtidig give en ren flad kant til det næste trin.
- Det ønskede resultat omdanner bundt enden fra en lige kant til en spids med små mængder af isolering fjernet fra enden af hver ledning. Kontroller det punkt ved hjælp af et dissektionsmikroskop før forkromning tetrode. Hvis der opstår flosser på spidsen, recut og repolish.
- Hvis impedans afprøvning i løbet af efter-følgendeent plating trin viser ekstremt lave inter wire-værdier (mindre end 4 MOhm), indikerer det for meget materiale fjernes under polering trin. Recut og repolish den tetrode.
- Før hvert eksperiment, skære spidsen af tetrode med en skarp skalpel, ikke saks. Dette forhindrer knusning og splaying af trådenderne samtidig give en ren flad kant til det næste trin.
- Plate den tetrode. Sæt spidsen af tetrode i en mættet kobbersulfat opløsning (85 ml vand og 5 ml svovlsyre, 50 g kobbersulfat). Plade hver ledning med en strøm på 2,5 microamperemetret med en stimulus isolator. Sprøjt strøm i 1 sek, pause i 1 sek, og gentage denne proces 4x.
- Kontroller impedans wiren og interimpedance af hvert par ledninger. Impedansen af hver ledning skal være mellem 0,5-1 MOhm og inter impedans skal være over 4 MOhm.
- Monter adapteren på hovedtrin af en multikanal registreringssystem.
- Vedhæft en bøjet insekt pin til en mikromanipulator. Fastgør spidsen af tetrode til insekt polet med dental voks
2. Animal Forberedelse
- BedøveKakerlak med is.
- Efter kakerlak stopper bevæger sig, begrænse kakerlak lodret mod en flad kork overflade med store sadel stifter, der danner bro insekt, men ikke trænge nogen del af sin krop.
- Overfør præparatet i en plastbeholder og placere isen omkring dyret for at minimere blodgennemstrømningen og kropsbevægelser.
- Placer en plastik krave ved halsen for at støtte hovedet og placere dental voks omkring hovedet for at stabilisere den.
- Skær et lille vindue mellem ocelli med et barberblad og fjerne neglebånd fra hovedet.
- Fjern bindevæv og fedt med en pincet for at blotlægge hjernen.
- Placere nogle kakerlak saltvand ind i hovedet kapslen til at dække hjernevæv.
- At desheath hjernen, bruge en fin pincet til forsigtigt at få fat i kappen på toppen af hjernen og bruge en anden fin pincet til at rive kappen fra hinanden i tråden implanteret område.
- Åbne et lille hul i hovedet kapsel forreste til hjernen with et insekt ben. Indsæt en fletning af tre større diametre (56 um) isolerede kobbertråde i hullet til at tjene som en reference / jordelektrode.
- Sænk spidsen af tetrode til hjernen overflade med mikromanipulator og placer den i nærheden af hjernen regionen af interesse.
- Forsigtigt to små stykker af tynde acetat ark (2 mm x 1 mm), lidt større end hullet i hovedet kapsel, anterior og posterior til tetrode.
- Tænd registreringssystem.
- Sænk langsomt tetrode 150-250 um under hjernen overflade, afhængigt af optagekvalitet.
- Sluk for registreringssystem.
- Flyt de to stykker acetat ark så tæt på tetrode som muligt uden at røre den (figur 1A).
- Varm en lille spatel eller fladtrykt kanyle og sætte det ind dentalvoks sådan, at der er flydende voks på spidsen af spatel. Rør forsigtigt den fjerneste ende af hvert stykke acetat ark fratetrode med spatel, så flydende voks kan flyde på hvert stykke og lukke hullet mellem den og hovedet neglebånd.
- Gentag trin 2.16. Drop en lille mængde af flydende voks på acetat ark hver gang. Starte processen langt væk fra tetrode og bevæge sig gradvist hen imod det. Til sidst tetrode vil blive forankret ved dental voks. Undgå at få varm voks ind i hulrummet og ind i hjernen.
- Brug samme metode som trin 2.16 og 2.17 at forankre reference / jord elektrode med voks.
- Varm voks, der lægger tetrode til mikromanipulator at frigive tetrode fra det.
- Loop den tetrode i dental voks på hovedet for at give en trækaflastning (figur 1B).
- Dæk trækaflastning loop med dental voks (figur 1C).
- Fjern forsigtigt de begrænsninger og overdrage udarbejdelsen på en petriskål. Begrænse forberedelse dorsalsiden op med store sadel ben.
- Vedhæften stang til pronotum ved hjælp af en limpistol. Dette er en træpind, som strækker sig fra pronotum over maven.
- Fastgør spidsen af tetrode slangen til den bageste ende af stangen med dental voks.
- Forankre tetrode og reference / jordelektrode til den forreste ende af stangen med dental voks.
- Træk tetrode fra muffeenden af røret så meget som muligt, men ikke slæbebåd på det, for at fjerne risikoen for, at dyret kan beskadige den del af tetrode uden slangen (figur 1D).
- Fjern alle de begrænsninger. Fastgør reference / jord elektroden til tetrode slangen med dental voks.
- Vent mindst 60 minutter for dyret at komme sig fra isen anæstesi før nogen eksperiment.
3. Forsøgsprocedurer
- Tilslut en PC med både registreringssystemet og et LED-lys ved hjælp af en USB til seriel port kabel.
- Start neurale optagelser.
- Start videooptagelser ved 20 frames per sekund for at gå eksperimenter ved hjælp af Motmot billede erhvervelse pakke 16 eller 120 fps til klatring forsøg med en høj hastighed kamera.
- Placer kakerlak i en 40 cm x 40 cm plexiglas arena for walking forsøg eller en 58 cm lang, 5 cm bred og 5 cm høj arena for klatring eksperimenter. Walking arena har en gennemsigtig barriere strækker sig fra midten af den højre væg til midten af arenaen, hvorover hovedtrin er placeret. Barrieren bruges til at forhindre dyrene i at gå i områder, hvor kameraet synspunkt er blokeret af hovedtrin. Den klatring arena har en akryl blok (enten 1,2 cm eller 1,8 cm høj og 5 cm bred) eller en hylde placeret på en sammenlignelig højde i midten.
- Generer en TTL puls fra pc'en ved hjælp af et skræddersyet Matlab kommando. (R = serial ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'on' /; fclose (s), slette (r) ;). TTL puls genererer en gangetamp til optagelsen, og enten tænder eller slukker LED lys.
- Lad kakerlak at udforske arena, indtil den stopper bevæger sig i mere end 30 sekunder for at gå eksperimenter. Lad kakerlak til enten klatre over blokken / hylde eller tunnel gennem hylden for klatring eksperimenter.
- Stop videooptagelser.
- Stop neurale optagelser.
- Skriv ned tidsstemplet genereret af TTL puls.
- Fjern kakerlak fra arena og vent mindst 3 minutter.
- Gentag trin 3,2-3,10 til næste forsøg.
- Når alle optagelser er afsluttet, passerer 5 sek af 5 uA DC-strøm gennem en af wire tip (anode) og henvisningen elektrode (katode) at deponere kobber i hjernen på tråden spids.
4.. Offline Analyse
- Synkroniser video-og neurale data ved at forbinde rammen, hvor LED-lys er tændt, og tidsstemplet registreret af systemet pådet øjeblik.
- Mark wire tip placeringer. Brug Timms intensivering procedurer til at bundfælde og observere kobber i 12 mM seriesnit 17. Fremtrædende indskud skal være synlige i 3-8 tilstødende sektioner (ca. 18-48% af længden af den dorsale ventrale plan område, vi optage fra) (Figur 2).
- Sammenholde specifikke elektriske impulser til aktiviteten af enkelte neuroner. Følg spike sortering procedurer i detaljer andetsteds 10,14,18. Bruge programmet KlustaKwik (version 1.5, forfatter K. Harris, Rutgers University) til at generere indledende, automatiseret klyngedannelse. Importere dem ind i programmet MClust (version 3.5, forfattere AD Redish et al., University of Minnesota) for yderligere raffinement og analyse (figur 3).
- Spor kakerlak bevægelser. Til fods eksperimenter, ekstrakt position kakerlaks (visuel) massemidtpunkt og dens krop orientering i hver ramme af vidEO optagelser med Caltech Multiple Fly Tracker (version 0.1.5.6, http://ctrax.sourceforge.net/) og den tilhørende FixErrors værktøjskasse til Matlab 19. Til klatring eksperimenter, ekstrakt position blokken og kakerlak hoved og pronotum i hver ramme af video ved hjælp af bevægelse analyse software pakke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi indspillede den neurale aktivitet på 50 enheder fra CC i 27 forberedelserne til vandre eksperimenter. For 15 af disse præparater (23 enheder) blev klatring eksperimenter også udført. Enkelte enheder er navngivet efter forberedelse og unit-numre (f.eks enhed 1-2 indikerer forberedelse 1 enhed 2).
Snapshots af video af en klatring forsøg er vist i figur 4.. Hele videoen er tilgængelig i supplerende Video 1 (Lyden er fra enhed 1-2). Optagelsen blev foretaget i den rigtige fan-formet krop (FB). Den kakerlak stoppede walking når det stødte på blokken og brugt sine antenner til at vurdere blok (figur 4A-C). Derefter kakerlak rejst foran sin krop, ændre kroppen substrat vinkel (figur 4D-E), inden den svingede sit ben mod toppen af blokken og klatrede over det (figur 4F-I). Hastigheden og højden af the kakerlak samt den øjeblikkelige fyring sats for de to sorterede enheder fra den første til den nuværende ramme vises over hver frame. Den øjeblikkelige fyring blev beregnet ved at udjævne spike tidspunkter af hver enhed ved hjælp af en Gauss-kerne med en bredde på 50 msek. Den fyring sats enhed 1-1 steg i klatring og forøgelsen af fyring sats forud for stigningen i hastighed (Figur 4I). Enhed 1-2 var tavs før klatring, men begyndte at fyre efter klatring blev indledt (figur 4I). Piggene i de to sorterede enheder i 1 sekund for den aktuelle ramme er vist under hver ramme. Den orange linje angiver den tid, der er omfattet af hver ramme og det blå rektangel angiver to gange bredden af den kerne, som blev anvendt til at beregne den øjeblikkelige skudhastighed for den aktuelle ramme.
En snapshot af video af en arena udforskning forsøg er vist i figur 5A. Hele videoen er available i supplerende Video 2 (Lyden er fra enhed 2-1). Optagelsen blev foretaget i midten FB. Placeringen af kakerlak og dens krop orientering i hver ramme blev udvundet ved hjælp Ctrax og bruges til at beregne frem og overskriften hastighed samt øjeblikkelig fyring sats. Bane af kakerlak i hele videoen er vist i figur 5B. Hver sort prik angiver placeringen af kakerlak i hver ramme og stien er farvekodet med den øjeblikkelige fyring sats enhed 2-1. Da vi indspillede hver retssag ved en konstant frame rate (dvs. 20 fps), jo længere afstanden mellem to prikker, jo hurtigere hastighed på det tidspunkt. Den fyring sats enhed 2-1 øges, når kakerlak begyndte at gå og var korreleret med ganghastighed. For at undersøge indstillingen af de enkelte enheder til dyrets bevægelse tilstand (dvs. hastighed og retning), vi konstrueret skudhastighed kort baseret på forward ganghastighed og turning hastighed for hver enhed. For mange CC enheder blev forøget skudhastighed begrænset til specifikke bevægelseskomponenter stater. For eksempel var enhed 2-1 tunet til at sende walking uanset drejehastighed (figur 5C).
Figur 1. Billeder af animalsk forberedelse. AC forfra kakerlak hoved kapsel. A. To stykker acetat ark blev placeret tæt på tetrode at tilvejebringe grundlaget for voks. B. En trækaflastning, var at skabe d ved at bøje tetrode i voks. C . Den tetrode var fuldt dækket af dental voks. D. Dorsal visning af kakerlak kroppen. Et træ stang blev fastgjort til dyrets pronotum og tetrode slangen var fastgjort til stangen. Den tetrode og reference / jordforbindelseselektrode vire yderligere sikret ved at knytte dem til den forreste af stangen. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Mark wire tip placeringer. A. En del af hjernen forberedelse n o 2, der viser en brun kobber deponeringssted i vifteformet legeme (FB). B. Skematisk tegning af CC og wiren spids placering. PB, protocerebral bro; FB, vifteformede organ. EB, ellipseformet krop Klik her for at se større billede.
Figur 3. &# 160; En typisk tetrode optagelse A. Rå spænding spor fra enkelte elektroder inden for en tetrode bundt.. Bemærk forskellen i spænding spor mellem de forskellige elektroder. B. Tre enheder blev sorteret ved hjælp MClust. C. 3-dimensionel visning af bølgeform energi som optaget på tre af de fire elektroder. Hver prik er en enkelt tærskel begivenhed, farvekodede efter klyngen var det i sidste ende tildelt. Klik her for at se større billede.
.. Figur 4 snapshots af videoen på en klatring forsøg Over hver ramme: normaliseret hastighed, højde kakerlak samt øjeblikkelig skudhastighed af de to sorterede enheder fra den første til denaktuelle ramme. Tid 0 indikerer indtræden af klatring. Skudhastighed var normaliseret 0-1, og hastighed og højde blev normaliseret 0-0,5 til udstilling. Under hver ramme: piggene de to sorterede enheder i 1 sekund for den aktuelle ramme. Den orange linje angiver den tid, der er omfattet af hver ramme og det blå rektangel angiver to gange bredden af den kerne, som blev anvendt til at beregne den øjeblikkelige skudhastighed for den aktuelle ramme. Individuelle enheder blev navngivet i overensstemmelse med forberedelse og unit-numre (f.eks. "Unit 1-2" angiver forberedelse 1 enhed 2). Klik her for at se større billede.
Figur 5.. Et øjebliksbillede af video af en arena udforskning forsøg A. Den rødeoval linje angiver formen af kakerlak i rammen og den røde stiplede linje angiver placeringen af kakerlak tyngdepunkt i de foregående 10 frames. Til højre: drejning og fremad ganghastighed samt den øjeblikkelige fyring sats enhed 2-1 på denne ramme. Herunder: pigge af enhed 2-1 inden 4 sek af den nuværende ramme. Som i figur 4 orange linje angiver den tid, der er omfattet af hver ramme og det blå rektangel angiver to gange bredden af den kerne, som blev anvendt til at beregne den øjeblikkelige skudhastighed for den aktuelle ramme. B. bane af kakerlak i hele video. Den store sorte prik angiver startpunktet for kakerlak og hver lille sort prik angiver positionen af kakerlak i hver ramme. Den bane blev farvekodet med den øjeblikkelige fyring sats enhed 2-1, fra blå (lav) til rød (høj). C. skudhastighed kort over enhed 2-1. For hele eksperimentet frem og turning hastighed samt spike tider blev glattet ved hjælp af en Gauss-kerne med en bredde på 150 msek og blev inddelt i nonoverlapping 50 msek lange strækninger. For hver opdelt afsnit blev en hastighedsvektor frembringes ved at midle fremad og drejehastighed inden for denne periode hhv. Firing for hvert hastighedsvektoren blev også beregnet. Alle hastighedsvektorerne blev binned (10 mm / sek fremad ganghastighed og 10 grader / sek drejehastighed) og en skudhastighed kort blev genereret ved at overlejre gennemsnit fyring for hver bin ved at tage gennemsnittet af alle fyring satser hvis tilsvarende hastighed vektorer faldt i at bin. X-aksen er drejehastigheden og Y-aksen er den fremadgående ganghastighed. Positiv drejning hastighed indikerer højre drejning og negativ drejning hastighed indikerer venstre drejning. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens tidligere elektrofysiologiske undersøgelser af CC eller andre regioner af insekt hjerne har givet os indsigt i den centrale styring af adfærd, blev de fleste af dem udført i enten tilbageholdende præparater 9,11 eller tøjret dem 10,14. Som et resultat, kan dyrets sanseoplevelse og fysiologiske tilstand være meget forskellige fra dem i naturlige omgivelser. Endvidere er de adfærdsmæssige opgaver at dyret kan udføre, er begrænset til et plan under disse situationer. Her præsenterede vi en metode til at optage fra CC i frit opfører kakerlakker. Forhåbentlig har vi givet dig med alle de nødvendige oplysninger, du bliver nødt til at fange elektrofysiologiske optagelser i frit opfører insekter i dit eget laboratorium. Vi præsenterede procedurerne for de systemer, vi bruger (Neuralynx, MClust, WinAnalzye og Ctrax), men når Recoding elektroderne er implanteret, kan optagelse setup let kan tilpasses til andre systemer. & #160;
Vi har udført 27 præparater, og som af endnu ingen af forsøgene blev afbrudt, fordi kakerlak beskadiget wire sæt. Vi har ikke observeret nogen forsøg fra dyret til at rengøre eller fjerne wire sæt, voks eller stang. De implanterede kakerlakker vandrede i en normal gangart. De var i stand til at udforske arenaen og udføre klatring opgaver lige så godt som intakte dem. Vores forsøg varede normalt 2-4 timer efter tetrode blev implanteret. Lejlighedsvis nogle enheder forsvundet eller deres aktivitet formindskes gennem tiden, men de fleste optagelser var meget stabil gennem hele eksperimentet. Vi har også isoleret nogle fag og vendte tilbage til optagelse og stimulering den følgende dag. Denne metode synes pålidelig i længere perioder ekstracellulære optagelser i frit opfører insekter.
Et punkt vægt er den skrøbelige natur wire sæt. De er let beskadiget, hvis stor omhu ikke er taget under opførelsen og implantation. Flyt altid ledninger og eventuelle dissektionsinstrumenter nær dem langsomt, og pas på ikke at støde eller rive dem. Ledninger kan trækkes forsigtigt fra præparatet efter eksperimentet og lesioning er afsluttet, giver mulighed for to eller tre anvendelser. Vær sikker på at teste, repolish og replate før hver brug.
Nøglen til en vellykket forberedelse er at holde ledersæt væk fra kakerlak. Vi bruger en lang stang strækker sig fra pronotum til over maven og fastgør tetrode slangen til den bageste ende af stangen. Følgelig tetrode slangen er altid bag kakerlak, når det bevæger sig rundt i en arena, således at insektet ikke kan nå slangen med antenner eller ben. Placering af ledersæt bag kakerlak giver også afstand over dyrets krop. Dette forbedrer video kvaliteten af vores arena experimeNTS fordi kameraet er placeret over arenaen. Efterlad ingen overskydende ledninger mellem dyrets hoved og tetrode slangen. Hvis insekt kan nå ledningerne med dens antenner eller ben, vil det bryde dem. I denne metode, slangesættet glider frit over tråden, tillader os at trække overskydende ledning op, og fastgør den i nærheden af hovedtrin.
En mulig begrænsning af vores metode er størrelsen af arenaen, hvor kakerlak kan udforske. Den tetrode er 40 cm i længde, som er nok til at give adgang til hele 40 x 40 cm 2 arena. Vi har ikke stødt på problemer såsom støj og tetrode kvalitet. Imidlertid kunne sådanne problemer opstår, når vi gør længere tetrodes for en større arena. Et andet potentielt problem med en længere tetrode er vægten af tetrode. Vores tetrode og stang vejer ca 0,25 g som tilsyneladende ikke hindrer en 2-3 g kakerlak. Vi observerede intakte kakerlakker udforske den samme arena, der anvendes til elektrophysiology eksperimenter. Walking aktivitet og den samlede hastighed var ens mellem kakerlakker bærer en stang og tetrode og ubehæftede dyr. Men vi har ikke testet grænsen for den belastning, som en kakerlak kan bære før sine præstationer dråber. En løsning på de begrænsninger af en længere ledning er at bygge en motoriseret platform for hovedtrin og kameraet. Under et sådant system, kan kameraet spore Kakerlak bevægelser i realtid og output til motoren sådan, at platformen kan bevæge sig i overensstemmelse hermed. Derfor ville et relativt kort tetrode være tilstrækkelig til et stort arena fordi hovedtrin ville forblive direkte over dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Nick Kathman for forslag og hjælpe på at forberede manuskriptet. Denne teknik blev udviklet i samarbejde med arbejde støttes af AFOSR under tilskud FA9550-10-1 til 0054 og National Science Foundation under Grant No IOS-1.120.305 til RER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
- Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
- Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
- Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
- Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
- Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
- Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
- Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
- Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
- Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
- Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
- Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , Springer Verlag. (1980).
- Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
- Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
