Summary
We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons in staat stelt te controleren activiteit in individuele eenheden van tethered kakkerlakken. Hier presenteren we een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt om ook hersenactiviteit opnemen in vrij bewegende insecten.
Abstract
Toenemende belangstelling voor de rol van de hersenactiviteit in insecten motorbesturing vereist dat we in staat zijn toezicht te houden op neurale activiteit, terwijl insecten voeren natuurlijk gedrag. We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons de activiteit opnemen van meerdere neuronen tegelijk terwijl een tethered kakkerlak gedraaid of veranderde loopsnelheid. Terwijl een grote stap vooruit, tethered voorbereidingen bieden toegang tot beperkte gedrag en vaak geen feedback processen die zich in vrij bewegende dieren. We presenteren nu een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt op te nemen van het centrale complex van vrij bewegende kakkerlakken als ze lopen in een arena en omgaan met barrières door te draaien, klimmen of tunneling. In combinatie met hoge snelheid video en cluster snijden, kunnen we nu betrekking hersenactiviteit om verschillende parameters van de beweging van vrij gedragen insecten.
Introduction
Dit artikel beschrijft een succesvol systeem voor het opnemen van neuronen in het centrale complex (CC) van de kakkerlak, Blaberus discoidalis, als het insect loopt in een arena en deals met voorwerpen die ervoor zorgen dat het om te draaien, tunnel onder of klimmen over obstakels. De draden kunnen ook worden aangesloten op een stimulator activiteit te roepen in de omliggende neuropil met als gevolg gedragsveranderingen.
In de afgelopen tien jaar veel aandacht is gericht op de rol die de verschillende gebieden van de hersenen in het controleren van gedrag van insecten. Veel van deze focus is gericht op de middellijn hersenen neuropils die gezamenlijk worden aangeduid als het centrale complex (CC). Er is vooruitgang geboekt als gevolg van grote rassen van technieken gericht vragen over de rol van de CC in gedrag. Deze technieken variëren van neurogenetische manipulaties, voornamelijk in Drosophila, gekoppeld behavimondelinge analyse 1-3, om elektrofysiologische technieken die de neurale activiteit in de CC en poging om die activiteit betrekking hebben op gedragsmatig relevante parameters te monitoren.
Elektrofysiologische technieken omvatten intracellulaire opname van individuele geïdentificeerde neuronen 4-9 en extracellulaire, vaak met multi channel sondes 10,11. Deze twee technieken zijn gratis. Intracellulaire opname met scherpe elektroden of whole cell patch biedt zeer gedetailleerde gegevens over geïdentificeerde neuronen, maar is beperkt tot een of twee cellen tegelijk, vereist weinig of geen beweging, en kan worden gehandhaafd voor een relatief korte periode van tijd. Extracellulaire opnames kunnen eenvoudig worden ingesteld, hoeft terughoudendheid niet nodig, en kan worden gehandhaafd voor uren. Met multi channel tetrodes en cluster snijden, kan vrij grote populaties van neuronen tegelijkertijd 9,12 worden geanalyseerd. Terwijl de hele cel patch is met succes gebruikt in tethered insecten 13, vinden wij dat er ook behoefte aan technieken die ons toelaten om neurale activiteit op te nemen in de hersenen voor langere tijd in vrij gedragen insecten zoals zij omgaan met belemmeringen voor voorwaartse beweging.
De noodzaak om op te nemen als het insect beweegt en stuitert op en neer duwde ons naar extracellulaire technieken. We hebben goed succes opname had ingehouden preparaten handel verkrijgbare 16 kanalen silicium sondes 11, maar de geringe omvang van zelfs grote kakkerlakken betekent dat de probes lichaam worden gemonteerd af. Dat, in combinatie met de gevoeligheid van de sonde tanden, die ze ongeschikt voor een gratis wandel preparaat. In twee eerdere projecten, gebruikten we bundels van fijne draden die een Tetrode soortgelijke opname eigenschappen te bereiken, maar in een meer robuuste regeling. Deze Tetrode bundels liet ons op te nemen van tethered kakkerlakken eend betrekking CC eenheid activiteit op veranderingen in te lopen en de snelheid 14 gedrag als gevolg van antennal contact met een staaf 10 draaien.
Zo nuttig als deze tethered voorbereidingen zijn en zullen blijven, doen ze presenteren een aantal beperkingen. Ten eerste, het gedrag dat het insect kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak. Dat wil zeggen, we konden gemakkelijk veranderingen in loopsnelheid of draaien roepen, maar klimmen en tunneling acties waren niet mogelijk, in ieder geval met de typische tether regeling. Ten tweede, onze tethered voorbereidingen zijn "open loop". Dat is, zij niet toestaan normale voortbewegingsapparaten feedback aan het systeem. Dus, zoals de kakkerlak ingeschakeld onze tether, de visuele wereld was niet dienovereenkomstig gewijzigd. Het is mogelijk om gesloten lus tether systemen te bouwen om dit soort feedback te introduceren. Ze worden echter beperkt door de complexiteit van de programmering en hardware van de gesimuleerde visuele omgeving. Nevertheless, vonden we dat we op onze bestaande tethered opname methoden zou kunnen verbeteren door het opnemen van het dier als het vrij in een arena of track en kwam objecten als hij zou in zijn natuurlijke omgeving gelopen.
Hoewel draadloze systemen voor de registratie van hersenactiviteit 15 zou ideaal zijn, de huidige systemen hebben beperkingen in het aantal opname-kanalen, de tijd van data-acquisitie, het leven en het gewicht van de batterij. Daarom hebben we gekozen om te proberen onze tethered opnamesysteem voor gebruik aan te passen in vrij bewegende preparaten. Betere draadloze systemen beschikbaar komen, kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan dergelijke inrichtingen. Het systeem dat wordt beschreven in dit artikel is licht van gewicht, werkt erg goed en lijkt weinig schadelijk effect op het gedrag van de kakkerlak hebben. Met een goedkope high speed camera en cluster snijden software, kan de activiteit in individuele hersenen neuronen worden gerelateerd aan beweging. Hier beschrijven we de preparatie van de Tetrode draden en hun implantatie in de hersenen van het insect en opnametechnieken voor elektrische activiteit en beweging en hoe die gegevens kunnen elkaar worden gebracht voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Tetrode Draden
- Trek een zeer dunne nichrome draad (12 micrometer diameter, PAC coating) van ongeveer 1,1 m lengte. Bevestig een tape tag aan elk uiteinde. Hang de draad over een horizontale draadstang zodanig dat de beide uiteinden op dezelfde hoogte bij de stationaire.
- Herhaal stap 1.1 voor een tweede draad, waardoor twee uiteinden voor een totaal van 4, en leg deze naast de eerste draad (ongeveer 1 cm ertussen).
- Plak de vier uiteinden samen met een tape-tag en bevestig het label om een gemotoriseerd roterend opwikkelinrichting. Dit apparaat kan worden gemaakt van een goedkope gelijkstroommotor.
- Wikkel de tetrode in een richting voor 2 min (60 min) en ontspannen in de tegenovergestelde richting gedurende 30 sec.
- Gebruik een warmte kanon om de draden samensmelten. Raak de draden niet aan met het pistool. Gebruik drie op en neer gaat van wisselende richtingen, met elke pas duurt ongeveer 10 sec.
- Snijd de bovenkant en de onderkant van de wond draden. De vier draden zijn getwist eend versmolten aan een uiteinde, maar gescheiden van de andere.
- Voeg de ondersteunende buis. Snijd een 30 cm lengte van polyethyleen buis (diameter: binnen 0,28 mm, buiten 0,61 mm). Rijg de Tetrode heel langzaam en voorzichtig in de ondersteunende buis zodanig dat het niet knikken.
- Zodra het gesmolten einde verschijnt er aan de andere kant, haal deze door, zodat er een gelijke lengte van de draad aan beide uiteinden van de geleidebuis.
- Pak de afzonderlijke einde van elke draad met een tang. Met de basis van de vlam van een gasbrander voorzichtig verbranden de isolatie af van de laatste 2 of 3 mm van elke draad. Verwarm de draad tot het gloeit, maar niet krullen.
- Sluit de Tetrode met een man-vrouw IC socket adapter die uw opname apparaat past. Zet de deinsulated einde van elke draad in een ander stopcontact van de adapter met een pincet. Stabiliseren van de draad in het stopcontact met een kleine koperen pin. Gebruik een fijne punt soldeerbout en vul de aansluiting met het gesmolten soldeer. Wees voorzichtig om geen contactde fragiele draad met de soldeerbout.
- Controleer de impedantie van elke draad en de impedantie tussen elk paar draden.
- Plaats de gesmolten, gedraaide uiteinde in een bak met zout en sluit een koperdraad dirigent van de zoutoplossing om de meter ohm.
- Sluit het andere uiteinde van de meter om de steekbout met de draad. De impedantie van elke draad moet onder 3 MQ.
- Als de bovenstaande waarden niet worden bereikt, probeer het nog eens soldeerverbindingen.
- Verwijder de draden van de zout, spoel ze schoon met water, en test de inter draad impedantie voor elke koppeling (n = 6). De inter impedantie dient boven 5 MQ.
- Als de bovenstaande waarden niet worden bereikt, snijd een kleine hoeveelheid van de tip uit bij de gesmolten einde en opnieuw te testen.
- Gooi alle draad set die niet voldoet aan zowel de impedantie eisen voor alle van de draden.
- Zet de Tetrode.
- Vouw een klein rechthoekig kartonnen doosje sligHTLV groter dan de socket adapter.
- Breng de adapter in de doos met de mannelijke kant op de bodem. Doordringen in de doos zodanig dat alle pinnen van de mannelijke kant zijn buiten de box, terwijl de rest van de adapter in de doos.
- Tape de hoeken van de doos aan de buitenkant. Gebruik kleine stukjes dubbelzijdig plakband aan de binnenkant van de doos aan een persoon draadstrengen stabiliseren. De draad moet worden gefuseerd zodra deze uit de doos.
- Meng fast set 2 componenten epoxy en giet het in het vakje voor de adapter en alle draden vast te zetten.
- Bevestig het nabije einde van de geleiding slang aan een kant van de doos met tandartsen maar laat de buis te openen, zodat de tetrode kan worden getrokken door vrij aan beide uiteinden.
- Slijp de Tetrode.
- Vóór elk experiment, snijd het topje van de Tetrode met een scherp scalpel, geen schaar. Dit voorkomt het breken en splaying van de draadeinden, terwijl het verstrekken van een schone vlakke rand voor de volgende stap.
- Het gewenste resultaat verandert de bundel uiteinde van een rechte rand een puntig met kleine hoeveelheden isolatie uit het uiteinde van elke draad. Controleer het punt met behulp van een dissectie microscoop voordat plating de Tetrode. Als een rafelen optreedt op het puntje, recut en repolish.
- Als impedantie testen tijdens de subsequent plating stap toont extreem lage inter draad waarden (minder dan 4 MQ), geeft teveel materiaal verwijderd tijdens de polijststap. Recut en repolish de Tetrode.
- Vóór elk experiment, snijd het topje van de Tetrode met een scherp scalpel, geen schaar. Dit voorkomt het breken en splaying van de draadeinden, terwijl het verstrekken van een schone vlakke rand voor de volgende stap.
- Plate de Tetrode. Plaats de punt van de tetrode tot een verzadigde kopersulfaatoplossing (85 ml water, 5 ml zwavelzuur, 50 g kopersulfaat). Plaat elke draad met een stroom van 2,5 uA met een stimulus isolator. Spuit de stroom voor 1 sec, pauze voor 1 sec en herhaal dit proces 4x.
- Controleer de impedantie van elke draad en interimpedance van elk paar draden. De impedantie van elke draad moet tussen 0.5-1 MQ en de inter impedantie moet hoger zijn dan 4 MQ.
- Monteer de adapter op de headstage van een multichannel opname systeem.
- Bevestig een gebogen insect pin naar een micromanipulator. Bevestig het uiteinde van de Tetrode om het insect pin met tandartsen
2. Bereiding van dieren
- Verdoven van dekakkerlak met ijs.
- Na de kakkerlak niet meer beweegt, bedwingen de kakkerlak verticaal tegen een vlakke kurk oppervlak met grote zadel pinnen die het insect straddle maar een deel van zijn lichaam niet binnendringen.
- Breng het preparaat in een plastic container en plaats ijs rond het dier bloedstroom en lichaamsbewegingen minimaliseren.
- Plaats een plastic kraag in de nek naar het hoofd ondersteunen en plaats tandartsen rond het hoofd te stabiliseren.
- Snijd een klein venster tussen de ocelli met een scheermesje en de nagelriem verwijderen uit het hoofd.
- Verwijder bindweefsel en vet met een tang om de hersenen bloot.
- Plaats enkele kakkerlak zoutoplossing in de kop capsule naar het hersenweefsel te dekken.
- Naar de hersenen desheath, met een fijne tang om voorzichtig pak de mantel op de top van de hersenen en een andere fijne tang om de mantel uit elkaar scheuren in de draad geïmplanteerde gebied.
- Open een klein gaatje in het hoofd capsule juist voor de hersenen with een insect pin. Plaats een vlecht van drie grotere diameters (56 micrometer) geïsoleerde koperen draden in het gat om te dienen als referentie / aardelektrode.
- Laat de tip van de Tetrode aan de hersenen oppervlak met de micromanipulator en plaats het in de buurt van de hersenen regio van belang.
- Plaats voorzichtig twee kleine stukjes dunne acetaatblad (2 mm x 1 mm), iets groter dan de kiespijn capsule, anterieure en posterieure de tetrode.
- Zet het opnamesysteem.
- Langzaam de Tetrode 150-250 urn onder de hersenen oppervlak, afhankelijk van de opnamekwaliteit.
- Schakel het opnamesysteem.
- Verplaats de twee stukken van acetaat vel zo dicht mogelijk bij de Tetrode mogelijk zonder aan te raken (figuur 1A).
- Verhit een kleine spatel of afgeplatte injectienaald en zet het in tandtechnische was zodanig dat er vloeibare was aan het uiteinde van de spatel. Raak voorzichtig het uiteinde van elk stuk van acetaat vel uit deTetrode met de spatel zodat vloeibare wax kan stromen op elk stuk en dicht de kloof tussen haar en het hoofd cuticula.
- Herhaal stap 2.16. Laat een kleine hoeveelheid vloeibare was op de acetaat vel per keer. Start het proces ver weg van de Tetrode en beweeg langzaam naar toe. Uiteindelijk de Tetrode zal worden verankerd door tandartsen. Voorkom dat heet kaarsvet in de holte en op de hersenen.
- Gebruik dezelfde methode als de stappen 2.16 en 2.17 van de referentie / massa-elektrode met was te verankeren.
- Verwarm de was die de tetrode hecht aan de micromanipulator om de tetrode weghaalt.
- Loop de Tetrode in de tandheelkundige wax op het hoofd van een trekontlasting (Figuur 1B) te verstrekken.
- Bedek de trekontlasting lus met tandartsen (figuur 1C).
- Verwijder voorzichtig de beperkingen en de overdracht van de voorbereiding op een petrischaal. Beperken de voorbereiding dorsale zijde naar boven met grote zadel pinnen.
- Hechteneen stang aan de pronotum met een lijmpistool. Dit is een houten stok die zich uitstrekt van het pronotum over de buik.
- Bevestig het uiteinde van de Tetrode buis met het achterste uiteinde van de staaf met tandartsen.
- Veranker de Tetrode en het referentie / aardelektrode aan het voorste uiteinde van de staaf met tandartsen.
- Trek de tetrode uit het stopcontact uiteinde van de slang zoveel mogelijk, maar niet ruk aan het, om de kans dat het dier het deel van de tetrode beschadigen buiten de buis (figuur 1D) elimineren.
- Verwijder alle beperkingen. Bevestig de referentie / aardelektrode naar de Tetrode buis met tandartsen.
- Wacht minstens 60 minuten om het dier te herstellen van de anesthesie ijs voordat experiment.
3. Experimentele Procedures
- Sluit een PC met zowel het opnamesysteem en een LED-licht met behulp van een USB naar seriële poort kabel.
- Start neurale opnames.
- Start video-opnames met 20 frames per seconde voor het lopen experimenten met het beeld Motmot acquisitie pakket 16 of 120 fps voor het beklimmen van experimenten met behulp van een high speed camera.
- Plaats de kakkerlak in een 40 cm x 40 cm Plexiglas arena te wandelen experimenten of een 58 cm lang, 5 cm breed en 5 cm hoog arena voor het beklimmen van experimenten. The walking arena heeft een transparante barrière uitstrekt van het midden van de rechter muur naar het midden van de arena, waarboven de headstage zich bevindt. De barrière wordt gebruikt om te voorkomen dat de dieren lopen in gebieden waar de camera uitzicht is geblokkeerd door de headstage. De klimfaciliteit heeft een acryl blok (ofwel 1,2 cm of 1,8 cm en 5 cm breed) of een plank bij een vergelijkbare lengte in het midden.
- Genereer een TTL puls van de pc met behulp van een aangepaste MATLAB commando. (S = seriële ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'uit' / s.RequestToSend = 'op' /; fclose (s), verwijderen (s) ;). De TTL puls genereert een keeraanstampen voor het opnamesysteem en ofwel wordt in-of uitgeschakeld de LED-licht.
- Laat de kakkerlak naar de arena te verkennen tot het niet verder bewegen voor meer dan 30 seconden te lopen experimenten. Laat de kakkerlak om ofwel klimmen over het blok / plank of tunnel door de plank voor het beklimmen van experimenten.
- Stop video-opnames.
- Stop neurale opnames.
- Noteer het tijdstempel gegenereerd door de TTL puls.
- Verwijder de kakkerlak uit de arena en wacht minstens 3 minuten.
- Herhaal stap 3,2-3,10 voor de volgende proef.
- Zodra alle opnames zijn voltooid, geeft 5 seconden van 5 uA DC stroom door een van de uiteinden draad (anode) en de referentie-elektrode (kathode) koper storten de hersenen op de draad tip.
4. Offline Analyse
- Synchroniseer video en neurale gegevens door het koppelen van het frame waar de LED-verlichting wordt ingeschakeld en de tijdstempel geregistreerd door het systeem opdat moment.
- Mark draad tip locaties. Gebruik Timms intensivering procedures neer te slaan en observeer de koper in 12 micrometer seriecoupes 17. Prominente deposito moet zichtbaar zijn in 3-8 aangrenzende secties (ongeveer 18-48% van de lengte van de dorsale ventrale vlak van het gebied dat we opnemen) (Figuur 2).
- Correleren specifieke elektrische impulsen om de activiteit van enige neuronen. Volg spike uitzoeken in detail vastgelegd elders 10,14,18 procedures. Gebruik het programma KlustaKwik (versie 1.5, auteur K. Harris, Rutgers University) om de eerste, geautomatiseerde clustering genereren. Importeren ze in het programma MClust (versie 3.5, auteurs AD Redish et al.., University of Minnesota) voor verdere verfijning en analyse (Figuur 3).
- Volg de bewegingen van de kakkerlak. Voor het lopen experimenten, haal de positie van de kakkerlak (visuele) zwaartepunt en zijn lichaam oriëntatie in elk frame van de video-opnamen met behulp van de Caltech Multiple Fly Tracker (versie 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) en de bijbehorende FixErrors toolbox voor MATLAB 19. Voor het beklimmen van experimenten, haal de positie van het blok en het hoofd van de kakkerlak en pronotum in elk frame van de video met behulp van motion analyse software pakket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We namen de neurale activiteit van 50 eenheden van de CC in 27 voorbereidingen voor wandelen experimenten. Voor 15 van deze preparaten (23 eenheden), werden klimmen experimenten ook uitgevoerd. Individuele eenheden worden benoemd op basis van voorbereiding en eenheid nummers (bijv. unit 1-2 geeft voorbereiding 1, unit 2).
Momentopnamen van de video van een klimmen proef zijn weergegeven in Figuur 4. Het hele video is in aanvullende Video 1 (Het geluid van unite 1-2). De opname werd gemaakt in de juiste waaiervormige lichaam (FB). De kakkerlak stond stil toen het in aanraking met de blok en gebruikt zijn antennes om het blok (Figuren 4A-C) te beoordelen. Toen hief de kakkerlak de voorkant van zijn lichaam, verandert het lichaam substraat hoek (Figuren 4D-F), voordat hij zwaaide zijn poot naar de bovenkant van het blok en klom eroverheen (fig. 4F-I). De snelheid en hoogte van the kakkerlak alsmede de momentane vuursnelheid van de twee gesorteerde selecteren uit de eerste tot de huidige frame staan boven de lijst weergegeven. De momentane afvuren werd berekend door het gladstrijken piek tijden van elke eenheid met een Gaussische kernel met een breedte van 50 msec. De vuren van unit 1-1 stegen tijdens het klimmen en de toename van het afvuren tarief vooraf aan de verhoging van de snelheid (figuur 4I). Unit 1-2 zweeg voordat klimmen maar begon te vuren na klimmen werd ingeleid (Figuur 4I). De pieken van de twee gesorteerde eenheden binnen 1 seconde van het huidige frame worden hieronder elk frame weergegeven. De oranje lijn geeft de tijd waarop elk frame en blauwe rechthoek geeft tweemaal de breedte van de kern die werd gebruikt om de momentane vuursnelheid van het huidige frame te berekenen.
Een momentopname van de video van een arena exploratie proces wordt getoond in figuur 5A. De hele video is een vBESCHIKBARE in aanvullende Video 2 (Het geluid komt uit unit 2-1). De opname werd gemaakt in het midden FB. De positie van de kakkerlak en de lichaamsoriëntatie in elk frame werd geëxtraheerd met Ctrax en gebruikt om vooruit berekenen en post snelheid en momentane vuursnelheid. Het traject van de kakkerlak in de gehele video wordt getoond in figuur 5B. Elke zwarte stip geeft de positie van de kakkerlak in elk frame en het pad is kleur gecodeerd met de momentane vuursnelheid van unit 2-1. Nu we elke proef op een constante framesnelheid (dwz 20 fps), hoe langer de afstand tussen twee punten, hoe sneller de snelheid op dat moment. De vuren van unit 2-1 verhoogd wanneer de kakkerlak begon te lopen en werd gecorreleerd met loopsnelheid. Met het oog op de afstemming van de afzonderlijke eenheden te onderzoeken om locomotion toestand van het dier (dwz snelheid en richting), we geconstrueerd vuursnelheid kaarten gebaseerd op voorwaartse loopsnelheid en turNing snelheid voor elke eenheid. Voor veel CC-eenheden, werd verhoogd vuursnelheid beperkt tot specifieke motoriek staten. Zo werd unit 2-1 afgestemd op vooruit loopt ongeacht draaisnelheid (figuur 5C).
Figuur 1. Foto's van dierlijke preparaat. AC Vooraanzicht van de kakkerlak hoofd capsule. A. Twee stukken acetaatblad geplaatst dichtbij de tetrode de basis voor was. B. Een trekontlasting is creëren d door buigen van de tetrode in wax. C . De Tetrode werd volledig gedekt door tandartsen. D. Dorsal weergave van de kakkerlak lichaam. Een houten staaf is bevestigd aan pronotum het dier en de tetrode buis werd bevestigd aan de stang. De Tetrode en het referentie / aardelektrode were verder beveiligd door ze aan de voorste van de staaf. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Mark draad tip locaties. Een. Een deel van de hersenen van de voorbereiding n o 2, waaruit een bruine koperafzetting site in het waaiervormige lichaam (FB). B. Schematische tekening van de CC en de draad tip locatie. PB, protocerebral brug, FB, waaiervormige lichaam. EB, ellipsoïde lichaam Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. &# 160; Een typische Tetrode opname A. Rauwe spanning sporen van enkele elektroden binnen een Tetrode bundel.. Merk het verschil van de spanning sporen tussen verschillende elektroden. B. drie eenheden werden gesorteerd via MClust. C. 3-dimensionaal beeld van de golfvorm energie die op drie van de vier elektroden. Elk punt is een enkele drempel gebeurtenis, kleur gecodeerd door de cluster werd uiteindelijk toegewezen. Klik hier voor grotere afbeelding.
.. Figuur 4 momentopnamen van de video van een klimmen proef Boven elke lijst: genormaliseerde snelheid, hoogte van de kakkerlak en momentane vuren van de twee gesorteerde selecteren uit de eerste naar dehuidige frame. Tijd 0 geeft het begin van de beklimming. Vuursnelheid werd genormaliseerd 0-1, en de snelheid en hoogte werden genormaliseerd 0-0,5 voor weergave doeleinden. Hieronder elk frame: de pieken van de twee gesorteerde eenheden binnen 1 seconde van het huidige frame. De oranje lijn geeft de tijd waarop elk frame en blauwe rechthoek geeft tweemaal de breedte van de kern die werd gebruikt om de momentane vuursnelheid van het huidige frame te berekenen. Individuele eenheden werden genoemd volgens bereiding en eenheid nummers (bv.. "Unit 1-2" geeft voorbereiding 1, unit 2). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Een momentopname van de video van een arena exploratie proef A. De rodeovale lijn geeft de vorm van de kakkerlak in dat kader en de rode stippellijn geeft de positie van het centrum van de kakkerlak van de massa in de voorgaande 10 frames. Rechts: draaien en voorwaartse loopsnelheid en de momentane vuursnelheid van unit 2-1 bij dat frame. Onder: de spikes van unit 2-1 binnen 4 seconden van het huidige frame. Zoals in figuur 4, de oranje lijn geeft de tijd waarop elk frame en blauwe rechthoek geeft tweemaal de breedte van de kern die werd gebruikt om de momentane vuursnelheid van het huidige frame te berekenen. B. De baan van de kakkerlak in de gehele video. De grote zwarte stip geeft het startpunt van de kakkerlak en elke kleine zwarte stip geeft de positie van de kakkerlak in elk frame. Het traject werd een kleurcode met de momentane vuursnelheid van unit 2-1, van blauw (laag) tot rood (hoog). C. De vuursnelheid kaart van unit 2-1. Voor het gehele experiment, vooruit en turning snelheid en spike tijden werden gladgestreken met een Gauss-kernel met een breedte van 150 msec en werden verdeeld in niet-overlappende 50 msec lange stukken. Voor elk verdeeld sectie, werd een snelheid vector gegenereerd door het gemiddelde te voren en respectievelijk draaisnelheid binnen die termijn. Firing tarief voor elke snelheid vector werd ook berekend. Alle snelheidsvectoren werden weggegooid (10 mm / sec voor voorwaartse loopsnelheid en 10 graden / sec voor draaisnelheid) en een vuursnelheid kaart werd gegenereerd door overlappen de gemiddelde vuren tarief voor elke bin verkregen door het gemiddelde van alle werkingsveld wiens corresponderende snelheidsvectoren viel in die bak. X-as is de draaisnelheid en de y-as is de voorwaartse loopsnelheid. Positieve draaisnelheid geeft rechts draaiend en negatieve draaisnelheid geeft links draaien. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de vorige elektrofysiologische studies over de CC of andere regio's van het insect hersenen ons heeft verstrekt inzicht in de centrale controle van het gedrag, de meeste van hen werden uitgevoerd in zowel ingetogen bereidingen 9,11 of tethered degenen 10,14. Dientengevolge, het dier zintuiglijke ervaring en fysiologische toestand kan verschillen van die in een natuurlijke omgeving. Bovendien is de gedragstaken dat het dier kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak onder deze omstandigheden. Hier presenteerden we een methode om op te nemen van de CC in vrij gedragen kakkerlakken. Hopelijk hebben we u voorzien van alle nodige informatie die u nodig hebt om elektrofysiologische opnames vast te leggen in een vrij gedragen insecten in uw eigen laboratorium. We presenteerden de voorwaarden voor de systemen die we gebruiken (Neuralynx, MClust, WinAnalzye en Ctrax), maar zodra het hercoderen elektroden worden geïmplanteerd, kan de opname setup gemakkelijk worden aangepast aan andere systemen. & #160;
We hebben verricht 27 voorbereidingen en vanaf nog geen van de proeven is beëindigd omdat de kakkerlak beschadigde de draad sets. We hebben niet waargenomen elke poging van het dier te reinigen of verwijderen van de draad sets, was, of stang. De geïmplanteerde kakkerlakken liepen in een normale gang. Ze waren in staat om de arena te verkennen en uit te voeren klimmen taken net zo goed als intact degenen. Onze experimenten meestal duurde 2-4 uur na de Tetrode werd geïmplanteerd. Af en toe sommige eenheden verdwenen of hun activiteiten verminderd door de tijd, maar de meeste opnames waren erg stabiel gedurende het hele experiment. We hebben ook geïsoleerd bepaalde onderwerpen en terug naar opname en stimulatie de volgende dag. Deze methode blijkt betrouwbaar gedurende lange extracellulaire opnames vrij gedragen insecten.
Een punt van aandacht is de kwetsbaarheid van de wire sets. Ze kunnen gemakkelijk beschadigd raken als grote zorg is niet genomen tijdens de bouw en de implantatie. Bewegen altijd de draden en eventuele dissectie-instrumenten in de buurt van hen langzaam, en let niet te stoten of scheuren ze. Draden kunnen zorgvuldig worden getrokken van het preparaat na de proef en laesie voltooid, waardoor twee of drie gebruik. Zorg ervoor dat u opnieuw te testen, repolish en replate voor elk gebruik.
De sleutel tot een succesvolle voorbereiding is de draad sets weg van de kakkerlak houden. We gebruiken een lange staaf uitstrekt van de pronotum boven de buik en bevestig de tetrode slang aan het achterste uiteinde van de stang. Bijgevolg is de Tetrode buis is altijd achter de kakkerlak als het bewegen in een arena dusdanig dat de insecten de slang niet kan bereiken met zijn antennes of benen. Het plaatsen van de draad ondergaat achter de kakkerlak ook speling over het lichaam van het dier. Dit verbetert de beeldkwaliteit van onze arena experimegen omdat de camera boven de arena wordt geplaatst. Laat geen overtollige draden tussen het hoofd van het dier en de Tetrode buis. Als het insect de draden kan bereiken met zijn antennes of benen, zal het hen breken. In deze methode, de slang glijdt vrij over de draad, waardoor we overtollige draad omhoog te trekken en zet hem in de buurt van de headstage.
Een mogelijke beperking van onze werkwijze is de grootte van de arena waar de kakkerlak kan verkennen. De tetrode is 40 cm lengte die voldoende toegang tot de volledige 40 x 40 cm 2 arena verschaffen. We hebben geen problemen gehad, zoals lawaai en Tetrode kwaliteit. Anderzijds kan deze problemen lijken als we langer tetrodes voor een grotere arena. Een ander mogelijk probleem met een langere tetrode is het gewicht van de tetrode. Onze Tetrode en staaf weegt ongeveer 0,25 g die blijkbaar geen 2-3 g kakkerlak belemmeren. We zagen intact kakkerlakken verkennen dezelfde arena gebruikt voor electrophysiology experimenten. De wandel-activiteit en de snelheid waren gelijk tussen kakkerlakken met een staaf en Tetrode en onbezwaard dieren. We hebben echter niet de grens van de lading die een kakkerlak kan uitvoeren voordat de prestaties druppels getest. Een oplossing voor de beperkingen van een langere draad is een gemotoriseerde platform voor de headstage en de camera op. In een dergelijk systeem kan de camera bewegingen van de kakkerlak in real time en uitgang bijhouden van de motor zodanig dat het platform dienovereenkomstig kan bewegen. Daarom zou een relatief korte tetrode voldoende grote arena omdat de headstage direct boven het dier blijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs danken Nick Kathman voor suggesties en helpen bij de voorbereiding van het manuscript. Deze techniek werd ontwikkeld in samenwerking met het werk ondersteund door de AFOSR onder subsidie FA9550-10-1-0054 en de National Science Foundation onder Grant No IOS-1120305 om RER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
- Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
- Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
- Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
- Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
- Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
- Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
- Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
- Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
- Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
- Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
- Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , Springer Verlag. (1980).
- Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
- Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
